專利名稱：Notch1結(jié)合劑及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的領(lǐng)域一般涉及結(jié)合人Notchl的抗體和其它劑，以及涉及使用該抗體和其它劑用于治療血液疾病、尤其是Notch途徑相關(guān)的疾病的方法。
背景技術(shù)：
Notch信號傳導(dǎo)途徑是普遍地保守的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)。其牽涉在發(fā)育期間的細胞命運確定中，包括胚胎模式形成和胚后組織維持。另外，Notch信號傳導(dǎo)已被鑒定為維持造血干細胞的關(guān)鍵因子。哺乳動物Notch 受體家族包括 4 個成員Notchl、Notch2、Notch3 和 Notch4。Notch受體是大的單跨膜I型跨膜蛋白，具有多個保守的結(jié)構(gòu)基序。胞外域包含牽涉在配體結(jié)合中的可變數(shù)目的表皮生長因子(EGF)-樣重復(fù)和牽涉在Notch異二聚化中的三個富含半胱氨酸的LIN-12/Notch重復(fù)(LNR)。胞內(nèi)域包含牽涉在結(jié)合Notch下游信號傳導(dǎo)蛋白中的RAM23基序、也牽涉在介導(dǎo)下游信號傳導(dǎo)中的7cdcl0/錨蛋白重復(fù)、和牽涉在Notch蛋白降解中的PEST結(jié)構(gòu)域。哺乳動物Notch 配體包括 Λ-樣 I (DLL1)、Λ-樣 3 (DLL3)、Λ-樣 4 (DLL4)、Jaggedl和Jagged2。類似于Notch受體,Notch配體是具有多個保守結(jié)構(gòu)基序的I型跨膜蛋白。所有Notch配體共同的胞外基序包括牽涉在受體結(jié)合中的單個Δ/Serrate/Lag-2(DSL)結(jié)構(gòu)域、以及可能牽涉在穩(wěn)定受體結(jié)合中的可變數(shù)目的EGF-樣重復(fù)。Jagged蛋白的胞外域包含富含半胱氨酸的區(qū)域，其與von Willebrand因子C型結(jié)構(gòu)域具有部分同源性，并可能牽涉在配體二聚化中。這一基序在DLL家族成員中不存在。(Leong等，2006, Blood,107:2223-2233)。Notch受體的胞外域與通常位于相鄰細胞上的Notch配體的胞外域相互作用，導(dǎo)致Notch受體的2個蛋白水解切割。一個胞外切割由ADAM (A Disintegrin AndMetallopeptidase,解整合素-金屬肽酶)蛋白酶介導(dǎo),跨膜域內(nèi)的第二切割由Y分泌酶復(fù)合物介導(dǎo)。后一切割產(chǎn)生Notch胞內(nèi)域(ICD)，該Notch胞內(nèi)域移位進入細胞核，在細胞核中其激活CBF1, Suppressor of Hairless, Lag-2 (CSL)家族的轉(zhuǎn)錄因子，上述家族的轉(zhuǎn)錄因子作為主要下游效應(yīng)子增加Hairy/Split增強子(HES)家族的細胞核堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄。(Artavanis 等，1999, Science, 284:770 ;Brennan 和 Brown, 2003, BreastCancer Res. , 5:69 ；Iso 等,2003, Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. , 23:543)。Notch途徑已經(jīng)與血液和實體的腫瘤和癌癥二者的發(fā)病關(guān)聯(lián)。與腫瘤發(fā)生相關(guān)的許多細胞功能和微環(huán)境信號已經(jīng)顯示為被Notch途徑信號傳導(dǎo)調(diào)節(jié)，包括細胞增殖、凋亡、粘附和血管發(fā)生。(Leong等，2006，Blood，107:2223-2233)。另外，Notch受體和/或Notch配體已經(jīng)顯示為在多種人癌癥中起到潛在的致癌作用，所述人癌癥包括急性骨髓性白血病、B細胞慢性淋巴細胞性白血病、霍奇金淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、T細胞急性淋巴母細胞性白血病、腦癌、乳癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌和皮膚癌。(Leong等，2006，Blood,107:2223-2233)。人中的Notchl基因首先在T細胞急性淋巴母細胞性白血病的亞型中鑒定為導(dǎo)致Notch途徑激活的移位的基因座(Ellisen等，1991，Cell，66:649-61)。最近已顯示，多于50%的人T細胞急性淋巴母細胞性白血病具有牽涉Notchl的胞外異二聚結(jié)構(gòu)域和/或C末端PEST結(jié)構(gòu)域的激活突變(Weng等，2004，Science, 306:269-271 ；Pear &Aster, 2004, Curr. Opin. HematoI. , 11:416-33)。小鼠模型中 T 細胞內(nèi)的 Notchl 信號傳導(dǎo)的組成型激活類似地產(chǎn)生T細胞淋巴瘤，表明了發(fā)病原因(Robey等，1996，Cell,87:483-92 ；Pear 等,1996,J. Exp.Med. , 183:2283-91 ；Yan 等,2001, Blood, 98:3793-9 ；Bellavia等，2000，EMB0 J.，19:3337-48)。逆轉(zhuǎn)錄病毒激活的Notch2已經(jīng)牽涉在由貓白血病病毒引
起的胸腺淋巴瘤中(Rohn等，1996, J. Virology, 70:8071-8080)。人T細胞急性淋巴母細胞性白血病樣品已經(jīng)顯示表達Notch3和其靶基因HES-I，其在正常外周T細胞或非T細胞白血病中都不表達(Bellavia等，2002，PNAS，99:3788-3793)。如此，Notch途徑已經(jīng)被鑒定為用于多種血液癌癥中治療性介入的可能的靶。已經(jīng)報道了抗-Notch抗體及其作為抗癌治療劑的可能應(yīng)用。參見例如美國專利申請公布第2008/0131434和2009/0081238號，通過引用將其每一篇整體并入本文。還參見國際公布 No. W02008/057144、W02008/076960、TO2008/150525、W02010/005566 和W02010/005567 ;通過引用將其每一篇整體并入本文。
發(fā)明概要本發(fā)明提供特異性結(jié)合Notchl受體的胞外域的非配體結(jié)合近膜區(qū)的結(jié)合劑(例如抗體)，和包含所述劑的組合物，例如藥物組合物。本發(fā)明還提供使用該結(jié)合劑用于治療血液癌癥的方法，通過向需要其的受治療者施用該劑。在一些實施方案中，該方法包括抑制癌細胞的生長。在一些實施方案中，該癌癥是血液癌癥，諸如白血病或淋巴瘤。在一些實施方案中，該血液癌癥是急性骨髓性白血病、霍奇金淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤或T細胞急性淋巴母細胞性白血病。在一些實施方案中，該血液癌癥是T細胞急性淋巴母細胞性白血病。在一些實施方案中，該治療血液癌癥的方法包括抑制Notchl信號傳導(dǎo)。在一些實施方案中，該治療血液癌癥的方法包括抑制Notchl激活。在一些實施方案中，該治療癌癥或抑制癌細胞生長的方法包括用該結(jié)合劑靶向癌干細胞。在一些實施方案中，該癌干細胞包括白血病起源細胞(leukemia initiating cell)。在一些實施方案中，該方法包括減少受治療者中癌干細胞的頻率，減少受治療者中癌干細胞的數(shù)量，減少癌癥的致瘤性，和/或通過減少受治療者中癌干細胞的數(shù)量或頻率來減少癌癥的致瘤性。在一方面，本發(fā)明提供治療受治療者中血液癌癥的方法，包括向所述受治療者施用治療有效量的特異性結(jié)合人Notchl的胞外域的非配體結(jié)合近膜區(qū)的結(jié)合劑。在一些實施方案中，該血液癌癥是急性骨髓性白血病、霍奇金淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤或T細胞急性淋巴母細胞性白血病。在一些實施方案中，該血液癌癥是T細胞急性淋巴母細胞性白血病。在一些實施方案中，該結(jié)合劑是抗體。在一些實施方案中，該結(jié)合劑是包括以下的抗體(a)包含 RGYWIE (SEQ ID NO: 15)的重鏈 CDRl、包含 QILPGTGRTNYNEKFKG (SEQ IDNO: 16)的重鏈 CDR2、和包含 FDGNYGYYAMDY (SEQ ID NO: 17)的重鏈 CDR3 ;和 / 或(b)包含RSSTGAVTTSNYANCSEQ ID NO: 18)的輕鏈 CDRl、包含 GTNNRAP (SEQ ID NO: 19)的輕鏈 CDR2、和包含 ALWYSNHWVFGGGTKL (SEQ ID NO: 20)的輕鏈 CDR3。在某些實施方案中，本發(fā)明提供治療受治療者中血液癌癥的方法，包括向所述受治療者施用治療有效量的特異性結(jié)合人Notchl的胞外域的非配體結(jié)合近膜區(qū)的結(jié)合劑(例如抗體)，其中該結(jié)合劑包括(a)包含RGYWIE(SEQ ID NO: 15)、或包含1、2、3或4個氨基酸取代的其變體的重鏈CDRl ；(b)包含QILPGTGRTNYNEKFKG (SEQ ID NO: 16)、或包含1、2、3或4個氨基酸取代的其變體的重鏈⑶R2 ;和/或(c)包含F(xiàn)DGNYGYYAMDY (SEQ ID NO: 17)、或包含1、2、3或4個氨基酸取代的其變體的重鏈CDR3。在某些實施方案中，該結(jié)合劑(例如抗體)包括(或還包括)(a)包含RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO: 18)、或包含1、2、3或4個氨基酸取代的其變體的輕鏈⑶Rl ;(b)包含GTNNRAP (SEQ ID NO: 19)、或包含1、2、3或4個氨基酸取代的其變體的輕鏈CDR2 ;和/或(c)包含ALWYSNHWVFGGGTKL (SEQID NO: 20)、或包含1、2、3或4個氨基酸取代的其變體的輕鏈CDR3。在一些實施方案中，該氨基酸取代是保守性氨基酸取代。在一些實施方案中，該血液癌癥是急性骨髓性白血病、霍奇金淋巴瘤、·多發(fā)性骨髓瘤或T細胞急性淋巴母細胞性白血病。在一些實施方案中，該血液癌癥是T細胞急性淋巴母細胞性白血病。在某些實施方案中，本發(fā)明提供治療受治療者中血液癌癥的方法，包括向所述受治療者施用治療有效量的特異性結(jié)合人Notchl的胞外域的非配體結(jié)合近膜區(qū)的結(jié)合劑(例如抗體)，其中該結(jié)合劑包括(a)與SEQ ID NO: 14或SEQ ID NO: 24具有至少約90%、至少約95%、至少約98%或100%序列同一性的重鏈可變區(qū)；和/或(b)與SEQID N0:8、SEQ IDNO: 28或SEQ ID NO: 32具有至少約90%、至少約95%、至少約98%或100%序列同一性的輕鏈可變區(qū)。在一些實施方案中，該結(jié)合劑(例如抗體)包括包含SEQ ID N0:14的重鏈可變區(qū)和包含SEQ ID N0:8的輕鏈可變區(qū)。在一些實施方案中，該結(jié)合劑(例如抗體)包括包含SEQID NO:24的重鏈可變區(qū)和包含SEQ IDNO:28的輕鏈可變區(qū)。在一些實施方案中，該結(jié)合劑(例如抗體)包括包含SEQ IDNO:24的重鏈可變區(qū)和包含SEQ ID N0:32的輕鏈可變區(qū)。在一些實施方案中，該Notchl結(jié)合劑是抗體52M51。在一些實施方案中，該Notchl結(jié)合劑是抗體52M51的人源化形式。在某些實施方案中，該Notchl結(jié)合劑包括52M51抗體的重鏈和輕鏈(帶有或不帶有信號/前導(dǎo)序列)。在某些實施方案中，該Notchl結(jié)合劑是52M51抗體。在一些實施方案中，該Notchl是抗體52M51的人源化形式。按照布達佩斯條約的規(guī)定，產(chǎn)生52M51抗體的雜交瘤細胞系在2008年8月7日保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，10801University Boulevard, Manassas, VA, USA,分配的指定編號是 PTA-9405。在一些實施方案中，該抗體是由按照布達佩斯條約的規(guī)定，在2008年10月15日保藏在ATCC，分配的指定編號是PTA-9549的多核苷酸編碼的抗體52M51的人源化形式52M51H4L3。在上述方面或?qū)嵤┓桨浮⒁约氨疚膭e處描述的其它方面和/或?qū)嵤┓桨傅拿恳粋€的某些實施方案中，該結(jié)合劑(例如抗體)特異性結(jié)合Notchl受體的胞外域的非配體結(jié)合近膜區(qū)，其中Notchl受體的非配體結(jié)合近膜區(qū)包括人Notchl受體的約氨基酸1427至約氨基酸1732。在一些實施方案中，Notchl受體的近膜區(qū)包括SEQ ID N0:2的至少一部分。在一些實施方案中，Notchl受體的近膜區(qū)包括SEQ ID N0:2。在某些實施方案中，該結(jié)合劑(例如抗體)特異性結(jié)合至少一種另外Notch受體的胞外域的非配體結(jié)合近膜區(qū)。在一些實施方案中，本發(fā)明提供特異性結(jié)合與抗體52M51結(jié)合的表位相同或重疊的Notchl表位的抗體。在另一方面，本發(fā)明提供治療受治療者中血液癌癥的方法，包括向所述受治療者施用治療有效量的特異性結(jié)合人Notchl的胞外域的非配體結(jié)合近膜區(qū)的結(jié)合劑(例如抗體)，其中該結(jié)合劑結(jié)合所述近膜區(qū)中的與由以ATCC專利保藏號PTA-9405保藏的雜交瘤細胞系產(chǎn)生的抗體52M51結(jié)合的表位相同的表位。 在一些實施方案中，該結(jié)合劑與抗體52M51競爭對Notchl近膜區(qū)的特異性結(jié)合。在一些實施方案中，該結(jié)合劑與抗體52M51競爭對包含SEQ ID NO: 2的至少一部分的Notchl的非配體結(jié)合近膜區(qū)的特異性結(jié)合。在一些實施方案中，該結(jié)合劑與抗體52M51競爭對包含SEQ ID NO: 2的Notchl的非配體結(jié)合近膜區(qū)中的表位的特異性結(jié)合。在一些實施方案中，該血液癌癥是急性骨髓性白血病、霍奇金淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤或T細胞急性淋巴母細胞性白血病。在一些實施方案中，該血液癌癥是T細胞急性淋巴母細胞性白血病。在另一方面，本發(fā)明提供抑制血液癌癥生長的方法，包括將所述癌細胞與有效量的特異性結(jié)合人Notchl受體的胞外域的非配體結(jié)合近膜區(qū)的結(jié)合劑(例如抗體)接觸，其中該抗體包括(a)包含 RGYWIE (SEQ ID NO: 15)的重鏈 CDR1、包含 QILPGTGRTNYNEKFKG (SEQID NO: 16)的重鏈 CDR2、和包含 FDGNYGYYAMDY (SEQ ID NO: 17)的重鏈 CDR3 ;和 / 或(b)包含 RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO: 18)的輕鏈 CDRl、包含 GTNNRAP (SEQ ID NO: 19)的輕鏈CDR2、和包含ALWYSNHWVFGGGTKL (SEQ ID NO:20)的輕鏈CDR3。在一些實施方案中，該血液癌癥是急性骨髓性白血病、霍奇金淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤或T細胞急性淋巴母細胞性白血病。在一些實施方案中，該血液癌癥是T細胞急性淋巴母細胞性白血病。在上述方面或?qū)嵤┓桨?、以及本文別處描述的其它方面和/或?qū)嵤┓桨傅拿恳粋€的某些實施方案中，該結(jié)合劑是抗體。在一些實施方案中，該抗體是重組抗體。在一些實施方案中，該抗體是單克隆抗體。在一些實施方案中，該抗體是嵌合抗體。在一些實施方案中，該抗體是人源化抗體。在一些實施方案中，該抗體是人抗體。在某些實施方案中，該抗體是抗體片段。在某些實施方案中，該抗體或抗體片段是單價、單特異性、二價、雙特異性或多特異性的。在某些實施方案中，該抗體與細胞毒性部分共軛。在某些實施方案中，該抗體是分離的。在又另外的實施方案中，該抗體是大體上純的。還提供包含用在本文所述的治療血液癌癥的方法中的、特異性結(jié)合人Notchl受體的胞外域的非配體結(jié)合近膜區(qū)的結(jié)合劑(例如抗體)的藥物組合物。在某些實施方案中，該藥物組合物還包括藥學(xué)上可接受的載體。在上述方面或?qū)嵤┓桨?、以及本文別處描述的其它方面和/或?qū)嵤┓桨傅拿恳粋€的某些實施方案中，該結(jié)合劑(例如抗體)是Notchl拮抗劑。在一些實施方案中，該結(jié)合劑抑制Notchl信號傳導(dǎo)。在一些實施方案中，該結(jié)合劑抑制Notchl激活。在一些實施方案中，該結(jié)合劑抑制Notchl的活性。在一些實施方案中，該結(jié)合劑抑制組成型激活的Notchl的活性。在一些實施方案中，該結(jié)合劑抑制近膜區(qū)中的裂解。在某些實施方案中，該結(jié)合劑抑制Notchl的裂解(例如，在S2位點被金屬蛋白酶裂解)和/或抑制Notchl被配體結(jié)合的激活。在一些實施方案中，該結(jié)合劑抑制Notchl的胞內(nèi)域(I⑶)的釋放或形成。在某些實施方案中，該結(jié)合劑抑制血液癌癥細胞的生長。在一些實施方案中，該結(jié)合劑抑制T細胞急性淋巴母細胞性白血病細胞的生長。在進一步的方面，本發(fā)明提供抑制血液癌癥細胞中Notchl的活性的方法，包括將該癌癥細胞與有效量的上述方面和實施方案、以及本文別處描述的其它方面/實施方案中描述的任一種抗體或多肽接觸。在某些實施方案中，該血液癌癥細胞是T細胞急性淋巴母細胞性白血病細胞。在另一方面，本發(fā)明提供在受治療者中抑制血液癌癥生長的方法，該方法包括向所述受治療者施用治療有效量的上述方面和實施方案、以及本文別處描述的其它方面/實施方案中描述的任一種抗體或多肽。在一些實施方案中，該血液癌癥包括癌干細胞。在一些實施方案中，該血液癌癥包括白血病起源細胞。在一些實施方案中，該方法包括用本文所述的結(jié)合劑和抗體靶向該癌干細胞。在某些實施方案中，該方法包括減少血液癌癥中癌干細胞的頻率，減少血液癌癥中白血病起源細胞的數(shù)量，減少血液癌癥中癌干細胞的數(shù)量，減少血液癌癥的致瘤性，和/或通過減少血液癌癥中癌干細胞的數(shù)量或頻率來減少血液癌癥的致瘤性。在一些實施方案中，該方法包括抑制Notchl的活性和/或抑制血液癌癥的生長?！ぴ谀承嵤┓桨钢校撗喊┌Y是急性骨髓性白血病、霍奇金淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤或T細胞急性淋巴母細胞性白血病。在某些實施方案中，該血液癌癥細胞是T細胞急性淋巴母細胞性白血病細胞。在另外的方面中，本發(fā)明提供在受治療者中抑制血液癌癥生長的方法，該方法包括向所述受治療者施用治療有效量的特異性結(jié)合人Notchl的胞外域的非配體結(jié)合近膜區(qū)的抗體，其中該結(jié)合抑制Notchl的活性。在一些實施方案中，該方法包括抑制組成型激活的Notchl的活性。在進一步的方面，本發(fā)明提供通過減少包含癌干細胞的血液癌癥中癌干細胞的頻率或數(shù)量來減少血液癌癥的致瘤性的方法，該方法包括將該癌細胞與有效量的本文所述的抑制Notchl活性的結(jié)合劑或抗體接觸。在上述方面和/或?qū)嵤┓桨?、以及本文描述的其它方面或?qū)嵤┓桨傅拿恳粋€的某些實施方案中，該方法還包括向所述受治療者施用至少一種另外的治療劑。在上述方面或?qū)嵤┓桨浮⒁约氨疚膭e處描述的其它方面和/或?qū)嵤┓桨傅拿恳粋€的某些實施方案中，該抗體或多肽聯(lián)合用于血液癌癥的另外的治療施用于受治療者。在某些實施方案中，用于血液癌癥的另外的治療包括放射治療、化療和/或另外的治療抗體。本發(fā)明還提供治療人中血液癌癥的方法，其中包含癌干細胞的血液癌癥不以該癌干細胞過表達一種或多種Notch受體為特征，該方法包括向人施用治療有效量的結(jié)合Notchl的胞外域的近膜區(qū)并阻斷Notchl的配體激活的結(jié)合劑或抗體。在一些實施方案中，施用本文所述的結(jié)合劑或抗體以治療血液癌癥，其中該血液癌癥以組成型激活的Notchl為特征。本發(fā)明還提供治療人中血液癌癥的方法，包括向人施用治療有效量的(a)結(jié)合Notchl并抑制過表達Notchl的癌干細胞生長的第一抗體；和(b)結(jié)合Notch受體并阻斷Notch受體的配體激活的第二抗體。在一些實施方案中，該方法包括向人施用治療有效量的(a)結(jié)合Notchl并抑制過表達Notchl的癌干細胞生長的第一抗體；和(b)結(jié)合VEGF的第二抗體。
在進一步的實施方案中，本發(fā)明提供用于(除了其它以外)以上方法中的制品。例如，本發(fā)明提供包含容器和其中包含的組合物的制品，其中該組合物包含結(jié)合Notch的抗體，且該制品還包括指示該組合物可用于治療包含癌干細胞的癌癥的包裝說明書。在一些實施方案中，本發(fā)明提供包含容器和其中包含的組合物的制品，其中該組合物包含結(jié)合Notch的抗體,且該制品還包括指示該組合物可用于治療包含表達一種或多種Notch受體的癌干細胞的癌癥的包裝說明書。在某些實施方案中，本發(fā)明另外涉及包含容器和其中包含的組合物的制品，其中該組合物包含結(jié)合Notch受體并阻斷Notch受體的配體激活的抗體,且該制品還包括指示該組合物可用于治療癌癥的包裝說明書，其中該癌癥包含不以過表達Notch受體為特征的癌干細胞。在某些實施方案中，提供制品，其包括(a)第一容器和其中包含的組合物，其中 該組合物包含結(jié)合Notch受體并抑制包含過表達Notch的癌干細胞的癌細胞生長的第一抗體；和(b)第二容器和其中包含的組合物,其中該組合物包含結(jié)合Notch并阻斷Notch受體的配體激活的第二抗體。 在一些實施方案中，提供另外的制品，其包括容器和其中包含的組合物，其中該組合物包含結(jié)合Notch并阻斷Notch受體的配體激活的抗體,且該制品還包括指示該組合物可用于治療選自以下組成的組的癌癥的包裝說明書急性骨髓性白血病、霍奇金淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤和T細胞急性淋巴母細胞性白血病。本發(fā)明另外提供結(jié)合Notch并阻斷Notch受體的配體激活的抗體(例如，人抗體或人源化抗體)；包含該抗體和藥學(xué)上可接受的載體的組合物；和包含與細胞毒性劑共軛的該抗體的免疫共軛物。在一方面，本發(fā)明提供編碼上述方面或?qū)嵤┓桨?、以及本文別處描述的其它方面和/或?qū)嵤┓桨傅娜我环N抗體或多肽的分離的多核苷酸。在一些實施方案中，本發(fā)明提供包含該多核苷酸的載體。在一些實施方案中，宿主細胞包括該多核苷酸或該載體。在其它實施方案中，產(chǎn)生該抗體的方法包括培養(yǎng)包含該多核苷酸的宿主細胞從而表達該多核苷酸，和任選地還包括從宿主細胞培養(yǎng)物(例如，從宿主細胞培養(yǎng)基)回收該抗體。而且，本發(fā)明提供編碼如上述實施方案或方面所述、以及本文別處描述的人源化或人抗體的分離的多核苷酸；包含該多核苷酸的載體；包含該多核苷酸或該載體的宿主細胞；以及包括培養(yǎng)包含該多核苷酸的宿主細胞從而表達該多核苷酸，和任選地還包括從宿主細胞培養(yǎng)物(例如，從宿主細胞培養(yǎng)基)回收該抗體的產(chǎn)生該抗體的方法。本發(fā)明還涉及包含與一種或多種加利車霉素分子共軛的結(jié)合Notch的抗體的免疫共軛物，和這種共軛物用于治療表達Notch的癌癥，例如，其中癌干細胞過表達Notch的癌癥的用途。在根據(jù)馬庫什組或可選擇要素的其它分組，包括但不限于以“和/或”或“或”分開的可選擇要素的分組描述了本發(fā)明的方面或?qū)嵤┓桨傅那闆r下，本發(fā)明不僅包括作為整體列出的整個組，還個別地包括該組的各成員和主要組的所有可能亞組，以及還包括缺少一個或多個組成員的主要組。本發(fā)明還預(yù)見到明確排除要求保護的發(fā)明中任何組成員中的一個或多個。例如，措辭諸如“X和/或Y”涵蓋單獨的“X”、單獨的“Y”、以及“X”與“Y” 一起。
附圖簡述圖I :抑制Notch信號傳導(dǎo)的靶向Notch的近膜區(qū)的抗體的鑒定。(A)Notch受體和52M抗原區(qū)的圖示。該52M抗原包括Notchl受體在受體成熟期間經(jīng)受弗林蛋白酶切割和在配體結(jié)合后經(jīng)受ADAM (A Disintegrin And Metallopeptidase,解整合素-金屬肽酶)蛋白酶切割的區(qū)域。隨后通過Y-分泌酶進行的加工引起在細胞核中激活基因轉(zhuǎn)錄的Notch的胞內(nèi)域(IO))的釋放。(B)在可溶性Notch配體(hDLL4_Fc)和Notchl受體抗體存在下培養(yǎng)的Notchl-HeLa細胞生成的熒光素酶水平(y軸)。來自帶有或不帶有hDLL4_Fc的未轉(zhuǎn)染(NT)細胞的結(jié)果示于X軸的最左邊。52M Notchl抗體沿著X軸顯示，并且與DBZ(一種Notch Y -分泌酶抑制劑)和21M18 (—種抗-DLL4抗體)比較。熒光素酶活性下降表明，Notchl抗體52M51、52M63、52M74和52M80都顯著地抑制Notch信號 傳導(dǎo)。(C)在可溶性Notch配體(hDLL4_Fc)和Notchl受體抗體存在下培養(yǎng)的Notchl-HeLa細胞生成的熒光素酶水平(y軸)。來自帶有或不帶有hDLL4-Fc的未轉(zhuǎn)染(NT)細胞的結(jié)果示于x軸的最左邊。52M51鼠雜交瘤產(chǎn)生的抗體和人源化變體52M51H4L3以所示的各種濃度沿著x軸顯示。熒光素酶活性下降表明，親本鼠抗體52M51和人源化變體顯著地抑制Notch信號傳導(dǎo)。(D)對表達Notchl的HeLa細胞進行配體介導(dǎo)的刺激后的I⑶形成的蛋白質(zhì)印跡分析。在不存在DLL4配體(-DLL4)時產(chǎn)生最小I⑶，但是DLL4的存在刺激形成。雖然存在DLL4，但是抗體52M51、52M63、52M74和52M80將I⑶形成減少至背景水平。圖2 :在白血病異種移植模型中對抗Notchl抗體的評價。在輻射后以IOX IO6個骨髓單核細胞預(yù)處理N0D/SCID小鼠。7天后，對小鼠注射5 X IO6個原代T細胞急性淋巴母細胞性白血病細胞。注射T細胞急性淋巴母細胞性白血病細胞5周后，處死小鼠并通過流式細胞術(shù)分析從脾分離的細胞的T-ALL移入。流式細胞術(shù)分析使用針對人CD45和CD34的特異性單克隆抗體進行。使用Tree Star FlowJo軟件確定抗體染色陽性的細胞比例。使用GraphPad Prism軟件通過Student t檢驗計算顯著性。指出小鼠脾中人⑶45+和⑶34+細胞的百分比。*林代表與對照抗體LZ-I相比p〈0. 001的顯著性。圖3 =HPB-ALL細胞中Notchl抑制的體外評價。將HPB-ALL細胞鋪板在96孔板中并用抗Notchl抗體52M51 (_■_)、對照抗體(-▼-)或二苯并卩丫庚因(dibenzazepine,DBZ) (-·_)處理。數(shù)據(jù)顯示為相對光單位(RLU)。圖4 =Notchl對HPB-ALL細胞增殖的抑制的體外評價。在12 μ M DBZ、100 μ g. ml抗Notchl抗體52M51或100 μ g/ml對照抗體存在下培養(yǎng)HPB-ALL細胞。通過流式細胞術(shù)分析細胞的K167蛋白。圖5 =Notchl對ICD形成的抑制的體外評價。在12 μ M DBZUOO μ g. ml抗Notchl抗體52M51或100 μ g/ml對照抗體存在下培養(yǎng)HPB-ALL細胞。通過SDS-PAGE分離全細胞蛋白提取物，并使用NotchlICD特異性抗體通過蛋白質(zhì)印跡分析評價。圖6 :抗Notchl抗體對HPB-ALL腫瘤體內(nèi)生長的抑制。將HPB-ALL細胞皮下注射到N0D/SCID小鼠中。用對照抗體(_ ■ _)或抗Notchl抗體52M51 (-▼-)處理小鼠。數(shù)據(jù)顯示為隨著處理后天數(shù)的腫瘤體積(mm3)?？贵w以15mg/kg每周一次施用。圖7 :在彌散性白血病異種移植模型中對抗Notchl抗體的評價。將HPB-ALL細胞注射到N0D/SCID小鼠的尾靜脈中。注射后I天，用對照抗體或抗Notchl抗體52M51處理動物。大約5周后，使小鼠安樂死，分析脾、外周血和骨髓中HPB-ALL細胞的存在。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供結(jié)合一種或多種人Notch受體、尤其是Notchl的新型試劑,包括但不限于多肽，諸如抗體。該Notch結(jié)合劑包括人Notchl的拮抗劑。還提供相關(guān)的多肽和多核苷酸、包含該Notch結(jié)合劑的組合物、以及制備該Notch結(jié)合劑的方法。還提供使用該新型Notch結(jié)合劑的方法，例如抑制血液癌癥生長和/或治療血液癌癥的方法。本發(fā)明還鑒定特異性結(jié)合人Notchl的胞外域的非配體結(jié)合近膜區(qū)并抑制腫瘤體內(nèi)生長的分子(例如抗體)。已經(jīng)將對于配體結(jié)合必需和足夠的Notch的配體結(jié)合區(qū)鑒定為EGF重復(fù)11和12，表明Notch受體的該區(qū)在Notch信號傳導(dǎo)和腫瘤發(fā)生中是重要的(Rebay 等，1991，Cell,67:687 ；Lei 等,2003,Dev. , 130:6411 ；Hambleton等，2004，Structure, 12:2173)。預(yù)料之外的是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在人Notch受體的胞外域的配 體結(jié)合域外部結(jié)合的抗體抑制腫瘤細胞體內(nèi)生長(參見美國專利公布第2008/0131434號和國際公布W02010/005567，通過引用將其每一篇整體并入本文)。因此，在一種或多種人Notch受體-Notchl、Notch2、Notch3和Notch4_的胞外域的配體結(jié)合域外部結(jié)合的抗體具有作為潛在的癌治療劑的價值?，F(xiàn)在已經(jīng)鑒定出特異性結(jié)合Notchl的胞外域的近膜區(qū)的單克隆抗體，包括單克隆抗體52M51(實施例I)。已經(jīng)產(chǎn)生了人源化52M51抗體(實施例2)。包括52M51和52M51的人源化變體在內(nèi)的幾種抗體，雖然與Notchl在配體結(jié)合區(qū)外的區(qū)域中結(jié)合，但是抑制配體誘導(dǎo)的Notchl信號傳導(dǎo)(實施例3和圖IB和

圖1C)。已經(jīng)表明幾種抗體抑制Notch胞內(nèi)域(I⑶)形成的能力(實施例3和7 ;圖ID和5)。52M51顯示抑制HPB-ALL細胞的實體瘤生長(實施例8和圖6)。52M51顯示減少人白血病細胞的體外細胞存活力和增殖(實施例5和6 ;圖3和4)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)52M51在兩種異種移植物模型中抑制白血病細胞體內(nèi)移入(實施例4和9 ;圖2和7)。I.定義為了便于理解本發(fā)明，在以下定義多個術(shù)語和短語。本文使用的術(shù)語“拮抗劑”是指部分或全部阻斷、抑制或中和Notch途徑的生物學(xué)活性的任何分子。本文使用的術(shù)語“拮抗劑”包括部分或全部阻斷、抑制或中和Notch受體的表達的任何分子。合適的拮抗劑分子特別包括拮抗性抗體或抗體片段。本文使用的術(shù)語“抗體”是指通過至少一個位于免疫球蛋白分子的可變區(qū)內(nèi)的抗原識別位點，識別和特異性結(jié)合諸如蛋白、多肽、肽、糖類、多核苷酸、脂質(zhì)或上述物質(zhì)的組合等靶的免疫球蛋白分子。如本文所用，該術(shù)語包括完整的多克隆抗體、完整的單克隆抗體、抗體片段(例如Fab、Fab’、F(ab’)2、和Fv片段)、單鏈Fv (scFv)抗體、由至少兩個完整抗體產(chǎn)生的諸如雙特異性抗體等多特異性抗體、單特異性抗體、單價抗體、嵌合抗體、人源化抗體、人抗體、包含抗體的抗原決定部分的融合蛋白、和任何其它包含抗原識別位點的經(jīng)修飾免疫球蛋白分子，只要該抗體顯示所需的生物活性。基于分別稱為α、δ、ε、Y和μ的抗體重鏈恒定域的身份，抗體可以是五個主要種類免疫球蛋白中的任一種IgA、IgD、IgE、IgG 和 IgM,或其亞類(同種型)(例如，IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl 和 IgA2)。不同種類的免疫球蛋白具有不同的眾所周知的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)造?？贵w可以是裸的或與包括但不限于毒素和放射性同位素的其它分子共軛。術(shù)語“抗體片段”表示完整抗體的一部分，和表示完整抗體的抗原決定可變區(qū)。抗體片段的實例包括但不限于Fab、Fab’、F (ab’)2和Fv片段、線性抗體、單鏈抗體和由抗體片段形成的多特異性抗體。術(shù)語抗體的“可變區(qū)”是指單獨的或組合的抗體輕鏈的可變區(qū)或抗體重鏈的可變區(qū)。重鏈和輕鏈的可變區(qū)各由通過三個還稱為“高變區(qū)”的互補決定區(qū)(⑶R)連接的四個框架區(qū)(FR)組成。各鏈中的⑶R通過框架區(qū)鄰近保持在一起，并且與來自另一鏈的⑶R —起幫助形成抗體的抗原結(jié)合位點。至少有兩種用于確定CDR的技術(shù)(I)基于跨物種序列變異性的方法(即，Kabat 等，1991，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版，National Institutes of Health, Bethesda Md.),和(2)基于抗原-抗體復(fù)合物的晶體學(xué)研究的方法(Al-Lazikani 等，1997，J. Molec. Biol.，273:927-948)。另外，本領(lǐng)域有時使用這兩種方法的組合來確定CDR。本文所用的術(shù)語“單克隆抗體”是指參與高度特異性識別和結(jié)合單抗原決定簇或表位的同源性抗體群。這與通常包括針對不同抗原決定簇的不同抗體的混合物的多克隆抗體不同。術(shù)語“單克隆抗體”涵蓋完整的全長單克隆抗體以及抗體片段(例如，F(xiàn)ab、Fab’、F(ab’)2、Fv)、單鏈(scFv)抗體、包含抗體部分的融合蛋白、和任何其它包含抗原識別位點·的經(jīng)修飾免疫球蛋白分子。另外，“單克隆抗體”是指通過包括但不限于雜交瘤產(chǎn)生、噬菌體選擇、重組表達和轉(zhuǎn)基因動物的任何多種方式制得的此類抗體。本文所用的術(shù)語“人源化抗體”是指非人(例如鼠)抗體的形式，其為含有最小非人序列的特異性免疫球蛋白鏈、嵌合免疫球蛋白或其片段。本文使用的術(shù)語“人抗體”是指由人產(chǎn)生的抗體或通過使用本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)制備的具有與由人產(chǎn)生的抗體相應(yīng)的氨基酸序列的抗體。人抗體的該定義包括完整或全長抗體、其片段、和/或包含至少一個人重鏈和/或輕鏈多肽的抗體，例如，包含鼠輕鏈和人重鏈多肽的抗體。本文使用的術(shù)語“嵌合抗體”是指其中免疫球蛋白分子的氨基酸序列源自兩個或以上物種的抗體。通常而言，輕鏈和重鏈的可變區(qū)對應(yīng)于源自一個哺乳動物物種(例如，小鼠、大鼠、兔等)的具有所需特異性、親和性和/或能力的抗體的可變區(qū)，而恒定區(qū)與源自另一物種(通常是人)的抗體中的序列同源，從而避免在該物種中弓I發(fā)免疫應(yīng)答。術(shù)語“表位”和“抗原決定簇”在本文中可互換地使用，是指抗原的能夠被特定抗體識別和特異性結(jié)合的部分。當(dāng)抗原是多肽時，表位可由連續(xù)的氨基酸形成和由通過蛋白的三級折疊而并置的不連續(xù)氨基酸形成。當(dāng)?shù)鞍鬃冃詴r通常會保留由連續(xù)的氨基酸形成的表位(還稱為線性表位)，而當(dāng)?shù)鞍鬃冃詴r通常會喪失通過三級折疊形成的表位(還稱為構(gòu)象性表位)。表位通常包括至少3個，或更經(jīng)常至少5個或8-10個呈單獨空間構(gòu)象的氨基酸。術(shù)語“選擇性結(jié)合”或“特異性結(jié)合”是指結(jié)合劑或抗體與表位、蛋白或靶分子的反應(yīng)或結(jié)合比與其它物質(zhì)(包括不相關(guān)蛋白)的反應(yīng)或結(jié)合更頻繁、更迅速、持久性更大、親和性更大或上述情況的某些組合。在某些實施方案中，“特異性結(jié)合”是指例如，抗體與蛋白結(jié)合的Kd為約O. ImM或更小，但更經(jīng)常為小于約I μ Μ。在某些實施方案中，“特異性結(jié)合”是指抗體與靶結(jié)合的Kd有時為至少約O. I μ M或更小或有時為至少約O. 01 μ M或更小。由于不同物種中同源性蛋白之間的序列同一性，特異性結(jié)合可以包括識別多于一個物種中蛋白(例如Notch受體)的抗體。類似地，由于不同蛋白的多肽序列某些區(qū)域內(nèi)的同源性，特異性結(jié)合可以包括識別多于一種蛋白(例如人Notchl和人Notch2)的抗體(或其它多肽或結(jié)合劑)。應(yīng)該理解，在某些實施方案中，與第一靶特異性結(jié)合的抗體或結(jié)合部分可以與第二靶特異性結(jié)合或不與第二靶特異性結(jié)合。這樣，“特異性結(jié)合”不必然地要求(盡管其可以包括)專一性結(jié)合，即，與單個靶的結(jié)合。如此，在某些實施方案中，抗體可特異性結(jié)合多于一種靶(例如人Notchl、人Notch2、人Notch3、和/或小鼠Notch)。在某些實施方案中，多個靶可被抗體上同一抗原結(jié)合位點結(jié)合。例如，在某些情況中，抗體可包括兩個相同的抗原結(jié)合位點，其每一個特異性結(jié)合兩種或多種蛋白(例如Notchl和Notch2)上的相同表位。在某些替代性實施方案中，抗體可以是雙特異性的，包括具有不同特異性的至少兩個抗原結(jié)合位點。通過非限制性實例，雙特異性抗體可包括識別一種蛋白(例如人Notchl)上的表位的一個抗原結(jié)合位點，還包括識別第二蛋白(例如人Notch2)上的不同表位的第二、不同抗原結(jié)合位點。通常但不一定提及結(jié)合是指特異性結(jié)合。術(shù)語“多肽”和“肽”和“蛋白”在本文中可互換地使用，是指任何長度的氨基酸的聚合物。聚合物可以是線性或分支的，其可包括修飾的氨基酸，且其可被非氨基酸中斷。這些術(shù)語還涵蓋已被天然修飾或通過介入修飾的氨基酸聚合物；例如，二硫鍵形成、糖基化、 脂質(zhì)化、乙?；?、磷酸化或任何其它操作或修飾，諸如與標(biāo)記組分共軛。該定義中還包括，例如，包含氨基酸的一種或多種類似物(包括例如，非天然氨基酸)、以及本領(lǐng)域已知的其它修飾的多肽。應(yīng)理解的是，由于本發(fā)明的多肽是基于抗體的，在某些實施方案中，該多肽可作為單鏈或締合的鏈存在。術(shù)語“多核苷酸”和“核酸”在本文可互換地使用，是指任何長度的核苷酸聚合物，并包括DNA和RNA。核苷酸可以是脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修飾的核苷酸或堿基、和/或其類似物、或可被DNA或RNA聚合酶摻入聚合物中的任何底物?！案邍?yán)格性條件”可鑒定為以下條件(I)洗滌采用低離子強度和高溫，例如在50 0C以O(shè). 015M氯化鈉/0. 0015M檸檬酸鈉/0. 1%十二烷基硫酸鈉；(2)雜交期間在42°C采用變性劑諸如甲酰胺，例如，50% (v/v)甲酰胺加O. 1%牛血清白蛋白/0. l%Ficoll/0. 1%聚乙烯吡咯烷酮/pH 6. 5的50mM磷酸鈉緩沖劑加750mM氯化鈉、75mM檸檬酸鈉；或(3)在42°C采用 50% 甲酰胺、5XSSC(0. 75MNaCl、0. 075M檸檬酸鈉)、50mM 磷酸鈉(pH6. 8),0. 1% 焦磷酸鈉、5 X Denhardt溶液、超聲化的鮭精DNA (50μ g/ml)、0. 1%SDS、和10%硫酸葡聚糖，在420C以O(shè). 2 X SSC (氯化鈉/檸檬酸鈉)和在55°C以50%甲酰胺洗滌，隨后是包含EDTA的
O.I X SSC在55 °C的高嚴(yán)格性洗滌。在兩種或多種核酸或多肽的上下文中，術(shù)語“相同”或“同一性”百分比是指為了最大對應(yīng)性比較和比對(如果需要則引入缺口)時，相同或具有指定百分比的相同核苷酸或氨基酸殘基的兩種或多種序列或亞序列，不考慮任何保守性氨基酸取代作為序列同一性的部分。同一性百分比可使用序列比較軟件或算法或通過目視檢查來測量?？捎脕慝@得氨基酸或核苷酸序列的比對的多種算法和軟件是本領(lǐng)域公知的。這些包括但不限于BLAST、ALIGN、Megalign、BestFit、GCG Wisconsin軟件包等。在一些實施方案中，本發(fā)明的兩種核酸或多肽是大體上相同的，表示它們?yōu)榱俗畲髮?yīng)性比較和比對時具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%，和在一些實施方案中至少95%、96%、97%、98%、99%的核苷酸或氨基酸殘基同一性，如使用序列比較軟件或通過目視檢查測量的。在一些實施方案中，跨至少約10個、至少約20、至少約40-60殘基長度或其間的任何整數(shù)值的序列區(qū)域存在同一性。在一些實施方案中，跨多于60-80個殘基，諸如至少約90-100個殘基的較長區(qū)域存在同一性，且在一些實施方案中，序列跨被比較的序列(諸如核苷酸序列的編碼區(qū))全長是大體上相同的?！氨Ｊ匦园被崛〈笔瞧渲幸粋€氨基酸殘基被具有相似側(cè)鏈的另一個氨基酸殘基代替的氨基酸取代。具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族在本領(lǐng)域中已定義，包括堿性側(cè) 鏈(例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電荷的極性側(cè)鏈(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β -分支側(cè)鏈(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香族側(cè)鏈(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。例如，苯丙氨酸對酪氨酸的取代是保守性取代。優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽和抗體的序列中的保守性取代不消除包含該氨基酸序列的多肽或抗體對抗原的結(jié)合，該抗原即，該多肽或抗體結(jié)合的一種或多種Notch蛋白。鑒定不消除抗原結(jié)合的核苷酸和氨基酸保守性取代的方法是本領(lǐng)域公知的。本文使用的術(shù)語“載體”是指能夠在宿主細胞中遞送和通常表達一種或多種目標(biāo)基因或序列的構(gòu)建體。載體的實例包括但不限于病毒載體、裸DNA或RNA表達載體、質(zhì)粒、粘?；蚴删w載體、陽離子縮合劑伴隨的DNA或RNA表達載體、和脂質(zhì)體中包裹的DNA或RNA表達載體?！胺蛛x的”多肽、抗體、多核苷酸、載體、細胞或組合物是呈自然中不存在的形式的多肽、抗體、多核苷酸、載體、細胞或組合物。分離的多肽、抗體、多核苷酸、載體、細胞或組合物包括已被純化到不再呈其于天然中存在的形式的程度的那些。在一些實施方案中，分離的抗體、多核苷酸、載體、細胞或組合物是大體上純的。本文所用的術(shù)語“大體上純的”是指至少50%純(B卩，不含污染物)、至少90%純、至少95%純、至少98%純、或至少99%純的材料。如本文所用，術(shù)語“癌癥(cancer ) ”和“癌性的(cancerous ) ”是指或描述其中一群細胞的特征在于失調(diào)的細胞生長的哺乳動物中的生理狀況。癌癥的實例包括但不限于癌、母細胞瘤、肉瘤、和血液癌癥諸如淋巴瘤和白血病。本文所用的術(shù)語“腫瘤”和“贅生物”是指任何由過度的細胞生長或增殖導(dǎo)致的組織的團塊，其可以是良性的(非癌的)或惡性的(癌的)，包括癌前病變。術(shù)語“增殖性障礙”和“增殖性疾病”是指與異常細胞增殖有關(guān)的障礙，如癌。本文所用的術(shù)語“轉(zhuǎn)移”是指癌從原始位置擴散或轉(zhuǎn)移到身體的其它區(qū)域的過程，并且伴隨著位于新位置處的類似的癌性病變的發(fā)生。“轉(zhuǎn)移”或“轉(zhuǎn)移性”細胞是失去與相鄰細胞的粘附接觸并且經(jīng)由血流或淋巴從疾病的原發(fā)位置遷移從而侵襲鄰近的身體結(jié)構(gòu)的細胞。術(shù)語“癌干細胞”和“CSC”和“腫瘤干細胞”在本文中可互換地使用，并且指來自具有以下性質(zhì)的癌癥的細胞(I)具有廣泛的增殖能力；(2)能夠進行不對稱細胞分裂從而產(chǎn)生增殖或發(fā)育潛能降低的一種或多種分化子代；和(3)能夠進行對稱細胞分裂以用于自我更新或自我維持。當(dāng)連續(xù)移植到免疫受損宿主(例如小鼠)時，與不能形成腫瘤的大多數(shù)腫瘤細胞相比，這些性質(zhì)賦予癌干細胞以形成或建立腫瘤或癌癥的能力。癌干細胞以無序方式進行自我更新與分化，從而形成具有異常細胞類型的腫瘤，當(dāng)發(fā)生突變時所述異常細胞類型可以隨時間而改變。本文使用的“癌干細胞”可包括白血病起源細胞。術(shù)語“癌細胞”和“腫瘤細胞”是指源自癌癥或腫瘤或癌前病變的全部細胞群體，包括占癌細胞群大部分的非致瘤性細胞和致瘤性干細胞(癌干細胞)。當(dāng)僅指缺乏更新和分化能力的那些腫瘤細胞時，本文所用的術(shù)語“癌細胞”或“腫瘤細胞”將被術(shù)語“非致瘤性”修飾，以將那些腫瘤細胞與癌干細胞區(qū)分。本文所用的術(shù)語“致瘤性的”是指癌干細胞的功能特征，包括自我更新(產(chǎn)生另外的致瘤性癌干細胞)的性質(zhì)和增殖以產(chǎn)生所有其它腫瘤細胞(產(chǎn)生分化的因而非致瘤性的腫瘤細胞)的性質(zhì)。
本文所用的術(shù)語腫瘤的“致瘤性”是指當(dāng)連續(xù)移植到免疫受損宿主(例如小鼠)時，來自腫瘤的細胞的隨機樣品形成可察覺的腫瘤的能力。術(shù)語“受治療者”是指任何動物(例如哺乳動物)，包括但不限于人、非人靈長類動物、犬、貓、嚙齒類動物等，其是特定治療的接受者。通常而言，對于人受治療者，術(shù)語“受治療者”和“患者”在本文中可互換地使用。術(shù)語“藥學(xué)上可接受的”是指由美國聯(lián)邦或州政府的管理機構(gòu)已批準(zhǔn)或可批準(zhǔn)的，或在美國藥典或其它公知的藥典中列出的，以用于包括人的動物。術(shù)語“藥學(xué)上可接受的賦形劑、載體或佐劑”或“可接受的藥物載體”是指可以與本文公開的至少一種結(jié)合劑(例如抗體)一起對受治療者施用的賦性劑、載體或佐劑，并且其不破壞結(jié)合劑的藥理學(xué)活性，并且當(dāng)以足以遞送治療效果的劑量施用時是無毒的。術(shù)語“有效量”或“治療有效量”或“治療效果”是指對于“治療”受治療者或哺乳動物中的疾病或障礙有效的結(jié)合劑、抗體、多肽、多核苷酸、小有機分子或其它藥物的量。在癌癥的情況下，治療有效量的藥物(例如抗體)具有治療效果并因此可以減少癌細胞的數(shù)量；降低致瘤性、致瘤頻率或致瘤能力；減少癌干細胞的數(shù)量或頻率；減少腫瘤尺寸；減少癌細胞群體；抑制或停止癌細胞向周圍器官的浸潤(包括例如癌向軟組織和骨的擴散)；抑制和停止腫瘤或癌細胞轉(zhuǎn)移；抑制和停止腫瘤或癌細胞生長；某種程度上減輕與癌有關(guān)的一種或多種癥狀；減少發(fā)病率和死亡率；改進生活質(zhì)量；或所述效應(yīng)的組合。在諸如抗體等試劑阻止生長和/或殺死現(xiàn)有的癌細胞的情況下，可將其稱為細胞抑制性和/或細胞毒性。術(shù)語“治療”或“處理”或“要治療”或“緩解”或“要緩解”是指I)治愈、減慢、減輕診斷的病理性狀況或障礙的癥狀、和/或使診斷的病理性狀況或障礙的進展停止的治療措施；和2)防止或減緩所靶向的病理性狀況或障礙的發(fā)展的預(yù)防性或防備性措施。因此，需要治療的受治療者包括已經(jīng)患有疾病的受治療者；有傾向患疾病的受治療者和要預(yù)防疾病的受治療者。在一些實施方案中，如果患者顯示出以下情況的一種或多種，則根據(jù)本發(fā)明的方法成功地“治療” 了受治療者癌細胞的數(shù)量減少或完全不存在；腫瘤尺寸減少；對癌細胞向周圍器官的浸潤(包括癌細胞向軟組織和骨的擴散)的抑制或不存在；腫瘤或癌細胞轉(zhuǎn)移的抑制或不存在；腫瘤生長的抑制或不存在；減輕一種或多種與特定癌相關(guān)的癥狀；發(fā)病率和致死率降低；生活質(zhì)量改進；致瘤性降低；癌干細胞的數(shù)量或頻率減少；或上述效應(yīng)的某些組合。如本說明書和權(quán)利要求書所用，單數(shù)形式的“a”、“an”和“the”包括復(fù)數(shù)形式，除非上下文明確指出。應(yīng)該理解每當(dāng)在本文用措辭“包含”來描述實施方案時，還提供以“組成”和/或“基本上由組成”描述的其它類似實施方案。本文在短語中使用的術(shù)語“和/或”諸如“A和/或B”意為包括A和B 二者；A或B；A (單獨)；和B (單獨)。類似地，在短語中使用的術(shù)語“和/或”諸如“A、B和/或C”意為涵蓋以下實施方案的每一種A、B和C ;A、B或C ;A或C ;A或B ;B或C ;A和C ；A和B ；B和C ；A (單獨)；B (單獨);和C (單獨)。II. Notchl 結(jié)合劑本發(fā)明提供特異性結(jié)合人Notchl的胞外域的非配體結(jié)合近膜區(qū)的劑、包含那些 結(jié)合劑的組合物、和使用那些結(jié)合劑用于治療血液癌癥的方法。尤其是，在某些實施方案中，本發(fā)明提供結(jié)合Notchl的劑，包括拮抗劑，和在人患者中使用該劑或拮抗劑抑制癌癥生長和治療癌癥或其它疾病的方法。在某些實施方案中，該拮抗劑是特異性結(jié)合人Notchl的胞外域的非配體結(jié)合區(qū)的抗體。在一方面，本發(fā)明提供特異性結(jié)合人Notchl的胞外域的非配體結(jié)合近膜區(qū)的結(jié)合劑。在一些實施方案中，該結(jié)合劑是抗體。在一些實施方案中，該結(jié)合劑或抗體結(jié)合人Notchl的包含約氨基酸1427至約氨基酸1732的區(qū)域。在一些實施方案中，該結(jié)合劑或抗體結(jié)合包含SEQ ID N0:2的區(qū)域。在一些實施方案中，該結(jié)合劑或抗體特異性結(jié)合SEQ IDN0:2中的區(qū)域。在一些實施方案中，該結(jié)合劑或抗體特異性結(jié)合包含SEQ ID N0:2的區(qū)域中的表位。在某些實施方案中，結(jié)合Notchl的結(jié)合劑或抗體還特異性結(jié)合至少一種另外Notch受體的胞外域的非配體結(jié)合近膜區(qū)。在一些實施方案中，該至少一種另外Notch受體是Notch2。在一些實施方案中，該至少一種另外Notch受體是Notch3。在一些實施方案中，該至少一種另外Notch受體是Notch4。在某些實施方案中，該Notchl結(jié)合劑是多肽。在某些實施方案中，該Notchl結(jié)合劑或多肽是抗體。在某些實施方案中，該抗體是IgG抗體。在一些實施方案中，該抗體是IgGl抗體。在一些實施方案中，該抗體是IgG2抗體。在某些實施方案中，該抗體是單克隆抗體。在某些實施方案中，該抗體是人源化抗體。在某些實施方案中，該抗體是人抗體。在某些實施方案中，該抗體是抗體片段。在某些實施方案中，該Notchl結(jié)合劑(例如抗體)以約I μ M或更小、約IOOnM或更小、約40ηΜ或更小、約20ηΜ或更小、約IOnM或更小、或約InM或更小的解離常數(shù)(Kd)結(jié)合人Notchl的胞外域的非配體結(jié)合近膜區(qū)。在某些實施方案中，該Notchl結(jié)合劑或抗體以約40ηΜ或更小、約20ηΜ或更小、約IOnM或更小、或約InM或更小的Kd結(jié)合人Notchl。在一些實施方案中，該劑或抗體對Notchl的解離常數(shù)是使用固定在Biacore芯片上的包含Notchl胞外域的近膜區(qū)的Notchl融合蛋白確定的解離常數(shù)。可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法檢測本發(fā)明的Notchl結(jié)合劑(例如抗體)的特異性結(jié)合?？梢允褂玫拿庖邫z驗包括但不限于使用下述技術(shù)的競爭性和非競爭性檢驗系統(tǒng)如Biacore分析、FACS分析、免疫熒光、免疫細胞化學(xué)、蛋白質(zhì)印跡分析、放射免疫檢驗、ELISA、“夾心”免疫檢驗、免疫沉淀檢驗、沉淀反應(yīng)、凝膠擴散沉淀素反應(yīng)、免疫擴散檢驗、凝集檢驗、補體固定檢驗、免疫放射度檢驗、突光免疫檢驗和蛋白A免疫檢驗。所述檢驗在本領(lǐng)域中是常規(guī)的并且是眾所周知的(參見，例如Ausubel等編，1994, Current Protocols inMolecular Biology, Vol.I,John Wiley & Sons,Inc. , New York)。在一些實施方案中，可使用ELISA確定Notchl結(jié)合劑(例如抗體)對人Notchl的特異性結(jié)合。在一些實施方案中，ELISA檢驗包括制備Notchl抗原，用抗原包被96孔微量滴定板的孔，向所述孔中添加與諸如酶促底物(例如辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶)等可檢測化合物共軛的Notchl結(jié)合劑或抗體，溫育一段時間，并且檢測所述結(jié)合劑或抗體的存在。在一些實施方案中，Notchl結(jié)合劑或抗體不與可檢測化合物共軛，而是向所述孔中添加識別Notchl結(jié)合劑或抗體的第二共軛抗體。在一些實施方案中，代替用Notchl抗原包被所述孔的是，可以用Notchl結(jié)合劑或抗體包被所述孔，并且在向經(jīng)包被的孔中添加抗原后添加與可檢測化合物共軛的第二抗體。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知可經(jīng)改編和/或優(yōu)化而增加檢出信號的參數(shù)，以及可使用的ELISA的其它變化形式(參見例如Ausubel等編，1994,Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, John Wiley & Sons, Inc. , NewYork at 11. 2. I)?？梢酝ㄟ^競爭結(jié)合檢驗確定抗體或其它結(jié)合劑對Notchl的結(jié)合親和力和抗體抗原相互作用的結(jié)合解離率(on-oFF rate)。在一些實施方案中，一種競爭結(jié)合檢驗是放射免疫檢驗，所述放射免疫檢驗包括在增加量的未標(biāo)記抗原的存在下使經(jīng)標(biāo)記抗原(例如3H 或125I標(biāo)記的抗原)或其片段或變體與目的抗體一起溫育，然后檢測與經(jīng)標(biāo)記抗原結(jié)合的抗體。可以從根據(jù)斯卡恰特作圖分析獲得的數(shù)據(jù)確定抗體對抗原的親和力和結(jié)合解離率。在一些實施方案中，使用Biacore動力學(xué)分析來確定抗體或劑結(jié)合Notch (例如,人Notchl、人Notch2、人Notch3、人Notch4或小鼠Notch)的結(jié)合親和力和結(jié)合解離率。Biacore動力學(xué)分析包括分析抗體與固定在Biacore芯片表面上的抗原(例如Notchl蛋白)的結(jié)合和解離。在一些實施方案中，可使用Biacore動力學(xué)分析來研究定性表位競爭結(jié)合檢驗中不同抗體的結(jié)合。在某些實施方案中，本發(fā)明提供特異性結(jié)合人Notchl的胞外域的非配體結(jié)合近膜區(qū)的抗體，其中該抗體包括抗體52M51的⑶R (參見表I)的一個、兩個、三個、四個、五個和/或六個。在一些實施方案中，該抗體包括52M51的⑶R的一個或多個、52M51的⑶R的兩個或更多個、52M51的⑶R的三個或更多個、52M51的⑶R的四個或更多個、52M51的⑶R的五個或更多個、或52M51的⑶R的所有六個。在一些實施方案中，該抗體包括具有每⑶R多達四個(即，O、I、2、3或4個)氨基酸取代的⑶R。在某些實施方案中，重鏈⑶R被包含在重鏈可變區(qū)中。在某些實施方案中，輕鏈CDR被包含在輕鏈可變區(qū)中。表I
權(quán)利要求
1.一種治療受治療者中血液癌癥的方法，包括向所述受治療者施用治療有效量的特異性結(jié)合人Notchl的胞外域的非配體結(jié)合近膜區(qū)的抗體，其中所述抗體包括 (a)包含RGYWIE (SEQ ID NO: 15)的重鏈 CDR1、包含 QILPGTGRTNYNEKFKG (SEQ IDNO: 16)的重鏈 CDR2、和包含 FDGNYGYYAMDY (SEQ ID NO: 17)的重鏈 CDR3 ;和 / 或(b)包含RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO: 18)的輕鏈 CDR1、包含 GTNNRAP(SEQ ID NO: 19)的輕鏈 CDR2、和包含 ALWYSNHWVFGGGTKL (SEQ ID NO:20)的輕鏈 CDR3。
2.一種治療受治療者中血液癌癥的方法,包括向所述受治療者施用治療有效量的特異性結(jié)合人Notchl的胞外域的非配體結(jié)合近膜區(qū)的抗體，其中所述抗體包括 (a)包含RGYWIE(SEQ ID NO: 15)、或包含1、2、3或4個氨基酸取代的其變體的重鏈CDRl ； (b)包含QILPGTGRTNYNEKFKG(SEQ ID NO: 16)、或包含1、2、3或4個氨基酸取代的其變體的重鏈⑶R2 ； (c)包含F(xiàn)DGNYGYYAMDY(SEQ ID NO: 17)、或包含1、2、3或4個氨基酸取代的其變體的重鏈CDR3 ； (d)包含RSSTGAVTTSNYAN(SEQID NO: 18)、或包含1、2、3或4個氨基酸取代的其變體的輕鏈⑶Rl ； (e)包含GTNNRAP(SEQ ID NO: 19)、或包含1、2、3或4個氨基酸取代的其變體的輕鏈CDR2 ;和 (f)包含ALWYSNHWVFGGGTKL(SEQ ID NO: 20)、或包含I、2、3或4個氨基酸取代的其變體的輕鏈⑶R3。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述氨基酸取代是保守性氨基酸取代。
4.一種治療受治療者中血液癌癥的方法,包括向所述受治療者施用治療有效量的特異性結(jié)合人Notchl的胞外域的非配體結(jié)合近膜區(qū)的抗體，其中所述抗體包括(a)與SEQID NO: 14或SEQ ID NO: 24具有至少約90%序列同一性的重鏈可變區(qū)；和/或(b)與SEQID N0:8、SEQ ID N0:28或SEQ ID NO:32具有至少約90%序列同一性的輕鏈可變區(qū)。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述抗體包括(a)與SEQID NO: 14或SEQ ID NO: 24具有至少約95%序列同一性的重鏈可變區(qū)；和/或(b)與SEQID N0:8、SEQ ID N0:28或SEQ ID NO:32具有至少約95%序列同一性的輕鏈可變區(qū)。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述抗體包括 (a)包含SEQID NO: 14或SEQ ID NO:24的重鏈可變區(qū)；和/或 (b)包含SEQ ID NO:8、SEQ ID NO: 28 或 SEQ ID NO: 32 的輕鏈可變區(qū)。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述抗體包括 (a)包含SEQID NO: 14的重鏈可變區(qū)和 (b)包含SEQID NO:8的輕鏈可變區(qū)。
8.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述抗體包括(a)包含SEQID NO:24的重鏈可變區(qū)和 (b)包含SEQID NO:28的輕鏈可變區(qū)。
9.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述抗體包括 (a)包含SEQID NO:24的重鏈可變區(qū)和 (b)包含SEQID NO:32的輕鏈可變區(qū)。
10.如權(quán)利要求1-9中任一項所述的方法，其中所述抗體是重組抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體、人抗體、或抗體片段。
11.如權(quán)利要求1-10中任一項所述的方法，其中所述抗體是單特異性抗體或雙特異性抗體。
12.如權(quán)利要求1-11中任一項所述的方法，其中所述抗體是單價抗體。
13.如權(quán)利要求1-12中任一項所述的方法，其中所述抗體是IgA、IgD、IgE、IgG或IgM抗體。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述抗體是IgGl或IgG2抗體。
15.—種治療受治療者中血液癌癥的方法,包括向所述受治療者施用治療有效量的特異性結(jié)合人Notchl的胞外域的非配體結(jié)合近膜區(qū)的抗體，其中所述抗體由在ATCC以52M51或?qū)＠２靥朠TA-9405保藏的雜交瘤細胞系產(chǎn)生。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述抗體是52M51的人源化形式。
17.一種治療受治療者中血液癌癥的方法,包括向所述受治療者施用治療有效量的特異性結(jié)合人Notchl的胞外域的非配體結(jié)合近膜區(qū)的抗體，其中所述抗體由在ATCC以52M51H4L3或?qū)＠２靥朠TA-9549保藏的多核苷酸編碼。
18.—種治療受治療者中血液癌癥的方法,包括向所述受治療者施用治療有效量的特異性結(jié)合人Notchl的胞外域的非配體結(jié)合近膜區(qū)的抗體，其中所述抗體結(jié)合由以ATCC專利保藏號PTA-9405保藏的雜交瘤細胞系產(chǎn)生的抗體52M51結(jié)合的所述近膜區(qū)中的表位相同的表位。
19.一種治療受治療者中血液癌癥的方法,包括向所述受治療者施用治療有效量的特異性結(jié)合人Notchl的胞外域的非配體結(jié)合近膜區(qū)的抗體，其中所述抗體與抗體52M51競爭對所述近膜區(qū)的特異性結(jié)合。
20.如權(quán)利要求1-19中任一項所述的方法，其中所述受治療者是人。
21.—種抑制血液癌癥生長的方法，包括將所述癌細胞與有效量的特異性結(jié)合人Notchl的胞外域的非配體結(jié)合近膜區(qū)的抗體接觸，其中所述抗體包括 (a)包含RGYWIE (SEQ ID NO: 15)的重鏈 CDR1、包含 QILPGTGRTNYNEKFKG (SEQ IDNO: 16)的重鏈 CDR2、和包含 FDGNYGYYAMDY (SEQ ID NO: 17)的重鏈 CDR3 ;和 / 或(b)包含RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO: 18)的輕鏈 CDRl、包含 GTNNRAP (SEQ ID NO: 19)的輕鏈 CDR2、和包含 ALWYSNHWVFGGGTKL (SEQ ID NO: 20)的輕鏈 CDR3。
22.如權(quán)利要求1-21中任一項所述的方法，其中所述Notchl的非配體結(jié)合近膜區(qū)包括SEQ ID NO:2。
23.如權(quán)利要求1-22中任一項所述的方法，其中所述抗體特異性結(jié)合至少一種另外Notch受體的胞外域的非配體結(jié)合近膜區(qū)。
24.如權(quán)利要求1-23中任一項所述的方法，其中所述抗體是Notchl拮抗劑。
25.如權(quán)利要求1-24中任一項所述的方法，其中所述抗體抑制Notchl的激活。
26.如權(quán)利要求1-25中任一項所述的方法，其中所述抗體抑制Notchl活性。
27.如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述抗體抑制組成型激活的Notchl的活性。
28.如權(quán)利要求1-27中任一項所述的方法，其中所述抗體抑制Notchl信號傳導(dǎo)。
29.如權(quán)利要求1-28中任一項所述的方法，其中所述抗體抑制所述近膜區(qū)中的裂解。
30.如權(quán)利要求29所述的方法，其中所述抗體抑制所述近膜區(qū)中在S2位點處的裂解。
31.如權(quán)利要求1-30中任一項所述的方法，其中所述抗體抑制Notchl的胞內(nèi)域(I⑶)的釋放。
32.如權(quán)利要求1-31中任一項所述的方法，其中所述血液癌癥是急性骨髓性白血病、霍奇金淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤或T細胞急性淋巴母細胞性白血病。
33.如權(quán)利要求1-31中任一項所述的方法，其中所述血液癌癥是T細胞急性淋巴母細胞性白血病。
34.如權(quán)利要求1-33中任一項所述的方法，其中所述抗體抑制所述癌細胞的生長。
35.如權(quán)利要求1-34中任一項所述的方法，所述方法還包括施用至少一種另外的治療劑。
36.如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述另外的治療劑是化學(xué)治療劑。
37.如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述另外的治療劑是另外的治療抗體。
38.如權(quán)利要求37所述的方法，其中所述另外的治療抗體包括特異性結(jié)合第二Notch受體的抗體。
39.如權(quán)利要求37所述的方法，其中所述另外的治療抗體包括特異性結(jié)合Notch受體配體的抗體。
40.如權(quán)利要求1-39中任一項所述的方法，其中所述抗體與細胞毒性劑共軛。
41.如權(quán)利要求1-40中任一項所述的方法，其中所述抗體在放射治療后施用。
42.如權(quán)利要求1-40中任一項所述的方法，其中所述抗體與放射治療一起施用。
43.一種通過減少包含癌干細胞的血液癌癥中癌干細胞的頻率或數(shù)量來減少所述血液癌癥的致瘤性的方法，所述方法包括將所述癌細胞與有效量的抑制Notchl活性的抗體接觸。
全文摘要
本發(fā)明涉及Notch1結(jié)合劑和使用該劑用于治療疾病諸如血液癌癥的方法。本發(fā)明提供特異性結(jié)合人Notch1的胞外域的非配體結(jié)合近膜區(qū)的抗體。本發(fā)明還提供使用抑制Notch1活性的劑用于治療癌癥的方法。還描述治療血液癌癥的方法，包括向患有血液癌癥諸如T細胞淋巴母細胞性白血病的受治療者施用治療有效量的本發(fā)明的結(jié)合劑或抗體。
文檔編號C07K16/00GK102958534SQ201180009457
公開日2013年3月6日 申請日期2011年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月13日
發(fā)明者愛德華·特恩·圖恩·范德霍斯特 申請人:昂考梅德藥品有限公司