專利名稱：一種硫酸粘桿菌素b的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，涉及多肽類抗生素的制備，具體是一種硫酸粘桿菌素B 的制備方法。
背景技術(shù)：
粘桿菌素是由多粘芽孢桿菌產(chǎn)生的，由多種氨基酸和脂肪酸組成的一族堿性環(huán)多肽類抗生素的總稱。研究到目前為止已發(fā)現(xiàn)粘桿菌素A、B、C、D、E、M等多個組分中，其中只有粘桿菌素 B (polymyxin B 簡稱 polymyxin)、粘桿菌素 E (polymyxin E 簡稱 Colistin) 具有較低的毒性及良好的抗菌活力。因此對粘桿菌素B和粘桿菌素E研究相對較多，且目前已有相應(yīng)的產(chǎn)品在臨床上使用。臨床上常用它們的硫酸鹽或甲磺酸鹽。粘桿菌素B為抗革蘭氏陰性桿菌的抗生素，具殺菌作用，對大多數(shù)革蘭氏陰性桿菌有較強的抗菌作用，對綠膿桿菌的作用更為顯著，對大腸桿菌、沙門氏菌、痢疾桿菌、流感桿菌、百日咳桿菌、產(chǎn)氣桿菌及肺炎桿菌等也有良好的作用。臨床上主要用于敏感菌引起的感染及綠膿桿菌引起的泌尿系統(tǒng)感染、腦膜炎、敗血癥、燒傷感染以及皮膚粘膜感染等。目前制備硫酸粘桿菌素B主要是離子交換法，此方法分離步驟長、收率低、成本高，而且?guī)泶罅繌U水，嚴(yán)重污染環(huán)境。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)的上述問題，本發(fā)明提供了一種提高硫酸粘桿菌素B的收率和品質(zhì)的制備方法。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案得以實現(xiàn)的
一種硫酸粘桿菌素B的制備方法，其特征在于，它依次包括如下步驟
(1)發(fā)酵液的預(yù)處理將含有粘桿菌素B的發(fā)酵液用酸調(diào)pH為2.(Γ3. 5，邊攪拌邊加入 2^5%wt的助濾劑后過濾，得到一次濾液；
(2)減壓濃縮將一次濾液在-0.095 -0. 098Mpa下濃縮，溫度為5(T90°C，濃縮后得到液相含量為2000(T30000ug/ml的濃縮液；
(3)加熱將濃縮液邊攪拌邊加熱至溫度為8(T10(TC，保溫l(T30min，然后冷卻至室溫，得到渾濁液；
(4)抽濾按每IOOml渾濁液取0.5 lg助濾劑，將助濾劑加入純水中，攪拌后進行抽濾形成濾餅層，再向濾餅層加入步驟(3)所得渾濁液進行抽濾，得到二次濾液；
(5)沉淀分離將二次濾液用堿調(diào)pH為10.(Γ12.0，攪拌0.5、h，在(TlO°C條件下靜止2、h，將沉淀后的二次濾液抽濾，得到濾餅，用純水洗滌濾餅2 3次，向洗滌后的濾餅中邊攪拌邊加入稀硫酸至PH為3. (Γ7. 0，得到酸化液；
(6)噴霧干燥將酸化液噴霧干燥后得到硫酸粘桿菌素B，噴霧干燥時進風(fēng)溫度為 140^2000C，出風(fēng)溫度為 7(Tl20°C。針對現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點，本發(fā)明提供了一種制備硫酸粘桿菌素B的新工藝。其特點在于，它不僅提高了硫酸粘桿菌素B的收率和品質(zhì)，而且更加綠色環(huán)保，對硫酸粘桿菌素B的生產(chǎn)具有可持續(xù)發(fā)展的意義。本發(fā)明采用先過濾除去發(fā)酵液中的菌體，再濃縮濾液、 加熱除去濃縮液中的雜蛋白，然后沉淀分離，最后噴霧干燥，得到硫酸粘桿菌素B。具有專一性強、工序短、設(shè)備投資少、收率高、成本低，而且整個過程不采用溶劑，減少環(huán)境污染等優(yōu)點。具體來說，本發(fā)明先除去菌體，再進行分離純化。由于粘桿菌素B是一種多肽類物質(zhì)，發(fā)酵液濾液中的雜蛋白與粘桿菌素B的性質(zhì)有類似之處，在沉淀分離過程中會同時沉淀出來，影響產(chǎn)品質(zhì)量，因此，本發(fā)明采用加熱使雜蛋白變性然后過濾的方法除去雜蛋白， 制備的硫酸粘桿菌素B純度高、產(chǎn)品質(zhì)量好。濃縮濾液的目的在于提高濾液的濃度，雜蛋白和粘桿菌素B的含量同時會提高，這樣會使加熱除去雜蛋白更加徹底，同時也能提高粘桿菌素B沉淀分離時的收率，對整個工藝具有重要作用。沉淀分離是在一定的條件下將粘桿菌素B以某種形式沉淀出來，雜質(zhì)溶解在溶質(zhì)中，過濾后得到固體，再將固體用硫酸酸化溶解，得到高純度的硫酸粘桿菌素B溶液，起到分離純化的效果，專一性強，產(chǎn)品質(zhì)量好。作為優(yōu)選，步驟(1)所述的酸為草酸、硫酸、鹽酸、磷酸的一種或多種。作為優(yōu)選，所述的助濾劑為珍珠巖、硅藻土、纖維素、酸性白土、活性炭、石棉的一種或多種。作為優(yōu)選，步驟(2)所述溫度為6(T70°C。作為優(yōu)選，步驟(3)所述保溫時間為15 20min。作為優(yōu)選，步驟(5)所述堿為氫氧化鈉、氨水、氫氧化鉀、碳酸鈉、碳酸氫鈉的一種或多種。作為優(yōu)選，步驟(5)所述用堿調(diào)pH為10. 5 11. 5。作為優(yōu)選，步驟(5)所述用稀硫酸調(diào)pH為6. (Γ7. 0。作為優(yōu)選，步驟(6)所述的進風(fēng)溫度為17(Tl80°C。作為優(yōu)選，步驟(6)所述的出風(fēng)溫度為9(Tl00°C。本發(fā)明的主要優(yōu)點是與現(xiàn)有技術(shù)中離子交換法相比具有工序短、廢水少、污染少、 成本低，而且總收率高，可達(dá)75 80%。
具體實施例方式以下實施例中所述粘桿菌素B發(fā)酵液為由多粘芽孢桿菌突變菌株產(chǎn)生的含有粘桿菌素B的發(fā)酵液。目前已知多種菌株可發(fā)酵得到上述發(fā)酵液，例如保藏在美國模式培養(yǎng)物集存庫(American type culture collection)即 ATCC 的編號為 ATCC10401、保藏于藥用微生物菌種中心(CPCC)的編號為CPCC 140301、CPCC 140855的菌株均能發(fā)酵得到粘桿菌素B發(fā)酵液。實施例1
(1)發(fā)酵液的預(yù)處理
將發(fā)酵液用硫酸調(diào)PH為2. 7，邊攪拌邊加入3%wt的珍珠巖助濾劑，通過板框過濾，至無濾液滴出為止，得到一次濾液。板框過濾收率為94. 5%。(2)減壓濃縮
將一次濾液進行減壓濃縮，溫度為75°C，真空度為-0. 098MPa，濃縮至液相含量為^300ug/ml，得到濃縮液。濃縮收率為97. 5%。(3)加熱
將濃縮液邊攪拌邊加熱至90°C，保溫lOmin，然后冷卻至室溫，得到渾濁液。(4)抽濾
按每IOOml渾濁液取0. 9g珍珠巖，將珍珠巖加入純水中，攪拌后進行抽濾形成濾餅層， 再向濾餅層加入步驟(3)所得渾濁液進行抽濾，得到二次濾液。(5)沉淀分離
將二次濾液用氨水調(diào)PH為10. 6，攪拌2. 5 11，在41條件下靜止3.5 h，將沉淀后的二次濾液抽濾，得到濾餅，用純水洗滌濾餅2次，向洗滌后的濾餅中邊攪拌邊加入稀硫酸至pH 為6. 2，得到酸化液。沉淀分離收率為84. 5%。(6)噴霧干燥
將酸化液用噴霧干燥器進行干燥，進風(fēng)溫度為190°C，出風(fēng)溫度為105°C，得到硫酸粘桿菌素B。噴霧干燥收率為99%，硫酸粘桿菌素B含量為81. 6%。實施例2
(1)發(fā)酵液的預(yù)處理
將發(fā)酵液用硫酸調(diào)PH為3. 0，邊攪拌邊加入4. 2%wt的珍珠巖助濾劑，通過板框過濾，至無濾液滴出為止，得到一次濾液。板框過濾收率為95%。(2)減壓濃縮
將一次濾液進行減壓濃縮，溫度為80°C，真空度為-0. 095MPa，濃縮至液相含量為 20000ug/ml，得到濃縮液。濃縮收率為98. 5%。(3)加熱
將濃縮液邊攪拌邊加熱至80°C，保溫25min，然后冷卻至室溫，得到渾濁液。(4)抽濾
按每IOOml渾濁液取0. 8g珍珠巖，將珍珠巖加入純水中，攪拌后進行抽濾形成濾餅層， 再向濾餅層加入步驟(3)所得渾濁液進行抽濾，得到二次濾液。(5)沉淀分將二次濾液用氨水調(diào)PH為10，攪拌3 h，在10°C條件下靜止2 h，將沉淀后的二次濾液抽濾，得到濾餅，用純水洗滌濾餅2次，向洗滌后的濾餅中邊攪拌邊加入稀硫酸至pH為3，得到酸化液。沉淀分離收率為86%。(6)噴霧干燥
將酸化液用噴霧干燥器進行干燥，進風(fēng)溫度為200°C，出風(fēng)溫度為110°C，得到硫酸粘桿菌素B。噴霧干燥收率為98. 5%，硫酸粘桿菌素B含量為80. 9%。 實施例3
(1)發(fā)酵液的預(yù)處理
將發(fā)酵液用硫酸調(diào)PH為2，邊攪拌邊加入2%wt的硅藻土助濾劑，通過板框過濾，至無濾液滴出為止，得到一次濾液。板框過濾收率為97%。(2)減壓濃縮
將一次濾液進行減壓濃縮，溫度為90°C，真空度為-0. 097MPa，濃縮至液相含量為 ^840ug/ml，得到濃縮液。濃縮收率為97. 5%。
5
(3)加熱
將濃縮液邊攪拌邊加熱至100°c，保溫15min，然后冷卻至室溫，得到渾濁液。(4)抽濾
按每IOOml渾濁液取0. 8g硅藻土，將硅藻土加入純水中，攪拌后進行抽濾形成濾餅層， 再向濾餅層加入步驟(3)所得渾濁液進行抽濾，得到二次濾液。(5)沉淀分離
將二次濾液用氨水調(diào)PH為11，攪拌0.5 h，在8°C條件下靜止4 h，將沉淀后的二次濾液抽濾，得到濾餅，用純水洗滌濾餅1次，向洗滌后的濾餅中邊攪拌邊加入稀硫酸至PH為7。 得到酸化液，沉淀分離收率為88%。(6)噴霧干燥
將酸化液用噴霧干燥器進行干燥，進風(fēng)溫度為180°C，出風(fēng)溫度為120°C，得到硫酸粘桿菌素B。噴霧干燥收率為96%，硫酸粘桿菌素B含量為83. 1%。實施例4
(1)發(fā)酵液的預(yù)處理
將發(fā)酵液用硫酸調(diào)PH為3. 5，邊攪拌邊加入5%wt的珍珠巖助濾劑，通過板框過濾，至無濾液滴出為止，得到一次濾液。板框過濾收率為98%。(2)減壓濃縮
將一次濾液進行減壓濃縮，溫度為50°C，真空度為-0. 096MPa，濃縮至液相含量為 22400ug/ml，得到濃縮液。濃縮收率為95%。(3)加熱
將濃縮液邊攪拌邊加熱至95°C，保溫30min，然后冷卻至室溫，得到渾濁液。(4)抽濾
按每IOOml渾濁液取Ig珍珠巖，將珍珠巖加入純水中，攪拌后進行抽濾形成濾餅層，再向濾餅層加入步驟(3)所得渾濁液進行抽濾，得到二次濾液。(5)沉淀分離
將二次濾液用氨水調(diào)PH為12，攪拌4 h，在6°C條件下靜止3 h，將沉淀后的二次濾液抽濾，得到濾餅，用純水洗滌濾餅2次，向洗滌后的濾餅中邊攪拌邊加入稀硫酸至pH為6. 5， 得到酸化液。沉淀分離收率為87. 5%。(6)噴霧干燥
將酸化液用噴霧干燥器進行干燥，進風(fēng)溫度為170°C，出風(fēng)溫度為70°C，得到硫酸粘桿菌素B。噴霧干燥收率為97%，硫酸粘桿菌素B含量為81. 5%。實施例5
(1)發(fā)酵液的預(yù)處理
將發(fā)酵液用硫酸調(diào)PH3. 2，邊攪拌邊加入3. 5%wt的珍珠巖助濾劑，通過板框過濾，至無濾液滴出為止，得到一次濾液。板框過濾收率為95%。(2)減壓濃縮
將一次濾液進行減壓濃縮，溫度為65°C，真空度為-0. 098MPa，濃縮至液相含量為 30000ug/ml，得到濃縮液。濃縮收率為96%。(3)加熱將濃縮液邊攪拌邊加熱至85°C，保溫20min，然后冷卻至室溫，得到渾濁液。(4)抽濾
按每IOOml渾濁液取0. 5g珍珠巖，將珍珠巖加入純水中，攪拌后進行抽濾形成濾餅層， 再向濾餅層加入步驟(3)所得渾濁液進行抽濾，得到二次濾液。(5)沉淀分離
將二次濾液用氨水調(diào)PH為11. 5，攪拌3. 5h，在0°C條件下靜止3. 5 h，將沉淀后的二次濾液抽濾，得到濾餅，用純水洗滌濾餅3次，向洗滌后的濾餅中邊攪拌邊加入稀硫酸至 PH6. 0，得到酸化液。沉淀分離收率為89. 5%。(6)噴霧干燥
將酸化液用噴霧干燥器進行干燥，進風(fēng)溫度為140°C，出風(fēng)溫度為120°C，得到硫酸粘桿菌素B。噴霧干燥收率為97%，硫酸粘桿菌素B含量為82. 4%。
權(quán)利要求
1.一種硫酸粘桿菌素B的制備方法，其特征在于所述方法依次包括如下步驟(1)發(fā)酵液的預(yù)處理將含有粘桿菌素B的發(fā)酵液用酸調(diào)PH為2.(Γ3. 5，邊攪拌邊加入 2^5%wt的助濾劑后過濾，得到一次濾液；(2)減壓濃縮將一次濾液在-0.095 -0. 098Mpa下濃縮，溫度為5(T90°C，濃縮后得到液相含量為2000(T30000ug/ml的濃縮液；(3)加熱將濃縮液邊攪拌邊加熱至溫度為8(T10(TC，保溫l(T30min，然后冷卻至室溫，得到渾濁液；(4)抽濾按每IOOml渾濁液取0.5 lg助濾劑，將助濾劑加入純水中，攪拌后進行抽濾形成濾餅層，再向濾餅層加入步驟(3)所得渾濁液進行抽濾，得到二次濾液；(5)沉淀分離將二次濾液用堿調(diào)pH為10.(Γ12. 0，攪拌0. 5^4 h，在(TlO°C條件下靜止2、h，將沉淀后的二次濾液抽濾，得到濾餅，用純水洗滌濾餅2 3次，向洗滌后的濾餅中邊攪拌邊加入稀硫酸至PH為3. (Γ7. 0，得到酸化液；(6)噴霧干燥將酸化液噴霧干燥后得到硫酸粘桿菌素B，噴霧干燥時進風(fēng)溫度為 140^2000C，出風(fēng)溫度為 7(Tl20°C。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的硫酸粘桿菌素B的制備方法，其特征在于步驟(1)所述的酸為草酸、硫酸、鹽酸、磷酸的一種或多種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的硫酸粘桿菌素B的制備方法，其特征在于步驟(1)和(3)所述的助濾劑為珍珠巖、硅藻土、纖維素、酸性白土、活性炭、石棉的一種或多種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的硫酸粘桿菌素B的制備方法，其特征在于步驟(2)所述溫度為 60^70 0C ο
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的硫酸粘桿菌素B的制備方法，其特征在于步驟(3)所述保溫時間為15 20min。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的硫酸粘桿菌素B的制備方法，其特征在于步驟(5)所述堿為氫氧化鈉、氨水、氫氧化鉀、碳酸鈉、碳酸氫鈉的一種或多種。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的硫酸粘桿菌素B的制備方法，其特征在于步驟(5)所述用堿調(diào) PH 為 10. 5 11. 5。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的硫酸粘桿菌素B的制備方法，其特征在于步驟(5)所述用稀硫酸調(diào)PH為6. (Γ7. 0。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的硫酸粘桿菌素B的制備方法，其特征在于步驟(6)所述的進風(fēng)溫度為17(Tl80°C。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的硫酸粘桿菌素B的制備方法，其特征在于步驟(6)所述的出風(fēng)溫度為9(Tl00°C。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種硫酸粘桿菌素B的制備方法。該方法通過發(fā)酵液預(yù)處理、減壓濃縮、加熱、沉淀分離和噴霧干燥，從發(fā)酵液中提取粘桿菌素B，制備硫酸粘桿菌素B。本發(fā)明專一性強、工序短、設(shè)備投資少、成本低、廢水少、污染少，而且收率高，達(dá)75~80%。
文檔編號C07K1/14GK102250219SQ20111019283
公開日2011年11月23日 申請日期2011年7月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月11日
發(fā)明者儲消和, 劉樹鵬, 姚亞紅, 熊莉, 生英濤 申請人:浙江升華拜克生物股份有限公司