專利名稱：單分散聚甲基丙烯酸酯混合型陽離子交換層析介質在萬古霉素柱層析純化中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及抗生素純化領域，具體涉及萬古霉素的柱層析純化領域。
背景技術：
萬古霉素是由放線菌屬微生物菌株產生的一種糖肽類抗生素，其可抑制細菌細胞壁合成以及改變細胞膜的滲透性，對抑制革蘭氏陽性菌如葡萄球菌、鏈球菌、梭狀芽胞桿菌感染引起的疾病有明顯療效，同時可用于治療對青霉素過敏或使用青霉素或頭孢菌素沒有效果的患者。離子交換層析介質是是生物大分子分離純化中最常用的方法之一，廣泛應用于氨基酸、多肽、蛋白質、抗生素以及天然產物的分離純化。其主要由三部分組成，第一部分是母體結構，即載體；第二部分是固定在母體結構上的帶電功能基團；第三部分是與功能基團帶相反電荷的離子對。與傳統(tǒng)的離子交換樹脂相比，用于生物大分子分離的離子交換層析介質除了具備高的離子密度、具有一定的耐壓、耐酸堿性能外，還要求母體結構足夠親水， 使其具有良好的生物相容性，并且要具有均勻的粒徑。目前用于生物大分子分離的介質大多數(shù)不具備所有的以上特點，在實際應用中具有缺陷。Aya Ohkubo等(Journal of Chromatography A, 1997, 779 Il3-I22)使用娃膠為基質，鍵合強陽離子基團，合成強陽離子層析介質用于小分子的分離純化能達到很好的分離效果。但是硅膠基質不能耐堿性，這限制了它的應用范圍。美國專利7018814公開了ー種鹽酸萬古霉素的純化方法，該方法以強陽離子交換樹脂為分離介質，以氫氧化銨水溶液為流動相對萬古霉素進行粗提，回收率為88%。該方法使用的離子交換樹脂基質粒徑為50-200 u M的不均勻微球，不能滿足精細純化要求。中國專利200710187300. 5公開了 ー種用葡聚糖基質的S印hadex CM-25 (GE Healthcare)分離純化萬古霉素的方法，該方法以碳酸氫銨水溶液為流動相，能得到95%以上的純度，70%以上的回收率。但是該方法中使用的分離介質為葡聚糖基質，其在不同鹽濃度下床體積會發(fā)生非常明顯的變化，同時葡聚糖基質較軟，不耐高壓，這在快速的分離上有很大的局限。Capto MMC(GE Healthcare)是ー種復合型陽離子交換層析介質，由于其表面鍵合了包含疏水基團、離子交換基團以及氫鍵的復合配基，因此其具有不同于傳統(tǒng)生物分離離子交換層析介質的選擇性，以及更高的動態(tài)載量。但是，該介質使用的基質為瓊脂糖，其耐高壓性能較低，在高流速的操作下有一定的缺陷。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是針對上述問題，提供一種能達到高純度和高回收率，而且柱層析不會隨著鹽濃度和流速的變化而發(fā)生變化，層析填料可耐高壓和高流速、并具備高載量的層析介質。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術方案是，單分散聚甲基丙烯酸酯混合型陽離子交換層析介質在萬古霉素柱層析純化中的應用，采用單分散聚甲基丙烯酸酯混合型陽離子交換層析介質為填料的色譜柱進行柱層析。優(yōu)選的，用所述單分散聚甲基丙烯酸酯混合型陽離子交換層析介質作為色譜柱的固定相，將含萬古霉素的樣品上樣在該色譜柱上，用鹽的水溶液作為流動相洗脫吸附在填料上的萬古霉素。優(yōu)選的，所述鹽的水溶液是NH4HCO3的水溶液。優(yōu)選的，所述單分散聚甲基丙烯酸酯基質混合型陽離子交換層析介質是由蘇州納微生物科技有限公司生產，產品型號為Uni MSP-50S。Uni MSP-50S是在親水性的聚甲基丙烯酸基質表面鍵合上疏水基團和離子交換基團，其具備疏水和離子交換的雙重作用，因此做為柱層析填料時相比傳統(tǒng)離子交換層析介質具有更好的選擇性，而且填料床的體積不會隨流動相濃度發(fā)生變化，在純化萬古霉素吋， 只需要低鹽濃度鹽水溶液就可將吸附在填料上的萬古霉素洗脫下來，達到高純度及高回收率，同時，強耐反壓性能使其能夠在高流速下操作。本發(fā)明的有益效果是單分散聚甲基丙烯酸酯混合型陽離子交換層析介質Uni MSP-50S不但利于以水溶液做流動相分離純化萬古霉素粗品，達到高純度和高回收率，而且柱層析不會隨著鹽濃度和流速的變化而發(fā)生變化，層析填料可耐高壓和高流速、并具備高載量，同時可使用低鹽濃度將吸附在層析柱上的萬古霉素洗脫下來。


圖I是實施例I中使用的蘇州納微生物科技有限公司單分散聚甲基丙烯酸酯混合型陽離子交換層析介質Uni MSP-50S掃描電鏡照片。圖2是實施例I中提純前的萬古霉素粗品的HPLC分析圖譜。圖3是實施例I中提純后的萬古霉素的HPLC分析圖譜。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進ー步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的內容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附后權利要求書限定的范圍。實施例1，
采用10X220mm、一端可調節(jié)的玻璃色譜柱，蘇州納微生物科技有限公司生產的單分散聚甲基丙烯酸酯混合型陽離子交換層析介質Uni MSP-50S為層析填料裝填層析柱，裝柱高度19cm，裝柱體積14. 9mL，先用3. OCV超純水以I. 5mL/min的流速平衡色譜柱。萬古霉素粗品(純度89%)用超純水溶解，調節(jié)pH為3. 2，粗品濃度37. 5mg/mL,上樣體積15mL，色譜柱載量為37. 8mg/mL。上樣后，先用超純水沖洗3. 0BV,然后用0. 33% NH4HCO3洗脫4. OCV以除去雜質，最后用0. 45% NH4HCO3洗脫7. OCV井分管收集洗脫液。收集液經檢測，得到色譜純度在95%以上的回收率約78%，色譜純度在97%以上的回收率約61. 5%。實施例2，采用10X220mm、一端可調節(jié)的玻璃色譜柱，蘇州納微生物科技有限公司生產的單分散聚甲基丙烯酸酯混合型陽離子交換層析介質Uni MSP-50S為層析填料裝填層析柱，裝柱高度19cm，裝柱體積14. 9mL，先用3. OCV超純水以I. 5mL/min的流速平衡色譜柱。萬古霉素粗品(純度89%)用超純水溶解，調節(jié)pH為3. 2，粗品濃度37. 5mg/mL,上樣體積22. OmL,色譜柱載量為55. 4mg/mL。上樣后，先用超純水沖洗3. 0BV，然后用0. 33% NH4HCO3洗脫4. OCV 以除去雜質，最后用0. 45% NH4HCO3洗脫7. OCV井分管收集洗脫液。收集液經檢測，得到色譜純度95%以上的回收率約76%，色譜純度在97%以上的回收率約60. 1%。實施例3，
米用 10X220mm、一端可調節(jié)的玻璃色譜柱，GE CM-Sephadex C-25 (GE Healthcare, 粒徑范圍40-120微米)為層析填料裝填層析柱，裝柱高度20. 0cm，裝柱體積15. 7mL，先用
5.OCV超純水以I. OmL/min的流速平衡色譜柱。萬古霉素粗品(純度89%)用超純水溶解,調節(jié)pH為3. 2，粗品濃度37. 5mg/mL,上樣體積23. 2mL,色譜柱載量為55. 4mg/mL。上樣后，先用超純水沖洗5. OBV,然后用0. 4% NH4HCO3洗脫4. OCV以除去雜質，最后用4. 0% NH4HCO3洗脫6. OCV井分管收集洗脫液。收集液經檢測，得到色譜純度95%以上的回收率約75%，色譜純度在97%以上的回收率約62. 5%。實施例4，
測試鹽溶液對填料體積的影響
采用10 X 250mm、一端可調玻璃柱，Uni MSP-50S (蘇州納微生物科技有限公司)為層析填料，裝柱完畢后用3CV超純水以2mL/min流速平衡色譜柱，測量柱床高度為21. Ocm，體積為16. 5mL，用3CV 3% NaCl溶液以2mL/min流速沖洗色譜柱，沖洗結束后測量柱床高度為 21. Ocm,體積為16. 5mL,體積與原體積相比無變化。實施例5，
測試鹽溶液對填料體積的影響
米用 10 X 250mm — 端可調玻璃柱，CM Sephadex C-25 (GE Healthcare,粒徑范圍 40-120微米)為層析填料，裝柱完畢后用3CV超純水以2mL/min流速平衡色譜柱，測量柱床高度為22. Ocm，體積為17. 3mL，用3CV 1% NaCl溶液以2mL/min流速沖洗色譜柱，沖洗結束后測量柱床高度為18. 8cm，體積為14. 8mL，體積比原體積縮小14. 5% ;繼續(xù)用3CV 2% NaCl 溶液以2mL/min流速沖洗色譜柱，沖洗結束后測量柱床高度為17. 3cm,體積為13. 6mL,體積比原體積縮小21. 4% ;繼續(xù)用3CV 3% NaCl溶液以2mL/min流速沖洗色譜柱，沖洗結束后測量柱床高度為16. 2cm，體積為12. 7mL，體積比原體積縮小26. 4%。實施例6，
測試壓力對填料的影響
采用10 X 250mm—端可調玻璃柱，Uni MSP-50S (蘇州納微生物科技有限公司)為層析填料，裝柱完畢后用3CV超純水以2mL/min流速平衡色譜柱，測量柱床高度為21.0cm， 體積為16. 5mL，調節(jié)流速使壓カ增高至0. 3MPa，繼續(xù)沖洗3CV超純水，測量柱床高度為 21. Ocm,體積為16. 5mL,體積與原體積相比無變化。實施例7，
測試壓カ對填料影響
米用 10 X 250mm — 端可調玻璃柱，CM Sephadex C-25 (GE Healthcare,粒徑范圍40-120微米)為層析填料，裝柱完畢后用3CV超純水以2mL/min流速平衡色譜柱，測量柱床高度為21. Ocm,體積為16. 5mL，調節(jié)流速使壓カ增高至0. 3MPa,繼續(xù)沖洗3CV超純水，測量柱床高度為18. 6cm,體積為16. 5mL,體積減小11. 4%。將實施例一、ニ、四、六和實施例三、五、七性能進行對比，比較結果見表I。表I 介質Uni MPS-50S與介質CM Sephadex C-25比較結果表
權利要求
1.單分散聚甲基丙烯酸酯混合型陽離子交換層析介質在萬古霉素柱層析純化中的應用，其特征在干，采用單分散聚甲基丙烯酸酯混合型陽離子交換層析介質為填料的色譜柱進行柱層析。
2.如權利要求I所述的單分散聚甲基丙烯酸酯混合型陽離子交換層析介質在萬古霉素柱層析純化中的應用，其特征在干，用所述單分散聚甲基丙烯酸酯混合型陽離子交換層析介質作為色譜柱的固定相，將含萬古霉素的樣品上樣在該色譜柱上，用鹽的水溶液作為流動相洗脫吸附在填料上的萬古霉素。
3.如權利要求2所述的單分散聚甲基丙烯酸酯混合型陽離子交換層析介質在萬古霉素柱層析純化中的應用，其特征在于，所述鹽的水溶液是NH4HCO3的水溶液。
全文摘要
本發(fā)明公開了單分散聚甲基丙烯酸酯混合型陽離子交換層析介質在萬古霉素柱層析純化中的應用，采用單分散聚甲基丙烯酸酯混合型陽離子交換層析介質為填料的色譜柱進行柱層析。本發(fā)明不但利于以水溶液做流動相分離純化萬古霉素粗品，達到高純度和高回收率，而且柱層析不會隨著鹽濃度和流速的變化而發(fā)生變化，層析填料可耐高壓和高流速、并具備高載量，同時可使用低鹽濃度將吸附在層析柱上的萬古霉素洗脫下來。
文檔編號C07K1/18GK102603872SQ20121010359
公開日2012年7月25日 申請日期2012年4月11日 優(yōu)先權日2012年4月11日
發(fā)明者吳俊成, 林生躍, 江必旺, 肖書霞, 陳榮姬 申請人:蘇州納微生物科技有限公司