專利名稱：重組二聚化抗凝血酶III-Fc融合蛋白及其哺乳動物細胞高效表達系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重組ニ聚化抗凝血酶III的Fe融合蛋白及其制備方法和它在醫(yī)療上的應用，特別是在治療多種凝血相關(guān)的疾病，抗血管新生，抗炎癥和抗病毒方面的用途。
背景技術(shù)：
人體內(nèi)與凝血系統(tǒng)功能相拮抗的是抗凝血系統(tǒng)，在正常情況下，兩者保持動態(tài)平衡?？鼓窱II (AT)是人體血漿中的ー種重要的抗凝血因子，它在血漿中承擔著70%的生理性抗凝血酶活性(Johnson DJ等，EMBO J，2006，25 :2029-37)，在維持血液生理性凝血與抗凝血平衡中起非常重要的作用。AT是肝細胞和血管內(nèi)皮細胞分泌的絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族(Serine Protease Inhibitor, SEPIN)的重要成員之一。AT通過與凝血酶FIIa結(jié)合成凝血酶-抗凝血酶(TAT)復合物，從而滅活凝血酶。此外，它還可以較強地抑制凝血因子Xa、IXa的活性，對凝血因子XIa、Xlla、纖溶酶、激肽釋放酶的活性也有一定的抑制作用。體內(nèi)AT升高一般不會引起病理性后果，但是AT量減少常見于以下病例a)遺傳性AT缺乏遺傳性抗凝血酶缺陷癥是ー種較常見的人類遺傳性疾病，它與家族性靜脈血栓形成傾向有關(guān)(Abildgaard U 等,Thromb Haemost, 2007,98 :97-104) ；b)獲得性 AT 缺乏見于各種肝病，如肝硬化、重癥呷、肝癌晩期等；c)AT丟失增多如腎臟疾??；d)AT消耗增多如各種原因所造成的血液凝固性增高，AT中和活化的凝血因子，以致消耗増加；e)最重要的是AT的先天性或后天獲得性缺乏癥可導致血栓的形成，而引起腦血栓或心肌梗塞等非常嚴重的疾病。因此，AT在臨床上有預防和治療慢性血栓或血塞形成的作用，對治療抗凝血酶缺失癥也有顯著效果。除了抗凝作用，AT還具有抗炎作用。其抗炎作用首先由Taylor在猴子模型上研究彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)時提出，他發(fā)現(xiàn)輸注AT能大大降低接受致死量大腸桿菌猴子的死亡率(Taylor FB Jr等，Crit Care Med, 2000, 28 :S12_9)。越來越多的證據(jù)表明體內(nèi)凝血與炎癥反應之間存在網(wǎng)絡(luò)效應關(guān)系(Esmon CT, Blood, 2000,95 :1113-16 ；Cirino G等，Thrends Pharmacol Sci,2000, 21 :170-2)。Johnson 等(Johnson K 等，J Immunol,1998,160 :5130-35)進ー步研究發(fā)現(xiàn)，身體內(nèi)局部血栓的形成可刺激單核細胞及血管內(nèi)皮細胞合成大量的促炎因子，包括IL-8、IL-6。凝血酶在其中也起重要作用。凝血酶能裂解白細胞、內(nèi)皮細胞源性的IL-8 (含77個氨基酸，第77位殘基為丙氨酸殘基)生成含72個氨基酸的IL_8(第72位的殘基為絲氨酸)，增強了其中性粒細胞激活活性，故當凝血酶及IL-8在血管炎癥反應部位共存時可放大IL-8的效應。相應的，嚴重炎癥反應還可通過白細胞-內(nèi)皮細胞的相互作用損傷微血管細胞、微血管組織，進而刺激凝血酶的大量生成。迄今AT抗炎作用機制尚未完全闡明，可能存在多種作用機制。Oka j ima等(Oka j ima K等，Semin Thromb Hemost, 1998，24 :27-32)認為 AT 可促使內(nèi)皮細胞釋放 PGI2，PGI2 能抑制白細胞-內(nèi)皮細胞相互反應；同吋，AT還通過與內(nèi)皮細胞表面的葡胺聚糖相互作用，干擾了細菌毒素與葡胺聚糖的結(jié)合，減輕了細菌毒素的細胞反應，所以AT的抗炎作用與其與內(nèi)皮細胞上的葡萄糖胺聚糖結(jié)合能力緊密相關(guān)(Johnson DJ等，EMBO J，2006，25 :2029-37)。Minnema 等(Minnema MC 等，Blood, 2000，95 :1117-23)認為 AT 通過抑制凝血酶/FXa 介導的促炎因子如IL-6、IL-8、IL-10等的釋放來削弱炎癥反應。另外AT滅活了絲氨酸蛋白酶活性中心，從而抑制絲氨酸蛋白酶本身引起的細胞炎癥反應。大量的研究表明AT在多種組織中發(fā)揮其抗炎功能。在肺組織中，AT可抑制嗜中性粒細胞的滲透作用，且減少微血管滲漏(Duru S 等，Acta Anaesthesiol Scand, 2005，49 :1142-8)。在肝組織中，AT 通過調(diào)節(jié)局部前列環(huán)素水平來抑制肝損傷(Aytekin FO等,Am J Surg, 2005,189 161-6 ；Tsuboi H等，Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2007, 292 :G678_83)。在胃腸道，AT 可減少白細胞在血管內(nèi)的粘附和集聚(Ostrovsky L等，Circulation, 1997,96 :2302-10)。在皮膚組織中，AT可降低脂多糖(LPS)誘導的白細胞-內(nèi)皮細胞間相互作用(Hoffmann JN等，Am J Physiol Cell Physiol, 2000，279 :C98_107)。此外，AT 還被發(fā)現(xiàn)對非典型性分枝桿菌感染(Chan ED 等,Scand J Infect Dis, 2007, 39 :690-6)、糖尿病(Hashemi M 等,Diabetes Res Clin Pract，2007，75 :246-8)和脂膜炎的病理過程有影響作用(O，RiordanK等,Transplantation, 1997,63 :480-2)。進ー步的實驗發(fā)現(xiàn)AT的抗炎特性與其使用劑量 有夫。小劑量的AT(50U/kg及100U/kg)雖能明顯抑制內(nèi)毒素誘導的大鼠發(fā)生凝血障礙，但不能阻止白細胞在肺內(nèi)的聚集及對肺血管造成的損傷。而大劑量的AT(250U/kg)能顯著改善由內(nèi)毒素誘導的肺內(nèi)皮細胞的損傷(Uchiba M等，Thromb Res，1998，89 :233-41)。這ー研究結(jié)果也已在AT對重癥感染疾病治療作用研究的多中心KyberSept III期臨床試驗中得到證實。近年研究發(fā)現(xiàn)，通過有限的水解或熱變性后，AT具有抗血管新生的作用(RichardB等，JBiol Chem, 2008, 283 :14417-29)，能阻止細胞從Gl向S期轉(zhuǎn)變，抑制細胞増殖；同時還能抑制內(nèi)皮細胞表面促血管新生硫酸こ酰肝素蛋白多糖(proangiogenic heparansulfate proteoglycan,HSPG)和基底膜蛋白多糖(perlecan)的表達。通過抑制HSPG介導的FGF家族信號通路以及VEGF家族信號通路(Zhang W等，Blood, 2004,103 :1185-91)、阻斷HSPG介導的血管生長因子與血管內(nèi)皮細胞的黏附(Zhang W等，J Biol Chem, 2006, 281 37302-10)從而抑制血管新生。Zhang 等(Zhang W 等，Cancer Res, 2006,66 :5047-55)通過研究表明AT可以改變?nèi)四氺o脈內(nèi)皮細胞基因表達，有35種基因表達水平顯著增高，其中大多數(shù)基因具有抗血管生成作用，例如半胱天冬酶-3 (caspase-3)、p21、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑CHMPs) _1、2、3等；而有93種基因表達水平明顯下降，其中超過50%的基因具有血管形成作用，例如基底膜蛋白多糖(perlecan)、絲裂原蛋白活化激酶_3 (MAPK3)、早期生長反應因子-1 (EGRl)等。但目前尚缺乏動物或臨床前試驗證明AT在體內(nèi)有抗血管新生作用，如果該作用得到證實，那么聯(lián)合應用標準化療及這種抗凝藥應能更好地抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，并能減少腫瘤患者的血栓并發(fā)癥。絲氨酸蛋白酶抑制劑(Serpin)，包括AT對慢性病毒性疾病的進程具有雙向調(diào)節(jié)作用。HIV-I型及HCV感染者，其α-I抗胰蛋白酶(AAT)水平異常偏低(Potthoff AV等，AIDS, 2007, 21 :2115-6 ；Shapiro L 等，F(xiàn)ASEB J，2001，15 :115-22)，且被證實它與進行性疾病和進行性肝纖維化有關(guān)(Cheung KJ等，J Viral H印at，2009，16 :418-29)。相反，大量的臨床數(shù)據(jù)掲示serpin表達水平升高與HIV感染的發(fā)生率的下降，或延緩疾病進程相關(guān)(McNeely TB 等，Blood, 1997,90 :1141-9 ；Burgener A 等，J Proteome Res, 2008, 7 4446-54 ；Geiben-Lynn R 等，JBiol Chem，2002，277 :42352-7)。肝素活化的 AT 顯示出極強的抗病毒作用，它不僅對 HIV-I (Elmaleh DR 等，Int J Mol Med, 2005,16 :191-200)具有抑制作用，且同樣可抑制 HCV、HSV-I 和 HSV-2 (Whitney JB 等，PLoS One, 2011,6 :el8589)。AT在抗凝血、抗炎癥、抗血管新生和抗病毒方面顯現(xiàn)的生物學特性，使其在臨床上具有重大應用價值。AT在國外臨床上已經(jīng)廣泛使用，用于多種疾病的治療，包括彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)、先天及后天獲得性AT缺乏癥、多器官功能障礙綜合征(MODS)、敗血癥、重癥感染介導的全身炎癥反應和感染中毒性休克等(Puskds A等，Int Angiol, 2007, 26 53-63 ；Topaloglu S 等，Angiology, 2007, 58 :85-91)。尤其是針對 DIC 的治療，效果極為顯著。DIC在歐美姆年的發(fā)病率約為50萬例,死亡率超過50 %,僅美國即有20-30億美兀市場。美國GTC公司用轉(zhuǎn)基因山羊生產(chǎn)的人抗凝血酶“ATryn”分別于2006年8月和2008年10月獲得了歐洲藥監(jiān)局和美國FDA的批準。另外，最新研究結(jié)果表明，AT可以緩解抗凝 血常用藥肝素形成的耐藥性(Spiess BD, Ann Thorac Surg，2008，85 :2153-60)，這也預示著其更加廣闊的市場前景。隨著對AT作用機理的進一步深入研究、適應癥的進ー步拓寬，有望被開發(fā)成為抗炎癥、抗病毒、抗腫瘤等的藥物，運用到各類嚴重危害人類健康的炎癥疾病、病毒性疾病、腫瘤疾病、心腦血管疾病的預防和治療。AT是ー種單鏈糖蛋白，分子量大約為59，000至65，000，AT基因位于第I號染色體長臂(lq23-25)，長約16kb，包括7個外顯子和6個內(nèi)含子，其mRNA長為I. 5kb，編碼432個氨基酸的成熟蛋白，分子中有3對ニ硫鍵，Cys8-Cysl28、Cys21-Cys95和Cys247-Cys430 (Chandra T 等，Proc Natl Acad Sci USA，1983，80 :1845-8)。AT 有兩個重要的功能區(qū)(Patnaik MM等，Haemophilia，2008，14 :1229-39)，ー個是位于N端的肝素結(jié)合區(qū)，ー個是位于C端的凝血酶反應位點。AT反應位點在Pl (Arg393)和ΡΓ (Ser394)位，Pl通過與凝血酶活性中心的Ser結(jié)合，形成穩(wěn)定的AT凝血酶復合物，而滅活凝血酶。AT與Serpin家族的其他成員的ー個很重要的區(qū)別是它可以通過結(jié)合肝素類分子來提高其抑制活性。肝素是ー種高度硫酸化的粘多糖，被廣泛用作抗凝劑。這類分子有ー個特殊的戊糖序列，可以被AT識別，使AT分子構(gòu)象發(fā)生變化暴露出反應中心環(huán)，從而大大提高其結(jié)合凝血酶的能力(Johnson DJ等，EMBO J，2006，25 :2029-37)。在肝素存在下，AT的抗凝作用可以增加數(shù)千倍(Izaguirre G等，JBiol Chem，2007，282 :33609-22)。AT在人血漿中以兩種異構(gòu)形式存在，α型具有4個N糖苷連接的糖鏈，β型僅有3個N糖苷連接的糖鏈，缺少Asnl35上的糖鏈，人血漿中的AT中，90% 95%是α型，其余5% 10%是β型。在體內(nèi)存在的α型和β型AT都能有效結(jié)合肝素，但β型AT只需要較低濃度的肝素就能達到最聞活性。目前，AT蛋白的主要來源包括天然提純和基因工程兩種途徑。從人血漿中提取的AT蛋白已廣泛應用于臨床，但使用血液制品的缺點在于有病毒感染的危險，且這種危險性采用現(xiàn)有技術(shù)不能完全排除，盡管AT蛋白在血液制品的生產(chǎn)過程中進行了病毒滅活處理， 仍然有許多問題還不能完全解決，如AT蛋白的變性以及潛存的AIDS病毒、人細小病毒和可引起突變型克雅氏的朊病毒(prion)。所以，利用基因工程的方法表達人重組AT (rhAT)蛋白已成為ー種必然趨勢。
采用基因工程途徑獲得rhAT蛋白，主要包括乳腺生物反應器(美國專利US2003096974 ;中國專利CN1840187A)、原核表達體系及真核表達體系三種方法。目前，由轉(zhuǎn)基因山羊乳腺生產(chǎn)的抗凝血藥Atryn ( a-antithrombin)由美國FDA批準上市,但是轉(zhuǎn)基因動物表達體系的構(gòu)建耗時長、費用高，不適于大規(guī)模生產(chǎn)，且留有潛在的使用安全性問題，動物體內(nèi)雖然可以對外源蛋白進行翻譯后修飾，但由于牛、羊等家畜存在自身機體保護系統(tǒng)可對所有外源性物質(zhì)產(chǎn)生排斥反應，如出現(xiàn)蛋白質(zhì)水解等問題。此外乳汁中可能含有的微生物及不完全修飾的多肽都對產(chǎn)品的安全性構(gòu)成了極大的威脅，如出現(xiàn)引起人類過敏反應的蛋白質(zhì)。迄今，已在多種原核和真核體系中表達rhAT，先后在E. coli (Bock SC等，Nucleic Acid Res, 1982,10 :8113-25)、COS 細胞(Stephens AW 等，Proc Natl Acad SciUSA，1987，84 :3886-90)、BHK 細胞(Fan B 等，J Biol Chem，1993，268 :17588-96 ；Garone L等，Biochemistry, 1996,35 :8881-9)以及酵母(中國專利 CN101402968A ；Mochzuki S 等，Protein Expression Purif，2001，23 :55-65)等系統(tǒng)對AT進行了表達。但是，采用基因重組技術(shù)制備的rhAT在活性上次于血漿源性的AT (pAT)，并且存在表達量不高的問題。Bock等1982年最早報道AT在大腸桿菌中表達，所產(chǎn)生的蛋白沒有糖基化修飾，也未能檢測到功能活性。 中國倉鼠卵巢細胞(Chinese Hamster Ovary Cell, CH0)是用于真核生物外源基因表達最為成功的宿主細胞，已有越來越多的藥用蛋白在其中獲得了高效表達，很多藥物已投放市場，如EP0、G-CSF，多種抗體藥物等。與其它表達系統(tǒng)相比，該系統(tǒng)具有許多優(yōu)點，如擁有完備的翻譯后加工過程，包括糖基化、羥基化，使表達的外源真核基因產(chǎn)物能夠保持其天然結(jié)構(gòu)及活性，且使表達產(chǎn)物分泌到胞外，有利于外源蛋白的分離純化。有大量文獻報道了利用 CHO 細胞表達 rhAT 的先例(ffasley LC 等，J Biol Chem，1987，262 :14766-72 ;ZettlmeisslG 等，J Biol Chem，1989，264 :21153-9 ;PCT 專利 TO02/02793)。據(jù)文獻可知利用CHO細胞表達AT存在以下幾個問題，首先是表達量低(< 120mg/L) ( R6ssler B等，Enzyme Microb Technol，1996，18 :423-7)，無法滿足エ業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)的需求；其ニ，采用基因重組技術(shù)制備的rhAT在活性上次于從天然原料如血漿中獲得的pAT，如Wasley等于1987年將AT基因在CHO細胞系中表達，但僅檢測到5% 10%活性。近年來，研究者對CHO表達體系及細胞大規(guī)模培養(yǎng)條件不斷進行優(yōu)化和改進，獲得了較高的表達量。2005年，Kuwae利用CHO細胞成功表達了 AT,其表達量可高達lg/L (Kuwae S等，JBiosci Bioeng,2005,100 =502-10) ο其三，表達產(chǎn)物rhAT的糖基化形式與pAT不同(Zettlmeissl G等，JBiol Chem, 1989,264 :21153-9 ；Franze/ n LE 等，J Biol Chem，1980，255 :5090-3)，這可能導致rhAT在生物活性上次于pAT，且會改變其在體內(nèi)的半衰期。根據(jù)pAT的結(jié)構(gòu)，可推測由CHO細胞表達的具有生物活性的rhAT包含四個潛在的糖基化位點，每個位點含I個復合體型N-糖苷連接的糖鏈，由N-こ酰氨基葡萄糖、唾液酸、半乳糖和甘露糖構(gòu)成，且它的糖鏈結(jié)構(gòu)未經(jīng)巖藻糖修飾，而采用重組技術(shù)生產(chǎn)的rhAT，在其復合體型N-糖苷連接的糖鏈還原末端N-こ酰氨基葡萄糖上均結(jié)合了巖藻糖，這可能導致它與肝素的結(jié)合親和カ變低，因此便不能獲得足夠的抗凝血活性(Fan B等，J Biol Chem, 1993,268 =17588-96 ；Garone L等，Biochemistry, 1996,35 :8881-9)。另ー方面,pAT或rhAT如缺失糖鏈還原末端唾液酸,貝丨J其血漿清除率都將大大加快，即體內(nèi)半衰期縮短(Zettlmeissl G等，J Biol Chem, 1989, 264 21153-59)，而在高密度細胞培養(yǎng)生產(chǎn)rhAT吋，由死細胞裂解所釋放的唾液酸苷酶對糖鏈的去唾液酸化作用是不可避免的。由此，可知rhAT的體內(nèi)半衰期及生物活性都不及pAT。據(jù)已報道的有關(guān)AT的藥代動力學數(shù)據(jù)顯示，對正常受試者或遺傳性AT缺乏癥病人，AT在體內(nèi)半衰期變化范圍為22小時至4. 8天(Bucur SZ等，Transfusion, 1998, 38 481-98 ；Schwartz RS 等，Am J Med，1989，87 :53S_60S)，但對于急性 DIC 患者，因 AT 在短時間內(nèi)被大量消耗，致使AT的體內(nèi)半衰期降至幾小吋。據(jù)兩項AT臨床研究數(shù)據(jù)顯示(BlauhutB 等，Thromb Res,1982, 27 :271-278 ；Vinazzer H, Ann Univ Sarav Med,1983, Suppl 3 185-7)在給予AT治療后，急性DIC患者體內(nèi)AT平均活性僅恢復了 38%和47%，而正常組AT平均活性已恢復了 78%和83%;正常組AT的血漿清除相對半衰期分別為20和25小吋，而急性DIC患者僅為4. 25和4. 4小吋?？鼓幬锏目鼓?、抗栓效力，主要取決于其對適當血液水平(blood level)的控制和維持。而根據(jù)AT的抗凝機制可知,AT是凝血酶的ー種自殺型抑制劑，以底物的形式與凝血酶I : I結(jié)合，形成一個緊密的不可逆的復合物，在抑制凝血酶等目標酶的過程中，自身亦被裂解滅活，而形成的抗凝血復合物(TAT)亦迅速于網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除。由此可知，半衰期適當延長更有利于AT在一定時間內(nèi)建立并維持體內(nèi) 凝血和抗凝血系統(tǒng)的平衡，血藥濃度更趨于平穩(wěn)，減小血藥濃度波動并減少給藥次數(shù)，且在體內(nèi)不會造成累積，不增加出血風險，安全性高，尤其對于急性DIC患者及類似因AT消耗大量増加，致其體內(nèi)半衰期大幅縮短的病癥，或?qū)χ匕Y感染者抗炎治療以及DIC患者單用AT治療都必須給予大劑量AT，長效AT制劑的開發(fā)及應用顯得更加必要和迫切。IgG類的免疫球蛋白是人類血液中最豐富的蛋白質(zhì)。它們的半衰期可高達21天，而Fe片段是IgG保持體內(nèi)較長半衰期的主要原因，同時具有穩(wěn)定蛋白的作用。針對以上現(xiàn)有技術(shù)中所述有關(guān)AT的制備及其在臨床應用過程中存在的缺點及局限，如表達量不高、半衰期短以及穩(wěn)定性差等，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)長效、穩(wěn)定性好且降低生產(chǎn)成本的AT衍生物。迄今為止尚沒有具有半衰期顯著延長且可以高效穩(wěn)定表達的AT衍生物AT產(chǎn)生。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的就是克服現(xiàn)有AT制備及其在臨床應用過程中存在的缺點及局限，提供具有半衰期顯著延長且可以高效穩(wěn)定表達的AT衍生物。本發(fā)明ー個目的是提供一種重組ニ聚化hAT-L-vFc融合蛋白，具有與血漿來源的抗凝血酶III類似或更高的體外生物學活性，以及延長的體內(nèi)半衰期。本發(fā)明另ー個目的是提供一種采用哺乳動物細胞表達系統(tǒng)高效表達或生產(chǎn)這類重組ニ聚化hAT-L-vFc融合蛋白的方法。本發(fā)明另一目的提供了一種編碼上述重組ニ聚化hAT-L-vFc融合蛋白的DNA序列，進ー步地，該DNA序列具有SEQ ID NO :I、3或5所示的DNA序列。根據(jù)本發(fā)明的另一目的,提供ー種載體,該載體包含上述DNA序列。根據(jù)本發(fā)明的另一目的，提供ー種宿主細胞，該宿主細胞包含上述載體。進一歩。本發(fā)明另ー個目的涉及高效表達或生產(chǎn)這類重組ニ聚化hAT-L-vFc融合蛋白所采用的CHO衍生細胞株。本發(fā)明另ー個目的涉及含有重組ニ聚化hAT-L-vFc融合蛋白的藥物組合物。以下具體介紹本

發(fā)明內(nèi)容
融合蛋白及其制備方法本發(fā)明提供了一種重組ニ聚化hAT-L-vFc融合蛋白，其特征在于所述的融合蛋白從N端到C端依次含有人AT、肽接頭和人IgG Fe變體，并且所述的人IgG Fe變體選自下組⑴含有Pro331Ser突變的人IgG2絞鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)域；(ii)含有 Ser228Pro 和 Leu235Ala 突變的人 IgG4 絞鏈區(qū)、CH2 和 CH3 區(qū)域；(iii)含有 Leu234Val、Leu235Ala 和 Pro33ISer 突變的人 IgGl 絞鏈區(qū)、CH2 和 CH3區(qū)域。其中，IgG Fe變體是無裂解性的，且與天然IgG Fe相比含有氨基酸突變，較佳地，使用約2-20個氨基酸長度的、含有以下2種或多種氨基酸構(gòu)成的柔性肽接頭甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸和蘇氨酸，如本發(fā)明實施例中所公開的優(yōu)選序列為GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyG IyGlySerGlyGlyGlyGlySerο本發(fā)明所述的重組ニ聚化hAT-L-vFc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO :2、4或6所示，其成熟蛋白為去除了 hAT前導肽(I到38位氨基酸殘基)之后SEQ ID N0:2、4或6所示的氨基酸序列，其特征在于，人IgG Fe變體含有絞鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)域。其CH2區(qū)域在228、234、235和331位(由EU編號體系確定的位置)含有氨基酸突變，從而降低Fe的效應子功能。Fe 元件Fe元件來自免疫球蛋白的Fe區(qū)域，F(xiàn)e在消滅病原體的免疫防御中具重要作用。IgG的效應子功能由Fe介導通過兩種主要機制(I)與細胞表面Fe受體(Fe Y Rs)的結(jié)合，由吞噬作用或裂解作用或殺傷細胞通過抗體-依賴性細胞毒性(ADCC)途徑消化病原體，或
(2)與第一補體成分Cl的Clq部分的結(jié)合，引發(fā)依賴于補體的細胞毒性(CDC)途徑，從而裂解病原體。在四種人IgG同種型中，IgGl和IgG3能有效的結(jié)合Fe Y Rs。IgG4~FCYRi^々結(jié)合親和力比IgGl和IgG3的低ー個數(shù)量級，而IgG2與Fe Y Rs的結(jié)合低得難以測定。人IgGl和IgG3還能有效地結(jié)合Clq，并激活補體級聯(lián)反應。人IgG2對補體的固定很弱，而IgG4表現(xiàn)極端缺乏激活補體級聯(lián)的能力(Jefferis R等，Immunol Rev, 1998,163 :59-76)。對應用于人的治療而言，融合蛋白的Fe區(qū)域必須不會介導不良效應子功能而裂解或除去這些細胞。因此，hAT-L-Fc的Fe區(qū)域必須是非裂解性的，即在結(jié)合Fe Y Rs和Clq而觸發(fā)效應子功能方面，F(xiàn)e必須是無活性的。顯然，沒有ー種天然的IgG同種型適合產(chǎn)生hAT-L-Fc融合蛋白。為了得到非裂解性的Fe，必須使天然Fe區(qū)域中的一些氨基酸突變，以減少其效應子功能。通過比較人和鼠的IgG同種型的氨基酸序列，CH2區(qū)域氨基末端附近的Fe部分顯示在IgG Fe與Fe Y Rs的結(jié)合中起作用。已用基因工程抗體證明在234位至237位基序的重要性 Duncan AR 等，Nature, 1988, 332 :563-564)。按 Kabat 等人(Sequences of Proteinsof Immunological Interest,1991,桌 5 te, United States Department of Health andHuman Services)所述的EU編號體系將氨基酸殘基編號。在四種人IgG同種型中，IgGl和IgG3與Fe Y Rs的結(jié)合最好，且具有相同的序列Leu234-Leu-Gly-Gly237 (圖I僅顯示了IgGl)。在以低親和力與Fe Y Rs結(jié)合的IgG4中，其序列含有單個氨基酸取代，Phe取代234位的Leu。在不結(jié)合Fe Y Rs的IgG2中，兩個取代和一個缺失形成Val234_Ala_Gly237 (圖I)。為了減少Fe與Fe Y Rs的結(jié)合和ADCC活性，用Ala替代IgG4中的Leu235 (HutchinsJT 等，Proc Natl Acad Sci USA，1995，92 :11980-4)。IgGl 抗體內(nèi)的 Glu233-Leu_Leu235序列曾被用IgG2中的Pro233-Val-Ala235相關(guān)序列來替換。這種改變使IgGl變體在小鼠中失去了透過Fe Y R-介導除去祀點細胞的能力(Isaacs JD等，J Immunol, 1998,161 3862-9)。對于Fe Y R與Clq結(jié)合非常重要的第二部分位于人IgG的CH2區(qū)域羧基端附近(Duncan AR等，Nature, 1988, 332 :738-40)。在四種人IgG同種型中，這部分中僅有一個位點顯示取代用IgGU IgG2和IgG3中的Ala330和Pro331替代IgG4中的Ser330和Ser331 (圖I)。Ser330的存在不影響Fe Y R與Clq的結(jié)合。用Ser替代Pro331使IgGl失去了與Clq的結(jié)合親和力，而用Pro替代Ser331部分保留了 IgG4補體固定活性(Tao MH等，J Exp Med, 1993，178 :661-7 ；Xu Y 等，JBiol Chem, 1994，269 :3469-74)。肽接頭 連接肽的長度對融合蛋白的活性非常重要。已有人報道了促紅細胞生成素(EPO)衍生物(如ニ聚物)，與EPO単體相比，含有2個完整的EPO區(qū)域(相隔3到7個氨基酸肽接頭)的融合蛋白表現(xiàn)出減弱的活性(Qiu H等，J Biol Chem，1998，273 :11173-6)。然而，當這兩個EPO區(qū)域間的肽接頭的長度為17個氨基酸吋，ニ聚體EPO分子的體外和體內(nèi)生物活性明顯提高(Sytkowski AJ等，J Biol Chem，1999，274 :24773-8 ;美國專利No. 6，187，564)。這可能解釋為融合蛋白兩部分間增加的連接肽，使該分子的兩部分能分別行使其功能(Ashkenazi A 等，Curr Opin in Immunol, 1997,9 :195-200)。本發(fā)明人經(jīng)過長期而深入的研究，首次設(shè)計了一種獨到的絞鏈區(qū)肽接頭來降低空間位阻效應，可以制得hAT的C端與Fe連接的融合蛋白，中間有柔軟的肽接頭，如本發(fā)明實施例中所公開的優(yōu)選序列為 GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer。令人意外的是，此融合蛋白不僅不會導致hAT的功能喪失，反而能夠維持、甚至提高AT-Fc融合蛋白的生物活性。此外，本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，在hAT和人IgG Fe變體間添加的肽接頭以兩種方式提高hAT-L-Fc的體外生物活性⑴使Fe區(qū)域遠離hAT上的結(jié)構(gòu)域，和⑵使ー個hAT遠離另ー個hAT的結(jié)構(gòu)域，從而降低空間位阻效應。且人的IgG Fe變體在CH2區(qū)域在228、234、235,331位點含有氨基酸突變，從而降低Fe的效應子功能。本發(fā)明融合蛋白通常由生物合成的方法制備。根據(jù)本發(fā)明所述的核苷酸序列，本技術(shù)領(lǐng)域人員可方便地用各種已知方法制得本發(fā)明的編碼核酸。這些方法例如但不限于PCR, DNA人工合成等，具體的方法可參見J.薩姆布魯克，《分子克隆實驗指南》。作為本發(fā)明的一種實施方式，可通過分段合成核苷酸序列再進行重疊延伸PCR的方法來構(gòu)建本發(fā)明的編碼核酸序列。本發(fā)明還提供了ー種表達載體，包含編碼本發(fā)明的融合蛋白的序列以及與之操作性相連的表達調(diào)控序列。所述的“操作性相連”或“可操作地連于”指這樣ー種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠調(diào)節(jié)或控制同一線性DNA序列其它部分的活性。例如，如果啟動子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它就是可操作地連于編碼序列。表達載體可采用市售的例如但不限于pcDNA3、pIRES、pDR、pBK、pSP0RT等可用于真核細胞系統(tǒng)表達的載體。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)宿主細胞來選擇合適的表達載體。
根據(jù)已知空載表達載體的酶切圖譜，本領(lǐng)域技術(shù)人員可按照常規(guī)方法通過限制性酶剪切與拼接，將本發(fā)明的融合蛋白的編碼序列插入合適的限制性位點，制得本發(fā)明的重組表達載體。本發(fā)明還提供了表達本發(fā)明融合蛋白的宿主細胞，其中含有本發(fā)明的融合蛋白的編碼序列。所述的宿主細胞優(yōu)選的是真核細胞，例如但不限于CH0，C0S細胞，293細胞，RSF細胞等。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的細胞是CHO細胞，其可較佳地表達本發(fā)明的融合蛋白，可獲得結(jié)合活性良好，穩(wěn)定性良好的融合蛋白。用重組DNA制備本發(fā)明融合蛋白的方法，通常的步驟包括I)提供編碼融合蛋白的核酸序列；2)將I)的核酸序列插入到合適的表達載體，獲得重組表達載體；3)將2)的重組表達載體導入合適的宿主細胞；4)在適合表達的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化宿主細胞；5)收集上清液，并純化融合蛋白產(chǎn)物。將所述編碼序列導入宿主細胞可采用本領(lǐng)域的多種已知技術(shù)，例如但不限于磷酸鈣沉淀，原生質(zhì)體融合，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，電穿孔，微注射，反轉(zhuǎn)錄法，噬菌體轉(zhuǎn)導法，堿金屬離子法。有關(guān)宿主細胞的培養(yǎng)和表達可參見Olander RM Dev Biol Stand 1996 ;86 :338?？赏ㄟ^離心去除懸浮液中的細胞和殘渣，收集清液。可通過瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)進行鑒定?？蓪⑸鲜鲋苽浍@得的融合蛋白純化為基本均一的性質(zhì)，例如在SDS-PAGE電泳上呈單一條帯。例如，當重組蛋白為分泌表達時，可以采用商品化的超濾膜來分離所述蛋白，例如Millipore、Pellicon等公司產(chǎn)品，首先將表達上清濃縮。濃縮液可采用凝膠層析的方法進ー步加以純化，或采用離子交換層析的方法純化。例如陰離子交換層析(DEAE等)或陽離子交換層析。凝膠基質(zhì)可為瓊脂糖、葡聚糖、聚酰胺等常用于蛋白純化的基質(zhì)。Q-或SP-基團是較為理想的離子交換基團。最后，還可用羥基磷灰石吸附層析，金屬螯合層析，疏水相互作用層析和反相高效液相色譜(RP-HPLC)等方法對上述純化產(chǎn)物進ー步精制純化。上述所有純化步驟可利用不同的組合，最終使蛋白純度達到基本均一。可利用含有所述融合蛋白的特異性抗體、受體或配體的親和層析柱對表達的融合蛋白進行純化。根據(jù)所使用的親和柱的特性，可利用常規(guī)的方法，如高鹽緩沖液、改變PH等方法洗脫結(jié)合在親和柱上的融合性多肽。可選擇地，所述的融合蛋白的氨基端或羧基端還可含有ー個或多個多肽片段，作為蛋白標簽。任何合適的標簽都可以用于本發(fā)明。例如，所述的標簽可以是FLAG，HA, c-Myc，6-His或8-His等。這些標簽可用于對融合蛋白進行純化。在本發(fā)明的另一方面提供了ー種從哺乳動物細胞系如CHO-衍生的細胞系制備或生產(chǎn)這種重組融合蛋白的方法，其特征在于，包括步驟(a)將編碼重組ニ聚化hAT-L-vFc融合蛋白的DNA引入CHO細胞，生成CHO衍生的細胞系；(b)培養(yǎng)這種CHO衍生的細胞系，從而表達重組hAT-L-vFc融合蛋白；和 (c)純化步驟(b)表達的重組hAT-L-vFc融合蛋白。所述的編碼重組hAT-L-vFc融合蛋白的DNA具有SEQ ID NO :1、3或5所示的核苷酸序列。所述重組ニ聚化融合蛋白從N端到C端依次含有hAT、肽接頭和人IgG Fe變體(表示為hAT-L-vFc)，其特征為表現(xiàn)出很好的體外生物活性，即在摩爾基礎(chǔ)上，具有與hAT類似或更高的體外生物活性，以及更長的體內(nèi)半衰期；其中在MT和IgG Fe變體間存在含有約2-20個氨基酸的柔性肽接頭；和柔性肽接頭含有2個或多個氨基酸選自甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸和蘇氨酸的氨基酸；和其中人IgG Fe變體含有選自以下的人IgG的絞鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)域Pro331Ser 突變的人 IgG2 ；Ser228Pro 和 Leu235Ala 突變的人 IgG4 ;和 Leu234Val、Leu235Ala 和 Pro331Ser 突變的人 IgGl。所述的hAT-L-vFc融合蛋白在其生長培養(yǎng)基中每24小時內(nèi)，在表達超過30 (較佳地為50) μ g/106 (百萬)個細胞的條件下，培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的CHO-衍生的細胞系；其中重組融合蛋白在摩爾基礎(chǔ)上，具有與hAT類似的或更高的體外生物活性，更長的體內(nèi)半衰期。這些hAT-L-vFc融合蛋白具有延長的血清半衰期而無不良副作用，改善了藥物動 力學和藥效，從而降低了實現(xiàn)類似藥效所需的劑量和注射次數(shù)。此外,本發(fā)明表達產(chǎn)量高且IgG的融合蛋白可以通過Protein A親和層析得到高效便捷的純化。本發(fā)明ー優(yōu)選實施例中，高產(chǎn)量CHO-衍生的細胞株在IOOmL搖瓶中培養(yǎng)16天，其表達的重組融合蛋白累積產(chǎn)量為2g/L(圖6)。在細胞培養(yǎng)的第6天至第12天間，活細胞數(shù)目最多約為7 X IO6個/mL，在此條件下，分泌率測定為50 μ g/ΙΟ6個細胞/24小時。因此，本發(fā)明還提供了高效表達或生產(chǎn)這類重組ニ聚化hAT-L-vFc融合蛋白的CHO細胞系，其含有編碼所述融合蛋白的核酸序列。綜上，本發(fā)明所述的融合蛋白及其制備方法的優(yōu)點概括如下I. Fe與hAT偶聯(lián)形成的ニ聚體hAT-L-vFc融合蛋白，在CHO細胞中具有較高的表達量，比重組hAT在CHO細胞中表達量高2倍以上。2. ニ聚體hAT-L-vFc融合蛋白純化步驟簡單、高效便捷、可降低生產(chǎn)成本。3. ニ聚體hAT-L-vFc融合蛋白和具有和與血漿來源的hAT類似的體外生物學活性。(摩爾比活性)。4. ニ聚體hAT-L-vFc融合蛋白的循環(huán)半衰期延長，血清中藥物濃度波動的減少，安全性提高，耐受性的改善，降低注射頻率而提高患者的生活質(zhì)量。藥物組合物本發(fā)明提供了ー種藥物組合物，其特征在于，包括藥學上可接受的載體或賦形劑或稀釋劑，以及有效量的本發(fā)明所述的hAT-L-vFc融合蛋白。本發(fā)明所述的hAT-L-vFc融合蛋白一般地應用于AT先天性或獲得性缺乏癥患者的出血性疾病的預防和治療以及血友病A或B患者的自發(fā)或手術(shù)性出血的預防和治療或其他相關(guān)的出血性疾病。進ー步講，本發(fā)明提供了ー種藥物組合物，它含有有效量(如O. 000001-90wt% ；較佳的O. l-50wt% ;更佳的,5-40wt% )的本發(fā)明的融合蛋白，以及藥學上可接受的載體。通常，可將有效量的本發(fā)明融合蛋白配制于無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中PH通常約為5-8，較佳地，pH約為6-8。術(shù)語“有效量”或“有效劑量”是指可對人和/或動物產(chǎn)生功能或活性的且可被人和/或動物所接受的量?！八帉W上可接受的”的成分是適用于人和/或哺乳動物而無過度不良副反應(如毒性、刺激和變態(tài)反應)的，即具有合理的效益/風險比的物質(zhì)。術(shù)語“藥學上可接受的載體”指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。藥學上可接受的載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、こ醇、及其組合。通常藥物制劑應與給藥方式相匹配，本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進行制備。所述的藥物組合物宜在無菌條件下制造。活性成分的給藥量是治療有效量。本發(fā)明的藥物制劑還可制成緩釋制劑。本發(fā)明所述的融合蛋白的有效量可隨給藥的模式和待治療的疾病的嚴重程度等而變化。優(yōu)選的有效量的選擇可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)各種因素來確定(例如通過臨床試驗)。所述的因素包括但不限于所述的融合蛋白的藥代動力學參數(shù)例如生物利用率、代謝、半衰期等；患者所要治療的疾病的嚴重程度、患者的體重、患者的免疫狀況、給藥 的途徑等。應理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。


圖I顯示了人IgGl、IgG2、IgG4和它們變體的絞鏈區(qū)和CH2區(qū)域的氨基酸序列的比對。比較這三部分氨基酸序列氨基酸區(qū)域228、234-237和330-331。這些變體的氨基酸突變以粗斜體顯示。氨基酸殘基編號是根據(jù)EU編號體系標定。圖2顯示了在PCDNA3表達載體內(nèi)NheI-MluI片段的hAT-L_vFcY2的核苷酸序列及推導的氨基酸序列。人AT由信號肽(1-38)、成熟AT蛋白(39-444)構(gòu)成。成熟的融合蛋白含有人 AT (39-444)、肽接頭(445-460)和 Fcy2 變體(461-683)。圖3顯示了在PCDNA3表達載體內(nèi)NheI-MluI片段的hAT-L_vFcY4的核苷酸序列及推導的氨基酸序列。人AT由信號肽(1-38)、成熟AT蛋白(39-444)構(gòu)成。成熟的融合蛋白含有人 AT (39-444)、肽接頭(445-460)和 Fcy4 變體(461-689)。圖4顯示了在PCDNA3表達載體內(nèi)NheI-MluI片段的hAT-L_vFcYl的核苷酸序列及推導的氨基酸序列。人AT由信號肽(1-38)、成熟AT蛋白(39-444)構(gòu)成。成熟的融合蛋白含有人 AT (39-444)、肽接頭(445-460)和 Fcy1 變體(461-687)。圖5顯示了所構(gòu)建hAT-L-vFc融合蛋白基因的真核表達質(zhì)粒的基因圖譜。該表達質(zhì)粒全長9740bp，含有10個主要基因片斷，包括LhCMV啟動子；2.目標基因hAT-L-vFc ；
3.EMCV IRES ；4. mDHFR篩選基因；5. bGH中止序列；6. SV40啟動子；7.卡拉霉素抗性基因；
8.SV40中止序列；9. ColEl復制子；10.氨芐青霉素抗性基因。圖6顯示了在300ml搖瓶內(nèi)細胞株的生長及其分泌hAT-L-vFc融合蛋白的濃度趨勢曲線圖。圖7顯示了 hAT-L-vFc純化蛋白的體外活性。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例，進ー步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如 Sambrook 等人，分子克隆實驗室手冊' (New York Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。實施例I.構(gòu)建編碼hAT-L-vFc Y融合蛋白的基因人AT基因購自Thermo-Fisher公司。通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增目的基因，為了便于克隆，將引入限制性酶內(nèi)切位點NheI的寡核苷酸序列TCAGATCCGCTAGCCGCCCACCATGGTCTCCCAGGCCCTCAGGCTC用作5’引物；將引入BamHI限制性酶內(nèi)切位點的寡核苷酸序列GTCGAGGATCCGGGAAATGGGGCTCGCAGGAGGAC 用作 3’ 引物。由 DNA 測序驗證人 AT 基因序列。柔性肽Linker 與人 IgG Fe 區(qū)域 Fcy2 變體 vFcy2 (Pro331Ser 突變)、Fcy4 變體 vFcY4(Ser228Pro 和 Leu235Ala 突變)、Fcyl 變體 vFcYl (Leu234Val、Leu235Ala 和Pro331SSer突變)的融合基因由人工合成的方法獲得，所合成的片段5’和3’端各有一 個限制性酶內(nèi)切位點，分別為BamHI和EcoRI。由DNA測序驗證L_vFcY基因序列。將獲得的DNA片段經(jīng)插入到哺乳動物細胞表達載體P⑶NA3 (Invitrogen)的BamHI和EcoRI位點，得到P⑶NA3-L-VFC Y質(zhì)粒。將獲得的AT片段經(jīng)NheI/BamHI雙酶切后，插入到質(zhì)粒P⑶NA3-L-vFc Y的相應酶切位點間，得到了融合基因表達質(zhì)粒p⑶NA3-hAT_L-VFcY，該質(zhì)粒含巨細胞病毒早期啟動子，它是哺乳動物細胞高水平表達外源基因所需的增強子。該質(zhì)粒還含有選擇性標記物，從而在細菌中可以具有氨芐青霉素抗性，而在哺乳動物細胞中可以具有G418抗性。另外，當宿主細胞是DHFR基因表達缺陷型吋，P⑶NA3表達載體含有小鼠的ニ氫葉酸還原酶(DHFR)基因，從而存在氨甲蝶呤(MTX)時能共擴增hAT-L-vFc Y融合基因和DHFR基因(美國專利4，399，216)。在人AT和Fe部分間存在的(且彼此化學結(jié)合)的肽接頭(較佳地為柔性接頭)増加了 AT區(qū)域的柔性且提高了它的生物活性。對本發(fā)明而言，優(yōu)選的是長度為約20個或更少(但不能少于2個)氨基酸的肽接頭。宜使用含有或由2個或更多選自以下氨基酸構(gòu)成的肽接頭甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸和蘇氨酸。一種肽接頭的例子含有Gly-Ser肽構(gòu)件，如GlyGlyGlyGlySer0圖2、圖3、圖4分別顯示了含三種Fcy變體融合基因的核苷酸序列及推導的氨基酸序列，它們共同含有編碼人AT、16-氨基酸肽接頭(GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer)和各自含有編碼 Fcy2 變體 vFcy2 (hAT_L_vFc y 2)、Fcy4 變體vFcy4(hAT-L-vFc y 4)或 Fcy1 變體 vFcYl (hAT_L_vFc γ )的序列。實施例2.融合蛋白在轉(zhuǎn)染細胞系中的表達將重組的表達載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入哺乳動物宿主細胞系，以表達hAT-L-vFcY融合蛋白。為了穩(wěn)定高水平的表達，優(yōu)選的宿主細胞系是DHFR酶缺陷型CHO-細胞(美國專利No. 4，818，679)。一種優(yōu)選的轉(zhuǎn)染方法是電穿孔，也可以使用其它方法，包括磷酸鈣共沉降、脂轉(zhuǎn)染和原生質(zhì)融合。在電穿孔中，用設(shè)置為250V電場和960 μ Fd電容的Gene PulserElectroporator (Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA),在比色杯內(nèi)的 2 5X IO7 個細胞中加入10 μ g用PvuI線性化的質(zhì)粒DNA。在轉(zhuǎn)染兩天后，將培養(yǎng)基改成含O. 4mg/mL G418的生長培養(yǎng)基。用抗人IgG Fe的ELISA分析方法，篩選對選擇用藥具有抗性的轉(zhuǎn)染子。也可用抗AT分析的ELISA進行融合蛋白表達量的定量。通過極限稀釋96孔組織培養(yǎng)板，亞克隆產(chǎn)生高水平Fe融合蛋白的孔。
為了實現(xiàn)融合蛋白較高水平的表達，宜用受MTX藥物抑制的DHFR基因進行共擴増。在含有遞增濃度MTX的生長培養(yǎng)基中，用DHFR基因共擴增轉(zhuǎn)染的融合蛋白基因。用極限稀釋的亞克隆能在高達I μ g/mL MTX培養(yǎng)基中生長的轉(zhuǎn)染子。測定分泌率對亞克隆的細胞系進行進ー步的分析。分泌率水平超過約30 (較佳地約50) μ g/106(即百萬)個細胞/24小時的細胞系適應使用無血清生長培養(yǎng)基的懸浮培養(yǎng)。然后用條件培養(yǎng)基純化融合蛋白。
實施例3.融合蛋白的生產(chǎn)實施例2優(yōu)選得到的高產(chǎn)量細胞株首先在培養(yǎng)皿中進行無血清馴化培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)移到搖瓶中進行懸浮馴化培養(yǎng)。待細胞適應這些培養(yǎng)條件后，然后在300ml搖瓶中進行補料添加培養(yǎng)。上述CHO衍生的細胞株在IOOml體積的搖瓶中培養(yǎng)16天，其表達的重組融合蛋白累積產(chǎn)量為2g/L(圖6)。在細胞培養(yǎng)的第6天至第12天間，活細胞數(shù)目最多約為7 X IO6個/mL。為了得到更多的hAT-L-vFc重組蛋白，也可以選用2000ml搖瓶培養(yǎng)。實施例4.融合蛋白的純化與定性用IN NaOH將含有實施例3的融合蛋白的條件培養(yǎng)基滴定到pH 7 8，然后用O. 45微米的硝酸纖維素過濾器過濾。將濾液加樣到磷酸鹽緩沖液鹽水(PBS)平衡的ProsepA柱上。待融合蛋白結(jié)合于Prosep A后,棄去流出的組分。用PBS洗漆該柱,直到2801*111處的00值低于0.01。然后用O. IM pH為3. 75的檸檬酸緩沖液洗脫結(jié)合的融合蛋白。用O. 4體積的IM K2HPO4中和，合并含有純化蛋白的組分，并用PBS透析。然后用O. 22微米的硝酸纖維素過濾器過濾，并存儲在_70°C。在還原條件下，由SDS-PAGE測得純化的血漿來源MT蛋白分子量在60kDa。純化的hAT-L-vFcγ蛋白遷移至約85kDa。用BSA作為標準，通過BCA蛋白質(zhì)分析定量該融合蛋白。實施例5.體外活性檢測本發(fā)明采用HYPHEN BioMed 公司生產(chǎn)的 BIOPHEN Antithrombin 5 試劑盒(Ref :A221105)定量測定所制備的hAT-L-vFc融合蛋白在肝素協(xié)同作用下的體外生物學活性。該試劑盒采用自動或手動操作來檢測其抗Xa因子活性。AT是人體血漿中的ー種重要的生理性抗凝血酶，它通過抑制絲氨酸蛋白酶類凝血因子的活性，尤其是凝血酶、凝血因子Xa和因子IXa，以調(diào)節(jié)血液凝血過程和阻止血栓的形成。當與肝素形成復合物后，使AT更快、更強的抑制凝血酶的活性。該試劑盒是基于在肝素協(xié)同作用下AT對一定量的(過量)凝血因子Xa的抑制作用來動態(tài)檢測AT的活性大小。反應體系中凝血因子Xa對其特異性顯色底物的酰胺分解作用(amydolitic activity)使底物裂解并產(chǎn)生PNA，而所產(chǎn)生pNA的量與體系中AT的量成反比，通過測定所釋放pNA的量可計算出體系中因子Xa的殘留量。測量波長為405nm，反應體系溫度須維持在37°C。圖7顯示了與血漿來源的hAT或純化的實施例4的重組hAT-L-vFc蛋白的摩爾濃度(nM)與其參比活性的對應關(guān)系。在上述條件下，hAT的IC50值約為29. 2±2. 2nM，而經(jīng)純化的實施例4 的 hAT-L-vFc 蛋白約為 7. 24±O. 39nM。實施例6.融合蛋白的藥代動力學測定SD大鼠單劑量(10mg/Kg)尾靜脈注射hAT-L-vFc樣品，選取不同時間點抽取SD大鼠的血液樣品，肝素抗凝，離心后的上清液用ELISA方法測定血漿中的融合蛋白含量。用ELISA測定時，用羊抗人的Fe的多抗進行包埋、辣根過氧化物酶標記的鼠抗人hAT的單抗來檢測。實施例4中純化hAT-L-vFc樣品的血漿半衰期約為180分鐘，而美國GTC公司用轉(zhuǎn)基因山羊生產(chǎn)的重組hAT藥品ATryn同劑量血漿半衰期約為40分鐘，所以本發(fā)明中重組hAT-L-vFc體內(nèi)半衰期大幅度延長。在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每ー篇文獻被単獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以誒對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種重組ニ聚化hAT-L-vFc融合蛋白，其特征在于所述的融合蛋白從N端到C端依次含有人AT、肽接頭和人IgG Fe變體， 并且所述的人IgG Fe變體選自下組 (i)含有Pro331Ser突變的人IgG2絞鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)域； (ii)含有Ser228Pro和Leu235Ala突變的人IgG4絞鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)域； (iii)含有Leu234Val、Leu235Ala 和 Pro331Ser 突變的人 IgGl 絞鏈區(qū)、CH2 和 CH3 區(qū)域。
2.如權(quán)利要求I所述的重組hAT-L-vFc融合蛋白，其特征在于，所述的肽接頭含有2-20個氨基酸，所述肽接頭存在于人AT和人IgG Fe變體之間；且所述的肽接頭含有兩個或更多選自甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸和蘇氨酸的氨基酸，優(yōu)選序列為GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer0
3.如權(quán)利要求I所述的重組hAT-L-vFc融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO :2、4或6所示。
4.如權(quán)利要求I所述的重組hAT-L-vFc融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列是去除了 I到38位氨基酸殘基的hAT前導肽之后的SEQ ID NO :2、4或6所示的氨基酸序列。
5.如權(quán)利要求I所述的重組hAT-L-vFc融合蛋白，其特征在于，所述的hAT_L_vFc融合蛋白在摩爾基礎(chǔ)上，具有與rhAT類似或更高的體外生物活性、更長的半衰期。
6.一種編碼根據(jù)權(quán)利要求1-5任意一項權(quán)利要求所述的重組ニ聚化hAT-L-vFc融合蛋白的DNA序列,特征在于該DNA序列具有SEQ ID NO :1、3或5所示的DNA序列。
7.ー種載體，該載體包含具有SEQ ID NO :1、3或5所示的DNA序列。
8.—種CHO衍生細胞株，其特征在于，其含有編碼hAT-L-vFc融合蛋白的DNA序列，并且所述的DNA序列具有SEQ ID NO :1、3或5所示的核苷酸序列，所述細胞株在其生長培養(yǎng)基中在每24小時內(nèi)，產(chǎn)生超過50 μ g/百萬個細胞的如權(quán)利要求1-5任一所述的重組hAT-L-vFc融合蛋白。
9.ー種制備權(quán)利要求I所述重組hAT-L-vFc融合蛋白的方法，其特征在于，包括步驟 (a)將編碼重組ニ聚化hAT-L-vFc融合蛋白的DNA引入CHO細胞，生成CHO衍生的細胞系; (b)培養(yǎng)這種CHO衍生的細胞系，從而表達重組hAT-L-vFc融合蛋白；和 (C)純化步驟(b)表達的重組hAT-L-vFc融合蛋白， 所述的編碼重組hAT-L-vFc融合蛋白的DNA具有SEQ ID NO :1、3或5所示的核苷酸序列， 所述的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO :2、4或6所示。
10.ー種藥物組合物，其特征在于，包括藥學上可接受的載體或賦形劑或稀釋劑，以及有效量的權(quán)利要求1-5任意一項權(quán)利要求所述的hAT-L-vFc融合蛋白。
11.權(quán)利要求10的藥物組合物在制備預防和治療AT先天性或獲得性缺乏癥患者的出血性疾病以及血友病A或B患者的自發(fā)或手術(shù)性出血疾病藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種重組二聚化抗凝血酶III-Fc融合蛋白，具有與血漿來源的抗凝血酶III類似或更高的體外生物學活性，以及延長的體內(nèi)半衰期。本發(fā)明提供的這種融合蛋白含有人抗凝血酶III(hAT)、約20個或更少氨基酸的柔性肽接頭(L)、和人IgG Fc變體(vFc)(表示為hAT-L-vFc)(Fc)。這種Fc變體無裂解性，且顯示極小的不良Fc-介導的負作用。這類hAT-L-vFc融合蛋白表現(xiàn)出血清半衰期延長，且生物活性增加，從而改善藥物動力學和藥效。本發(fā)明還公開了一種采用哺乳動物細胞高效表達或生產(chǎn)這類重組融合蛋白的方法。
文檔編號C07K19/00GK102690354SQ20121014686
公開日2012年9月26日 申請日期2012年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月14日
發(fā)明者周若蕓, 孫乃超, 李強 申請人:安源生物科技(上海)有限公司