專利名稱：一種多肽hm-3的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物化學(xué)領(lǐng)域中多肽的合成和純化方法，具體說是涉及多肽HM-3合成和純化工藝。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)腫瘤治療化學(xué)藥物由于其無選擇的細(xì)胞毒性，對患者有較大的毒副作用，容易產(chǎn)生耐藥性。目前抑制腫瘤血管生成來抑制腫瘤營養(yǎng)和轉(zhuǎn)移的方法成為新的腫瘤治療途徑，其最大的潛力在于克服了耐藥性。HM-3是一種血管生成抑制劑，其特征在于該血管生成抑制劑，是具有整合素、肝素親和性和結(jié)合能力的多肽，對治療胃癌，直腸癌，肝癌等有良好的效果。多肽合成是一個(gè)重復(fù)添加氨基酸的過程，分為液相合成法和固相合成法。在液相合成中，每次接肽以后都要對產(chǎn)物分離純化或結(jié)晶以便除去未反應(yīng)的原料和副產(chǎn)物，這個(gè)步驟相當(dāng)費(fèi)時(shí)間且麻煩，損失也很大。固相合成法是液相合成為基礎(chǔ)的，固相合成順序一般從C端(羧基端)向N端(氨基端)合成。固相合成法，大大的減輕了每步產(chǎn)品提純的難度。為了防止副反應(yīng)的發(fā)生，參加反應(yīng)的氨基酸的側(cè)鏈都是保護(hù)的。羧基端是游離的，并且在反應(yīng)之前必須活化。固相合成方法有兩種，即Fmoc和tBoc。由于Fmoc比tBoc存在很多優(yōu)勢，現(xiàn)在大多采用Fmoc法合成在多肽合成中，許多雜質(zhì)顯示了與產(chǎn)物相似的性質(zhì)，隨著肽鏈的增長，分離的難度也增大，因此純化的方法和工藝顯得很重要。近年來，多肽的分離純化方法很多，例如毛細(xì)管電泳法，高效液相法和超濾法等，其中高效液相色譜法應(yīng)用較為廣泛，氣分離效果好，速度快，樣品容量大，回收率高，已成為生物多肽的主要分離純化方法之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種多肽HM-3合成工藝及純化方法。本發(fā)明的技術(shù)方案為一種多肽 HM-3 的制備方法，其以 Riioc-Asp(Otbu)-Wang resin 或 Fmoc-Asp (Otbu) -CTCresin為起始原料，然后用保護(hù)氨基酸依次接二肽至十八肽，接肽工作完成后充分洗滌，然后切肽、后處理即得HM-3粗品。將粗品進(jìn)行純化，首先溶解，然后用制備型高效液相經(jīng)過兩次純化，最后濃縮凍干得到純品。其中反相制備液相色譜發(fā)所用的色譜柱是C18柱，流動(dòng)相由乙腈和緩沖溶液組成，其特征是流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。所述的接肽(包括接二肽至十八肽)的步驟如下稱取 Fmoc-Asp (Otbu)-wang resin 或 Fmoc—Asp (Otbu)-CTC resin 適量，佳J入玻璃砂芯反應(yīng)柱中，加入CH2Cl2適量使樹脂充分膨脹。每一克的Fmoc-Asp (Otbu)-wang resin 或 Fmoc-Asp (Otbu)-CTC resin 力口入 5 15mlCH2Cl2。a、脫帽加入六氫吡啶/DMF的脫帽液10 50mL，反應(yīng)2 IOmin將脫帽液抽干， 中間用DMF洗滌一次，然后再加入一次脫帽液適量反應(yīng)，脫去Fmoc保護(hù)基。
b、洗滌將脫帽液抽干，用DMF洗滌樹脂幾次，充分洗凈副產(chǎn)物。C、縮合將用于接肽的保護(hù)氨基酸和激活劑溶于DMF和縮合劑中，搖勻，并充分反應(yīng)。d、洗滌將反應(yīng)液抽干，用DMF充分洗滌樹脂，洗凈副產(chǎn)物。所述切肽的步驟如下把抽干的樹脂裝入圓底燒瓶中，加入切割液充分裂解合好的十八肽中間體，用砂芯漏斗將樹脂與多肽分離，所述的裂解液的體積組成為三氟乙酸苯酚水苯甲硫醚EDT = 88 92 2. 5 3. 5 2. 5 3. 5 1. 5 2. 5 1. 5 2. 5。所述后處理步驟如下先加無水乙醚到切割液中將多肽析出，然后離心，把清液倒掉，然后再用無水乙醚洗滌多肽，抽干得多肽粗品。所述的純化的步驟如下a、溶解稱取粗品配制成5 20g/l的溶液，用0. 45 μ m的混合濾膜過濾。b、制備①一次純化用5% 10%的乙腈和90% 95%的緩沖溶液，流速為 50ml/min lOOml/min下沖洗IOmin 20min平衡制備柱。用輸液泵上樣，采集基線，收集紫外波長220nm吸收值大于200mv的溶液，檢驗(yàn)是否有樣品。用梯度洗脫，乙腈的起始百分?jǐn)?shù)為5 % 10 %，30 50min后乙腈的百分?jǐn)?shù)為15 20 %。收集紫外波長220nm吸收值大于200mv的溶液，檢測純度大于95%的合并作為峰頂，待做二次分離純化。②二次純化將一次收到的峰頂旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)掉有機(jī)溶劑后用輸液泵上樣，用5% 10%的乙腈和90% 95% 的緩沖溶液。流速50 lOOml/min，并采集基線，收取在紫外波長220nm吸收大于200mv的溶液，檢測是否有樣品沖出。用梯度洗脫，乙腈的起始百分?jǐn)?shù)為5% 8%，30 50min后乙腈的百分?jǐn)?shù)為15 18%。收取在紫外波長220nm吸收大于200mv的溶液，通過檢測純度大于99%的作為合格。C、濃縮、過濾、凍干將合格溶液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀37°C減壓濃縮，除去殘留溶劑和注射用水。最后用0. 22um濾膜過濾，濾液裝入凍干盤中，用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行冷凍干燥。 所述的六氫吡啶/DMF的濃度為六氫吡啶占溶液體積的15% 25%。所述的多肽HM-3的制備方法，其特征在于所述的激活劑為HBTU、HOBT等。所述的多肽HM-3的制備方法，其特征在于所述的縮合劑為DIC、DIEA等。所述的多肽HM-3的制備方法，其特征在于所述的氨基酸原料、激活劑和縮合劑與樹脂的投料摩爾比例為2 5 1。所述的緩沖溶液是含0. 5 2%。的三氟乙酸，含1 5%。的醋酸。其中所述的多肽HM-3的氨基酸序列見seq no. 1。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于1、Fmoc法裂解和脫側(cè)鏈保護(hù)基時(shí)可采用弱酸。TFA為應(yīng)用最廣泛的弱酸試劑，它可以脫除t-Bu、Boc、Adoc、Mtr等；條件溫和、副反應(yīng)較少。不足之處Arg側(cè)鏈的Mtr很難脫除，TFA用量較大；無法除掉Cys的t-Bu等基因.也有采用強(qiáng)酸脫保護(hù)的方法如用HF 來脫除一些對弱酸穩(wěn)定的保護(hù)基，如Asp、Glu、Ser, Thr的Bzl (芐基)保護(hù)基等，但是當(dāng)脫除Asp的吸電子保護(hù)基時(shí)，會引起環(huán)化副反應(yīng)。上述裂解液在實(shí)際使用時(shí)發(fā)現(xiàn)，得率很低， 最終純化得率低于5%，對于工業(yè)大生產(chǎn)來說不適應(yīng)。因此本發(fā)明針對裂解工藝進(jìn)行了大量試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)TFA/苯甲硫醚/1,2-乙二硫醇苯酚/水=86/5/4/3/2。所裂解得到的粗品使用HPLC純化進(jìn)行了對比試驗(yàn)，采用該裂解液切割得粗品占HPLC色譜圖的總峰面積的80%，最終純化收率為22%。因此用此方案相對收率高，從而降低成本，而且切割液用的TFA量最少，也適當(dāng)?shù)哪芙档统杀竞徒档臀廴尽?、本發(fā)明針對激活劑和縮合劑的選擇進(jìn)行了摸索，常規(guī)的激活劑有TBTU，HBTU, Η0ΒΤ，縮合劑有DIC，DIEA。設(shè)計(jì)激活劑和縮合劑的不同組合，最終確定HBTU和DIC，HOBT 和DIEA作為兩種激活劑縮合劑組合，因?yàn)榈玫降拇制方?jīng)HPLC純化的純度高，在80%左右， 而且粗品量也多，收率大概在85%左右。3、本發(fā)明采用固相合成多肽，此方法，重復(fù)性高，可操作性強(qiáng)，污染少。4、本發(fā)明用WANG resin,相對樹脂比較穩(wěn)定，副反應(yīng)少，工藝粗品峰型好點(diǎn)，純化相對收率高，所以成本相對低點(diǎn)。用CTC resin反應(yīng)受溫度影響小，反應(yīng)速率快。5、本發(fā)明使用反相高效液相法純化多肽，使用梯度洗脫相對于等度洗脫來說，分離效果更好，分離過程中，保留時(shí)間合適，生產(chǎn)效率高，純度高。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。實(shí)施例1一、合成稱取Fmoc-Asp(Otbu)-Wang resinl4. 7g,倒入IL的玻璃砂芯反應(yīng)柱中，加入 CH2Cl2147ml使樹脂充分膨脹。脫帽加入六氫吡啶/DMF的脫帽液25ml，密封后放入振蕩器中反應(yīng)5分鐘，溫度控制在室溫，5分鐘后將脫帽液抽干，中間用DMF洗滌一次，然后再加入一次20 %的脫帽液 25ml反應(yīng)15分鐘洗滌將脫帽液抽干，用DMF洗滌樹脂6次，抽干，取20顆樹脂在小試管內(nèi)，加入驗(yàn)色劑，在115°C加熱3分鐘?？s合稱取保護(hù)氨基酸和HOBt 2. 025g，溶于15ml DMF和2. 33ml DIC，然后倒入反應(yīng)釜中反應(yīng)1. 5左右小時(shí)，溫度控制在34°C左右。洗滌將反應(yīng)液抽干，用DMF洗滌樹脂3次，抽干，取10-20顆樹脂在小試管內(nèi)，加入驗(yàn)色劑，在115°C加熱3-5分鐘。切肽把抽干的樹脂裝入500mL的圓底燒瓶中，加入300mL90%的切割液(按體積比比計(jì)三氟乙酸苯酚苯甲硫醚EDT = 90 3 3 2 2)，密封反應(yīng)2小時(shí)，用砂芯漏斗將樹脂與多肽分離。后處理先加無水乙醚到切割液中將多肽析出，然后離心，把清液倒掉，然后再用無水乙醚洗滌多肽6次，抽干得多肽粗品9. 5g。二、純化溶解精密稱取ID-18粗品，加入適當(dāng)?shù)募兓渲贸?0g/l的溶液，超聲攪拌至無顆粒狀澄清溶液。過濾將ID-18的溶液用沙芯過濾器0. 45um的混合濾膜過濾.制備一次純化
平衡制備柱用5%乙腈+95%三氟乙酸水溶液，流速80ml/min沖洗lOmin。上樣用輸液泵上樣，流速SOml/min，并采集基線，收取在紫外波長220nm吸收大于200mv的溶液，檢測是否有樣品沖出。洗脫洗脫梯度
權(quán)利要求
1.一種多肽HM-3的制備方法，其以Fmoc-Asp(Otbu)-Wang resin或 Fmoc-Asp (Otbu) -CTC resin為起始原料，然后用保護(hù)氨基酸依次接二肽至十八肽，接肽工作完成后充分洗滌，然后切肽、純化即得HM-3，其特征在于切肽所用的裂解液按體積比為三氟乙酸苯酚水苯甲硫醚EDT = 88 92 2. 5 3. 5 2. 5 3. 5 1. 5 2 · 5 · 1. 5 “ 2 · 5 ο ο
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種多肽HM-3的制備方法，其特征在于所述的接肽的步驟如下稱取 Fmoc-Asp(Otbu)-wang resin 或 Fmoc-Asp(Otbu)-CTC resin,按每克的 Fmoc-Asp (Otbu) -wang resin 或 Fmoc—Asp (Otbu)-CTC resin 力口入 5 15ml CH2Cl2 使樹月旨充分膨脹；a、脫帽加入六氫吡啶/DMF的脫帽液10 50mL，反應(yīng)2 IOmin后將脫帽液抽干，中間用DMF洗滌一次，然后再加入一次脫帽液反應(yīng)，脫去Fmoc保護(hù)基；b、洗滌將脫帽液抽干，用DMF洗滌樹脂；c、縮合將用于接肽的保護(hù)氨基酸和激活劑溶于DMF和縮合劑中，搖勻，并充分反應(yīng)；d、洗滌將反應(yīng)液抽干，用DMF充分洗滌樹脂，洗凈副產(chǎn)物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種多肽HM-3的制備方法，其特征在于所述的六氫吡啶/ DMF的濃度為六氫吡啶占溶液體積的15% 25%，摩爾濃度為1. 58 2. 63mol/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種多肽HM-3的制備方法，其特征在于所述的激活劑為 HBTU、HOBT。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種多肽HM-3的制備方法，其特征在于所述的縮合劑為 DIC、DIEA。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種多肽HM-3的制備方法，其特征在于所述的氨基酸原料、 激活劑和縮合劑與樹脂的摩爾比為2 5 1。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種多肽HM-3的制備方法，其特征在于所述的緩沖溶液是三氟乙酸水溶液，醋酸水溶液或磷酸鹽水溶液。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種多肽HM-3的制備方法，其特征在于按體積百分比計(jì)所述的三氟乙酸水溶液的濃度為0. 05 0. 3%。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種多肽HM-3的制備方法，其特征在于按體積百分比計(jì)所述的磷酸鹽水溶液中磷酸鹽的濃度是0. 01 0. 1M。
10.根據(jù)權(quán)利要求1一種多肽HM-3的制備方法，其特征在于所述的純化步驟如下溶解稱取粗品配制成5 20g/l的溶液，用0. 45 μ m的混合濾膜過濾；制備按體積百分比計(jì)①一次純化用5% 10%的乙腈和90% 95%的緩沖溶液，流速為50ml/min lOOml/min下沖洗IOmin 20min平衡制備柱；上樣，采集基線，收集紫外波長220nm吸收值大于200mv的溶液，用梯度洗脫，乙腈的起始百分?jǐn)?shù)為5% 10%，30 50min后乙腈的百分?jǐn)?shù)為15 20%;收集紫外波長220nm吸收值大于200mv的溶液，檢測純度大于95%的合并作為峰頂，待做二次分離純化；②二次純化將一次收到的峰頂旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)掉有機(jī)溶劑后用輸液泵上樣，用5% 10%的乙腈和90% 95%的緩沖溶液；流速50 lOOml/min， 并采集基線，收取在紫外波長220nm吸收大于200mv的溶液，檢測是否有樣品沖出；用梯度洗脫，乙腈的起始百分?jǐn)?shù)為5 % 8%，30 50min后乙腈的百分?jǐn)?shù)為15 18%;收取在紫外波長220nm吸收大于200mv的溶液，通過檢測純度大于99%的作為合格；濃縮、過濾、凍干將溶液37°C減壓濃縮，除去殘留溶劑和注射用水，最后用0. 22um濾膜過濾，濾液裝入凍干盤中，用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行冷凍干燥。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種HM-3多肽制備方法，屬于生物化學(xué)領(lǐng)域中的多肽技術(shù)領(lǐng)域，其以其以Fmoc-Asp(Otbu)-wang resin或Fmoc-Asp(Otbu)-CTC resin為起始原料，然后用保護(hù)氨基酸依次接二肽至十八肽，接肽工作完成后充分洗滌，然后切肽、后處理即得HM-3粗品。將粗品溶解，用制備型高效液相經(jīng)過兩次純化，最后濃縮凍干得到純品。該方法不僅保證了合成的效率，又提高了純度。
文檔編號C07K7/08GK102286078SQ201110194918
公開日2011年12月21日 申請日期2011年7月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月13日
發(fā)明者張弛, 徐寒梅 申請人:中國藥科大學(xué)