專利名稱：拮抗性抗il-7受體抗體及方法
拮抗性抗IL-7受體抗體及方法發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及抗體，如全長抗體或其抗原結(jié)合部分，其拮抗白細(xì)胞介素-7受體 (IL-7R)的活性，包括其與IL-7相互作用。本發(fā)明進(jìn)一步涉及包含IL-7R拮抗劑如拮抗性 IL-7R抗體的組合物，及涉及使用IL-7R拮抗劑作為藥物的方法。所述IL-7R拮抗劑可用于預(yù)防和/或治療2型糖尿病、移植物抗宿主疾病(GVHD)及自身免疫疾病，包括I型糖尿病、 多發(fā)性硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及狼瘡。
發(fā)明背景
IL-7R復(fù)合物是異源二聚體受體，由IL-7Ra鏈(IL_7Ra)和共有Y鏈U c) 組成(Mazzucchelli et al. , Nat Rev Immunol.，2007，7:144 - 54)。IL-7R 由白細(xì)胞介素-7(IL-7)結(jié)合，這是T和B淋巴細(xì)胞的發(fā)育和穩(wěn)態(tài)維持所必需的細(xì)胞因子(Fry et al.，J Immunol. , 2005, 174:6571 - 6)。IL-7與IL-7R的結(jié)合激活調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞存活、葡萄糖攝取、 增殖和分化的多個(gè)途徑。
IL-7R在樹突細(xì)胞和單核細(xì)胞上均表達(dá)，且似乎在多個(gè)造血譜系中起作用 (Reche PA, et al. , J Immunol. , 2001, 167:336 - 43) 在樹突細(xì)胞中，IL-7R 起免疫調(diào)節(jié)作用，而淋巴細(xì)胞需要IL-7R信號傳導(dǎo)用于存活、增殖和分化。Jak-Stat和PI3K Akt 途徑均通過 IL-7 與 IL-7R 的結(jié)合而被激活(Jian et al. , Cytokine Growth Factor Rev.，2005，16:513-533)。這些途徑包括信號串?dāng)_、共有相互作用結(jié)構(gòu)域、反饋環(huán)、整合的基因調(diào)節(jié)、多聚化及配體競爭。IL-7信號傳導(dǎo)的一些靶，包括Bcl2和Pyk2，有助于細(xì)胞存活。 其它靶，如PI3激酶、src家族激酶(Ick和fyn)以及STAT5，有助于細(xì)胞增殖。轉(zhuǎn)錄因子 STAT5有助于B和T細(xì)胞中多個(gè)不同下游基因的激活以及通過改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)而可有助于 VDJ重組。由IL-7誘導(dǎo)的細(xì)胞存活和細(xì)胞增殖信號組合誘導(dǎo)正常T細(xì)胞發(fā)育。關(guān)于復(fù)雜的IL-7信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)及其與免疫系統(tǒng)細(xì)胞中其它信號傳導(dǎo)級聯(lián)的相互作用的詳細(xì)描述還未充分闡明。
從本領(lǐng)域及在本發(fā)明之前可獲得的信息中，仍不明了在血液循環(huán)中導(dǎo)入拮抗性 IL-7R抗體以選擇性拮抗IL-7R是否能有效治療2型糖尿病、I型糖尿病、GVHD、狼瘡和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，以及如果如此，IL-7R抗體的什么性質(zhì)是這種體內(nèi)有效性所需的。
發(fā)明概述
本發(fā)明提供了與IL-7R選擇性相互作用及抑制其功能的拮抗性抗體。本發(fā)明首次證實(shí)某些拮抗性IL-7R抗體在體內(nèi)有效治療I型糖尿病、2型糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、GVHD 和狼瘡。
在一些實(shí)施方案中，提供了與IL-7R選擇性相互作用及抑制其功能的拮抗性抗體。在一些實(shí)施方案中，所述抗體特異性結(jié)合IL-7R并且包含與選自C1GM、C2M 3、P3A9、 P4B3、P2D2、P2Ell、HAL403a和HAL403b的單克隆抗體競爭結(jié)合IL-7R的抗原結(jié)合區(qū)。在一些實(shí)施方案中，所述抗體包含具有SEQ ID NO: 42或SEQ ID NO: 43所示氨基酸序列的多肽。 在其它實(shí)施方案中，所述抗體特異性結(jié)合IL-7R及識別與由選自C1GM、C2M3、P3A9、P4B3、 P2D2、P2E11、HAL403a和HAL403b的單克隆抗體識別的IL-7R表位重疊的表位。在一些實(shí)施方案中，所述抗體結(jié)合包含白細(xì)胞介素_7受體a (IL-7Ra)的殘基I82、K84、K100、T105 和Υ192的表位。在一些實(shí)施方案中，所述表位進(jìn)一步包含選自人類IL-7R a的殘基D190、 H191和K194的一或多個(gè)額外殘基。
在一些實(shí)施方案中，所述IL-7R是人類IL-7R。
在一些實(shí)施方案中，所述抗體特異性結(jié)合白細(xì)胞介素-7受體a (IL-7Ra)并且包含具有氨基酸序列X1X2VMH的重鏈可變區(qū)(VH)互補(bǔ)決定區(qū)I (⑶Rl)，其中X1是D或N，X2是 S 或 Y(SEQ ID NO:50);具有氨基酸序列 X1X2X3X4X5Gx6X7TyyADSVKG 的 VH CDR2，其中乂1是1^ 或A，X2是V或I，X3是G或S，X4是W或G，X5是D或S，X6是F、G或S，X7是F、A或S (SEQ ID N0:51);以及具有氨基酸序列X1X2X3X4X5X6X7X8的VH CDR3，其中X1是Q或D，X2是G或I， X3 是 D 或 S，X4 是 Y 或 G，X5 是 M、V 或 G，X6 是 G 或 F，X7 是 N、D 或 M，X8 是 N、Y 或 D (SEQ ID NO: 52);具有氨基酸序列TXiSSGX2IX3SSYVQ的輕鏈可變區(qū)(VL) CDRl，其中X1是R或G，X2是 S或R，&是0或A(SEQ ID NO: 53);具有氨基酸序列EDX1QRPS的VL CDR2，其中乂1是0或 N (SEQ ID NO: 54);以及具有氨基酸序列 X1X2YX3X4X5X6LX7 的 VL CDR3，其中 X1 是 Q 或 M，X2 是 S 或 Q，乂3是0 或 A，乂4是？或 S，乂5是!1或 S，X6 是H 或 S，乂7是￥ 或 W(SEQ ID NO:55), 其中所述抗體在STAT5激活測定中阻斷STAT5磷酸化。在一些實(shí)施方案中，VH⑶R2與VH CDR3之間的構(gòu)架區(qū)包含氨基酸序列丙氨酸-精氨酸，其中精氨酸與VH CDR3的第一個(gè)氨基酸殘基相鄰。在一些實(shí)施方案中，VH⑶R2與VH⑶R3之間的構(gòu)架區(qū)包含氨基酸序列半胱氨酸-丙氨酸-精氨酸，其中所述精氨酸與VH CDR3的第一個(gè)氨基酸殘基相鄰。
在一些實(shí)施方案中，所述抗體包含具有氨基酸序列X1X2VMH(SEQ ID NO:50)的重鏈 CDR接觸區(qū)(contact代81011)1，其中乂1是0或1\是3或￥;具有氨基酸序列GWDGFF (SEQ ID NO: 57)的重鏈CDR接觸區(qū)2 ;以及具有氨基酸序列ARX1X2X3X4 (SEQ ID NO: 58)的重鏈CDR 接觸區(qū)3 ;具有氨基酸序列SGSIDSSY(SEQ ID NO: 59)的輕鏈CDR接觸區(qū)I ;具有氨基酸序列 EDDQRPSGV(SEQ ID NO:60)的輕鏈CDR接觸區(qū)2 ;以及具有氨基酸序列FHHL(SEQ ID N0:61) 的輕鏈CDR接觸區(qū)3，其中所述抗體在STAT5激活測定中阻斷STAT5磷酸化。
在一些實(shí)施方案中，所述抗體特異性結(jié)合IL-7RCI，并且包含具有氨基酸序列 DSVMH(SEQ ID NO: 19)、GFTFDDS (SEQ ID NO:46)或 GFTFDDSVMH(SEQ ID NO:47)的重鏈可變區(qū)(VH)互補(bǔ)決定區(qū)1(CDR1)，具有氨基酸序列LVGWDGFFTYYADSVKG(SEQ ID NO:23)或 GffDGFF(SEQ ID NO:48)的 VH CDR2，以及具有氨基酸序列 Q⑶YMGNN(SEQ ID NO:49)的 VH ⑶R3，或者其具有⑶R1、⑶R2和/或⑶R3中一或多個(gè)保守氨基酸取代的變體。
在一些實(shí)施方案中，所述抗體包含具有氨基酸序列TRSSGSIDSSYVQ(SEQ ID NO:29)的輕鏈可變區(qū)(VL)CDRl，具有氨基酸序列EDDQRPS(SEQ ID N0:31)的VL CDR2，和/ 或具有氨基酸序列QSYDFHHLV (SEQ ID NO: 36)的VL CDR3，或者其在CDR1、CDR2和/或CDR3 中具有一或多個(gè)保守氨基酸取代的變體。在一些實(shí)施方案中，所述抗體進(jìn)一步包含具有SEQ ID NO: 19、46或47所示氨基酸序列的VH CDR1，具有SEQ ID NO:23或48所示氨基酸序列的VH CDR2，以及具有SEQ ID NO: 49所示氨基酸序列的VH CDR3，或者其在CDR1、CDR2和/ 或CDR3中具有一或多個(gè)保守氨基酸取代的變體。
在一些實(shí)施方案中，所述抗體特異性結(jié)合IL-7Ra，并且包含具有SEQ ID NO: 19, 46或47所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)(VH)互補(bǔ)決定區(qū)I (⑶Rl)，具有SEQ ID N0:23或 48所示氨基酸序列的VH CDR2，及具有SEQ ID NO:49所示氨基酸氨基酸序列的VH CDR3，具有SEQ ID N0:29所示氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)(VL)⑶R1，具有SEQ ID N0:31所示氨基酸序列的VL⑶R2，及具有SEQ ID NO:36所示氨基酸序列的VL⑶R3。在一些實(shí)施方案中，所述 VH 區(qū)包含氨基酸序列 EVQLVESGGGLVKPGGSLRL SCAASGFTFDDSVMHWVRQAPGKGLEWVSLVGffDGFFTYYADSVKGR FTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQGDYMGNNWGQGTLVTVSS (SEQ IDNO:40)以及所述 VL 區(qū)包含氨基酸序列 NFMLTQPHSVSESP GKTVTISCTRSSGSIDSSYVQWYQQRPGSSPTTVIYEDDQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSYDFHHLVFGGGTKLTVL(SEQ IDN0:41)。在一些實(shí)施方案中，所述抗體包含具有氨基酸序列NFMLTQPH SVSESPGKTVTISCTRSSGSIDSSYVQWYQQRPGSSPTTVIYEDDQRPSGV PDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSYDFHHLVFGGGTKLTVL QPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS(SEQ ID NO :43)的輕鏈以及具有氨基酸序列EVQLVESGGGLVKP GGSLRLSCAASGFTFDDSVMHWVRQAPGKGLEWVSLVGWDGFFTYYA DSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQGDYMGNNWG QGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSff NSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDKKVAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVK FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEffESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:42)的重鏈，有或沒有SEQ ID NO:42的C末端賴氨酸。在一些實(shí)施方案中，所述抗體可以是人抗體、人源化抗體或嵌合抗體。在一些實(shí)施方案中，所述抗體是單克隆抗體。在一些實(shí)施方案中，所述抗體包含恒定區(qū)。在一些實(shí)施方案中，所述抗體是人IgGl或IgG2Aa亞類。在一些實(shí)施方案中，所述抗體包含糖基化恒定區(qū)。在一些實(shí)施方案中，所述抗體包含與人Fe y受體具有増加的結(jié)合親和性的恒定區(qū)。在一些實(shí)施方案 中，提供了包含與IL-7R選擇性相互作用并抑制其功能的抗體的藥物組合物。在一些實(shí)施方案中，提供了重組產(chǎn)生與IL-7R選擇性相互作用并抑制其功能的抗體的細(xì)胞系。在一些實(shí)施方案中，提供了編碼與IL-7R選擇性相互作用并抑制其功能的抗體的核酸。在一些實(shí)施方案中，提供了降低個(gè)體中血糖水平的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括給需要這種治療的個(gè)體施用治療有效量的拮抗性IL-7R抗體，從而降低血糖水平。在一些實(shí)施方案中，提供了改善個(gè)體中葡萄糖耐受的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括給需要這種治療的個(gè)體施用治療有效量的拮抗性IL-7R抗體，從而改善葡萄糖耐受。在一些實(shí)施方案中，提供了預(yù)防或者治療個(gè)體I型糖尿病的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括給需要這種治療的個(gè)體施用治療有效量的拮抗性IL-7R抗體，從而預(yù)防或治療I型糖尿病的一或多個(gè)癥狀。在一些實(shí)施方案中，提供了預(yù)防或治療個(gè)體2型糖尿病的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括給需要這種治療的個(gè)體施用治療有效量的IL-7R拮抗劑，從而預(yù)防或治療2型糖尿病的一或多個(gè)癥狀。在一些實(shí)施方案中，所述IL-7R拮抗劑是拮抗性IL-7R抗體。
在一些實(shí)施方案中，提供了預(yù)防或治療個(gè)體類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括給需要這種治療的個(gè)體施用治療有效量的拮抗性IL-7R抗體，從而預(yù)防或治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的一或多個(gè)癥狀。
在一些實(shí)施方案中，提供了預(yù)防或治療個(gè)體移植物抗宿主疾病(GVHD)的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括給需要這種治療的個(gè)體施用治療有效量的拮抗性IL-7R抗體，從而預(yù)防或治療GVHD的一或多個(gè)癥狀。
在一些實(shí)施方案中，所述GVHD是慢性GVHD或急性GVHD。
在一些實(shí)施方案中，提供了預(yù)防或治療個(gè)體狼瘡的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括給需要這種治療的個(gè)體施用治療有效量的拮抗性IL-7R抗體，從而預(yù)防或治療狼瘡的一或多個(gè)癥狀。
在一些實(shí)施方案中，所述狼瘡是皮膚紅斑狼瘡、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、藥物誘導(dǎo)的紅斑狼瘡或新生兒狼瘡。
在一些實(shí)施方案中，提供了預(yù)防或治療個(gè)體多發(fā)性硬化的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括給需要這種治療的個(gè)體施用治療有效量的拮抗性IL-7R抗體，從而預(yù)防或治療多發(fā)性硬化的一或多個(gè)癥狀及降低和/或耗竭個(gè)體中幼稚( naive)和/或激活的T 細(xì)胞群。在一些實(shí)施方案中，個(gè)體中降低的或耗竭的T細(xì)胞群包含ThI和/或Th17細(xì)胞。 在一些實(shí)施方案中，施用拮抗性IL-7R抗體不導(dǎo)致個(gè)體中Th17細(xì)胞群擴(kuò)增。
在一些實(shí)施方案中，所述抗體可以經(jīng)腸胃外施用。在一些實(shí)施方案中，所述個(gè)體是人。
附圖簡述


圖1示出拮抗性IL-7R單克隆抗體P2D2、P2E11和HAL403a對于人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中IL-7介導(dǎo)的STAT5磷酸化的劑量依賴性作用。χ-軸表示表達(dá)磷酸-STAT5 (p-STAT)的CD4+細(xì)胞的百分比。
圖2示出拮抗性IL-7R單克隆抗體28G9對于非肥胖性糖尿病(NOD)小鼠中糖尿病發(fā)生的作用。
圖3示出拮抗性IL-7R單克隆抗體28G9對于NOD小鼠中(A)血糖水平(mg/dL) 和⑶體重(g)的作用。
圖4示出拮抗性IL-7R單克隆抗體28G9對于NOD小鼠中(A)幼稚⑶8+T細(xì)胞群和(B)記憶CD8+T細(xì)胞群的作用。對于χ-軸，總CD8+T細(xì)胞群設(shè)為100%。
圖5示出拮抗性IL-7R單克隆抗體28G9對于NOD小鼠中幼稚⑶4+T細(xì)胞群的作用。對于χ-軸，總⑶4+T細(xì)胞群設(shè)為100%。
圖6示出拮抗性IL-7R單克隆抗體28B6和28G9對于EAE動物的臨床嚴(yán)重性的作用。EAE的臨床嚴(yán)重性每天用0-5點(diǎn)得分系統(tǒng)評估。0，正常；1，松弛的尾部；2，部分后肢癱瘓；3，全部后肢癱瘓；4，四肢癱瘓；5，瀕死狀態(tài)或死亡。
圖7示出拮抗性IL-7R 單克隆抗體28G9對于EAE動物的臨床嚴(yán)重性的劑量依賴性作用。
圖8示出拮抗性IL-7R單克隆抗體28G9對于EAE動物的臨床嚴(yán)重性的作用。
圖9示出拮抗性IL-7R單克隆抗體28G9在具有建立的EAE的動物中的作用。圖10示出低劑量拮抗性IL-7R單克隆抗體28G9在具有建立的EAE的動物中的作用。圖11示出拮抗性IL-7R單克隆抗體28G9和28B6對于來自EAE動物的骨髄(BM)、脾、血液和淋巴結(jié)(LN)的(A)CD4T細(xì)胞和(B)CD8T細(xì)胞群的作用。對于x_軸，總淋巴細(xì)胞群設(shè)為100%。圖12A-C示出拮抗性IL-7R單克隆抗體28G9對于來自EAE動物的骨髄、脾、血液和淋巴結(jié)的(A)幼稚T細(xì)胞群、⑶記憶T細(xì)胞群和(C)激活的T細(xì)胞群的作用。對于X-軸，CD8+T細(xì)胞群設(shè)為100%。圖13示出拮抗性IL-7R單克隆抗體28G9對于來自EAE動物的骨髄、脾、血液和淋巴結(jié)的Teff細(xì)胞群(左圖)和Treg細(xì)胞群(右圖)的作用。對于X-軸，CD4+T細(xì)胞群設(shè)為100%o 表示與對照相比P〈0. 05。圖14示出在高脂肪飲食誘導(dǎo)的肥胖(DIO)小鼠中拮抗性IL-7R單克隆抗體28G9對于血液葡萄糖水平(mg/dL)的作用。圖15示出在高脂肪飲食誘導(dǎo)的肥胖(DIO)小鼠中拮抗性IL-7R單克隆抗體28G9對于葡萄糖不耐受的作用。

詳細(xì)描述本發(fā)明掲示了拮抗IL-7R功能、包括其與IL-7相互作用的抗體。本發(fā)明提供了產(chǎn)生拮抗性IL-7R抗體的方法、包含這些抗體的組合物以及使用這些抗體作為藥物的方法。IL-7R拮抗劑如拮抗性IL-7R抗體可用于預(yù)防和/或治療2型糖尿病、GVHD和自身免疫疾病，包括多發(fā)性硬化(MS)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、I型糖尿病和狼瘡。一般技術(shù)除非特別指出，實(shí)施本發(fā)明使用常規(guī)分子生物學(xué)(包括重組技術(shù))、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫學(xué)技術(shù)，這些技術(shù)在本領(lǐng)域技術(shù)人員技術(shù)范圍內(nèi)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中充分 1墻明，5ロ Molecular Cloning:A Laboratory Manual, second edition (Sambrooket al. , 1989)Cold Spring Harbor Press;01igonucIeotide Synthesi s(M.J.Gait,ed. ,1984) ；Methods in Molecular Biology, Humana Press;Cell Biology:ALaboratory Notebook (J. E. Cellis, ed.，1998) Academic Press;Animal Cell Culture(R.1. Freshney, ed. , 1987) !Introduction to Cell and Tissue Culture(J. P. Mather andP. E. Roberts, 1998)Plenum Press;Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures(A.Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell, eds. , 1993-1998)J. Wiley and Sons;Methods inEnzymology(Academic Press,Inc. ) ；Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weirand C. C. Blackwell, eds. ) ；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Millerand M. P. Calos, eds. , 1987) ；Current Protocols in Molecular Biology(F. M. Ausubel etal. , eds. , 1987) ；PCR:The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al. , eds. , 1994)；Current Protocols in Immunology(J. E. Coligan et al. , eds. , 1991) ；Short Protocolsin Molecular Biology(ffiley and Sons, 1999) ;Immunobiology (C.A. Janeway andP.Travers, 1997) ；Antibodies (P.Finch, 1997) ；Antibodies: a practical approach(D.Catty. , ed. , IRL Press, 1988-1989) ；Monoclonal antibodies: a practical approach(P.Shepherd and C. Dean,eds. , Oxford University Press, 2000) ；Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999) ；The Antibodies(M. Zanetti and J. D.Capra,eds. , Harwood Academic Publishers,1995)。
定義
“抗體”是能通過至少一個(gè)位于免疫球蛋白可變區(qū)內(nèi)的抗原識別位點(diǎn)特異性結(jié)合靶如碳水化合物、多核苷酸、脂質(zhì)、多肽等的免疫球蛋白分子。如本文所用，該術(shù)語不僅涵蓋了完整多克隆抗體或單克隆抗體，而且也包含其片段(如Fab、Fab’、F (ab’)2、Fv)、單鏈 (ScFv)和結(jié)構(gòu)域抗體(包括例如shark和camelid抗體)，以及包含抗體的融合蛋白，及包含抗原識別位點(diǎn)的免疫球蛋白分子的任何其它修飾構(gòu)型。抗體包括任何類別的抗體，如 IgG, IgA或IgM(或者其亞類)，以及所述抗體不需要是任何特定類別。根據(jù)抗體重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，免疫球蛋白可被分為不同類別。有五種主要類別的免疫球蛋白IgA、IgD、 IgE、IgG和IgM，其中一些可被進(jìn)一步分為亞類(同種型)，如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl 和IgA2。相應(yīng)于不同類別免疫球蛋白的重鏈恒定區(qū)分別被稱作alpha、delta、epsilon、 gamma和mu。不同類別免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型為本領(lǐng)域熟知。
如本文所用，“單克隆抗體”是指得自一群基本均質(zhì)抗體的抗體，即包含該群的各個(gè)抗體除了以微量存在的可能天然發(fā)生的突變之外是相同的。單克隆抗體是高度特異性的，針對單一抗原性位點(diǎn)。此外，與典型包括針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制備物相反，每個(gè)單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇。修飾語“單克隆” 是指所述抗體得自基本均質(zhì)抗體群的特征，不是指需要通過任何特殊方法產(chǎn)生抗體。例如，用于本發(fā)明的單克隆抗體可以通過雜交瘤方法制備，所述雜交瘤方法由Kohler and Milstein, 1975, Nature 256:495首次描述；或者可以通過重組DNA方法制備，如美國專利4，816，567所述。單克隆抗體也可以從使用如McCafferty et al. , 1990, Nature 348:552-554所述技術(shù)產(chǎn)生的噬菌體文庫分離。
如本文所用，“人源化抗體”是指非人(如鼠)抗體形式，其是嵌合的免疫球蛋白、 免疫球蛋白鏈或者其片段(如Fv、Fab、Fab’、F(ab' )2或抗體的其它抗原結(jié)合子序列)， 其含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列。優(yōu)選地，人源化抗體是人免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自受體互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的殘基由來自具有希望的特異性、親和性和容量 (capacity)的非人物種(供體抗體)如小鼠、大鼠或兔的⑶R的殘基置換。在一些情況中， 人免疫球蛋白的Fv構(gòu)架區(qū)(FR)殘基由相應(yīng)非人物種殘基置換。此外，人源化抗體可包含在受體抗體及在輸入的CDR或構(gòu)架序列中均未發(fā)現(xiàn)的殘基，但是包含其以進(jìn)一步精制和優(yōu)化抗體性能。通常，人源化抗體將包含基本上所有的至少一個(gè)及典型兩個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，其中所有或基本上所有相應(yīng)于非人免疫球蛋白的那些區(qū)域的CDR區(qū)以及所有或基本上所有FR 區(qū)是人免疫球蛋白共有序列的那些區(qū)域。人源化抗體優(yōu)選也包含至少一部分免疫球蛋白典型為人免疫球蛋白的恒定區(qū)或結(jié)構(gòu)域(Fe)。優(yōu)選的是具有如WO 99/58572所述修飾的Fe 區(qū)的抗體。其它形式的人源化抗體具有一或多個(gè)⑶R(⑶R LlXDR L2、⑶R L3、⑶R HlXDR H2或CDR H3)，其相對于原始抗體被改變，其也被稱作“衍生自”原始抗體的一或多個(gè)CDR的一或多個(gè)CDR。
如本文所用，“人抗體”是指具有相應(yīng)于由人產(chǎn)生的抗體和/或使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的或者本文掲示的任何產(chǎn)生人抗體的技術(shù)產(chǎn)生的抗體的氨基酸序列的抗體。人抗體的定義包括包含至少ー個(gè)人重鏈多肽或者至少ー個(gè)人輕鏈多肽的抗體。ー個(gè)這樣的實(shí)例是包含鼠輕鏈和人重鏈多肽的抗體。人抗體可以使用本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)產(chǎn)生。在一個(gè)實(shí)施方案中，人抗體選自曬菌體文庫，其中所述曬菌體文庫表達(dá)人抗體(Vaughan etal.，1996，Nature Biotechnology,14:309-314; Sheets et al.，1998，Proc. Natl. Acad.Sc1. (USA)95:6157-6162 ；Hoogenboom and Winter,1991，J. Mol. Biol.，227:381 ;Marks etal.，1991，J. Mol. Biol.，222:581)。人抗體也可以通過對動物進(jìn)行免疫而產(chǎn)生，所述動物中已經(jīng)轉(zhuǎn)基因?qū)肴嗣庖咔虻鞍谆蜃娲鷥?nèi)源基因座，例如其中內(nèi)源免疫球蛋白基因已經(jīng)部分或完全被失活的小鼠。這種方法在美國專利5，545，807,5, 545，806,5, 569，825、5,625, 126、5，633，425和5，661，016中描述。或者，人抗體可以通過使人B淋巴細(xì)胞永生化而制備，所述B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生針對靶抗原的抗體(如B淋巴細(xì)胞可以回收自個(gè)體或者可已經(jīng)在體外免疫)。見 Cole et al. Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, AlanR. Liss, p. 77, 1985 ；Boerner et al. , 1991, J.1mmunol. , 147 (I) :86-95 ；and U. S. PatentNo. 5，750，373 所述。如本文所用，術(shù)語“IL-7R”是指任何形式的IL-7R及其變體，其保留至少一部分IL-7R活性。除非不同地指出，如特別提及人類IL-7R，否則IL-7R包括所有哺乳動物物種如人、狗、貓、馬和牛的天然序列IL-7R。如本文所用，“IL-7R拮抗劑”是指抗體或分子，其能抑制IL-7R生物學(xué)活性和/或由IL-7R信號傳導(dǎo)介導(dǎo)的下游途徑，包括與IL-7結(jié)合、STAT5磷酸化、Src激酶、PI3激酶和Pyk2、以及Bcl2蛋白質(zhì)的上調(diào)。舉例的IL-7R拮抗劑包括但不限于拮抗性IL-7R抗體、IL-7R siRNA、IL-7R shRNA 和 IL-7R 反義寡核苷酸。拮抗性IL-7R抗體涵蓋這樣的抗體，其阻斷、拮抗、阻抑或降低(至任何程度，包括顯著程度地)IL-7R生物學(xué)活性， 包括由IL-7R信號傳導(dǎo)介導(dǎo)的下游途徑，如與IL-7相互作用和/或激發(fā)對IL-7的細(xì)胞應(yīng)答。對于本發(fā)明，顯然術(shù)語“拮抗性IL-7R抗體”(與“ IL-7R拮抗性抗體”、“拮抗性抗-1L-7R抗體”或者“抗-1L-7R拮抗性抗體”可互換使用)涵蓋所有先前鑒別的術(shù)語、稱謂和功能狀態(tài)及特性，從而IL-7R自身、IL-7R生物學(xué)活性(包括但不限干與IL-7相互作用，其介導(dǎo)STAT5磷酸化任何方面的能力、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)-Akt途徑激活、p27Kipl下調(diào)、Bcl-2上調(diào)、Rb超磷酸化及CXCR4上調(diào))或者生物學(xué)活性的結(jié)果，均基本上在任何有意義的程度被消除、降低或中和。在一些實(shí)施方案中，拮抗性IL-7R抗體結(jié)合IL-7R及防止與IL-7相互作用。拮抗性IL-7R抗體的實(shí)例在本文提供。如本文所用，“完全拮抗劑”是這樣的拮抗劑，其在有效濃度基本上完全阻斷IL-7R的可測量的作用。部分拮抗劑是指這樣的拮抗劑，其能部分阻斷可測量的作用，但是甚至在最高濃度時(shí)也不是完全拮抗劑?；旧贤耆侵钢辽俅蠹s80%、優(yōu)選至少大約90%、更優(yōu)選至少大約95%及最優(yōu)選地至少大約98%的可測量的作用被阻斷。術(shù)語“多肽”、“寡肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”在本文可互換使用，是指任何長度的氨基酸鏈，優(yōu)選相對短的鏈(例如10-100個(gè)氨基酸)。所述鏈可以是線性的或者分支的，其可包含修飾的氨基酸，和/或可以由非氨基酸中斷。該術(shù)語還涵蓋已經(jīng)天然和/或通過干預(yù)而修飾的氨基酸鏈；所述修飾例如ニ硫鍵形成、糖基化、脂質(zhì)化、こ?；?、磷酸化或者任何其它操縱或修飾，如與標(biāo)記成分綴合。該定義還包括如含有一或多個(gè)氨基酸類似物(包括如非天然氨基酸等)以及本領(lǐng)域已知其它修飾的多肽。應(yīng)理解所述多肽可以作為單鏈或締合 (associated)鏈存在。
如本領(lǐng)域已知，“多核苷酸”或“核酸”在本文可互換使用，是指任何長度的核苷酸鏈，及包括DNA和RNA。所述核苷酸可以是脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修飾的核苷酸或堿基和/或其類似物，或者通過DNA或RNA聚合酶可以摻入鏈中的任何底物。多核苷酸可包含修飾的核苷酸，如甲基化核苷酸及其類似物。如果存在，對核苷酸結(jié)構(gòu)的修飾可以在鏈裝配之前或之后實(shí)施。核苷酸的序列可以由非核苷酸成分中斷。多核苷酸在磷酸化之后可以進(jìn)一步修飾，如通過與標(biāo)記成分綴合。其它類型修飾包括如“caps”，用類似物取代一或多個(gè)天然發(fā)生的核苷酸，核苷酸間修飾如具有無電荷鍵(如甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷酸酰胺酯(phosphoamidates)、氨基甲酸酯等)及具有電荷鍵(如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的那些，含有懸垂(pendant)部分的那些，如蛋白質(zhì)(如核酸酶、毒素、抗體、信號肽、 聚-L-賴氨酸等)，具有嵌入劑(如吖啶、補(bǔ)骨脂素等)的那些，含有螯合劑(如金屬、放射性金屬、硼、氧化金屬等)的那些，含有烷化劑的那些，具有修飾鍵的那些(如α端基異構(gòu)體核酸等)以及未修飾形式的多核苷酸。此外，所述糖中通常存在的任何羥基基團(tuán)可以例如由膦酸基團(tuán)、磷酸基團(tuán)置換，由標(biāo)準(zhǔn)保護(hù)基團(tuán)保護(hù)，或者激活以制備對另外核苷酸的另外連接，或者可以與固體支持物綴合。5’和3’末端OH可以被磷酸化或者用胺或1-20個(gè)碳原子的有機(jī)帽化基團(tuán)部分取代。其它羥基也可以被衍生為標(biāo)準(zhǔn)保護(hù)基團(tuán)。多核苷酸也可含有本領(lǐng)域通常已知的核糖或脫氧核糖的類似形式，包括例如2’ -O-甲基_、2’ -O-烯丙基、 2’_氟代_或2’-疊氮-核糖，碳環(huán)糖類似物，α -或β -端基異構(gòu)體糖,差向異構(gòu)體糖如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖，吡喃糖，呋喃糖，景天庚酮糖，無環(huán)類似物及脫堿基核苷類似物如甲基核苷。一或多個(gè)磷酸二酯鍵可以由其它連接基團(tuán)置換。這些其它連接基團(tuán)包括但不限于這樣的實(shí)施方案，其中磷酸酯由P (O) S (硫代酯)、P (S) S ( 二硫代酯)、(O) NR2 (酰胺)、P (O) R、P (O) OR’、C0或CH2 (formacetal)置換，其中每個(gè)R或R’單獨(dú)地是H或者取代或未取代的烷基(1-20C)，任選含有醚(-0-)鍵、芳基、烯基、環(huán)烷基、環(huán)烯基或araldyl。不是所有核苷酸中的鍵均需要是相同的。前文描述適用于本文提及的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。
抗體的“ 可變區(qū)”是單獨(dú)或者組合指抗體輕鏈的可變區(qū)或者抗體重鏈的可變區(qū)。 如本領(lǐng)域已知，每個(gè)重鏈和輕鏈可變區(qū)均由四個(gè)構(gòu)架區(qū)(FR)組成，這四個(gè)構(gòu)架區(qū)通過三個(gè)也稱作超變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)連接。每個(gè)鏈中的CDR通過FR緊密固定在一起，與其它鏈的CDR —起使得形成抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)。確定CDR有至少兩種技術(shù)(I)基于跨物種序列可變性的方法(即 Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5th ed. , 1991, National Institutes of Health, Bethesda MD))；及(2) 基于抗原-抗體復(fù)合物的晶體學(xué)研究的方法(Al-lazikani et al.，1997，J. Molec. Biol. 273:927-948)。如本文所用，⑶R可以是指通過任一方法或者通過組合這兩種方法定義的CDR。
如本領(lǐng)域已知，抗體的“恒定區(qū)”是單獨(dú)或組合指抗體輕鏈的恒定區(qū)或者抗體重鏈的恒定區(qū)。
如本文所用，當(dāng)通過本文實(shí)施例2所述方法測量的平衡解離常數(shù)等于或低于 20nM、優(yōu)選低于大約6nM、更優(yōu)選低于大約InM、最優(yōu)選低于大約0. 2nM時(shí)，抗體與IL-7R“相互作用”。
與抗體或多肽“優(yōu)先結(jié)合”或者“特異性結(jié)合”(在本文可互換使用)的表位是本領(lǐng)域熟知的術(shù)語，確定這種特異性或優(yōu)先結(jié)合的方法也為本領(lǐng)域熟知。如果一分子與特定細(xì)胞或物質(zhì)比與另外的細(xì)胞或物質(zhì)以更頻繁、更快速、更長的持續(xù)時(shí)間和/或更大的親和性反應(yīng)或締合，則稱該分子呈現(xiàn)出“特異性結(jié)合”或“優(yōu)先結(jié)合”。如果抗體與靶的結(jié)合比與其它物質(zhì)結(jié)合具有更大親和性、親合力、更易于結(jié)合和/或具有更長持續(xù)時(shí)間，則該抗體與靶“特異性結(jié)合”或“優(yōu)先結(jié)合”。例如，特異性或優(yōu)先結(jié)合IL-7R表位的抗體是與結(jié)合其它IL-7R表位或非-1L-7R表位相比以更大親和性、親合力、更易于結(jié)合和/或具有更長持續(xù)時(shí)間結(jié)合這個(gè)表位的抗體。也應(yīng)理解通過閱讀這個(gè)定義，如特異性或優(yōu)先結(jié)合第一個(gè)靶的抗體(或者部分或表位)可以或者不可以特異性或優(yōu)先結(jié)合第二個(gè)靶。如此，“特異性結(jié)合”或“優(yōu)先結(jié)合”不必須需要(盡管其可包括)排它性結(jié)合。通常但非必需地，提及結(jié)合意味著優(yōu)先結(jié)合。如本文所用，“基本上純的”是指材料是至少50%純(即沒有污染物)、更優(yōu)選至少90%純、更優(yōu)選至少95%純、更優(yōu)選至少98%純及最優(yōu)選至少99%純。“宿主細(xì)胞”包括可以是或已經(jīng)是載體的受體的個(gè)體細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物以摻入多核苷酸插入體。宿主細(xì)胞包括単一宿主細(xì)胞的后代，所述后代與原始親代細(xì)胞由于天然、偶然或有意突變所致而非必須是完全相同(在形態(tài)學(xué)或基因組DNA互補(bǔ)方面)。宿主細(xì)胞包括在體內(nèi)用本發(fā)明的多核苷酸 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。如本領(lǐng)域已知，術(shù)語“Fe區(qū)”用于定義免疫球蛋白重鏈的C末端區(qū)域。“Fe區(qū)”可以是天然序列Fe區(qū)或者變體Fe區(qū)。盡管免疫球蛋白重鏈的Fe區(qū)的邊界可以變化，但是人IgG重鏈Fe區(qū)通常被定義為是從在位置Cys226或者從Pro230的氨基酸殘基至其羧基末端的一段序列。Fe區(qū)中殘基的編號是如Kabat所述EU指數(shù)的編號。Kabat et al. , Sequencesof Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, Nationa丄Institutes of Health, Bethesda, Md. , 1991。免疫球蛋白的Fe區(qū)通常包含兩個(gè)恒定區(qū),CH2和 CH3。如本領(lǐng)域所用，“Fe受體”和“FcR”描述了結(jié)合抗體Fe區(qū)的受體。優(yōu)選的FcR是天然序列人FcR。此外，優(yōu)選的FcR是結(jié)合IgG抗體的那些(Y受體)，包括Fe Y R1、FcyRII和Fe YRIII亞類受體，包括這些受體的等位基因變體和可變剪接形式。FcyRII受體包括Fe Y RIIA(激活受體)和Fe Y RIIB (抑制受體)，其具有相似的氨基酸序列，主要在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中不同。FcR 在 Ravetch and Kinet, 1991, Ann. Rev.1mmunol. , 9:457-92 ；Capel et al.，1994，Immunomethods, 4:25-34 ;以及 de Haas et al. , 1995, J. Lab. Clin.Med.，126:330-41中綜述?！癋cR”也包括新生兒受體FcRn，其與母體IgG轉(zhuǎn)移至胎兒相關(guān)(Guyer et al. , 1976, J. Tmmuno1. ,117:587 ;和 Kim et al. , 1994, J. Tmmuno1. , 24:249)。如本文所用，關(guān)于抗體所用術(shù)語“競爭”是指第一抗體或者其抗原結(jié)合部分與第二抗體或者其抗原結(jié)合部分的結(jié)合以極其相似的方式結(jié)合表位，由此在存在第二抗體的條件下與不存在第二抗體的條件相比，第一抗體與其關(guān)聯(lián)(cognate)表位結(jié)合的結(jié)果可檢測地降低?；蛘撸渲械诙贵w與其表位的結(jié)合在存在第一抗體的條件下也可檢測地降低，可以但不必須是這種情況。也就是說，第一抗體可抑制第二抗體與其表位的結(jié)合，而無需第二抗體抑制第一抗體與其各自表位的結(jié)合。然而，在每種抗體可檢測地抑制其它抗體與其關(guān)聯(lián)表位或配體結(jié)合的情況中，無論是相同、更大或更低程度，也稱這些抗體彼此“交叉競爭”與其各自表位的結(jié)合。競爭和交叉競爭抗體均包含在本發(fā)明中。無論這種競爭或交叉競爭發(fā)生的機(jī)制如何(如位阻、構(gòu)象改變或者結(jié)合共有表位或其一部分)，技術(shù)人員基于本文提供的教導(dǎo)意識到這種競爭和/或交叉競爭抗體涵蓋在本發(fā)明中且可用于本發(fā)明的方法中。
“功能性Fe區(qū)”具有天然序列Fe區(qū)的至少一種效應(yīng)物功能。舉例的“效應(yīng)物功能” 包括Clq結(jié)合，補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性，F(xiàn)e受體結(jié)合，抗體-依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性，吞噬作用，細(xì)胞表面受體(例如B細(xì)胞受體)的下調(diào)等。這種效應(yīng)物功能通常需要Fe區(qū)組合結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如抗體可變結(jié)構(gòu)域)并且可以使用本領(lǐng)域已知的評估這種抗體效應(yīng)物功能的各種測定評估。
“天然序列Fe區(qū)”包含與天然發(fā)現(xiàn)的Fe區(qū)的氨基酸序列相同的氨基酸序列?！白凅wFe區(qū)”包含由于至少一個(gè)氨基酸修飾而與天然序列Fe區(qū)不同的氨基酸序列，但仍保留天然序列Fe區(qū)的至少一種效應(yīng)物功能。在一些實(shí)施方案中，變體Fe區(qū)與天然序列Fe區(qū)相比或者與親代多肽的Fe區(qū)相比具有至少一個(gè)氨基酸取代，例如在天然序列Fe區(qū)或者親代多肽Fe區(qū)中大約I至大約10個(gè)氨基酸取代，以及優(yōu)選大約I至大約5個(gè)氨基酸取代。本文所述變體Fe區(qū)與天然序列Fe區(qū)和/或與親代多肽Fe區(qū)優(yōu)選具有至少大約80%序列相同性，最優(yōu)選與其具有至少大約90%序列相同性，更優(yōu)選具有至少大約95%、至少大約96%、至少大約97%、至少大約98%、至少大約99%序列相同性。
如本文所用，“治療”是為獲得有益或希望的臨床結(jié)果的方法。對于本發(fā)明，有益或希望的臨床結(jié)果包括但不限于如下一或多個(gè)結(jié)果增強(qiáng)葡萄糖清除、降低血糖水平、改善葡萄糖耐受、降低得自I型或2型糖尿病的高血糖水平的發(fā)生率，降低類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的一或多個(gè)癥狀的發(fā)生率或改善癥狀，降低GVHD的一或多個(gè)癥狀的發(fā)生率或改善癥狀，降低狼瘡的一或多個(gè)癥狀的發(fā)生率或改善癥狀，以及降低多發(fā)性硬化的一或多個(gè)癥狀的發(fā)生率或改善癥狀。
“降低發(fā)生率”是指任何降低嚴(yán)重性(可包括減少通常用于這個(gè)疾病的其它藥物 (如暴露于其它藥物)的需要和/或量和/或治療。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解，個(gè)體在其對治療的應(yīng)答方面可不同，正如此，如“降低發(fā)生率的方法”反映出基于合理預(yù)期施用IL-7R 拮抗劑，這種施用可能有希望在特定個(gè)體中導(dǎo)致這種發(fā)生率降低。
“改善”是指與未施用IL-7 R拮抗劑相比減輕或改良一或多個(gè)癥狀?！案纳啤币舶s短或減少癥狀的持續(xù)時(shí)間。
如本文所用，藥物、化合物或藥物組合物的“有效劑量”或“有效量”是足以實(shí)現(xiàn)任一或多個(gè)有益或希望結(jié)果的量。對于預(yù)防性應(yīng)用而言，有益或希望結(jié)果包括消除或降低疾病危險(xiǎn)、減輕疾病嚴(yán)重性或者延遲疾病發(fā)作，包括疾病的生物化學(xué)、組織學(xué)和/或行為癥狀，在疾病發(fā)展期間存在的其并發(fā)癥和中間病理學(xué)表型。對于治療性應(yīng)用，有益或希望結(jié)果包括這樣的臨床結(jié)果，如降低血糖水平，降低I型糖尿病、2型糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、 GVHD、狼瘡或多發(fā)性硬化的發(fā)生率及改善其一或多個(gè)癥狀，降低治療所述疾病必須的其它藥物的劑量，增強(qiáng)另一藥物的作用，和/或延遲患者疾病的進(jìn)展。有效劑量可以施用一次或多次。對于本發(fā)明，藥物、化合物或藥物組合物的有效劑量是足以實(shí)現(xiàn)直接或間接預(yù)防或治療性處理的量。在臨床中已知，藥物、化合物或藥物組合物的有效劑量可以聯(lián)合或不聯(lián)合另一藥物、化合物或藥物組合物實(shí)現(xiàn)。因此，在施用一或多種治療劑的情況中可考慮“有效劑量”，單一治療劑如果聯(lián)合一或多種其它治療劑可被認(rèn)為以有效量給予，可以實(shí)現(xiàn)或?qū)崿F(xiàn)希望的結(jié)果。“個(gè)體”或“對象”是哺乳動物，更優(yōu)選是人。哺乳動物也包括但不限于農(nóng)場動物、體育動物、寵物、靈長類動物、馬、狗、貓、小鼠和大鼠。如本文所用，“載體”是指ー種構(gòu)建體，其能在宿主細(xì)胞中輸送及優(yōu)選表達(dá)ー或多個(gè)感興趣的基因或序列。舉例的載體包括但不限于病毒載體、裸DNA或RNA表達(dá)載體、質(zhì)粒、粘?；蚴删w載體、與陽離子縮合劑締合的DNA或RNA表達(dá)載體、在脂質(zhì)體中包囊化的DNA或RNA表達(dá)載體，以及某些真核細(xì)胞，如生產(chǎn)者細(xì)胞。如本文所用，“表達(dá)控制序列”是指指導(dǎo)核酸轉(zhuǎn)錄的核酸序列。表達(dá)控制序列可以是啟動子，如組成型或可誘導(dǎo)啟動子，或者增強(qiáng)子。表達(dá)控制序列與被轉(zhuǎn)錄的核酸序列可操縱地連接。如本文所用，“藥物可接受的載體”或“藥物可接受的賦形劑”包括任何材料，當(dāng)其與活性成分組合時(shí)，使得該成分保留生物學(xué)活性且其與對象的免疫系統(tǒng)不反應(yīng)。實(shí)例包括但不限于任何標(biāo)準(zhǔn)藥物學(xué)載體，如磷酸鹽緩沖鹽水溶液、水、乳狀液如油/水乳狀液及各種類型的濕潤劑。對于氣霧劑或腸胃外施用，優(yōu)選的稀釋劑是磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)或常規(guī)(0.9%)鹽水。包含這種載體的組合物通過熟知的常規(guī)方法配制(見例如 Remington ' s Pharmaceutical Sciences, 18tn edition, A. Gennaro, ed. , MackPublishing Co. , Easton, PA, 1990 ;和Remington, The Science and Practice of Pharmacy20th Ed. Mack Publishing, 2000)。如本文所用，術(shù)語“k。/是指抗體與抗原結(jié)合的速率常數(shù)。特別地，使用Fab抗體片段(即ー價(jià))和IL-7R測量速率常數(shù)(km和kj及平衡解離常數(shù)。如本文所用，術(shù)語“kf”是指抗體從抗體/抗原復(fù)合物解離的速率常數(shù)。如本文所用，術(shù)語“Kd”是指抗體-抗原相互作用的平衡解離常數(shù)。在本文關(guān)于數(shù)值或參數(shù)所用詞“大約”包括(及描述)針對上述數(shù)值或參數(shù)本身的實(shí)施方案。例如，“大約X”的描述包括“X”的描述。數(shù)字范圍包括限定范圍的數(shù)字。應(yīng)理解本文實(shí)施方案用語言“包含”描述時(shí)，也提供了使用“由…組成”和/或“基本由…組成”描述的其它類似實(shí)施方案。當(dāng)本發(fā)明的方面或?qū)嵤┓桨敢择R庫什組或其它可選分組方式描述時(shí)，本發(fā)明不僅涵蓋作為整體列出的整個(gè)組，還涵蓋各個(gè)組中的每個(gè)成員和主要組的所有可能的亞組，以及缺少ー或多個(gè)組成員的主要組。本發(fā)明還包括在請求保護(hù)的發(fā)明中明確排除一或多個(gè)任何組成員。除非特別指出，本文所用所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的相同含義。在有沖突的情況中，本發(fā)明說明書包括定義起決定作用。在本說明書和權(quán)利要求書中，單詞“包含”應(yīng)理解為包含所述整數(shù)或整數(shù)組，但是不排除任何其它整數(shù)或整數(shù)組。除非特別指出，単數(shù)術(shù)語應(yīng)包括復(fù)數(shù)，復(fù)數(shù)術(shù)語應(yīng)包括単數(shù)形式。舉例的方法和材料在本文描述，但是在實(shí)施或檢測本發(fā)明中也可以使用與本文所述方法和材料相似或等價(jià)的方法和材料。所述材料、方法和實(shí)施例只是舉例說明而無限制
ム1g、。
_9] 預(yù)防或治療2型糖尿病、GVHD和自身免疫疾病的方法 一方面，本發(fā)明提供了治療與預(yù)防個(gè)體2型糖尿病的方法，包括給該個(gè)體施用有效量的IL-7R拮抗劑，如拮抗性IL-7R抗體。另一方面，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防個(gè)體自身免疫疾病如I型糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、狼瘡或多發(fā)性硬化的方法，所述方法包括給個(gè)體施用有效量的IL-7R拮抗劑。另一方面，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防個(gè)體GVHD的方法，包括給該個(gè)體施用有效量的IL-7R拮抗劑。
在一些實(shí)施方案中，治療性施用IL-7R拮抗劑有利地獲得降低的血糖水平和改善的葡萄糖耐受。在其它實(shí)施方案中，治療性施用IL-7R拮抗劑有利地保持血糖在希望的水平。
在一些實(shí)施方案中，治療性施用IL-7R拮抗劑有利地獲得降低的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生率及改善其一或多個(gè)癥狀，例如但不限于關(guān)節(jié)僵硬、關(guān)節(jié)腫脹、關(guān)節(jié)痛及關(guān)節(jié)發(fā)紅和發(fā)熱。
在一些實(shí)施方案中，治療性施用IL-7R拮抗劑有利地獲得降低的狼瘡發(fā)生率和/ 或改善其一或多個(gè)癥狀，包括例如但不限于疲勞、發(fā)熱、體重減輕、體重增加、關(guān)節(jié)痛、關(guān)節(jié)僵硬、關(guān)節(jié)腫脹、面頰皮疹、皮膚損害、口瘡、鼻潰瘍、脫發(fā)、Raynaud氏現(xiàn)象、呼吸淺短、胸痛、 眼干、瘀傷(bruising)、焦慮、抑郁和記憶力喪失。
在一些實(shí)施方案中，治療性施用IL-7R拮抗劑有利地獲得降低的多發(fā)性硬化發(fā)生率和/或改善其一或多個(gè)癥狀，包括例如但不限于肢體癱瘓、震顫、行走困難、吞咽困難、失明、視力模糊及肌肉無力。
在一些實(shí)施方案中，治療性施用IL-7R拮抗劑有利地獲得降低的GVHD發(fā)生率和/ 或改善其一或多個(gè)癥狀，包括例如但不限于腹痛、腹部痙攣、發(fā)熱、黃疸、皮疹、嘔吐、體重減輕、眼干、口干、脫發(fā)、肝炎、肺部疾病以及消化道疾病。
在一些實(shí)施方案中，治療性施用IL-7R拮抗劑有利地獲得降低的急性GVHD的發(fā)生率和/或改善其一或多個(gè)癥狀，包括例如但不限于肺炎、腸道炎癥、腹瀉、腹痛、腹部痙攣、 發(fā)熱、黃疸、惡心、嘔吐、肝損害、皮疹、皮膚損害、粘膜損害、粘膜脫落、胃腸道損害、體重減輕、斑丘疹、膽紅素水平升高、發(fā)病率和死亡率增加。
在一些實(shí)施方案中，治療性施用IL-7R拮抗劑有利地獲得降低的慢性GVHD的發(fā)生率和/或改善其一或多個(gè)癥狀，包括例如但不限于眼干、口干、脫發(fā)、肝炎、肺部疾病、消化道疾病、皮疫、口腔潰瘍、口腔粘膜萎縮(oralatrophy)、指甲營養(yǎng)不良(onchodystrophy)、 干燥綜合征、硬化癥、扁平苔蘚樣損害(lichen-palnus-like lesions)、皮膚異色病、食管蹼、筋膜炎和閉塞性細(xì)支氣管炎，及肝、皮膚和粘膜、結(jié)締組織、外分泌腺和/或胃腸道損害。
需要更低血糖水平的糖尿病個(gè)體可以用IL-7R拮抗劑例如拮抗性IL-7R抗體治療。使用本領(lǐng)域熟知的糖尿病臨床標(biāo)準(zhǔn)和預(yù)后指征選擇適于抗體治療的個(gè)體。通過已知預(yù)后指征評估為處于發(fā)生糖尿病危險(xiǎn)中的個(gè)體也允許施用IL-7R拮抗劑，所述指征如如家族史、空腹血糖水平或者降低的葡萄糖耐受性。本領(lǐng)域技術(shù)人員意識到或已知怎樣診斷具有糖尿病或者失調(diào)的葡萄糖吸收的個(gè)體，根據(jù)疾病的程度或嚴(yán)重性可適當(dāng)確定何時(shí)施用所述抗體及也可以選擇最希望的施用模式。
患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的個(gè)體可以用IL-7R拮抗劑如拮抗性IL-7R抗體治療。使用本領(lǐng)域熟知的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的臨床標(biāo)準(zhǔn)和預(yù)后指征選擇適于 IL-7R拮抗劑治療的個(gè)體。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的診斷和評估在本領(lǐng)域中是熟知的。嚴(yán)重性的評估可以基于本領(lǐng)域已知的測量進(jìn)行，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重性評分(RASS)。Bardwell et al. , Rheumatology,2002,41:38-45。在一些實(shí)施方案中，改善、控制類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生或進(jìn)展、降低類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生率和/或延遲類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎癥狀的發(fā)生或進(jìn)展通過RASS測量?；加欣钳彽膫€(gè)體可以用IL-7R拮抗劑如拮抗性IL-7R抗體治療。使用本領(lǐng)域熟知的狼瘡臨床標(biāo)準(zhǔn)和預(yù)后指征選擇適于IL-7R拮抗劑治療的個(gè)體。本領(lǐng)域技術(shù)人員意識到或已知怎樣診斷具有狼瘡的個(gè)體，及根據(jù)疾病的程度或嚴(yán)重性可適當(dāng)確定何時(shí)施用IL-7R拮抗劑及也可以選擇最希望的施用模式。患有多發(fā)性硬化的個(gè)體可以用IL-7R拮抗劑如拮抗性IL-7R抗體治療。使用本領(lǐng)域熟知的多發(fā)性硬化的臨床標(biāo)準(zhǔn)和預(yù)后指征選擇適于IL-7R拮抗劑治療的個(gè)體。通過已知預(yù)后指征評估的處于發(fā)生多發(fā)性硬化危險(xiǎn)中的個(gè)體也被允許施用IL-7R拮抗劑，所述指征如家族史或癥狀史。本領(lǐng)域技術(shù)人員意識到或已知怎樣診斷具有多發(fā)性硬化的個(gè)體及根據(jù)疾病的程度或嚴(yán)重性適當(dāng)確定何時(shí)施用IL-7R拮抗劑及也可以選擇最希望的施用模式?；加蠫VHD的個(gè)體可以用IL-7R拮抗劑如拮抗性IL-7R抗體治療。使用本領(lǐng)域熟知的GVHD臨床標(biāo)準(zhǔn)和預(yù)后指征選擇適于IL-7R拮抗劑治療的個(gè)體。GVHD的診斷或評估在本領(lǐng)域已經(jīng)充分確定。GVHD的檢測通常依賴于癥狀，但是可包括胃腸道內(nèi)窺鏡檢查，有或無活組織檢查、肝功能檢測(AST、ALP及膽紅素水平升高)、肝組織活檢、肺部X-射線檢查和/或皮膚活組織檢查。足以確定慢性GVHD診斷的特征包括例如但不限于硬化癥、扁平苔蘚樣損害、皮膚異色病、食管蹼、筋膜炎和閉塞性細(xì)支氣管炎(見如Leet andFlowers, Hematology, January 2008 ;2008:134-141)。急性肝 GVHD 可以通過例如急性患者中膽紅素水平測量。急性 皮膚GVHD可導(dǎo)致彌散性斑丘疹。GVHD嚴(yán)重性的評估可以基于本領(lǐng)域已知的測量進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，GVHD和/或GVHD癥狀的改善、控制、發(fā)生率降低或者疾病發(fā)生或進(jìn)展延遲通過整體級別(皮朕-肝-腸道)測量，每個(gè)器官評分從低值I分逐步至高值4分。在一些實(shí)施方案中，GVHD和/或GVHD癥狀的改善、控制、發(fā)生率降低或者發(fā)生和進(jìn)展延遲是通過檢測體重測量的。關(guān)于本文所述的所有方法，提及IL-7R拮抗劑時(shí)也包括包含一或多種其它物質(zhì)的組合物。這些組合物可進(jìn)ー步包含合適的賦形劑，如本領(lǐng)域熟知的藥物可接受的賦形劑，包括緩沖液。本發(fā)明可単獨(dú)使用或者組合其它常規(guī)治療方法。所述IL-7R拮抗劑可以通過任何合適途徑施用給個(gè)體。這些對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是明顯的，本文描述的實(shí)例不是意圖限制，只是舉例說明可利用的技木。因此，在一些實(shí)施方案中，根據(jù)已知方法如靜脈內(nèi)施用例如靜脈推注或在一段時(shí)間內(nèi)持續(xù)輸注、通過肌肉、腹膜內(nèi)、腦脊髓內(nèi)、經(jīng)皮、皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、舌下、滑膜內(nèi)、通過吹入、鞘內(nèi)、ロ服、吸入或者局部途徑施用給個(gè)體IL-7R拮抗劑。施用可以是全身性的，如靜脈內(nèi)施用，或者局部的。可商購的液體配制物的噴霧器，包括噴氣式噴霧器和超聲噴霧器可用于施用。液體配制物可以直接噴霧，凍干粉末可以在重建后噴霧?；蛘?，IL-7R拮抗劑可以使用碳氟化合物配制物和計(jì)量吸入器氣霧化，或者作為凍干和研磨的粉末吸入。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過位點(diǎn)特異性或靶向局部輸送技術(shù)施用IL-7R拮抗劑。舉例的位點(diǎn)特異性或靶向局部輸送技術(shù)包括IL-7R拮抗劑的各種可植入貯庫來源或者局部輸送導(dǎo)管，如注入導(dǎo)管、留置導(dǎo)管或針導(dǎo)管，合成的移植物，動脈外膜包膜(adventitialwrap),分流器(shunt)和支架或者其它可植入裝置,位點(diǎn)特異性載體,直接注射或直接應(yīng)用。見例如PCT出版物WO 00/53211和美國專利5，981，568。
IL-7R拮抗劑的各種配制物均可用于施用。在一些實(shí)施方案中，IL-7R拮抗劑可以純形式施用。在一些實(shí)施方案中，IL-7R拮抗劑與藥物可接受的賦形劑可以組合在各種配制物中。藥物可接受的賦形劑為本領(lǐng)域已知，是便于施用藥理學(xué)有效物質(zhì)的相對惰性的物質(zhì)。例如，賦形劑可以提供形式或一致性，或者作為稀釋劑。合適的賦形劑包括但不限于穩(wěn)定劑、濕潤劑和乳化劑，改變滲透性的鹽，包囊化劑，緩沖劑，及透皮增強(qiáng)劑。賦形劑以及腸胃外和非腸胃外藥物輸送配制物在Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing, 2000 中闡述。
在一些實(shí)施方案中，這些物質(zhì)配制成通過注射施用(如腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、肌肉注射等)。因此，這些物質(zhì)可以組合藥物可接受的載體如鹽水、Ringer’ s溶液、葡萄糖溶液等。特殊的給藥方案，即劑量、時(shí)機(jī)和重復(fù)將依賴于特定個(gè)體及個(gè)體的醫(yī)療史。
IL-7R拮抗劑可以使用任何合適方法施用，包括通過注射(如腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、肌肉等)。IL-7R抗體也可以通過吸入施用，如本文所述。通常，對于施用IL-7R抗體， 初始候選劑量可以是大約2mg/kg。對于本發(fā)明，典型每日劑量的范圍根據(jù)上述因素可以在從大約 3 μ g/kg 至 30 μ g/kg 至 300 μ g/kg 至 3mg/kg,至 30mg/kg,至 lOOmg/kg 或更多。例如，可以使用大約lmg/kg、大約2. 5mg/kg、大約5mg/kg、大約10mg/kg及大約25mg/kg的劑量。對于在幾天或更長時(shí)間內(nèi)的重復(fù)施用，根據(jù)具體情況持續(xù)治療直至出現(xiàn)希望的癥狀抑制或者直至達(dá)到足夠的治療水平，例如降低血糖水平。舉例的劑量方案包括施用初始劑量為大約2mg/kg,隨后每周一次維持劑量為大約lmg/kg的IL-7R抗體,或者隨后是每隔一周一次維持劑量為大約lmg/kg。然而，根據(jù)醫(yī)生希望達(dá)到的藥動學(xué)衰變模式也可以使用其它劑量方案。例如，在一些實(shí)施方案中，考慮一周1-4次給藥。在其它實(shí)施方案中，考慮一月一次或每隔一個(gè)月一次或每三個(gè)月一次給藥。這種治療的進(jìn)展通過常規(guī)技術(shù)和測定簡便地監(jiān)測。給藥方案(包括使用的IL-7R拮抗劑)可以隨時(shí)間變化。
對于本發(fā)明，IL-7R拮抗劑的合適劑量依賴于應(yīng)用的IL-7R拮抗劑(或者其組合物)，治療的癥狀的類型和嚴(yán)重性，無論施用所述物質(zhì)是預(yù)防性目的或是治療性目的，前期治療，患者的臨床病史及對所述物質(zhì)的反應(yīng)，患者對于施用的物質(zhì)的清除率，以及臨床醫(yī)生的決定。典型地，醫(yī)生將施用IL-7R拮抗劑直至達(dá)到實(shí)現(xiàn)希望的結(jié)果的劑量。劑量和/或頻率在治療過程中可以改變。經(jīng)驗(yàn)性判斷如半衰期通常有助于確定劑量。例如，與人免疫系統(tǒng)相容的抗體如人源化抗體或完全人抗體可用于延長抗體的半衰期及防止抗體被宿主免疫系統(tǒng)攻擊。在治療過程中可以確定并調(diào)整施用頻率，通常但非必須基于治療和/或癥狀的抑制和/或改善和/或延遲，如高血糖水平、關(guān)節(jié)痛等?；蛘撸卓剐訧L-7R抗體的持續(xù)連續(xù)釋放配制物可以是合適的。實(shí)現(xiàn)持續(xù)釋放的各種配制物和裝置為本領(lǐng)域已知。
在一個(gè)實(shí)施方案中，在已經(jīng)給予一或多次IL-7R拮抗劑的個(gè)體中，IL-7R拮抗劑的劑量可以根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定。給予個(gè)體逐漸增加劑量的IL-7R拮抗劑。為了 評估功效，可以遵照疾病指征。
根據(jù)本發(fā)明的方法施用IL-7R拮抗劑可以根據(jù)例如受體生理學(xué)狀況及技術(shù)人員已知的其它因素持續(xù)或間斷施用，無論施用目的是治療性的或是預(yù)防性的。IL-7R拮抗劑的施用在預(yù)選的時(shí)期可以基本是連續(xù)的或者可以是一系列間隔劑量。
在一些實(shí)施方案中，可以存在一種以上IL-7R拮抗劑。可以存在至少一種、至少兩種、至少三種、至少四種、至少五種不同的或者更多的IL-7R拮抗劑。通常，這些IL-7R拮抗劑可具有彼此無不利影響的互補(bǔ)活性。例如，可以使用一或多種如下IL-7R拮抗劑拮抗性IL-7R抗體，針對IL-7R的反義分子(包括針對編碼IL-7R的核酸的反義分子)，IL-7R抑制性化合物，及IL-7R結(jié)構(gòu)類似物。IL-7R拮抗劑也可與其它物質(zhì)聯(lián)合使用以增強(qiáng)和/或互補(bǔ)所述物質(zhì)的效力。本發(fā)明使用的IL-7R拮抗劑的治療配制物通過以凍干配制物或水溶液形式將具有希望純度的抗體與任選的藥物可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑混合而制備以貯存(Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing, 2000)?？山邮艿妮d體、賦形劑或穩(wěn)定劑在使用的劑量和濃度對于受體是無毒性的，可包含緩沖劑如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其它有機(jī)酸；鹽如氯化鈉；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(如十八烷基ニ甲基芐基氯化銨；氯化六甲雙銨；苯扎氯銨，芐索氯銨；苯酚、丁基或苯甲基醇；烷基對羥基苯甲酸酷，如甲基或丙基對羥基苯甲酸酯；兒茶酚；間苯ニ酚；環(huán)己醇；3_戊醇；及m-甲酚)；低分子量(少于大約10個(gè)殘基)多肽；蛋白質(zhì)，如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物如聚こ烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或者賴氨酸；單糖，ニ糖，及其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑如EDTA ;糖如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽平衡離子如鈉；金屬復(fù)合物(例如Zn-蛋白質(zhì)復(fù)合物)；和/或非離子表面活性劑如TWEEN 、PLUR0NICS 或聚こニ醇(PEG)。含有IL-7R拮抗劑的脂質(zhì)體通過本領(lǐng)域已知方法制備，如Epstein, etal. , Proc. Natl. Acad. Sc1. USA 82:3688, 1985 ；Hwang, et al. , Proc. Natl Acad. Sc1. USA77:4030, 1980 ;及美國專利4，485，045和4，544，545所述。具有增加的循環(huán)時(shí)間的脂質(zhì)體在美國專利5，013，556中掲示。特別有益的脂質(zhì)體可以通過逆相蒸發(fā)法產(chǎn)生，使用包含磷脂酰膽堿、膽固醇和PEG-衍生的磷脂酰こ醇胺(PEG-PE)的脂質(zhì)組合物進(jìn)行。通過指定孔徑的濾膜濾出脂質(zhì)體以產(chǎn)生具有希望直徑的脂質(zhì)體?；钚猿煞忠部梢园d在例如通過凝聚技術(shù)或通過界面聚合制備的微囊中，例如分別為羥甲基纖維素或明膠-微囊及聚(甲基甲基丙烯酸酷)微囊，在膠狀藥物輸送系統(tǒng)(例如脂質(zhì)體、白蛋白微球、微乳狀液、納米顆粒及納米膠囊)或在巨乳狀液中。這些技術(shù)在Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing, 2000 中描述?？梢灾苽涑掷m(xù)釋放制備物。持續(xù)釋放制備物的合適實(shí)例包括含有所述抗體的固體疏水性聚合物的半透性基質(zhì)，該基質(zhì)是有形顆粒形式，如薄膜或微囊。舉例的持續(xù)釋放基質(zhì)包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥こ基-甲基丙烯酸酷)，或者聚(こ烯醇))，聚交酯(美國專利3，773,919)，L-谷氨酸與7-こ基-L-谷氨酸的共聚物，不可降解的こ烯-こ酸こ烯酯共聚物,可降解的乳酸-こ醇酸共聚物如LUPRON DEPOT (由乳酸-こ醇酸共聚物及醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)組成的可注射微球體)，こ酸異丁酸鹿糖以及聚-D-(-)-3-羥丁酸。用于體內(nèi)施用的配制物必須是無菌的。這可易于通過例如滅菌過濾膜過濾而實(shí)現(xiàn)。治療性IL-7R拮抗劑組合物通常被置于具有無菌入口的容器中，例如具有可通過皮下注射針穿透的塞子的靜脈內(nèi)溶液袋或小瓶。本發(fā)明的組合物可以是單位劑量形式， 如片劑、藥丸、膠囊、粉末、顆粒、溶液或懸浮液，或者栓劑，以通過口服、腸胃外或直腸施用，或者通過吸入或吹入施用。
對于制備固體組合物如片劑，將主要的活性成分與藥物載體混合，例如常規(guī)的成片劑成分如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨糖醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸鎂、磷酸二鈣或樹膠，及其它藥物稀釋劑，如水，以形成含有本發(fā)明化合物或其無毒性藥物可接受的鹽的均質(zhì)混合物的固體預(yù)配制組合物。當(dāng)提及這些預(yù)配制組合物是均質(zhì)時(shí)，意味著活性成分在組合物中是均勻分散的，以便所述組合物可易于再分為等效單位劑量形式，如片劑、藥丸和膠囊。這種固體預(yù)配制組合物然后被再分為上述類型單位劑量形式，含有O.1至大約500mg本發(fā)明的活性成分。新組合物的片劑或藥丸可以包被或另外化合以提供賦予作用時(shí)間延長優(yōu)勢的劑型。例如，上述片劑或藥丸可包含內(nèi)部劑量和外部劑量成分，后者是前者的包膜形式。這兩種成分可以由腸衣分隔，上述腸衣抵抗在胃中崩解及允許內(nèi)部成分完整通過進(jìn)入十二指腸或者延遲釋放。許多材料可用于這種腸衣或包膜，這種材料包括許多高分子酸及高分子酸與這種材料如紫膠、十六烷醇和醋酸纖維素的混合物。
合適的表面活性劑特別包括非離子物質(zhì)，如聚氧乙烯山梨聚糖(例如Tween 20、 40、60、80或85)及其它山梨聚糖(例如Span 20、40、60、80或85)。具有表面活性劑的組合物便利地包含O. 05-5%的表面活性劑，及可以在O. 1-2. 5%之間。應(yīng)意識到可以加入其它成分，例如甘露醇或其它藥物可接受的載體(如果需要的話)。
合適的乳狀液可以使用可商購的脂肪乳狀液制備，如Intralipid 、Liposyn 、 Infonutrol >Lipofundin 和Lipiphysan ?；钚猿煞挚梢匀芙庠陬A(yù)混合的乳狀液組合物中，或者其可以溶解在油中(例如大豆油、紅花油、棉籽油、芝麻油、玉米油或杏仁油)及與磷脂混合時(shí)形成乳狀液(例如蛋黃磷脂、大豆磷脂或大豆卵磷脂)和水。應(yīng)意識到可以加入其它成分，例如甘油或葡萄糖，以調(diào)節(jié)所述乳狀液的張力。合適的乳狀液典型含有直至20% 的油，例如5-20%。所述脂肪乳狀液可包含O. 1-1. Oym的脂肪滴，特別是O. 1-0. 5 μ m，及 pH 范圍在 5. 5-8.0。
所述乳狀液組合物可以是通過混合IL-7R拮抗劑與Intralipid 或其成分(大豆油、蛋黃磷脂、甘油和水)而制備的那些。
吸入或吹入組合物包括在藥物可接受的水相或有機(jī)溶劑或其混合物中的溶液和懸浮液，以及粉末。液體或固體組合物可含有上述合適的藥物可接受的賦形劑。在一些實(shí)施方案中，所述組合物通過口腔或鼻呼吸途徑施用以發(fā)揮局部或全身作用。在優(yōu)選無菌藥物可接受的溶劑中的組合物可以通過使用氣體霧化。霧化的溶液可以從霧化裝置中直接吸入或者霧化裝置可以附面罩、帷幕(tent)或間歇性正壓呼吸機(jī)。溶液、懸浮液或粉末組合物可以優(yōu)選以適當(dāng)方式經(jīng)口腔或鼻從輸送該配制物的裝置施用。
IL-7R 拮抗劑
本發(fā)明的方法使用IL-7R拮抗劑，其是指阻斷、抑制或降低(包括顯著降低)IL_7R 生物學(xué)活性(包括通過IL-7R信號傳導(dǎo)介導(dǎo)的下游途徑，如激發(fā)對于IL-7R的細(xì)胞應(yīng)答)的任何蛋白質(zhì)、肽或核酸分子。舉例的IL-7R拮抗劑包括但不限于拮抗性IL-7R抗體、IL-7R siRNA, IL-7R shRNA 及 IL-7R 反義寡核苷酸。
IL-7R拮抗劑應(yīng)呈現(xiàn)出任一或多種如下特征(a)結(jié)合IL_7R ； (b)阻斷IL-7R與 IL-7相互作用；(c)阻斷或降低IL-7-介導(dǎo)的STAT5磷酸化；(d)降低體內(nèi)血糖水平；(e)增加體內(nèi)葡萄糖耐受；(f)降低實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)的疾病嚴(yán)重性；(g)阻斷或降低PI3K磷酸化；(h)阻斷或降低AKT磷酸化 '及(i)阻斷IL-7R與其它還未鑒別的因子的相互作用。在一些實(shí)施方案中，所述IL-7R拮抗劑是拮抗性IL-7R抗體。對于本發(fā)明，拮抗性IL-7R抗體優(yōu)選與IL-7Ra以抑制IL-7R信號傳導(dǎo)功能及IL-7相互作用的方式反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，所述拮抗性IL-7R抗體特異性識別靈長類IL-7R。在一些實(shí)施方案中，所述拮抗性IL-7R抗體結(jié)合靈長類和嚙齒類IL-7R?？捎糜诒景l(fā)明的抗體可包含單克隆抗體，多克隆抗體，抗體片段(如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、Fc等)，嵌合抗體,雙特異性抗體,異源綴合物(heteroconjugate)抗體,單鏈抗體(ScFv)，其突變體，包含抗體一部分(如結(jié)構(gòu)域抗體)的融合蛋白，人源化抗體，及包含所需特異性的抗原識別位點(diǎn)的免疫球蛋白分子的任何其它修飾的構(gòu)型，包括抗體的糖基化變體，抗體的氨基酸序列變體，及共價(jià)修飾的抗體。所述抗體可以是鼠、大鼠、人或任何其它來源(包括嵌合或人源化抗體)。在一些實(shí)施方案中，拮抗性IL-7R抗體是單克隆抗體。所述拮抗性IL-7R抗體也可以是人源化的。在其它實(shí)施方案中，所述抗體是人抗體。在一些實(shí)施方案中，所述抗體包含修飾的恒定區(qū)，例如但不限于激發(fā)免疫應(yīng)答的潛カ增加的恒定區(qū)。例如，所述恒定區(qū)可以被修飾為對Fe Y受體如Fe YRI或Fe Y RIIA具有増加的親和性。在一些實(shí)施方案中，所述抗體包含修飾的恒定區(qū)，如是免疫學(xué)惰性的、即激發(fā)免疫應(yīng)答潛力下降的恒定區(qū)。在一些實(shí)`施方案中，所述恒定區(qū)如Eur.J.1mmunol.，1999，29:2613-2624 ；PCT 申請?zhí)?PCT/GB99/01441 ;和/或 UK 專利申請?zhí)?809951. 8所述被修飾的恒定區(qū)。Fe可以是人IgGl、人IgG2或人IgG4。Fe可以是含有A330P331突變?yōu)镾330S331(IgG2Aa)的人IgG2，其中氨基酸殘基參考野生型IgG2序列編號。Eur. J.1mmunol.，1999,29:2613-2624。在一些實(shí)施方案中，所述抗體包含具有如下突變的 IgG4 的恒定區(qū)(Armour et al. , 2003, Molecular Immunology 40585-593)E233F234L235突變?yōu)镻233V234A235 (IgG4 A c)，其中編號參考野生型IgG4。在另ー實(shí)施方案中，F(xiàn)e 是人 IgG4E233F234L235 突變?yōu)?P233V234A235，具有 G236 缺失(IgG4Ab)。在另一實(shí)施方案中，F(xiàn)e是任何人IgG4Fc (IgG4、IgG4 A b或IgG4 A c)，含有鉸鏈穩(wěn)定突變S228突變?yōu)?P228 (Aalberse et al. , 2002, Immunology 105,9-19)。在另一實(shí)施方案中，F(xiàn)e 可以是無糖基化Fe。在一些實(shí)施方案中，所述恒定區(qū)是通過突變寡糖附著殘基(如Asn297)和/或是恒定區(qū)中糖基化識別序列一部分的側(cè)翼殘基而無糖基化的。在一些實(shí)施方案中，所述恒定區(qū)對于N連接的糖基化而是經(jīng)酶學(xué)無糖基化的。所述恒定區(qū)可以是對于N連接的糖基化經(jīng)酶學(xué)無糖基化或者通過在糖基化缺陷型宿主細(xì)胞中表達(dá)而無糖基化的。拮抗性IL-7R抗體與IL-7R(如人IL-7R)的結(jié)合親和性(Kd)可以是大約0. 002至大約200nM。在一些實(shí)施方案中，所述結(jié)合親和性是大約200nM、大約IOOnM、大約50nM、大約10nM、大約InM、大約500pM、大約100pM、大約60pM、大約50pM、大約20pM、大約15pM、大約10pM、大約5pM或大約2pM的任一。在一些實(shí)施方案中，所述結(jié)合親和性低于大約250nM、大約200nM、大約100nM、大約50nM、大約10nM、大約InM、大約500pM、大約100pM、大約50pM、大約20pM、大約10pM、大約5pM或大約2pM任一。
確定抗體與IL-7R的結(jié)合親和性的一種方式是通過測量所述抗體的單功能Fab片段的結(jié)合親和性。為獲得單功能Fab片段，可以將抗體(例如IgG)用木瓜蛋白酶裂解或者重組表達(dá)?？贵w的IL-7R Fab片段的親和性可以使用HBS-EP運(yùn)行緩沖液(O. OlM HEPES, pH 7. 4,0. 15NaCl, 3mM EDTA, O. 005%v/v Surfactant P20)通過表面等離子體共振技術(shù)石角定(Biacore 3000 表面等離子體共振(SPR)系統(tǒng)，Biacore , INC, Piscataway NJ),該系統(tǒng)裝備了預(yù)先固定的鏈霉抗生物素蛋白傳感器芯片(SA)。生物素化的人IL-7R(或任何其它IL-7R)可以在HBS-EP緩沖液中稀釋至濃度低于O. 5 μ g/mL,使用可變接觸時(shí)間注射至各個(gè)芯片通道，以獲得兩個(gè)抗原密度范圍，即對于詳細(xì)的動力學(xué)研究為50-200應(yīng)答單位 (RU)，或者對于篩選測定的800-1，000RU。再生研究示出在25%v/v乙醇中的25mM NaOH有效除去結(jié)合的Fab，而超過200次注射仍保持芯片上IL-7R的活性。典型地，將系列稀釋 (跨越O.1-1Ox估計(jì)的Kd濃度)的純化的Fab樣品以100 μ L/分鐘注射I分鐘，使解離時(shí)間直至2小時(shí)。Fab蛋白質(zhì)的濃度通過ELISA和/或SDS-PAGE電泳確定，使用已知濃度 (通過氨基酸分析確定)的Fab作為標(biāo)準(zhǔn)。動力學(xué)結(jié)合速率(km)和解離速率通過使用BIAevaluation程序?qū)?shù)據(jù)全局?jǐn)M合進(jìn)1:1Langmuir結(jié)合模型(Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B. (1994). MethodsEnzymology 6.99-110)而同時(shí)獲得。平衡解離常數(shù)(Kd)值以kf/U計(jì)算。這個(gè)方案適用于確定抗體與任何IL-7R的結(jié)合親和性，所述 IL-7R包括人IL-7R、另一哺乳動物的IL_7R(如小鼠IL-7R、大鼠IL-7R、靈長類IL-7R)以及不同形式的IL-7R?？贵w的結(jié)合親和性通常在25° C測量，但是也可以在37° C測量。
拮抗性IL-7R抗體可以通過本領(lǐng)域任何已知方法產(chǎn)生，包括如實(shí)施例1提供的方法。對于產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞系，免疫宿主動物的途徑和方案通常與經(jīng)確定的和常規(guī)的抗體刺激和產(chǎn)生技術(shù)一致，如本文進(jìn)一步描述。產(chǎn)生人和小鼠抗體的一般技術(shù)為本領(lǐng)域已知和/ 或在本文描述。
預(yù)期可以操縱任何哺乳動物對象包括人或來自其的抗體產(chǎn)生細(xì)胞作為產(chǎn)生哺乳動物包括人雜交瘤細(xì)胞系的基礎(chǔ)。典型地，用一定量的免疫原包括本文所述的免疫原經(jīng)腹膜內(nèi)、肌肉、口服、皮下、足釀(intraplantar)和/或皮內(nèi)接種所述宿主動物。
使用常規(guī)體細(xì)胞雜交技術(shù)(Kohler,B. and Milstein, C.，1975，Nature256:495-49 7)或者如Buck, D.W.，et al.，In Vitro, 18:377-381, 1982所述修改的技術(shù)可以從淋巴細(xì)胞和永生化骨髓瘤細(xì)胞制備雜交瘤?？衫玫墓撬枇?細(xì)胞系包括但不限于X63-Ag8. 653和得自 Salk Institute, Cell Distribution Center, San Diego, Calif.，USA 的那些細(xì)胞系可用于雜交。通常，所述技術(shù)包括融合骨髓瘤細(xì)胞和淋巴樣細(xì)胞，使用促融劑如聚乙二醇或者通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的電學(xué)方式進(jìn)行。在融合之后，從融合培養(yǎng)基中分離細(xì)胞，在選擇性生長培養(yǎng)基如次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸苷(HAT)培養(yǎng)基中生長，以消除未雜交的親代細(xì)胞。本文描述的任何培養(yǎng)基，補(bǔ)加或不補(bǔ)加血清，可用于培養(yǎng)分泌單克隆抗體的雜交瘤。作為另一種細(xì)胞融合技術(shù)，EBV永生化B細(xì)胞可用于產(chǎn)生本發(fā)明的IL-7R單克隆抗體。如果需要，擴(kuò)增及亞克隆所述雜交瘤，通過常規(guī)免疫測定方法測定上清的抗免疫原活性(如放射性免疫測定，酶免疫測定或者熒光免疫測定)。
可用作抗體來源的雜交瘤包含親代雜交瘤的所有衍生物、后代細(xì)胞，其產(chǎn)生特異于IL-7R或其一部分的單克隆抗體。
產(chǎn)生這種抗體的雜交瘤可以在體外或體內(nèi)通過使用已知方法生長。單克隆抗體可以分離自培養(yǎng)基或者體液，通過常規(guī)免疫球蛋白純化程序進(jìn)行，如硫酸銨沉淀、凝膠電泳、透析、層析及超濾，如果需要的話。如果存在不需要的活性，則可以除去，例如通過將制備物通過由附著于固相的免疫原制成的吸附劑及從免疫原中洗脫或釋放希望的抗體。用人IL-7Ra或含有與蛋白質(zhì)綴合的靶氨基酸序列的片段免疫宿主動物可產(chǎn)生一群抗體(如單克隆抗體)，所述蛋白質(zhì)在被免疫的物種中是免疫原性的，如匙孔血藍(lán)蛋白、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白，或大豆胰蛋白酶抑制劑，使用雙功能或衍生化試劑，例如馬來酰亞胺苯甲?；腔牾啺房?通過半胱氨酸殘基綴合)、N-羥基琥珀酰亞胺(通過賴氨酸殘基)、戊ニ醛、琥珀酸酐、SOCl2或R1N=C=NR,其中R和R1是不同的烷基基團(tuán)。 如果需要，可以對感興趣的拮抗性IL-7R抗體(單克隆或多克隆抗體)測序，然后可以將多核苷酸序列克隆進(jìn)載體中以表達(dá)或増殖。編碼感興趣抗體的序列可以在宿主細(xì)胞中在載體中維持，然后可以將宿主細(xì)胞擴(kuò)增及冷凍以備進(jìn)ー步使用?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知方式從B細(xì)胞中克隆抗體基因而在細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生重組單克隆抗體。見例如Tiller etal.，2008，J.1mmunol. Methods 329，112 ;美國專利 7，314，622?；蛘?，多核苷酸序列可用于遺傳操縱以“人源化”抗體或改善抗體的親和性或其它特性。例如，恒定區(qū)可以工程化為更類似人恒定區(qū)，以避免所述抗體用于在人體臨床試驗(yàn)和治療中的免疫應(yīng)答?？善谕麑贵w序列進(jìn)行遺傳操縱以獲得對于IL-7R的更高親和性及在抑制IL-7R中的更高效力。本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然已知可以對拮抗性IL-7R抗體進(jìn)行ー或多個(gè)多核苷酸改變并仍保留其與IL-7R的結(jié)合能力。有四個(gè)常規(guī)步驟人源化單克隆抗體。這些是(I)確定起始抗體輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域的核苷酸和推定的氨基酸序列，(2)設(shè)計(jì)人源化抗體，即決定在人源化過程中使用哪個(gè)抗體構(gòu)架區(qū)，(3)實(shí)際的人源化方法/技術(shù)，及(4)人源化抗體的轉(zhuǎn)染和表達(dá)。見例如美國專利 4，816，567,5, 807，715,5, 866，692,6, 331，415,5, 530，101,5, 693，761,5, 693，762、5，585，089 和 6，180，370。本領(lǐng)域已經(jīng)描述了許多包含衍生自非人免疫球蛋白的抗原結(jié)合位點(diǎn)的“人源化”抗體分子，包括具有與人恒定區(qū)融合的嚙齒類或修飾的嚙齒類V區(qū)及其相關(guān)CDR的嵌合抗體。見例如 Winter et al. Nature 349:293-299，1991、Lobuglio et al. Proc.Nat.Acad. Sc1. USA 86:4220-4224，1989、Shaw et al. J Immunol. 138:4534-4538，1987以及Brown et al. Cancer Res. 47:3577-3583，1987。其它參考文獻(xiàn)描述了移植進(jìn)人支持構(gòu)架區(qū)(FR)中的嚙齒類CDR，之后與合適的人抗體恒定區(qū)融合。見例如Riechmann etal. Nature 332:323-327，1988、Verhoeyen et al. Science 239:1534-1536，1988 及 Joneset al.Nature321:522-525, 1986。另ー參考文獻(xiàn)描述了由重組工程化的嚙齒類構(gòu)架區(qū)支持的嚙齒類⑶R。見例如歐洲專利出版物0519596。這些“人源化”分子被設(shè)計(jì)為使得對于嚙齒類動物抗人抗體分子的不希望的免疫應(yīng)答(其限制這些部分在人體受體中治療性應(yīng)用的持續(xù)時(shí)間和效力)最小化。例如，抗體恒定區(qū)可以被工程化，由此其是免疫學(xué)惰性的(如不激發(fā)補(bǔ)體裂解)。見例如PCT出版物PCT/GB99/01441、英國專利申請9809951. 8。也可以使用的其它人源化抗體的方法由Daugherty et al. , Nucl. Acids Res. 19:247ト2476，1991及美國專利 6，180，377,6, 054，297,5, 997，867,5, 866，692,6, 210，671 和 6，350，861 以及 PCT出版物WO 01/27160描述。顯然盡管上文所述是關(guān)于人源化抗體，但是所述一般原理可適用于定制抗體用于例如狗、貓、靈長類動物、馬和牛。進(jìn)一步地，本文所述人源化抗體的一或多個(gè)方面可以組合，如CDR移植、構(gòu)架突變和CDR突變。
或者，完全人抗體可以通過使用可商購的小鼠獲得，所述小鼠已經(jīng)工程化為表達(dá)特異性人免疫球蛋白。設(shè)計(jì)為產(chǎn)生更希望的(如完全人抗體)或更強(qiáng)力的免疫應(yīng)答的轉(zhuǎn)基因動物也可以用于產(chǎn)生人源化或人抗體。舉例的這種技術(shù)是來自AbgeniX，Inc. (Fremont, CA)的 Xenomouse 及來自 Medarex, Inc. (Princeton, NJ)的 I luMAb-1Vlouse 和 TC Mouse 。
或者，可以使用本領(lǐng)域已知的任何方法重組產(chǎn)生及表達(dá)抗體。或者，抗體可以通過噬菌體展示技術(shù)重組產(chǎn)生。見例如美國專利5，565，332,5, 580，717,5, 733，743和 6，265，150 ;以及 Winter et al.，Annu. Rev.1mmunol. 12:433-455，1994。或者，卩遼菌體展示技術(shù)(McCafferty et al. , Nature 348:552-553，1990)可用于在體外從未免疫供體的免疫球蛋白可變(V)結(jié)構(gòu)域基因所有組分中產(chǎn)生人抗體和抗體片段。根據(jù)這種技術(shù)，抗體V結(jié)構(gòu)域基因被符合讀框地克隆進(jìn)絲狀噬菌體如M13或fd的主要或次要外殼蛋白基因中，并在噬菌體顆粒表面上展示為功能性抗體片段。由于絲狀顆粒含有噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，因此基于抗體的功能性質(zhì)進(jìn)行的選擇也導(dǎo)致編碼呈現(xiàn)這些性質(zhì)的抗體的基因的選擇。因此，噬菌體模擬B細(xì)胞的一些性質(zhì)。噬菌體展示可以許多形式進(jìn)行，參見如 Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J. , Current Opinion in Structural Biology 3:564-571,1993。一些V基因節(jié)段的來源可用于噬菌體展示。Clackson et al. , Nature 352:624-628，1991從衍生自免疫的小鼠的脾的V基因的一個(gè)小隨機(jī)組合文庫中分離了抗噁唑酮抗體的多樣性陣列。使用基本如Mark et al.，J. Mol. Biol. 222:581-597，1991 或Griffith et al. , EMBO J. 12:725-734，1993所述技術(shù)，可以構(gòu)建來自未免疫的人供體的V基因的所有組分并且可以分離針對多樣性抗原陣列(包括自身抗原)的抗體。在天然免疫應(yīng)答中，抗體基因高速積累突變(體細(xì)胞超變)。一些導(dǎo)入的改變將賦予較高的親和性，展示高親和性表面免疫球蛋白的B細(xì)胞在隨后的抗原攻擊期間優(yōu)先復(fù)制并分化。這種天然過程可以通過應(yīng)用已知為“鏈改組”的技術(shù)模擬(Marks et al. , Bio/ Technol. 10:779-783, 1992)。在這種方法中，通過噬菌體展示獲得的“原始”人抗體的親和性可以通過用得自未免疫的供體的V結(jié)構(gòu)域基因的天然發(fā)生的變體(所有組分)相繼置換重鏈和輕鏈V區(qū)基因而改善。這種技術(shù)使得可以產(chǎn)生親和性在pM-nM范圍內(nèi)的抗體和抗體片段。產(chǎn)生非常大的噬菌體抗體所有組分的策略(也稱作“所有文庫的根源(the mother of all libraries)”)已經(jīng)由 Waterhouse et al. , Nucl. Acids Res. 21:2265-2266，1993 描述。基因改組也可以用于從嚙齒類動物抗體中衍生人抗體，其中所述人抗體與起始嚙齒類動物抗體具有相似親和性和特異性。根據(jù)這種方法，也稱作“表位印記(imprinting) ”， 通過噬菌體展示技術(shù)獲得的嚙齒類動物抗體的重鏈或輕鏈V結(jié)構(gòu)域基因由人V結(jié)構(gòu)域基因的所有組分置換，產(chǎn)生嚙齒類-人嵌合物?；诳乖倪x擇導(dǎo)致能恢復(fù)功能性 抗原結(jié)合位點(diǎn)的人可變區(qū)的分離，即表位控制(印記)配偶體的選擇。當(dāng)重復(fù)進(jìn)行該方法以置換剩余的嚙齒類動物V結(jié)構(gòu)域時(shí)，獲得人抗體(見PCT出版物W093/06213)。與通過⑶R移植人源化嚙齒類動物抗體的傳統(tǒng)方法不同，這種技術(shù)提供了完全人抗體，其不具有嚙齒類動物源的構(gòu)架或⑶R殘基。
抗體可以重組產(chǎn)生，通過首先從宿主動物分離抗體及產(chǎn)生抗體的細(xì)胞，獲得基因序列及使用該基因序列在宿主細(xì)胞(如CHO細(xì)胞)中重組表達(dá)抗體而產(chǎn)生?？梢允褂玫牧硪环椒ㄊ窃谥参?如煙草)或轉(zhuǎn)基因乳中表達(dá)抗體序列。在植物或乳中重組表達(dá)抗體的方法已經(jīng)在本領(lǐng)域揭不。見例如 Peeters, et al. Vaccine 19:2756, 2001 ；Lonberg, N.and D. Huszar Int. Rev.1mmunol 13:65，1995 以及 Pollock, et al. , J Tmmuno I Methods231:147，1999。產(chǎn)生抗體衍生物如人源化單鏈等的方法為本領(lǐng)域已知。免疫測定和流式細(xì)胞計(jì)量分選技術(shù)如熒光激活細(xì)胞分選技術(shù)(FACS)也可用于分離特異于IL-7R的抗體。所述抗體可以結(jié)合許多不同載體。載體可以是活性和/或惰性的。舉例的熟知載體包括聚丙烯、聚苯こ烯、聚こ烯、葡聚糖、尼龍、淀粉酶、玻璃、天然和修飾的纖維素、聚丙烯酰胺、瓊脂糖和磁鐵。對于本發(fā)明，載體的性質(zhì)可以是可溶的或不溶的。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知其它合適的載體用于結(jié)合抗體，或者使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)?zāi)艽_定合適的載體。在一些實(shí)施方案中，所述載體包含靶向心肌的部分。編碼單克隆抗體的DNA使用常規(guī)方法可易于分離及測序(如通過使用能特異性結(jié)合編碼單克隆抗體的重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)。雜交瘤細(xì)胞可作為這種DNA的優(yōu)選來源。一旦分離，所述DNA可以置于表達(dá)載體中(如在PCT出版物WO 87/04462中掲示的表達(dá)載體)，然后轉(zhuǎn)染進(jìn)宿主細(xì)胞如大腸桿菌細(xì)胞、猿猴COS細(xì)胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞，或者不另外產(chǎn)生免疫球蛋白的骨髄瘤細(xì)胞，以獲得在重組宿主細(xì)胞中合成單克隆抗體。見例如PCT出版物WO 87/04462所述。所述DNA也可以被修飾，例如通過用人重鏈和輕鏈恒定區(qū)編碼序列代替同源鼠序列(Morrison et al. , Proc. Nat. Acad.Sc1. 81:6851, 1984)，或者通過共價(jià)結(jié)合免疫球蛋白編碼序列與非免疫球蛋白多肽的所有或部分編碼序列。以這種方式，制備具有本文IL-7R單克隆抗體結(jié)合特異性的“嵌合”或“雜種”抗體。拮抗性IL-7R抗體可以使用本領(lǐng)域已知的方法鑒別或鑒定，從而檢測和/或測量IL-7R生物學(xué)活性的降低、改善或中和。在一些實(shí)施方案中，拮抗性IL-7R抗體通過將候選物質(zhì)與IL-7R保溫及監(jiān) 測結(jié)合和/或隨之IL-7R生物學(xué)活性的降低或中和而鑒別。所述結(jié)合測定可以用純化的IL-7R多肽進(jìn)行，或者用天然表達(dá)或被轉(zhuǎn)染表達(dá)IL-7R多肽的細(xì)胞進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述結(jié)合測定是競爭性結(jié)合測定，其中評估候選抗體與已知IL-7R拮抗劑競爭結(jié)合IL-7R的能力。該測定可以各種形式進(jìn)行，包括ELISA形式。在其它實(shí)施方案中，拮抗性IL-7R抗體通過將候選物質(zhì)與IL-7R保溫并監(jiān)測結(jié)合及隨之的STAT5磷酸化抑制而鑒別。在初始鑒別后，可以通過已知檢測靶向生物學(xué)活性的生物測定進(jìn)一步證實(shí)和細(xì)化候選拮抗性IL-7R抗體的活性。或者，生物測定可用于直接篩選候選物。一些鑒別和鑒定拮抗性IL-7R抗體的方法在實(shí)施例中詳細(xì)描述。拮抗性IL-7R抗體可以使用本領(lǐng)域熟知的方法鑒定。例如，ー種方法是鑒別其結(jié)合的表位或者“表位作圖”。本領(lǐng)域已知許多對蛋白質(zhì)上表位的位置進(jìn)行作圖和鑒定的方法，包括分辨抗體-抗原復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，競爭性測定，基因片段表達(dá)測定以及基于合成的妝的測定，例如在 Harlow and Lane, Using Antibodies, a Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1999 中果 11 章描述。在另ー實(shí)例中，表位作圖可用于確定拮抗性IL-7R抗體結(jié)合的序列。表位作圖可商購自各個(gè)來源，例如 Pepscan Systems (Edelhertweg 15, 8219PH Lelystad, The Netherlands)。所述表位可以是線性表位，即包含于一單段氨基酸序列中，或者是構(gòu)象表位，其通過可非必須包含于一單段序列中的氨基酸的三維相互作用形成?？梢苑蛛x或合成(如重組)不同長度 (如長度為至少4-6個(gè)氨基酸)的肽并用于使用拮抗性IL-7R抗體的結(jié)合測定中。在另一實(shí)例中，拮抗性IL-7R抗體結(jié)合的表位可以在系統(tǒng)篩選中確定，通過使用衍生自IL-7R序列的重疊肽及確定拮抗性IL-7R抗體的結(jié)合而進(jìn)行。根據(jù)基因片段表達(dá)測定，編碼IL-7R的開放讀框被隨機(jī)片段化或者通過特異性遺傳構(gòu)建片段化并確定表達(dá)的IL-7R片段與檢測抗體的反應(yīng)性。所述基因片段可例如通過PCR產(chǎn)生，然后在存在放射性氨基酸的條件下在體外轉(zhuǎn)錄及翻譯為蛋白質(zhì)。然后通過免疫沉淀和凝膠電泳確定抗體與放射性標(biāo)記的IL-7R 片段的結(jié)合。一些表位也可以通過使用在噬菌體顆粒表面上展示的隨機(jī)肽序列的大文庫鑒別(噬菌體文庫)?；蛘?，可以檢測一限定的重疊肽片段文庫在簡便結(jié)合測定中與測試抗體的結(jié)合。在另一實(shí)例中，可以進(jìn)行抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的誘變，結(jié)構(gòu)域交換(swapping)實(shí)驗(yàn)及丙氨酸掃描誘變以鑒別用于表位結(jié)合需要的、足夠的和/或必需的殘基。例如，可以使用突變IL-7R進(jìn)行結(jié)構(gòu)域交換實(shí)驗(yàn)，其中IL-7R多肽的各種片段已經(jīng)用來自另一物種的 IL-7R序列置換(交換)，或者使用密切相關(guān)的但是抗原性不同的蛋白質(zhì)(如前蛋白轉(zhuǎn)變酶 (proprotein convertase)家族的另一成員進(jìn)行。通過評估抗體與突變IL-7R的結(jié)合,可以評估特定IL-7R片段對于抗體結(jié)合的重要性。
可用于鑒定拮抗性IL-7R抗體的另一方法是使用競爭測定，該測定使用已知結(jié)合相同抗原即IL-7R上的各個(gè)片段的其它抗體，以確定所述拮抗性IL-7R抗體是否與其它抗體結(jié)合相同的表位。競爭測定為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。
表達(dá)載體可用于指導(dǎo)拮抗性IL-7R抗體的表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知施用表達(dá)載體以獲得外源蛋白在體內(nèi)的表達(dá)。見例如美國專利6，436，908,6, 413，942和6，376，471所述。表達(dá)載體的施用包括局部或全身施用，包括注射、口服施用、基因槍或經(jīng)導(dǎo)管施用，以及體表(topical)施用。在另一實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體是直接施用交感干或神經(jīng)節(jié)，或者施用給冠狀動脈、心房、心室或心包。
也可以使用靶向輸送含有表達(dá)載體或次基因組多核苷酸的治療組合物。受體介導(dǎo)的 DNA 輸送技術(shù)在例如 Findeis et al. , Trends Biotechnol.，1993，11:202、Chiou et al. , Gene Therapeutics:Methods And Applications Of Direct Gene Transfer, J. A. Wolff, ed. , 1994, Wu et al. , J. Biol. Chem. , 1988, 263:621, Wu et al. , J. Biol. Chem.，1994，269:542、Zenke et al. , Proc. Natl. Acad. Sc1. USA, 1990, 87: 3655> Wu et al., J. Biol. Chem. , 1991,266:338中描述。含有多核苷酸的治療組合物在基因治療方案中局部施用的范圍是大約IOOng至大約200mg的DNA。在基因治療方案期間也可以使用大約 500ng至大約50mg、大約Iyg至大約2mg、大約5 μ g至大約500 μ g及大約20 μ g至大約 100 μ g的DNA的濃度范圍。所述治療性多核苷酸和多肽可以使用基因輸送載體輸送。所述基因輸送載體可以是病毒或非病毒來源的 (見Jolly, Cancer Gene Therapy, 1994, 1:51； Kimura, Human Gene Therapy,1994, 5:845 ；Connelly, Human Gene Therapy,1995, 1:185 ； 及Kaplitt, Nature Genetics, 1994,6:148)。這種編碼序列的表達(dá)可以使用內(nèi)源哺乳動物或異源啟動子誘導(dǎo)。所述編碼序列的表達(dá)可以是組成型或受調(diào)節(jié)的。
輸送希望的多核苷酸及在希望的細(xì)胞中表達(dá)的基于病毒的載體為本領(lǐng)域熟知。舉例的基于病毒的載體包括但不限于重組逆轉(zhuǎn)錄病毒(見例如PCT出版物WO 90/07936 ；WO 94/03622 ；W0 93/25698 ；W0 93/25234 ；W093/11230 ；W0 93/10218 ；W0 91/02805 ；美國專利 5，219，740 和 4，777，127 ；GB 專利 2，200，651 ;及 EP 專利 0 345 242);基于 a 病毒的載體(如 Sindbis 病毒載體，Semliki 森林病毒(ATCC VR-67 ；ATCC VR-1247)，RossRiver 病毒(ATCC VR-373 ；ATCC VR-1246)及 Venezuelan 馬腦炎病毒(ATCCVR-923 ;ATCCVR-1250 ；ATCC VR 1249 ；ATCC VR-532));以及腺伴隨病毒(AAV)載體(見例如PCT出版物WO 94/12649, WO 93/03769 ；W093/19191 ；W0 94/28938 ；W0 95/11984 和 WO 95/00655)。也可以施用如在Curiel，Hum. Gene Ther.，1992,3:147中描述的與滅活的腺病毒相連的DNA。也可以應(yīng)用非病毒輸送載體和方法，包括但不限干與滅活的腺病毒連接或不連接的聚陽離子濃縮的DNA(見例如Curiel, Hum. Gene Ther. , 1992, 3:147);配體連接的DNA(見例如Wu，J. Biol. Chem.，1989，264:16985);真核細(xì)胞輸送載體細(xì)胞(見例如美國專利 5, 814, 482 ；PCT 出版物 WO 95/07994 ；W0 96/17072 ；W0 95/30763 及 TO 97/42338)以及與細(xì)胞膜的核酸電荷中和或融合。也可以使用裸DNA。舉例的裸DNA導(dǎo)入方法在PCT出版物WO 90/11092及美國專利5，580，859中描述?？勺鳛榛蜉斔洼d體的脂質(zhì)體在美國專利 5，422，120、PCT 出版物 WO 95/13796、WO 94/23697、W091/14445 和 EP 0524968 中描述。另外的方法在Philip, Mol. Cell Biol. , 1994, 14:2411 及 Woffendin, Proc. Natl. Acad.Sc1.，1994,91:1581 中描述。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涵蓋了包括本文所述或通過本發(fā)明方法產(chǎn)生及具有本文所述特性的抗體的組合物、包括藥物組合物。如本文所用，組合物包含拮抗IL-7R與IL-7相互作用的一或多種抗體，和/或包含編碼ー或多種這些抗體的序列的一或多種多核苷酸。這些組合物可進(jìn)ー步包含合適的賦形劑，如本領(lǐng)域熟知的藥物可接受的賦形劑，包括緩沖劑。本發(fā)明的拮抗性IL-7R抗體的特征在 于任意(一或多個(gè))如下特征(a)結(jié)合IL-7R ； (b)阻斷IL-7R與IL-7相互作用；(c)阻斷或降低IL-1-介導(dǎo)的STAT5磷酸化；(d)降低體內(nèi)血糖水平；(e)改善體內(nèi)葡萄糖耐受性；及(f)降低EAE疾病嚴(yán)重性。優(yōu)選地，拮抗性IL-7R抗體具有兩或更多個(gè)這些特征。更優(yōu)選地，所述抗體具有三或更多個(gè)所述特征。更優(yōu)選地，所述抗體具有四或更多個(gè)所述特征。更優(yōu)選地，所述抗體具有五或更多個(gè)所述特征。最優(yōu)選地，所述抗體具有所有這六個(gè)特征。因此，本發(fā)明提供了如下任一物質(zhì)或者包含如下任一物質(zhì)的組合物(包括藥物組合物)(a)具有如下的部分輕鏈序列的抗體NFMLTQPHSVSGSPGKTVTISCTRSSGSIDSSYVQWYQQRPGNSPTTVIYEDDQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLVTEDEADYYCQSYDSSHLVFGGGTKLTVLC(SEQ ID NO:1),NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTGSSGRIASSYVQWYQQRPGSAPTTVIYEDNQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSYASSSLWVFGGGTQLTVLS(SEQ ID NO:3)，NFMLTQPHSVSGSPGKTVTISCTRSSGSIDSSYVQWYQQRPGNSPTTVIYEDDQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLVTEDEADYYCMQYDSSHLVFGGGTKLTVLC(SEQ ID NO:5)，NFMLTQPHSVSGSPGKTVTISCTRSSGSIDSSYVQWYQQRPGNSPTTVIYEDDQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLVTEDEADYYCQSYDFHHLVFGGGTKLTVLC(SEQ ID NO:7)，NFMLTQPHSVSGSPGKTVTISCTRSSGSIDSSYVQWYQQRPGNSPTTVIYEDDQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLVTEDEADYYCQSYDFHHLVFGGGTKLTVLC(SEQ ID NO:9)，
NFMLTQPHSVSGSPGKTVTISCTRSSGSIDSSYVQWYQQRPGNSPTTVIYEDDQRPSGVPDRFSGSIDS SSNSASLTISGLVTEDEADYYCMQYDFHHLVFGGGTKLTVLC(SEQ ID NO:11)，
NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSIDSSYVQWYQQRPGSSPTTVIYE DDQRPSGVPDRFSGSID SSSNSASLTISGLKTEDEADYYCMQYDFHHLVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:44)，或
NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSIDSSYVQWYQQRPGSSPTTVIYEDDQRPSGVPDRFSGSIDS SSNSASLT ISGLKTEDEADYYCQSYDFHHLVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 41);及(b)具有如下的部分重鏈序列的抗體QVNLRESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFDDSVMHWVRQAPGKGLEWLSLVGWDGSATYYADSV KGRFTISRDNTKNLLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQGDYVFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:2),
QVTLKESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFT ISRDNSKNTVYLQMNSLRDEDTAVYYCARDISGGGMDVffGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:4)，
QVNLRESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFDDSVMHWVRQAPGKGLEWLSLVGWDGFFTYYADSVKGRFT ISRDNTKNLLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQGDYVFNNWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:6)，
QVNLRESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFDDSVMHWVRQAPGKGLEWLSLVGWDGFFTYYADSVKGRFT ISRDNTKNLLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQGDYMGDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:8)，
QVNLRESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFDDSVMHWVRQAPGKGLEWLSLVGWDGFFTYYADSVKGRFT ISRDNTKNLLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQGDYMGNNWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:10)，
QVNLRESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFDDSVMHWVRQAPGKGLEWLSLVGWDGFFTYYADSVKGRFT ISRDNTKNLLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQGDYMGNNWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 12)，或者
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFDDSVMHWVRQAPGKGLEWVSLVGWDGFFTYYADSVKGRFT ISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQGDYMGNNWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:40)。
表I
mAb輕鏈重 鏈P3A9NFMLTQPHSVSGSPGKTVTISCTRS SGSIDSSYVOWYOORPGNSPTTVIYQVNLRESGGGLVKPG G S L RLSC AASGFTFD DSVMHWVROAPGKGLEWLSLVGWDGSAT
權(quán)利要求
1.分離的白細(xì)胞介素_7受體(IL-7R)抗體，其特異性結(jié)合IL-7R并且包含與單克隆抗體交叉競爭結(jié)合IL-7R的抗原結(jié)合區(qū)，所述單克隆抗體選自P3A9、P4B3、P2D2、P2E11、 HAL403a、HAL403b、ClGM 和 C2M3。
2.權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體結(jié)合包含人白細(xì)胞介素_7受體a(IL-7Ra )的 182、K84、K100、T105 和 Y192 殘基的表位。
3.權(quán)利要求2的抗體，其中所述表位進(jìn)一步包含選自人IL-7Ra的D190、H191和K194 殘基的一或多個(gè)額外的殘基。
4.特異性結(jié)合白細(xì)胞介素_7受體a(IL-7Ra )的分離的抗體，其中所述抗體包含重鏈可變區(qū)(VH)互補(bǔ)決定區(qū)I (CDR1)、VH CDR2和VH CDR3、輕鏈可變區(qū)(VL)CDR1、VL CDR2 和VL CDR3，所述VH CDRl具有氨基酸序列X1X2VMH,其中X1是0或N，X2是S或Y (SEQ ID NO: 50);所述 VH CDR2 具有氨基酸序列 X1X2X3X4X5Gx6X7TyyADSVKG,其中 X1 是 L 或 A，X2 是 V 或 1，乂3是6 或 534是1 或635是0 或 S，X6是F、G或S，X7是F、A或S(SEQ ID NO:51)； 所述VH CDR3具有氨基酸序列X1X2X3X4X5X6X7X8，其中乂1是0或0，&是6或1，&是0或5，父4 是 Y 或G，乂5是] 、￥ 或G，乂6是6 或F，乂7是隊(duì)0 或 M，X8是N、Y或D(SEQ ID NO: 52);所述 VL CDRl具有氨基酸序列TxiSsgx2Ix3SSYVQ,其中X1是R或G，X2是S或R，X3是D或A (SEQID NO: 53);所述VL CDR2具有氨基酸序列EDX1QRPS,其中乂1是0或N(SEQ ID NO:54);所述VL ⑶R3具有氨基酸序列X1X2YX3X4X5X6LX7，其中X1是Q或M，X2是S或Q，X3是D或A，X4是F或 3，父5是11或5，乂6是!1或5，\是￥或W(SEQ ID NO:55)，其中所述抗體在STAT5激活測定中阻斷STAT5磷酸化。
5.特異性結(jié)合白細(xì)胞介素_7受體a(IL-7Ra )的分離的抗體，其中所述抗體包含具有氨基酸序列 DSVMH(SEQ ID NO: 19)、GFTFDDS (SEQ ID NO:46)或 GFTFDDSVMH(SEQ ID NO:47)的重鏈可變區(qū)(VH) 互補(bǔ)決定區(qū)1(CDR1)，具有氨基酸序列LVGWDGFFTYYADSVKG(SEQ ID NO: 23)或GWDGFF(SEQ ID NO: 48)的 VH CDR2，具有氨基酸序列 Q⑶YMGNN(SEQ ID NO: 49) 的VH CDR3，具有氨基酸序列TRSSGSIDSSYVQ(SEQ ID NO:29)的輕鏈可變區(qū)(VL)CDRl，具有氨基酸序列EDDQRPS(SEQ ID NO:31)的VL CDR2以及具有氨基酸序列QSYDFHHLV(SEQ ID NO:36)的 VLCDR3。
6.權(quán)利要求5的抗體，其中所述VH區(qū)包含SEQID NO:40所示氨基酸序列，并且VL區(qū)包含SEQ ID N0:41所示氨基酸序列。
7.權(quán)利要求6的抗體，其中所述抗體包含具有SEQID NO: 43所示氨基酸序列的輕鏈以及具有SEQ ID NO:42所示氨基酸序列的重鏈，有或沒有SEQ ID NO:42的C-末端賴氨酸。
8.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的抗體，其中所述抗體進(jìn)一步包含恒定區(qū)。
9.權(quán)利要求8的抗體，其中所述抗體是人IgGl或IgG2Aa亞類。
10.包含權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的抗體的藥物組合物。
11.重組產(chǎn)生權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的抗體的細(xì)胞系。
12.編碼權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的抗體的核酸。
13.一種治療和/或預(yù)防個(gè)體自身免疫疾病的方法，所述方法包括給患有或處于自身免疫疾病危險(xiǎn)中的個(gè)體施用治療有效量的拮抗性IL-7R抗體，從而改善和/或預(yù)防自身免疫疾病的一或多個(gè)癥狀，其中所述自身免疫疾病選自I型糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、狼瘡及多發(fā)性硬化。
14.權(quán)利要求13的方法，其中施用拮抗性IL-7R抗體導(dǎo)致與施用之前相比所述個(gè)體中幼稚和激活的T細(xì)胞群減少。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述個(gè)體中減少的T細(xì)胞群包含ThI和/或Th17細(xì)胞。
16.一種治療和/或預(yù)防個(gè)體中2型糖尿病的方法，所述方法包括給患有或處于2型糖尿病危險(xiǎn)中的個(gè)體施用治療有效量的IL-7R拮抗劑，從而改善和/或預(yù)防2型糖尿病的一或多個(gè)癥狀。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述IL-7R拮抗劑是拮抗性IL-7R抗體。
18.一種治療和/或預(yù)防個(gè)體中移植物抗宿主疾病(GVHD)的方法，包括給患有GVHD的個(gè)體施用治療有效量的拮抗性IL-7R抗體，從而改善GVHD的一或多個(gè)癥狀。
19.權(quán)利要求13-15、17或18任一項(xiàng)的方法，其中所述抗體是權(quán)利要求1_9任一項(xiàng)的抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供了結(jié)合白細(xì)胞介素-7受體(IL-7R)的拮抗性抗體。本發(fā)明進(jìn)一步提供了獲得這種抗體及抗體編碼核酸的方法。本發(fā)明進(jìn)一步涉及使用這些抗體及其抗原結(jié)合部分治療和/或預(yù)防2型糖尿病和免疫疾病的治療方法，所述免疫疾病包括1型糖尿病、多發(fā)性硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、移植物抗宿主疾病及狼瘡。
文檔編號C07K16/28GK103038254SQ201180011149
公開日2013年4月10日 申請日期2011年2月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月24日
發(fā)明者林家揚(yáng), 李麗芬, W·翟 申請人:瑞納神經(jīng)科學(xué)公司