專利名稱：抗細(xì)胞型朊蛋白單克隆抗體在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種與人體正常粘膜所分泌的天然蛋白-細(xì)胞型朊蛋白(cellularprion protein),相結(jié)合的單克隆抗體的雜交瘤，由該雜交瘤產(chǎn)生的抗細(xì)胞型朊蛋白單克隆抗體及其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
結(jié)直腸癌是世界第三大惡性腫瘤。近二十多年來，結(jié)直腸癌發(fā)病率逐年上升，尤其是亞洲國(guó)家結(jié)直腸癌發(fā)病率上升趨勢(shì)十分明顯，致死率居高不下，位居癌癥死因的第二位。目前，世界上治療腫瘤的主要方法是手術(shù)、放療、化療和生物治療等四種。從醫(yī)學(xué)角度看，至今腫瘤的治療沒有一種完全有效的手段，尤其是已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移的腫瘤患者，傳統(tǒng)的治療方 法無法控制腫瘤的全身擴(kuò)散。編碼細(xì)胞型朊蛋白的基因PRNP定位于20號(hào)染色體，基因全長(zhǎng)20kb，包含2個(gè)外顯子。PRNP基因轉(zhuǎn)錄的mRNA長(zhǎng)度為2. 5kb (NM_000311)，編碼由253個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，具有高度不穩(wěn)定的5個(gè)串聯(lián)八肽重復(fù)區(qū)(5 tandem octapeptide重復(fù)區(qū))。細(xì)胞型朊蛋白與瘋牛病致病性朊病毒蛋白具有相同的氨基酸序列，為同一個(gè)基因PRNP所編碼。但在三級(jí)結(jié)構(gòu)方面，細(xì)胞型朊蛋白具有豐富的α螺旋的三級(jí)結(jié)構(gòu)，而致病性朊蛋白表現(xiàn)為β折疊。相對(duì)于朊病毒的研究，細(xì)胞型朊蛋白的功能尚未得到明確的認(rèn)識(shí)。朊蛋白基因敲除小鼠的研究提示細(xì)胞型朊蛋白缺失后小鼠會(huì)出現(xiàn)心律失常、晝夜節(jié)律改變等癥狀。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞型朊蛋白與乳腺癌、前列腺癌、肝癌和結(jié)腸癌等多種腫瘤相關(guān)(Mehrpour，M. ；Codogno, P. ,2009. Cancer Lett.，290 :1_23)，在胃癌和乳腺癌中細(xì)胞型朊蛋白表達(dá)與Bcl-2上調(diào)相關(guān)，參與發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡功能(Liang，J. ；Pan, Y. L. ；Ning, X. X.；Sun，LJ. ;Lan，M. ;Hong，L ;Du，J. P. ;Liu，N. ;Liu，C. J. ;Qiao，T. D. ;Fan，D. M. , 2006.Tumour. Biol.，27 :84_91) (Li，Q. Q. ;Cao，X. X. ;Xu，J. D. ;Chen，Q. ；Wang, W. J. ;Tang，F(xiàn).；Chen, Z. Q. ;Liu，X. P. ;Xu，Z. D.，2009. Cell Mol. Life Sc1.，66 :504_515) 細(xì)胞型朊蛋白能抵抗腫瘤壞死因子RNF-α和TRAIL引起的乳腺癌細(xì)胞凋亡(Diaira-Mehrpoun M.；Arrabal, S. ；Jalil, A. ;Pinson，X. ;Gaudin，C. ;Pietu，G. ;Pitaval，A. ;Ripoche，H.；Eloit, M. ;Dormont，D. ；Chouaib, S. , 2004. Cancer Res.，64 :719-727) (Meslin，F(xiàn). ;Hamai，A. ;Gao，P. ； Jalil, A. ;Cahuzac，N. ;Chouaib，S. ;Mehrpour，M. , 2007. Cancer Res.，67 10910-10919)，此外還有報(bào)道指出細(xì)胞型朊蛋白通過增加葡萄糖水平上升來促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞生存(Li, Q.Q. ；Sun, Y. P. ；Ruan, C. P. ；Xu, X. Y. ；Ge, J. H. ；He, J. ；Xu, Z. D. ；ffang,Q. ；Gao, ff. C. ,2011. Cancer Sc1.，102 :400_406)。Dodelet 等人報(bào)道細(xì)胞型朊蛋白對(duì)于CD34+造血干細(xì)胞的自我更新是必須的(Dodelet, V. C. ；Cashman, N. R. , 1998. Blood,91 1556-1561), Weinberg的研究結(jié)果提示細(xì)胞型朊蛋白可能與乳腺細(xì)胞球狀體形成相關(guān)(Liao, M. J. ；Zhang, C. C. ；Zhou, B. ；Zimonjic, D. B. ；Mani, S. A. ；Kaba, M. ；Gifford, A.；Reinhardt, F. ；Popescu, N. C. ；Guo, ff. ；Eaton, E. N. ；Lodish, H. F. ；ffeinberg, R. A. , 2007.Cancer Res. ,67 :8131_8138)。盡管以上報(bào)道提示細(xì)胞型朊蛋白可能與多種腫瘤相關(guān)，但是細(xì)胞型朊蛋白在人類腫瘤中的具體生理功能至今還不清楚，對(duì)于腫瘤發(fā)生、發(fā)展的作用機(jī)制未見報(bào)道。越來越多的證據(jù)表明腫瘤干細(xì)胞對(duì)于腫瘤的發(fā)生起著重要作用。腫瘤干細(xì)胞是一類存在與腫瘤組織中具有極高自我更新能力的群體，對(duì)于放療和化療不敏感，往往成為腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的根源。我們已發(fā)表的文章表明CD44作為腫瘤干細(xì)胞的表面標(biāo)志物能夠促進(jìn)腫瘤的發(fā)生(Du, L. ；ffang, H. ；He, L. ；Zhang, J. ；Ni, B. ；ffang, X. ；Jin, H. ；Cahuzac, N.；Mehrpour, M. ；Lu, Y. ；Chen, Q. 2008. Clin. Cancer Res. 14 :6751_6760)。我們最近的研究結(jié)果顯示細(xì)胞型朊蛋白與結(jié)直腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移有正相關(guān)性。研究結(jié)果顯示細(xì)胞型朊蛋白與CD44雙陽(yáng)性的細(xì)胞具有更高的腫瘤形成能力和轉(zhuǎn)移能力，細(xì)胞型朊蛋白能顯著提高結(jié)直腸癌干細(xì)胞的成瘤性和轉(zhuǎn)移能力。因此，將其應(yīng)用于腫瘤藥物的制備，為腫瘤的治療提供了新的策略
發(fā)明內(nèi)容

因此，本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種高特異性和靈敏度的抗細(xì)胞型朊蛋白單克隆抗體以及這種鼠源抗細(xì)胞型朊蛋白單克隆抗體在制備抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物中的用途。該抗體的亞類為IgG2a，能特異結(jié)合細(xì)胞型朊蛋白重組抗原和天然抗原，能特異結(jié)合表達(dá)細(xì)胞型朊蛋白的轉(zhuǎn)移型腫瘤干細(xì)胞，能顯著抑制腫瘤細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。本發(fā)明用于實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下一方面，本發(fā)明提供一種保藏號(hào)為CGMCC No. 4972的雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)bM-PRI0-3 (分類命名小鼠雜交瘤細(xì)胞，保藏日期2011年6月21日，保藏號(hào)為CGMCCNo. 4972，保藏地中國(guó)院微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)。另一方面，本發(fā)明提供一種抗細(xì)胞型朊蛋白單克隆抗體，由保藏號(hào)為CGMCC No4972的雜交瘤細(xì)胞系的產(chǎn)生。優(yōu)選地，所述抗細(xì)胞型朊蛋白單克隆抗體能夠與細(xì)胞型朊蛋白特異性結(jié)合。優(yōu)選地，所述細(xì)胞型朊蛋白的氨基酸殘基序列如SEQ ID NO :1所示。優(yōu)選地，所述細(xì)胞型朊蛋白的編碼基因如SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列。又一方面，本發(fā)明提供一種制備重組載體的方法，所述方法包括上述所述的基因插入已知載體。又一方面，本發(fā)明還提供一種重組載體，所述重組載體含有上述所述的基因或由上述所述的方法產(chǎn)生。優(yōu)選地，所述已知載體為pET_30a(+)。再一方面，本發(fā)明提供一種制備重組有機(jī)體的方法，所述方法包括上述所述的重組載體導(dǎo)入宿主有機(jī)體。優(yōu)選地，所述宿主有機(jī)體為大腸桿菌，所述大腸桿菌優(yōu)選為BL21菌株，所述BL21菌株優(yōu)選為 BL21-Condon Plus(DE3)。又一方面，本發(fā)明提供一種抗細(xì)胞型朊蛋白單克隆抗體在制備用于抗腫瘤的藥物中的應(yīng)用。優(yōu)選地，所述抗腫瘤藥物包括抗結(jié)直腸癌藥物、抗結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移藥物、抗直腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移藥物、抗直腸癌細(xì)胞擴(kuò)散藥物、抗直腸癌干細(xì)胞轉(zhuǎn)移藥物和抗直腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)藥物。本發(fā)明的抗細(xì)胞型朊蛋白抗體靈敏度和特異性高，不僅與重組的細(xì)胞型朊蛋白抗原具有極強(qiáng)的特異性和敏感性，而且與結(jié)直腸腫瘤組織和細(xì)胞中的細(xì)胞型朊蛋白有極強(qiáng)的特異性和敏感性，從而作為分子標(biāo)志物應(yīng)用于結(jié)直腸癌腫瘤干細(xì)胞的臨床診斷和預(yù)后療效的評(píng)估。


以下，結(jié)合附圖來詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施方案，其中圖1為本發(fā)明所述的細(xì)胞型朊蛋白的編碼基因PCR擴(kuò)增后的瓊脂糖電泳結(jié)果示意圖，圖中I為PCR擴(kuò)增所得的細(xì)胞型朊蛋白的編碼基因，2為DNA標(biāo)記(Marker)；圖2為本發(fā)明所述的細(xì)胞型朊蛋白的編碼基因克隆于的pET_30a(+)載體的圖譜 及該載體克隆表達(dá)區(qū)域的圖譜；圖3為本發(fā)明所述的細(xì)胞型朊蛋白的編碼基因克隆的瓊脂糖電泳結(jié)果示意圖，圖中I為DNA標(biāo)記(Marker)，2-6分別為1_5號(hào)細(xì)胞型朊蛋白的基因克?。粓D4為1-5號(hào)細(xì)胞型朊蛋白的編碼基因克隆的測(cè)序圖譜；圖5為更換宿主BL21-Codon Plus (DE3)后，誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)胞型朊蛋白的SDS-PAGE電泳結(jié)果示意圖，圖中I為蛋白標(biāo)記(Marker)，2為未誘導(dǎo)表達(dá)的含細(xì)胞型朊蛋白的編碼基因的菌，3為誘導(dǎo)表達(dá)的含細(xì)胞型朊蛋白的編碼基因的菌的上清，4為誘導(dǎo)表達(dá)的含細(xì)胞型朊蛋白的編碼基因的菌的沉淀；圖6為大量表達(dá)的細(xì)胞型朊蛋白粗提純后進(jìn)行SDS-PAGE電泳結(jié)果示意圖，圖中I為蛋白標(biāo)記(Marker)，2為大量誘導(dǎo)表達(dá)的含細(xì)胞型朊蛋白的編碼基因的菌的沉淀，3為大量誘導(dǎo)表達(dá)的含細(xì)胞型朊蛋白的編碼基因的菌的上清；圖7為大量表達(dá)的細(xì)胞型朊蛋白純化后進(jìn)行SDS-PAGE電泳結(jié)果示意圖，圖中I為純化后的細(xì)胞型朊蛋白，2為蛋白標(biāo)記(Marker)；圖8為本發(fā)明所述的抗細(xì)胞型朊蛋白單克隆抗體進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)直腸癌配對(duì)組織中的表達(dá)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖，圖中圖8-1為細(xì)胞型朊蛋白在轉(zhuǎn)移型結(jié)腸癌組織中的表達(dá)情況，圖8-2為細(xì)胞型朊蛋白在非轉(zhuǎn)移型結(jié)腸癌組織中的表達(dá)情況；圖9為發(fā)明所述的抗細(xì)胞型朊蛋白單克隆抗體的用途驗(yàn)證-免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖，圖中A中的1、2、5、6、7、8為細(xì)胞型朊蛋白在6例轉(zhuǎn)移型直腸癌中的表達(dá)情況及在3、4例非轉(zhuǎn)移型直腸癌中的表達(dá)情況，圖中B為作為正對(duì)照的肌動(dòng)蛋白的實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖；圖10為本發(fā)明所述的抗細(xì)胞型朊蛋白單克隆抗體在進(jìn)行免疫熒光定位外源細(xì)胞型朊蛋白的實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖；圖11為本發(fā)明所述的抗細(xì)胞型朊蛋白單克隆抗體抑制腫瘤肝細(xì)胞轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖，圖11-1為L(zhǎng)gG抗體抑制腫瘤干細(xì)胞轉(zhuǎn)移的試驗(yàn)結(jié)果示意圖，圖11-2為抗細(xì)胞型朊蛋白單克隆抗體抑制腫瘤干細(xì)胞轉(zhuǎn)移的試驗(yàn)結(jié)果示意圖。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例中所使用的技術(shù)，包括基因擴(kuò)增，基因克隆，細(xì)胞融合，以及細(xì)胞培養(yǎng)、檢測(cè)技術(shù)，除非特別說明，均為本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)；所使用的儀器設(shè)備、試齊U、細(xì)胞等，除非是說明書中特別說明，均為本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過公共途徑獲得的。以下試驗(yàn)小鼠均為Balb/c小鼠，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。實(shí)施例1 :細(xì)胞型朊蛋白抗原的制備細(xì)胞型朊蛋白抗原是以正常某組織cDNA為模板，根據(jù)細(xì)胞型朊蛋白的編碼基因序列(SEQ ID NO 2)設(shè)計(jì)特異引物，引物兩端連入BamH I和Xho I酶切位點(diǎn)。上游引物5'-CGGGATCCGGTGGTGGTATGGCGAACCTTGGCTGCTGGAT-3' (SEQ IDNO 3)下游引物5'-CCGCTCGAGTCCCACTATCAGGAAGATGAGGAAAG-3(SEQ ID NO :4)'。 PCR擴(kuò)增細(xì)胞型朊蛋白的編碼基因(PCR參數(shù)95°C 5min，94°C 45S，62°C lmin，72°C lmin30s,72°C lOmin，反應(yīng)循環(huán)數(shù)為30)后進(jìn)行瓊脂糖電泳，結(jié)果如圖1所示，表明擴(kuò)增的為細(xì)胞型朊蛋白的編碼基因；再將擴(kuò)增的細(xì)胞型朊蛋白的編碼基因經(jīng)BamH I和Xho I雙酶切后與pET30a(+)連接，化學(xué)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞BL21，挑取1_5號(hào)單克隆提取質(zhì)粒酶切后進(jìn)行瓊脂糖電泳，結(jié)果如圖2所示，均勻大小正確的片段插入，再將其進(jìn)行測(cè)序(圖4為測(cè)序的實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖)，驗(yàn)證序列4號(hào)克隆正確。更換表達(dá)宿主BL21-Codon Plus(DE3)，選擇測(cè)序正確的陽(yáng)性菌4號(hào)克隆，0.4mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)過夜。誘導(dǎo)以后，收集菌體，經(jīng)超聲破碎后離心，以未誘導(dǎo)的表達(dá)菌作為負(fù)對(duì)照，上清和沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳，如圖5所示，結(jié)果顯示表達(dá)的產(chǎn)物為非可溶性蛋白。大量培養(yǎng)細(xì)菌后進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，收集誘導(dǎo)表達(dá)菌，超聲破碎離心后，上清和沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳，如圖6所示，表達(dá)的產(chǎn)物為非可溶性蛋白，且大小與細(xì)胞型朊蛋白相符；再將其提取細(xì)胞型朊蛋白，將經(jīng)N1-NAT親和層析柱(購(gòu)自GEHealthcare)進(jìn)行純化，50mM咪唑洗脫細(xì)胞型朊蛋白，SDS-PAGE電泳，結(jié)果如圖7所示，切取條帶進(jìn)行MALD1-TOF/TOF鑒定(購(gòu)自BRUKEROPTICS)，證實(shí)表達(dá)產(chǎn)物為細(xì)胞型朊蛋白。實(shí)施例2 :抗細(xì)胞型朊蛋白雜交瘤的制備I)免疫將經(jīng)N1-NAT親和層析純化得到的細(xì)胞型朊蛋白，腹部皮下免疫(免疫前眼眶取20 μ L血清做陰性對(duì)照)3只4-6周齡雌性Balb/c小鼠，編號(hào)為1，2，3 ;劑量為每只小鼠60 μ g蛋白+生理鹽水至200 μ L+CFA200 μ L0每14天皮下加強(qiáng)免疫一次，劑量為每只小鼠30 μ g蛋白+生理鹽水至200 μ L+IFA200 μ L。第3次加強(qiáng)免疫后7天眼眶取血測(cè)效價(jià)，達(dá)要求者沖擊免疫，50 μ g蛋白+生理鹽水至IOOyL;尾靜脈注射，待3天后融合。2)融合將新鮮切下的小鼠脾臟放到細(xì)胞篩上碾碎過濾，與sp2/0細(xì)胞(購(gòu)自華大蛋白質(zhì)中心凍存)按1: 5的比例混合，1500轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘。將裝有離心好的、且混勻的細(xì)胞的離心管放入37°C溫水浴中，邊攪動(dòng)細(xì)胞邊緩慢加入ImL PEG1500。在水浴中靜置I分鐘。緩慢加入IOmL的無血清的MDM(Sigma，H0262-10VL) 1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘。棄上清，加入IOmL的血清小心的將細(xì)胞吹打起來，并加入胸腺細(xì)胞(小鼠頸椎脫臼處死，75%乙醇浸泡3分鐘，取出小鼠置于無菌紙上，腹面朝上。打開胸腔分離出胸腺，放入培養(yǎng)皿中，用鑷子夾碎，加入400u/ml III型膠原酶5ml/只脾臟，37度消化20分鐘，用尼龍網(wǎng)過濾，得到胸腺單細(xì)胞懸液)及25mL半固體培養(yǎng)基，充分混勻，均勻倒入20個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)皿中。將細(xì)胞培養(yǎng)皿放入到濕盒中，放入5% CO2孵箱中培養(yǎng)。3)挑克隆融合后7-10天，觀察克隆細(xì)胞團(tuán)大小密度適中。在解剖鏡下，吸取圓、實(shí)、大克隆團(tuán)于預(yù)先準(zhǔn)備好培養(yǎng)基(含飼養(yǎng)細(xì)胞和1% HT次黃嘌呤(hypoxantin)和胸腺喃唳脫氧核苷(thymidin)液體)的96孔板中。放入5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱。4)篩選a. 一篩挑克隆后3天左右，觀察細(xì)胞量大約占底面積2/3時(shí)，取100 μ L上清ELISA篩選。陽(yáng)性克隆進(jìn)行換液，添加200 μ L完全 培養(yǎng)基(含I % HT液體)。b. 二篩2天后重復(fù)步驟a進(jìn)行二次篩選。陽(yáng)性株轉(zhuǎn)入預(yù)先準(zhǔn)備好培養(yǎng)基(含飼養(yǎng)細(xì)胞和I % HT液體)的24孔板。c.三篩5天后,用含標(biāo)簽His的其它重組蛋白包板,取100 μ L上清ELISA篩選。符合要求的克隆轉(zhuǎn)入6孔板或細(xì)胞培養(yǎng)瓶擴(kuò)大培養(yǎng)。5)細(xì)胞凍存對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞占滿底面積80%左右即可凍存。收集上清且去除死細(xì)胞等雜質(zhì)，上清存于_20°C。直接將凍存細(xì)胞放4°C半小時(shí)，然后放-20°C兩小時(shí)，轉(zhuǎn)-80°C凍存過夜，次日放液氮罐。實(shí)施例3 :由保藏號(hào)為CGMCC No. 4972的雜交瘤細(xì)胞系制備抗細(xì)胞型朊蛋白單克隆抗體發(fā)明人將雜交瘤(命名為AbM-PRI0_3，分類命名小鼠雜交瘤細(xì)胞，保藏日期2011年6月21日，保藏號(hào)為CGMCC No. 4972，保藏地中國(guó)院微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，用于制備鼠抗細(xì)胞型朊蛋白單克隆抗體，具體操作步驟如下I)細(xì)胞復(fù)蘇從-80°C冰箱或液氮罐中迅速取出凍存管；迅速放入37°C水浴鍋中快速攪動(dòng)，使凍存液在2分鐘內(nèi)全部融化成液體。往15mL離心管中加入3mL血清培養(yǎng)基，將凍存液吸入離心管，1500轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘。棄上清，用完全培養(yǎng)基懸起細(xì)胞，培養(yǎng)于6孔板(3mL)或瓶(5mL)中。2)腹水制備對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基洗滌并懸起；計(jì)數(shù)大約5X 105，ImL0懸浮的細(xì)胞腹腔注射小鼠。7-10天后便收集腹水。第一次收集3mL左右，每隔2、3天重復(fù)取，最終可收集8mL/只。每次取出的腹水4000轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘；中間為腹水。小心吸出腹水收集于離心管中，4°C保存。3)單克隆抗體的純化用HiTrap rProtein A FF(GE Healthcare, 17-5079-01)親和層析柱純化單克隆抗體。將腹水在4°C條件下，10000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，去除脂類物質(zhì)。離心后吸取上清，并用耦聯(lián)緩沖液以1: 3(腹水耦連液)稀釋，用0.45μπι膜過濾。濾液上樣到耦聯(lián)緩沖液平衡過的層析柱。用耦聯(lián)緩沖液洗過柱子后，用洗脫緩沖液洗脫抗體，收集于事先裝有中和液的收集管中。
實(shí)施例4 :單克隆抗體的鑒定I)單克隆抗體特異性的測(cè)定a.用本發(fā)明方法制得的鼠抗朊蛋白單克隆抗體和商品化鼠抗朊蛋白單克隆抗體(Cayman)分別以I 100，I 200，I 500，I 1000，I 2000稀釋后與結(jié)腸癌細(xì)胞共同孵育10分鐘,然后與苯腎上腺素(phenylephrine, PE)熒光標(biāo)記的二抗孵育10分鐘,在熒光顯微鏡下觀察定位和熒光強(qiáng)度，檢測(cè)抗體的特異性和靈敏度。本發(fā)明方法制得的鼠抗朊蛋白單克隆抗體更為特異地定位在細(xì)胞膜上。b.用本發(fā)明方法制得的鼠抗朊蛋白單克隆抗體和商品化鼠抗朊蛋白單克隆抗體分別以1: 200，I 500，I 1000,1 2000,1 5000稀釋后與結(jié)腸癌石蠟切片共同孵育60分鐘，然后與二抗孵育30分鐘，3，3-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，封片。在顯微鏡下觀察陽(yáng)性細(xì)胞的定位和信號(hào)，檢測(cè)抗體的特異性和靈敏度。本發(fā)明方法制得的鼠抗朊蛋白單克隆抗體更為特異地定位在細(xì)胞膜上，并且靈敏度是商品化鼠抗朊蛋白單克隆抗體的10倍。 2)單克隆抗體效價(jià)的測(cè)定用本發(fā)明方法制得的鼠抗朊蛋白單克隆抗體和商品化鼠抗朊蛋白單克隆抗體分別以1: 200，I 500,1 1000,1 2000,1 5000,1 10000 稀釋后與結(jié)腸癌細(xì)胞裂解液電泳轉(zhuǎn)膜孵育過夜，然后與辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育2小時(shí)，與ECL發(fā)光底物孵育曝光顯影，檢測(cè)抗體的靈敏度。結(jié)果顯示本發(fā)明方法制得的鼠抗朊蛋白單克隆抗體效價(jià)是商品化鼠抗朊蛋白單克隆抗體的20倍(本發(fā)明方法制得的鼠抗朊蛋白單克隆抗體效價(jià)為1000，商品化鼠抗朊蛋白單克隆抗體的效價(jià)為500，即10000/500 = 20)。3) ELISA法鑒定單克隆抗體亞類a.實(shí)驗(yàn)操作用IOOmM PBS (pH7. 4)稀釋包被羊抗鼠 IgG 至 O. 5 μ g/mL，每孔加 100 μ L，4。。，過夜。傾空液體，用含O. 05% Tween的PBS (PBST)洗3次，每孔加入200 μ L封閉液，37°C孵育I小時(shí)。傾空液體，用PBST清洗3次。每孔加入O.1mL雜交瘤上清，37°C孵育I小時(shí)。傾空液體用PBST清洗3次。用封閉液1: 1000稀釋HRP標(biāo)記的羊抗鼠(κ，λ )抗體(購(gòu)自 SouthernBiotech)或 I 2000 稀釋 HRP 標(biāo)記的羊抗鼠(IgM, IgGl, IgG2a, IgG2b, IgG3,IgA)抗體(購(gòu)自Southern Biotech)O.1mL每孔,分別加入適當(dāng)?shù)目字校?7°C用孵育I小時(shí)。傾空液體，用PBS-T清洗3次。每孔加50 μ L底物溶液，10-20分鐘內(nèi)測(cè)405nm波長(zhǎng)下的OD值。b.實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，本發(fā)明所述的抗細(xì)胞型朊蛋白單克隆抗體為IgG2a型鼠源單克隆抗體。實(shí)施例5 :ELISA法測(cè)定單克降抗體親和常數(shù)I)實(shí)驗(yàn)步驟包被免疫用重組細(xì)胞型朊蛋白，包被濃度為2 μ g/mL，100 μ L/孔，4°C包被過夜，I X PBST (磷酸鹽緩沖液，加吐溫20)洗3次。每孔加200 μ L封閉液37 °C封閉2小時(shí)，I XI3BST洗3次。抗細(xì)胞型朊蛋白單克隆抗體，從1: 200開始2倍梯度稀釋，最后I孔留空白對(duì)照，37°C孵育I小時(shí)，IXPBST洗3次。辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠二抗I 20000稀釋，每孔100 μ L，37°C孵育I小時(shí)，I XPBST洗3次。顯色液100 μ L/孔顯色10分鐘，50 μ L/孔終止液終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀(購(gòu)自北京天石醫(yī)療用品制作所，型號(hào)SM-3)，測(cè)定波長(zhǎng)450/630吸光值。2)數(shù)據(jù)分析找出> 1/2 “平臺(tái)OD值”對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)A。親和常數(shù)單個(gè)IgG抗體平均分子量值為150000，抗體原始濃度單位為4. 98mg/mL。3)結(jié)果本發(fā)明單克隆抗體的親和常數(shù)為1.08X 109。實(shí)施例6 :本發(fā)明的抗細(xì)胞型朊蛋白單克隆抗體的用途驗(yàn)證-免疫組化(IHC)1)材料來源本發(fā)明具體實(shí)施方式
所用結(jié)直腸癌組織標(biāo)本來源于北京腫瘤醫(yī)院組織標(biāo)本庫(kù)，共包括結(jié)直腸癌及對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織樣本。樣本取材是經(jīng)手術(shù)切除的新鮮結(jié)結(jié)直腸癌組織與其對(duì)應(yīng)的癌旁組織經(jīng)生理鹽水洗滌后，放入福爾馬林固定，石蠟包埋保存。標(biāo)本均經(jīng)病理證實(shí)，并有患者知情同意書。2)實(shí)驗(yàn)步驟烤片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化。O. 3% H2O2甲醇室溫10分鐘，然后用O. OlMPBS(磷酸鹽緩沖液)洗3次X5分鐘；5%脫脂奶粉，37°C封閉2小時(shí)；抗細(xì)胞型朊蛋白單克隆抗體(1 2000稀釋)，濕盒孵育4°C過夜；滴加羊抗鼠二抗(中杉金橋，PV-6002)，室溫孵育30分鐘；DAB-H202 (中杉金橋，ZL1-9031)顯色，鏡下控制3_5分鐘，PBS漂洗，終止顯色；蘇木素(中杉金橋，ZL1-9040)復(fù)染45秒，然后1%鹽酸酒精分化；自來水沖洗反藍(lán)；95 %和100 %乙醇脫水各5分鐘，二甲苯透明，中性樹膠封片。3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8所示，對(duì)免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析表明，細(xì)胞型朊蛋白在190例無轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌組織中不表達(dá)(_)或者弱陽(yáng)性表達(dá)(+);在53例轉(zhuǎn)移型結(jié)直腸癌組織中為陽(yáng)性結(jié)果(+++)，18例轉(zhuǎn)移型結(jié)直腸癌中弱陽(yáng)性表達(dá)(+)。P值小于O. 01。因此，組織芯片的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也完全支持蛋白質(zhì)組分析的結(jié)論，即細(xì)胞型朊蛋白在無轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌中低表達(dá)或不表達(dá)，但在轉(zhuǎn)移型結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)。實(shí)施例7 :本發(fā)明的抗細(xì)胞型朊蛋白單克降抗體的用涂驗(yàn)證-免疫印跡法(WB)本發(fā)明人進(jìn)一步應(yīng)用免疫印跡法WB測(cè)定細(xì)胞型朊蛋白在結(jié)直腸癌組織和6種結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的蛋白表達(dá)。1)實(shí)驗(yàn)步驟2種結(jié)直腸癌組織和6種結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的蛋白30 μ g樣本上樣于12% SDSPAGE膠；電泳結(jié)束后，將膠在I X轉(zhuǎn)移液中浸泡10分鐘；PVDF膜甲醇處理后350mA，轉(zhuǎn)膜70分鐘；將膜置于含5%脫脂奶粉的TBST封閉液中37°C封閉I小時(shí)；抗細(xì)胞型朊蛋白單克隆抗體(1 1000稀釋)37°C孵育I小時(shí)或者4°C孵育過夜；相應(yīng)羊抗鼠二抗(中杉金橋，I 2500稀釋)室溫孵育I小時(shí)；用皮爾斯發(fā)光試劑(購(gòu)自Pierce)孵育后用X光膠片曝光。2)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖9所示，在所有的八對(duì)結(jié)直腸癌和癌旁組織中，細(xì)胞型朊蛋白在正常組織中基本不表達(dá)，在低分化腫瘤組織中高表達(dá)。當(dāng)以結(jié)直腸癌組織中細(xì)胞型朊蛋白的表達(dá)作為陽(yáng)性對(duì)照時(shí)，6種結(jié)直腸癌細(xì)胞系中成瘤能力高的細(xì)胞系表達(dá)細(xì)胞型朊蛋白。
實(shí)施例8 :本發(fā)明的抗細(xì)胞型朊蛋白單克隆抗體的用途的驗(yàn)丨正-免疫熒光(IF)為了模擬細(xì)胞型朊蛋白的分泌后狀態(tài)，本發(fā)明人構(gòu)建了大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)了去除信號(hào)肽的細(xì)胞型朊蛋白質(zhì)一t-細(xì)胞型朊蛋白。本發(fā)明人采用免疫熒光技術(shù)來檢測(cè)t-細(xì)胞型朊蛋白的細(xì)胞定位。1)實(shí)驗(yàn)步驟將t-細(xì)胞型朊蛋白與結(jié)腸癌細(xì)胞SW480(購(gòu)自ATCC)共培養(yǎng)；3. 7%甲醛固定15分鐘；0. 2% TritonX-1OO打孔5分鐘；含1% BSA的PBS溶液封閉I小時(shí)；加特異抗細(xì)胞型朊蛋白單克隆抗體(1 100稀釋)暗盒中孵育2小時(shí)；FITC標(biāo)記的羊抗鼠二抗(中杉金橋，I 200稀釋)暗盒中孵育1小時(shí)；0.25 μ g/μ L 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)溶液染細(xì)胞4分鐘；將蓋玻片取出蓋在滴有IOyL抗熒光衰減封片劑的載玻片上，指甲油封片后，在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察。2)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖10所示，t_細(xì)胞型朊蛋白結(jié)合于細(xì)胞膜上，部分細(xì)胞型朊蛋白存在于高爾基體中。運(yùn)用獲得結(jié)論，細(xì)胞型朊蛋白能夠與腫瘤干細(xì)胞相結(jié)合，是該細(xì)胞的一個(gè)特異表達(dá)膜蛋白質(zhì)。細(xì)胞型朊蛋白在成熟過程中胞外區(qū)發(fā)生切割，產(chǎn)生一個(gè)14KD的N端從細(xì)胞膜上脫落，這就意味著細(xì)胞型朊蛋白作為腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)志物，可以在血清中檢測(cè)到細(xì)胞型朊蛋白的存在，這為細(xì)胞型朊蛋白的檢測(cè)提供了方便。具體地說，由于細(xì)胞型朊蛋白是一個(gè)很好的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物，它具有其他腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物沒有的優(yōu)點(diǎn)，臨床上可用ELISA的方法檢測(cè)血清中細(xì)胞型朊蛋白的含量。實(shí)施例9 :本發(fā)明的抗細(xì)胞型朊蛋白單克隆抗體的用途的驗(yàn)證-抑制腫瘤干細(xì)胞纖本發(fā)明人用Transwell技術(shù)檢測(cè)了抗細(xì)胞型朊蛋白單克隆抗體抑制腫瘤干細(xì)胞轉(zhuǎn)移的功能。1)實(shí)驗(yàn)步驟將Transwell浸泡在無菌的DMEM中平衡過夜；將結(jié)直腸癌干細(xì)胞從球狀克隆中用胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液，用PBS洗2次，計(jì)數(shù)。將3X105個(gè)細(xì)胞重懸在IOOyL DMEM中，接種到Transwell小室的上層，同時(shí)往Transwell下層中加入600 μ L含有10% FBS的DMEM0上下層培養(yǎng)液中均加入中濃度I μ g/mL的抗細(xì)胞型朊蛋白單克隆抗體，I μ g/mL IgG作為陰性對(duì)照，細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)。用3. 7%多聚甲醛固定細(xì)胞，然后用結(jié)晶紫染色。用棉簽小心擦去沒有轉(zhuǎn)移的細(xì)胞，PBS洗3次，顯微鏡下照相，統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)移的細(xì)胞數(shù)目。2)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖11所示，本發(fā)明的抗細(xì)胞型朊蛋白單克隆抗體顯著抑制腫瘤干細(xì)胞轉(zhuǎn)移。3)將本發(fā)明制備的抗細(xì)胞型朊蛋白單克隆抗體和小鼠IgG分別按照I μ g/mL的濃度與結(jié)腸癌腫瘤干細(xì)胞共孵育2小時(shí)，手術(shù)方法抑制該細(xì)胞到小鼠脾臟包膜下。30天以后處死小鼠檢測(cè)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，發(fā)現(xiàn)抗細(xì)胞型朊蛋白單克隆抗體能顯著抑制腫瘤干細(xì)胞在小鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移。實(shí)施例10 :本發(fā)明的抗細(xì)胞型朊蛋白單克降抗體的其他用涂的驗(yàn)證1)用本發(fā)明方法制得的鼠抗朊蛋白單克隆抗體與結(jié)直腸癌細(xì)胞共同孵育10分鐘，然后與PE熒光標(biāo)記的二抗孵育10分鐘，用流式細(xì)胞儀分選朊蛋白陽(yáng)性和陰性的CD44+結(jié)直腸癌細(xì)胞，取向同數(shù)目的分選細(xì)胞注射到裸鼠皮下，檢測(cè)腫瘤形成。結(jié)果發(fā)現(xiàn)表達(dá)細(xì)胞型朊蛋白結(jié)直腸癌細(xì)胞的腫瘤形成能力是不表達(dá)朊蛋白細(xì)胞的4倍。2)將分選的細(xì)胞手術(shù)移植到脾臟包膜下，縫合傷口，35天后處死小鼠檢查結(jié)直腸癌細(xì)胞是否發(fā)生肝轉(zhuǎn)移，并取肝臟固定，用石蠟切片，蘇木素-伊紅(HE)染色的方法確認(rèn)轉(zhuǎn)移灶。結(jié)果顯示表達(dá)細(xì)胞型朊蛋白的結(jié)腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力是不表達(dá)朊蛋白的結(jié)直腸癌細(xì)胞的20倍以上。3)取200個(gè)分選細(xì)胞接種到O. 35 %的瓊脂糖中，20天后染色發(fā)現(xiàn)細(xì)胞型朊蛋白陽(yáng)性的結(jié)直腸癌細(xì)胞的克隆形成能力顯著高于朊蛋白陰性細(xì)胞。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明制備的抗細(xì)胞型朊蛋白抗體能專一識(shí)別結(jié)直腸癌中的轉(zhuǎn)移型腫瘤干細(xì)胞。 因此，本發(fā)明提供的單克隆抗體用于制備臨床上檢測(cè)血清中細(xì)胞型朊蛋白腫瘤干細(xì)胞藥物有極高的應(yīng)用前景。
權(quán)利要求
1.一種保藏號(hào)為CGMCC No. 4972的雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)bM_PRI0_3。
2.一種抗細(xì)胞型朊蛋白單克隆抗體，由保藏號(hào)為CGMCC No. 4972的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗細(xì)胞型朊蛋白單克隆抗體，其特征在于，所述抗細(xì)胞型朊蛋白單克隆抗體與細(xì)胞型朊蛋白特異性結(jié)合。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗細(xì)胞型朊蛋白單克隆抗體，其特征在于，所述細(xì)胞型朊蛋白的氣基酸殘基序列如SEQ ID N0:1所不。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的細(xì)胞型朊蛋白的編碼基因，其特征在于，所述細(xì)胞型朊蛋白的編碼基因如SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列。
6.一種制備重組載體的方法，所述方法包括將權(quán)利要求5所述的基因插入已知載體，所述已知載體優(yōu)選為pET-30a(+)。
7.—種重組載體，所述重組載體含有權(quán)利要求5所述的基因或由權(quán)利要求6所述的方法產(chǎn)生。
8.一種制備重組有機(jī)體的方法，所述方法包括將權(quán)利要求7所述的重組載體導(dǎo)入宿主有機(jī)體，所述宿主有機(jī)體優(yōu)選為大腸桿菌，所述大腸桿菌優(yōu)選為BL21菌株，所述BL21菌株優(yōu)選為 BL21-Condon Plus(DE3)。
9.根據(jù)權(quán)利要求2至4任一項(xiàng)所述的抗細(xì)胞型朊蛋白單克隆抗體在制備用于抗腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的用途，其特征在于，所述抗腫瘤藥物包括抗結(jié)直腸癌藥物、抗結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移藥物、抗直腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移藥物、抗直腸癌細(xì)胞擴(kuò)散藥物、抗直腸癌干細(xì)胞轉(zhuǎn)移藥物和抗直腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)藥物。
全文摘要
本發(fā)明提供一種抗細(xì)胞型朊蛋白單克隆抗體在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，所述抗細(xì)胞型朊蛋白單克隆抗體由保藏號(hào)為CGMCC No.4972的雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)bM-PRIO-3產(chǎn)生，其與細(xì)胞型朊蛋白免疫結(jié)合，所述細(xì)胞型朊蛋白的氨基酸殘基序列如SEQ ID NO1所示；所述單克隆抗體用于制備抗腫瘤藥物，所述抗腫瘤藥物包括抗結(jié)直腸癌藥物、抗結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移藥物、抗直腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移藥物、抗直腸癌細(xì)胞擴(kuò)散藥物、抗直腸癌干細(xì)胞轉(zhuǎn)移藥物和抗直腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)藥物。
文檔編號(hào)C07K14/47GK103013927SQ201110284158
公開日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2011年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月22日
發(fā)明者陳佺, 杜蕾, 王珺, 金海京, 王曉慧 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所