專利名稱：從鉤藤中提取鉤藤堿單體的提取工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種藥物的提取工藝，特別涉及一種從鉤藤中提取鉤藤堿單體的提取工藝。
背景技術(shù)：
鉤藤[Uncariarrhynchophylla (Miq) Jacks]是我國傳統(tǒng)中藥，屬茜草 科植物，種類繁多，包括鉤藤[Uncaria rhynchophyl la (Miq. ) Jacks]、大葉鉤藤 [Uncaria macrophylla Wall]、毛鉤藤[Uncaria hirsuta Havi 1] > 華鉤藤[Uncaria sinensis (Oliv. )Havil]或無柄果鉤藤[Uncaria sessilifructus Roxb]等 15 種，其帶鉤 莖枝入藥，性涼味苦甘，具有清熱平肝、息風(fēng)定驚的功效。現(xiàn)代研究表明鉤藤具有顯著的降 壓、抗心律失常、鎮(zhèn)靜和治療老年癡呆癥等功效，且安全性較高。鉤藤有效成分為吲哚類生物堿，主要有鉤藤堿、異鉤藤堿、柯諾辛堿和柯諾辛堿B 等，其中鉤藤堿含量較高，為主要藥效成份，其分子式為C22H28N2O4，分子量為384. 47?，F(xiàn)代中 藥藥理研究表明，鉤藤堿主要作用于心血管系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)，包括降壓、心動(dòng)過緩和保 護(hù)腦缺血、鎮(zhèn)靜等作用。焦慮等精神表現(xiàn)除了明顯的神經(jīng)遞質(zhì)的改變外，還表現(xiàn)為大腦神經(jīng) 元和膠質(zhì)細(xì)胞的減少、衰老以及腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子等異常，即是大腦的可塑性發(fā)生改變， 這也是焦慮等精神異常常使腦功能受損繼發(fā)表現(xiàn)的原因。鉤藤堿對NMDA型離子型谷氨酸 受體具有非競爭性拮抗作用，對局部缺血導(dǎo)致的大鼠神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用是通過阻斷局 部缺血過程中NMDA、毒覃堿M1和5HT2受體介導(dǎo)的神經(jīng)毒性實(shí)現(xiàn)的。鉤藤堿對多種神經(jīng)細(xì) 胞死亡有保護(hù)功能。我們以往的研究也證實(shí)鉤藤堿對中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能具有抑制作用，降 低苯丙胺依賴大鼠腦內(nèi)興奮性氨基酸含量和增加抑制性氨基酸含量，恢復(fù)神經(jīng)核團(tuán)杏仁核 和伏核中NMDA受體2B蛋白和mRNA表達(dá)的異常，且鉤藤堿本身無藥物依賴性。鉤藤堿還影 響不同腦區(qū)中5HT、多巴胺和去甲腎上腺素的釋放。鉤藤堿可減少小鼠自發(fā)性運(yùn)動(dòng)和增強(qiáng)戊 巴比妥鈉的鎮(zhèn)靜催眠作用，這可能與其調(diào)節(jié)大鼠紋狀體和海馬內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及代謝物 的含量有關(guān)。這些研究提示鉤藤堿可用于多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療。目前提取鉤藤初步提取物的方法主要有水煮法、醇水滲漉法等，鉤藤總生物堿的 有柱層析法分離鉤藤總堿等，這些方法步驟繁雜，提取率較低。鉤藤堿單體的提取純化主要 有微生物發(fā)酵、堿化苯提取以及制備色譜法等方法，這些方法操作繁瑣，成本高，而且難以 重復(fù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種從鉤藤中提取鉤藤堿單體的提取工藝，所述工藝安全、高 效、成本低，鉤藤堿單體產(chǎn)率高，有利于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，為鉤藤堿作為新藥進(jìn)一步開發(fā) 提供了途徑。本發(fā)明所述從鉤藤中提取鉤藤堿單體的提取工藝，有以下步驟(1)取40目鉤藤粉，按照每重量份鉤藤粉加入5 10體積份的低級醇水溶液配置成鉤藤液，于4°C下保存8 16h，得到鉤藤冷浸液；(2)將步驟(1)所述的鉤藤冷浸液于室溫超聲30 60min，過濾，蒸干，得到固體 粗提物；(3)步驟( 得到固體粗提物經(jīng)丙酮溶解后，柱層析法洗脫固體粗提物的溶解液 (層析柱規(guī)格5 X 100cm)，其洗脫液為丙酮石油醚氨水，洗脫速度為每小時(shí)200 250mL，收 集餾分段，收集時(shí)間為14 16h ；(4)將步驟C3)所得餾分用鹽酸萃取，收集酸液后以氯仿萃取，水相用氨水調(diào)節(jié)其 PH為8 9，離心收集沉淀；(5)將步驟(4)所得沉淀以超純水反復(fù)洗滌脫色3次，-80°c凍干，即得純度> 90%的鉤藤堿單體。上述制備工藝中所述重量份為克、千克等，對應(yīng)的體積份為毫升、升等，即步驟(1) 中若重量份用克，則體積份則對應(yīng)為毫升；若重量份用千克，則體積份則對應(yīng)為升。步驟(1)中所述低級醇水溶液為甲醇或乙醇或丙醇的水溶液。步驟(1)中所述的低級醇與蒸餾水的混合比例為5 9 10。步驟(3)中所述的洗脫液中丙酮石油醚氨水的體積比為1 2 0. 2。步驟(3)中所述柱層析法為硅膠柱層析法。步驟⑷中所述鹽酸的濃度為0. 5% 16%。與現(xiàn)有工藝方法相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)1.以鉤藤堿含量為指標(biāo)，對不同產(chǎn)地鉤藤藥材進(jìn)行了篩選，確定了鉤藤堿含量最 高的藥材，解決了由藥材原因造成的鉤藤堿產(chǎn)率低的問題，使鉤藤堿單體的產(chǎn)率最大化；2.藥材預(yù)處理及粗提物制備方法簡便，易于操作，應(yīng)用乙醇水溶液作為冷浸液，無 毒環(huán)保，得到粗提物鉤藤堿含量顯著高于現(xiàn)有報(bào)道工藝；3.粗提物的分離采用硅膠柱層析法，方法重復(fù)性好，且易于放大，有利于工業(yè)化大 生產(chǎn)；4.萃取、純化步驟簡單，得到鉤藤堿單體純度較高，最終產(chǎn)率0. 27g/kg藥材。本發(fā)明方法過程環(huán)保，易于操作，成本較低，鉤藤堿單體產(chǎn)率顯著高于現(xiàn)有的提取 工藝，可以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化大生產(chǎn)，為鉤藤堿的藥理藥效作用的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。本發(fā)明對鉤藤堿定性定量方法建立及提取條件的優(yōu)化過程加以如下描述1.鉤藤堿定性定量方法建立薄層色譜法定性硅膠板(青島海洋化工廠分廠)厚度0. 2 0. 25mm,規(guī)格 25X40mm ；展開劑丙酮石油醚氨水=1 2 0. 2；顯色劑改良的碘化鉍鉀取2g碘化鉍鉀，加冰乙酸2mL，用水定容至50mL。再取 上述溶液lmL，加入0. 6mol/L的鹽酸2mL，加水至10mL，即得；點(diǎn)樣量為10 μ L，展開時(shí)間為5min，展開吹干后，以顯色劑均勻噴在板上，可顯示 鉤藤堿及其它生物堿橙色斑點(diǎn)。該法快速，準(zhǔn)確，鉤藤堿與其同分異構(gòu)生物堿(異鉤藤堿、 柯諾辛堿等)分離度高，可以作為鉤藤堿的定性方法。高效液相色譜法定量采用Waters色譜分析系統(tǒng)，色譜條件為Platisil 0DS(150mmX4. 6mm, 5 μ m)色譜柱，流動(dòng)相及梯度乙腈0. Olmol/L磷酸二氫鉀(Κ0Η調(diào)pH8. 0)0 40min內(nèi)比例由30 70遞增至60 40，流速1. OmL/min，柱溫30°C，檢測波 長245nm，進(jìn)樣量20 μ L，此色譜條件下，鉤藤堿出峰時(shí)間為31. 5min左右，能夠與其同分 異構(gòu)生物堿及其它雜質(zhì)完全分離(參見

圖1)；以甲醇溶解純度98%鉤藤堿(購自南昌貝塔生物技術(shù)有限公司)，配制濃度0.25、 0. 5、1. O、2. O、4. O、8. O、16. O、32. O、64. O μ g/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液，進(jìn)樣分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果 回歸方程為y = 5. 22X10V4. 96 X IO3 (r = 0. 9999)，線性良好；分析方法通過加標(biāo)回收試 驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果相對回收率為95. 95% 114. 40%，重復(fù)性試驗(yàn)RSD ^ 6. 50% (n = 9)，穩(wěn)定性試驗(yàn)鉤藤堿高、中、低濃度溶液室溫5d內(nèi)RSD為4. 62%、2. 65% 和4. 58%。試驗(yàn)結(jié)果表明，本方法準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好，可做作為鉤藤堿的定量方法。2.鉤藤藥材提取條件優(yōu)化采用湖南產(chǎn)鉤藤，考察了現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的多種鉤藤藥材初步提取方法，如水煮法、 乙醇回流、乙醇滲漉，結(jié)果鉤藤堿提取率較低，無法重復(fù)報(bào)道結(jié)果；乙醚回流法得到了一定 量的鉤藤堿，但樣品雜質(zhì)較多，操作步驟復(fù)雜，且經(jīng)考察發(fā)現(xiàn)鉤藤堿在乙醚中易轉(zhuǎn)化為其同 分異構(gòu)體柯諾辛堿B，導(dǎo)致了提取率降低；而甲醇冷浸超聲法雖然提取率較高，但涉及有毒 試劑甲醇，不易于工業(yè)化大生產(chǎn)。采用本發(fā)明所述工藝，具有更加環(huán)保，提取率高于甲醇冷 浸法的優(yōu)點(diǎn)。通過進(jìn)一步考察影響鉤藤堿提取率因素，確定了藥材質(zhì)量與冷浸液體積比 (物料比)、乙醇百分比、超聲時(shí)間這三個(gè)主要影響因素，通過3因素3水平正交試驗(yàn)，確定 了物料比1 5，80%乙醇，超聲時(shí)間30min為最佳提取條件，此條件下獲得鉤藤粗提物中鉤 藤堿提取率為0. 48g/kg藥材。表1不同提取方法鉤藤粗提物中鉤藤堿提取率
權(quán)利要求
1.一種從鉤藤中提取鉤藤堿單體的提取工藝，其特征在于所述工藝有以下步驟(1)取40目鉤藤粉，按照每重量份鉤藤粉加入5 10體積份的低級醇水溶液配置成鉤 藤液，于4°C下保存8 16h，得到鉤藤冷浸液；(2)將步驟(1)所述的鉤藤冷浸液于室溫超聲30 60min，過濾，蒸干，得到固體粗提物；(3)步驟( 得到固體粗提物經(jīng)丙酮溶解后，柱層析法洗脫固體粗提物的溶解液，其 洗脫液為丙酮石油醚氨水，洗脫速度為每小時(shí)200 250mL，收集餾分段，收集時(shí)間為14 16h ；(4)將步驟C3)所得餾分用鹽酸萃取，收集酸液后以氯仿萃取，水相用氨水調(diào)節(jié)其pH為 8 9，離心收集沉淀；(5)將步驟(4)所得沉淀以超純水反復(fù)洗滌脫色3次，-80°C凍干，即得純度>90%的 鉤藤堿單體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(1)中所述低級醇水溶液為甲醇或 乙醇或丙醇的水溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(1)中所述的低級醇與蒸餾水的混 合比例為5 9 10。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(3)中所述的洗脫液中丙酮石油 醚氨水的體積比為1 2 0.2。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(3)中所述柱層析法為硅膠柱層析法。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟中所述鹽酸的濃度為0.5% 16%。
全文摘要
本發(fā)明涉及從鉤藤中分離提取純化鉤藤堿單體的工藝，所述工藝包括低級醇水冷浸超聲法對鉤藤藥材的預(yù)處理、制備粗提物；以兩種有機(jī)試劑與氨水一定比例為洗脫液，硅膠柱層析法分離粗提物中鉤藤堿；洗脫餾分經(jīng)萃取和純化等步驟最終獲得鉤藤堿單體。本發(fā)明安全、高效、低成本，鉤藤堿單體產(chǎn)率高，每公斤藥材可獲得0.27g鉤藤堿單體，且純度高于90％，有利于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，為鉤藤堿作為新藥進(jìn)一步開發(fā)提供了途徑。
文檔編號C07D471/20GK102093359SQ20111004238
公開日2011年6月15日 申請日期2011年2月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月18日
發(fā)明者劉明, 周世文, 周吉銀, 徐穎, 湯建林, 胡嵐嵐 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院