專利名稱：大規(guī)模純化含有HisTaq和甲酸水解位點的融合蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)純化方法，特別涉及一種大規(guī)模純化含有His Taq和甲酸水解位點的融合蛋白的方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前，多肽的制備方法主要包括化學(xué)合成法和基因工程法。對于氨基酸數(shù)目不大以及需量較小的多肽，可以通過化學(xué)合成法合成。但是，對于氨基酸數(shù)目較多的多肽用化學(xué)方法合成難度大，成本高，而且周期也長，譬如IOOmg純度大于95%的樣品需要420元左右人民幣一個氨基酸，按50個左右氨基酸需要2萬多元，而純度大于98%需要800元人民幣每個氨基酸，按50個氨基酸計算需要4萬元，而且需要4周左右時間。因此要大量獲得高純度以及氨基酸數(shù)目較多的目的肽，采用基因工程方法成本遠遠低于化學(xué)合成法?；蚬こ谭椒ū磉_多肽需要考慮到菌體對外源基因的容忍度、表達方式以及純化工藝。因此，現(xiàn)有多肽的構(gòu)建過程中通常添加標簽，構(gòu)成融合蛋白，這不僅是為了增大多肽的分子量，相對降低其在菌體中的降解速度，而且有利于純化，降低成本。由于標簽可能會影響目的多肽的功能，因此，一般會在標簽與目的多肽之間加入酶解位點，純化工藝后期通過酶解釋放目的多肽。其中，甲酸水解((Asp丨ftx)/Gly)位點是實驗室常用的一個酶解位點，純化后的融合蛋白通過甲酸水解釋放出目的多肽。相對于需用引入酶進行酶解的位點，譬如腸激酶酶解位點，甲酸水解位點由于使用甲酸得到目的多肽，沒有引入新的蛋白污染，后續(xù)純化工藝更為簡單，成本更低。但是，目前沒有關(guān)于利用甲酸水解方法來大規(guī)模水解融合蛋白制備多肽的報道，這可能是由于甲酸水解條件控制不好容易引起非特異 t生M (Expression, purification and structural studies of ashort antimicrobial peptide. Biochimica et Biophsica Acta : 1788 000 314-32 ，造成副產(chǎn)物增加，從而得率低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，提供一種簡單、低成本、高效率、高純度，中間過程可以時實定量、監(jiān)控、分析的大規(guī)模純化含有His Taq和甲酸水解位點的融合蛋白的方法。所述的大規(guī)模為目的多肽得率為g級別的規(guī)模。本發(fā)明的另一目的在于提供上述方法的應(yīng)用。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)一種大規(guī)模純化含有His Taq和甲酸水解位點的融合蛋白的方法，為首先利用M2+親和層析分離得到融合蛋白，然后用甲酸水解融合蛋白，然后再通過M2+親和層析去除未水解的融合蛋白，得到純化的目的多肽；具體包括以下步驟(1)對表達含有His Taq和甲酸水解位點的融合蛋白的工程菌發(fā)酵液進行預(yù)處理，得到含有His Taq和甲酸水解位點的融合蛋白粗提物
①含有His Taq和甲酸水解位點的融合蛋白為分泌形式表達時，則去除工程菌發(fā)酵液中的固體物質(zhì)，收集發(fā)酵上清液，對發(fā)酵上清液進行濃縮；②含有His Taq和甲酸水解位點的融合蛋白為包涵體形式表達時，則收集工程菌菌體，進行破碎，然后將包涵體進行變性，溶解于溶液中；所述的工程菌優(yōu)選為細菌，更優(yōu)選為大腸桿菌；(2)融合蛋白粗提物的初次純化A、用含10 20mM咪唑的溶解緩沖液A平衡Ni-NTA柱至基線穩(wěn)定，然后將步驟 (1)得到的融合蛋白粗提物上柱，流速為3 6ml/min，Ni-NTA柱的載量為25 35mg蛋白 /ml柱體積；上柱完后，用含10 20mM咪唑的溶解緩沖液A洗柱子至基線，然后用含250 500mM咪唑的溶解緩沖液A洗脫至基線停止，收集蛋白峰處的洗脫液；最后用含IM咪唑的溶解緩沖液A沖洗Ni-NTA柱至基線，將殘留在柱上的蛋白和其它雜質(zhì)全部洗脫下來，再用去離子水沖洗Ni-NTA柱，Ni-NTA柱得以重復(fù)利用；所述的溶解緩沖液A的組成為6M尿素、 25 50mM Na2HPO4,300 500mM NaCl, pH 8. 0 ；所述去離子水的用量優(yōu)選為至少4倍柱體積；B、將蛋白峰處的洗脫液過C18反向疏水柱進行脫鹽處理，具體步驟如下將蛋白峰處的洗脫液的PH值調(diào)為3 4，然后上脫鹽平衡液平衡好的C18反向疏水柱；上柱的條件為流速5 Hml/min，載量6g融合蛋白/L柱體積；接著用體積百分比0. 的三氟乙酸水溶液沖洗C18反向疏水柱至無鹽；用脫鹽洗脫液洗脫至基線為止，收集不在基線處的洗脫液，濃縮至原體積的1/5，真空冷凍干燥，得到初級純化蛋白；所述的脫鹽平衡液為三氟乙酸、乙腈、超純水按照體積比0.1 5 94. 9混合得到的溶液；所述的脫鹽洗脫液為三氟乙酸、乙腈、超純水按照體積比0. 1 50 49. 9混合得到的溶液；所述的pH值優(yōu)選通過冰醋酸進行調(diào)節(jié)；所述的C18反向疏水柱的規(guī)格優(yōu)選為徑高比為0. 4 ；所述的濃縮優(yōu)選為使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行濃縮，條件為水浴溫度45°C ；所述的三氟乙酸和乙腈均為色譜純級別；(3)甲酸水解釋放目的肽用體積百分比為50% 60%的甲酸(色譜純)溶解初級純化蛋白，初級純化蛋白的終濃度為10 30mg/ml，于避光條件下、42 45°C的條件下振蕩36 4 進行水解， 水解后濃縮，真空冷凍干燥，得到甲酸水解蛋白；所述的濃縮優(yōu)選為使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行濃縮，條件為水浴溫度45°C ；(4)目的多肽的初步純化A、用含10 20mM咪唑的溶解緩沖液A平衡Ni-NTA柱至基線穩(wěn)定，將樣品上柱， 樣品為用含10 20mM咪唑的溶解緩沖液A溶解的甲酸水解蛋白，且PH值為8. 0 ；樣品上柱量為2 3倍柱體積，流速為2 5ml/min ；收集含有目的多肽的過柱液；所述的含10 20mM咪唑的溶解緩沖液A與甲酸水解蛋白的用量比例優(yōu)選為IOOml Ig ；B、用含10 20mM咪唑的溶解緩沖液A沖洗Ni-NTA柱至基線，收集過柱液；C、將步驟A和B的過柱液合并，得到初步純化的目的多肽；D、用含250 lmol/L咪唑的溶解緩沖液A沖洗Ni-NTA柱至基線，再用去離子水沖洗Ni-NTA柱，Ni-NTA柱得以重復(fù)利用；(5)C18反向疏水柱脫鹽處理初步純化的目的多肽通過C18反向疏水柱進行脫鹽處理，同步驟(2) B，差異僅在于流速為3 5ml/min ；(6)目的多肽的精制，通過制備型的高效液相色譜(HPLC)進行制備HPLC的條件為乙腈的起始濃度為體積百分比10%，終止?jié)舛葹轶w積百分比60%， 分管收集洗脫液；HPLC檢測各管收集液，確定各管收集液中目的肽的純度，合并純度高于質(zhì)量百分比95%的各管收集液，純度低于95%的各管收集液可合并后再次用HPLC進行精制；真空冷凍干燥純度高于95%的各管收集液合并液，得到純度高于95%的目的多肽(不含His Taq和甲酸水解位點)；所述HPLC的耗時優(yōu)選為30min 60min ；所述含有Hi s Taq和甲酸水解位點的融合蛋白的目的基因優(yōu)選公開號為 “CN101294187A”、發(fā)明名稱為“一種緩釋生物活性多肽的方法與應(yīng)用”中所涉及的GLP-I衍生物；所述含有His Taq和甲酸水解位點的融合蛋白在進行重組載體構(gòu)建時所用的載體優(yōu)選為PMFH載體；所述表達含有His Taq和甲酸水解位點的融合蛋白的工程菌優(yōu)選申請?zhí)枮?“201010221511. 8”、名稱為“利用乳糖誘導(dǎo)ρΜ 載體生產(chǎn)重組蛋白的發(fā)酵方法”的專利申請中所指的重組工程菌PMFH-GLP-1-PA6. 2-BL21 (DE3)；步驟(1)中所述的含有His Taq和甲酸水解位點的融合蛋白為包涵體形式表達時，更優(yōu)選采取包含以下步驟的預(yù)處理方法I、將收集得到的工程菌菌體與pH 7.4、50mM的PBS緩沖液混合均勻，室溫靜置 30min，然后在壓力為120 150MPa的條件下均質(zhì)破菌至少一次，收集不溶性物質(zhì)；pH 7. 4、 50mM的PBS緩沖液的使用體積優(yōu)選為相當于工程菌菌體質(zhì)量的10倍；所述的收集不溶性物質(zhì)的方法優(yōu)選為離心；離心的條件優(yōu)選為4°C、IOOOOrpm離心30min ；II、然后依次用洗滌液A和洗滌液B對步驟I得到的不溶性物質(zhì)進行洗滌；洗滌液 A為pH 8. 0、20mM的Tris-HCl ；洗滌液B為含有2M尿素的pH 7. 4、50mM的PBS緩沖液；所述的洗滌的條件優(yōu)選為以50rpm的速度攪拌IOmin ；所述的洗滌液A的使用體積優(yōu)選為相當于工程菌菌體質(zhì)量的10倍；所述的洗滌液B的使用體積優(yōu)選為相當于工程菌菌體質(zhì)量的 10倍；III、用含10 20mmol/L咪唑的溶解緩沖液A溶解步驟II洗滌處理好的不溶性物質(zhì)，除去其中仍不能溶解的物質(zhì)；上清液用孔徑為0. 45 μ m的膜進行過濾，收集濾液，得到含有His Taq和甲酸水解位點的融合蛋白的粗提物；所述的溶解緩沖液A的組成為6M 尿素、25 50mM Na2HPO4,300 500mM NaCl, pH8. 0 ；所述的溶解緩沖液的使用體積優(yōu)選為相當于工程菌菌體質(zhì)量的10倍；所述的除去其中仍不能溶解的物質(zhì)的方式優(yōu)選為離心 ’離心的條件優(yōu)選為4°C、IOOOOrpm離心30min ；上述方法還有選在制備過程中含有實時監(jiān)控的步驟，其中步驟( 使用融合蛋白標準曲線，步驟⑶ (6)使用目的多肽標準曲線；所述的融合蛋白標準曲線的建立方法為A、稱按照步驟(1)和步驟(2)得到初級純化蛋白粉末lOOmg，用2mL含按體積比 30 0. 1 69. 9混合的乙腈/三氟乙酸/水溶液溶解，再用前述溶液稀釋成濃度5mg/mL、 10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL和25mg/mL的溶液，每個濃度的溶液各取ImL ；B、HPLC檢測上述濃度梯度的融合蛋白溶液，上樣量均為20μ L，HPLC條件為流動相A為按體積比1 999的三氟乙酸/水溶液，流動相B為按體積比1 999的三氟乙酸 /乙腈溶液，20分鐘線性梯度洗脫，流動相B從體積百分比30%升至體積百分比60%，洗脫流速是1. OmL/min，檢測波長214nm ；C、記錄HPLC檢測各個樣品的融合蛋白峰面積值，以融合蛋白峰面積值對融合蛋白濃度繪制標準曲線；所述的目的多肽標準曲線的建立方法為A、稱取精制的目的多肽粉末10mg(即最終產(chǎn)品)，用2mL含按體積比 30 0. 1 69. 9混合的乙腈/三氟乙酸/水溶液溶解，再用前述溶液稀釋成濃度0.25mg/ mL、0. 5mg/mL、lmg/mL、l. 5mg/mL和ang/mL的溶液，每個濃度的溶液各取ImL ；B,HPLC檢測上述濃度梯度的目的肽溶液，上樣量均為20 μ L，HPLC條件為流動相 A為按體積比1 999的三氟乙酸/水溶液，流動相B為按體積比1 999的三氟乙酸/乙腈溶液，20分鐘線性梯度洗脫，流動相B從體積百分比5%升至體積百分比95%，洗脫流速是 1. OmL/min，檢測波長 214nm ；C、記錄HPLC檢測各個樣品的目的肽峰面積值，以目的肽峰面積值對目的肽濃度繪制標準曲線。所述大規(guī)模純化含有His Taq和甲酸水解位點的融合蛋白的方法應(yīng)用于HisTaq、 甲酸水解位點和目的多肽依次連接、且目的多肽本身不含有His Taq和甲酸水解位點的融合蛋白，其中特別適合應(yīng)用于對長度為40 100個氨基酸的含有His Taq和甲酸水解位點的融合蛋白進行純化。氨基酸個數(shù)少于40個，本發(fā)明較化學(xué)合成方法成本優(yōu)勢不明顯；氨基酸個數(shù)多于100個，對于表達以及蛋白復(fù)性都較困難，此發(fā)明技術(shù)優(yōu)勢也不明顯。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果(1)本發(fā)明所述的方法有效地對含有His Taq和甲酸水解位點的融合蛋白進行大規(guī)模的制備，最終目的多肽的得率高、純度高、耗時短(需時為7 10天)、成本低，可達到 g級別以上生產(chǎn)規(guī)模，可以滿足動物實驗以及臨床前的實驗研究。譬如利用本發(fā)明的方法對按照專利申請?zhí)?01010221511. 8的實施例1進行制備的菌體(共210g菌體)進行純化(一次性)，得到純度99. 5%的目的多肽為1230. 6mg,成本只有3 4千元人民幣，而通過化學(xué)合成法合成同樣長度的Ig目的多肽需要40萬元，耗時3個多月。這是由于本發(fā)明所使用的M2+親和層析對于融合蛋白純化不僅具有得率高以及純化簡單，蛋白純度高的優(yōu)點，C18反向疏水柱脫鹽能力強，耗時短，而且從經(jīng)濟上來講層析的填料Ni-NTA樹脂和C18 反向疏水柱填料可以通過再生多次重復(fù)使用，再生所需要的試劑主要為乙醇、EDTA、硫酸鎳等，成本比較低。(2)與其他的蛋白脫鹽技術(shù)相比，本發(fā)明所用的C18反向疏水柱脫鹽技術(shù)具有脫鹽效率高、脫鹽率高、蛋白回收率高，并且在精制前的C18反向疏水柱脫鹽不僅起到脫鹽效果，也起到對粗品的一個簡單純化效果。(3)與其它通過融合蛋白的基因工程方法制備多肽時運用酶切法釋放目的肽相比，本發(fā)明運用的甲酸水解條件釋放目的肽具有目的肽釋放效率高、不會帶入酶蛋白干擾， 方便除去、操作簡單、適合大規(guī)模生產(chǎn)、成本低等優(yōu)點。


圖1是SDS-PAGE電泳圖，其中M 為 Marker (從小到大依次為 14. 3kDa、20. IkDa,29. OkDa,44. 3kDa、66. 4kDa、 97. 2kDa),20. IkDa附近較深的條帶就是目的蛋白GLP-I衍生物融合蛋白所在的位置；泳道 1為實施例1步驟(2) ANi-NTA親和層析前的樣品；泳道2實施例1步驟(2) ANi-NTA親和層析后的樣品。圖2是實施例1步驟(3)甲酸水解后的樣品進行HPLC檢測的結(jié)果圖，其中保留時間9. 9min的峰是目的肽峰。圖3是實施例1步驟⑷得到的目的多肽進行HPLC檢測的結(jié)果圖，其中保留時間IOmin的峰為目的肽的峰。圖4是SDS-PAGE結(jié)果圖，其中M 為 Marker (從小至Ij 大分另Ij 是 2. 5kDa、6kDa、14. 4kDa、21. 5kDa、55. 4kDa)， 2. 5kDa 6kDa之間的帶為目的多肽條帶；泳道1為實施例1甲酸水解前樣品；泳道2為實施例1甲酸水解后樣品；泳道3為實施例1步驟⑷得到的目的多肽。圖5是經(jīng)過HPLC精制后目的多肽的HPLC分析圖譜，其中目的多肽的保留時間是 IOmin0圖6是質(zhì)譜鑒定實施例1得到的最終產(chǎn)品的結(jié)果圖。圖7是實施例1融合蛋白的標準曲線圖，橫坐標表示HPLC積分的融合蛋白面積， 縱坐標表示融合蛋白濃度。圖8是實施例1最終得到的目的肽的標準曲線圖橫坐標表示HPLC積分的目的肽面積，縱坐標表示目的肽濃度。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。實施例1(1)對表達含有His Taq和甲酸水解位點的融合蛋白的工程菌發(fā)酵液進行預(yù)處理，得到含有His Taq和甲酸水解位點的融合蛋白粗提物在210g濕菌體(專利申請?zhí)?01010221511. 8實施例1發(fā)酵所得)中加入2100ml PH 7. 4、50mM的PBS緩沖液，混合均勻，得到菌體懸浮液。菌體懸浮液在高壓勻漿機(壓力為150MPa)下破菌一次。4°C IOOOOrpm離心30min棄上清，取沉淀，樣品以包涵體形式存在于沉淀中。用2100ml洗滌液A(pH 8. 0、20mM的Tris-HCl)洗滌沉淀，洗滌方式為50rpm/ min攪拌IOmin ；接著4°C IOOOOrpm離心30min棄上清，取沉淀。再用2100ml洗滌液B (含有2M尿素的pH 7. 4、50mM的PBS緩沖液)洗滌沉淀，洗滌方式為50rpm/min攪拌IOmin ； 接著4°C IOOOOrpm離心30min，棄上清，取沉淀。用2100ml含IOmM咪唑的溶解緩沖液A (6M 尿素，25mM Na2HPO4, 300mM NaCl，pH 8.0)溶解沉淀，4°C IOOOOrpm離心 30min，棄沉淀，取上清；所得上清用0. 45μπι膜過濾，得到融合蛋白粗提物。(2)融合蛋白粗提物的初次純化Α、用含IOmM咪唑的溶解緩沖液A (同步驟(1))平衡Ni-NTA柱至基線穩(wěn)定，然后將步驟⑴得到的融合蛋白粗提物上柱，流速為3ml/min，Ni-NTA柱的載量為30mg蛋白/ml柱體積；上柱完后，用含IOmM咪唑的溶解緩沖液A洗柱子至基線，然后用含250mM咪唑的溶解緩沖液A(同步驟(1))洗脫至基線停止，收集蛋白峰處的洗脫液，通過SDS-PAGE檢測以及HPLC分析，SDS-PAGE的結(jié)果如圖1所示，HPLC的結(jié)果表明得到16. 38g融合蛋白，純度為94. 5 % ；最后用含IM咪唑的溶解緩沖液A沖洗Ni-NTA柱至基線，將殘留在柱上的蛋白和其它雜質(zhì)全部洗脫下來，再用4倍柱體積去離子水沖洗Ni-NTA柱，Ni-NTA柱得以重復(fù)利用；B、將蛋白峰處的洗脫液過C18反向疏水柱(徑高比為0. 4)進行脫鹽處理，具體步驟如下用冰醋酸將蛋白峰處的洗脫液的pH值調(diào)為4.0，然后上脫鹽平衡液(三氟乙酸、乙腈、超純水按體積比0.1 5 94.9)平衡好的C18反向疏水柱；上柱的條件為流速Hml/ min，載量6g融合蛋白/L柱體積；接著用體積百分比0. 的三氟乙酸水溶液沖洗C18反向疏水柱至無鹽；用脫鹽洗脫液(三氟乙酸、乙腈、超純水按體積比0.1 50 49.9)洗脫至基線為止，收集不在基線處的洗脫液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至原體積的1/5 (水浴溫度45°C )， 混勻，分裝至凍干管中，液氮預(yù)凍，-70°C真空冷凍干燥，得到初級純化蛋白粉末，其脫鹽率達到94. 以上，脫鹽回收率為87. 6% (用HPLC進行檢測，使用融合蛋白標準曲線)。所用的試劑均為色譜純級別，水為Mi 1 iQ水。(3)甲酸水角軍釋放目的月太用體積百分比為50%%的甲酸(色譜純)溶解初級純化蛋白粉末，初級純化蛋白的終濃度為30mg/ml，于45°C恒溫避光、200rpm/min振蕩4 進行水解，水解后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至原來體積的20% (水浴溫度45°C)時，加入適量水繼續(xù)旋蒸，重復(fù)3次后抽去絕大部分甲酸，真空冷凍干燥，得到甲酸水解蛋白粉末，用SDS-PAGE檢測，結(jié)果如圖4所示；用 HPLC進行檢測(使用目的多肽標準曲線)，結(jié)果如圖2所示；從結(jié)果可看出，甲酸的水解效率高。(4)目的多肽的初步純化A、用含20mM咪唑的溶解緩沖液A (同步驟(1))平衡Ni-NTA柱至基線穩(wěn)定，將樣品上柱，樣品為用含20mM咪唑的溶解緩沖液A溶解步驟(3)甲酸水解蛋白粉末得到溶液， 且PH值為8.0，濃度為lg/100ml ；樣品上柱量為3倍柱體積，流速為3ml/min ；收集含有目的多肽的柱穿液；B、用含20mM咪唑的溶解緩沖液A沖洗Ni-NTA柱至基線，收集柱穿液；C、將步驟A和B的過柱液合并，得到初步純化的目的多肽；用SDS-PAGETricine檢測(SDS-PAGE Tricine方法參考(蛋白質(zhì)電泳技術(shù)指南，夏其昌等、化學(xué)工業(yè)出版社、第一版、31頁)，結(jié)果如圖4所示；用HPLC進行檢測(使用目的多肽標準曲線)，結(jié)果如圖3所示，其純度為83. 1%，回收率為68.5% ；D、用含250mol/L咪唑的溶解緩沖液A沖洗Ni-NTA柱至基線，再用去離子水沖洗 Ni-NTA柱，Ni-NTA柱得以重復(fù)利用。(5)C18反向疏水柱脫鹽處理初步純化的目的多肽通過C18反向疏水柱進行脫鹽處理，同步驟(2) B，差異僅在于流速為3ml/min ；(6)目的多肽的精制，通過制備型的高效液相色譜(HPLC制備柱=YMC-PACK 0DS-A,250X20mm)進行制備
HPLC的條件為乙腈的起始濃度為體積百分比10%，終止?jié)舛葹轶w積百分比60%， 需時31min (如表1所示)，流速2ml/min，分管收集洗脫液；HPLC檢測各管收集液，確定各管收集液中目的肽的純度，合并純度高于質(zhì)量百分比95%的各管收集液，純度低于95%的各管收集液可合并后再次用HPLC進行精制；真空冷凍干燥純度高于95%的各管收集液合并液，得到純度為99. 5 %的目的多肽，回收率為71. 9 % (用HPLC進行檢測，使用目的多肽標準曲線，結(jié)果如圖5所示)，最終得到目的肽粉末1230. 6mg,產(chǎn)率為351. 6mg/L發(fā)酵液， 5. 86mg/g濕菌體。質(zhì)譜鑒定(少量目的多肽凍干粉末，溶于10% (ν/ν)乙腈、89. 9% H2O(ν/ v)、0. 1% TFA(ν/ν)的溶液，過0.20 μ m濾膜，再取過濾后的液體30 μ L上四級桿質(zhì)譜儀測定其分子量)，分子量與預(yù)期符合(如圖6所示)。表 權(quán)利要求
1. 一種大規(guī)模純化含有His Taq和甲酸水解位點的融合蛋白的方法，其特征在于包括以下步驟(1)對表達含有HisTaq和甲酸水解位點的融合蛋白的工程菌發(fā)酵液進行預(yù)處理，得到含有Hi s Taq和甲酸水解位點的融合蛋白粗提物①含有HisTaq和甲酸水解位點的融合蛋白為分泌形式表達時，則去除工程菌發(fā)酵液中的固體物質(zhì)，收集發(fā)酵上清液，對發(fā)酵上清液進行濃縮；②含有HisTaq和甲酸水解位點的融合蛋白為包涵體形式表達時，則收集工程菌菌體， 進行破碎，然后將包涵體進行變性，溶解于溶液中；(2)融合蛋白粗提物的初次純化A、用含10 20mM咪唑的溶解緩沖液A平衡Ni-NTA柱至基線穩(wěn)定，然后將步驟(1)得到的融合蛋白粗提物上柱，流速為3 6ml/min，Ni-NTA柱的載量為25 35mg蛋白/ml柱體積；上柱完后，用含10 20mM咪唑的溶解緩沖液A洗柱子至基線，然后用含250 500mM 咪唑的溶解緩沖液A洗脫至基線停止，收集蛋白峰處的洗脫液；最后用含IM咪唑的溶解緩沖液A沖洗Ni-NTA柱至基線，將殘留在柱上的蛋白和其它雜質(zhì)全部洗脫下來，再用去離子水沖洗Ni-NTA柱，Ni-NTA柱得以重復(fù)利用；所述的溶解緩沖液A的組成為6M尿素、25 50mM Na2HPO4、300 500mM NaCl，pH 8. 0 ；B、將蛋白峰處的洗脫液過C18反向疏水柱進行脫鹽處理，具體步驟如下將蛋白峰處的洗脫液的PH值調(diào)為3 4，然后上脫鹽平衡液平衡好的C18反向疏水柱；上柱的條件為流速5 Hml/min，載量6g融合蛋白/L柱體積；接著用體積百分比0. 的三氟乙酸水溶液沖洗C18反向疏水柱至無鹽；用脫鹽洗脫液洗脫至基線為止，收集不在基線處的洗脫液， 濃縮至原體積的1/5，真空冷凍干燥，得到初級純化蛋白；所述的脫鹽平衡液為三氟乙酸、 乙腈、超純水按照體積比0.1 5 94. 9混合得到的溶液；所述的脫鹽洗脫液為三氟乙酸、 乙腈、超純水按照體積比0.1 50 49. 9混合得到的溶液；(3)甲酸水解釋放目的肽用體積百分比為50 % 60 %的甲酸溶解初級純化蛋白，初級純化蛋白的終濃度為 10 30mg/ml，于避光條件下、42 45°C的條件下振蕩36 4 進行水解，水解后濃縮，真空冷凍干燥，得到甲酸水解蛋白；(4)目的多肽的初步純化A、用含10 20mM咪唑的溶解緩沖液A平衡Ni-NTA柱至基線穩(wěn)定，將樣品上柱，樣品為用含10 20mM咪唑的溶解緩沖液A溶解的甲酸水解蛋白，且pH值為8. 0 ；樣品上柱量為2 3倍柱體積，流速為2 5ml/min ；收集含有目的多肽的過柱液；B、用含10 20mM咪唑的溶解緩沖液A沖洗Ni-NTA柱至基線，收集過柱液；C、將步驟A和B的過柱液合并，得到初步純化的目的多肽；D、用含250 lmol/L咪唑的溶解緩沖液A沖洗Ni-NTA柱至基線，再用去離子水沖洗 Ni-NTA柱，Ni-NTA柱得以重復(fù)利用；(5)C18反向疏水柱脫鹽處理初步純化的目的多肽通過C18反向疏水柱進行脫鹽處理，同步驟(2) B，差異僅在于流速為3 5ml/min ；(6)目的多肽的精制，通過制備型的高效液相色譜進行制備HPLC的條件為乙腈的起始濃度為體積百分比10%，終止?jié)舛葹轶w積百分比60%，分管收集洗脫液；HPLC檢測各管收集液，確定各管收集液中目的肽的純度，合并純度高于質(zhì)量百分比95%的各管收集液，純度低于95%的各管收集液可合并后再次用HPLC進行精制；真空冷凍干燥純度高于95%的各管收集液合并液，得到純度高于95%的目的多肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述大規(guī)模純化含有HisTaq和甲酸水解位點的融合蛋白的方法， 其特征在于在純化過程中用HPLC實時監(jiān)控每一步驟得到產(chǎn)品質(zhì)量，其中步驟( 使用融合蛋白標準曲線，步驟⑶ (6)使用目的多肽標準曲線；所述的融合蛋白標準曲線的建立方法為A、稱按照步驟(1)和步驟(2)得到初級純化蛋白粉末lOOmg，用2mL含按體積比 30 0. 1 69. 9混合的乙腈/三氟乙酸/水溶液溶解，再用前述溶液稀釋成濃度5mg/mL、 10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL和25mg/mL的溶液，每個濃度的溶液各取ImL ；B、HPLC檢測上述濃度梯度的融合蛋白溶液，上樣量均為20μ L，HPLC條件為流動相A 為按體積比1 999的三氟乙酸/水溶液，流動相B為按體積比1 999的三氟乙酸/乙腈溶液，20分鐘線性梯度洗脫，流動相B從體積百分比30 %升至體積百分比60 %，洗脫流速是 1. OmL/min，檢測波長 214nm ；C、記錄HPLC檢測各個樣品的融合蛋白峰面積值，以融合蛋白峰面積值對融合蛋白濃度繪制標準曲線；所述的目的多肽標準曲線的建立方法為A、稱取精制的目的多肽粉末IOmg(即最終產(chǎn)品)，用2mL含按體積比30 0.1 69.9 混合的乙腈/三氟乙酸/水溶液溶解，再用前述溶液稀釋成濃度0. 25mg/mL、0. 5mg/mL、lmg/ mL、l. 5mg/mL和ang/mL的溶液，每個濃度的溶液各取ImL ；B、HPLC檢測上述濃度梯度的目的肽溶液，上樣量均為20μ L，HPLC條件為流動相A為按體積比1 999的三氟乙酸/水溶液，流動相B為按體積比1 999的三氟乙酸/乙腈溶液，20分鐘線性梯度洗脫，流動相B從體積百分比5%升至體積百分比95%，洗脫流速是 1. OmL/min，檢測波長 214nm ；C、記錄HPLC檢測各個樣品的目的肽峰面積值，以目的肽峰面積值對目的肽濃度繪制標準曲線。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述大規(guī)模純化含有HisTaq和甲酸水解位點的融合蛋白的方法，其特征在于步驟(1)中所述的含有His Taq和甲酸水解位點的融合蛋白為包涵體形式表達時，采取包含以下步驟的預(yù)處理方法I、將收集得到的工程菌菌體與PH7. 4、50mM的PBS緩沖液混合均勻，室溫靜置30min， 然后在壓力為120 150MPa的條件下均質(zhì)破菌至少一次，收集不溶性物質(zhì)；II、然后依次用洗滌液A和洗滌液B對步驟I得到的不溶性物質(zhì)進行洗滌；洗滌液A為 pH 8. 0、20mM的Tris-HCl ；洗滌液B為含有2M尿素的pH 7. 4、50mM的PBS緩沖液；III、用含10 20mmol/L咪唑的溶解緩沖液A溶解步驟II洗滌處理好的不溶性物質(zhì)， 除去其中仍不能溶解的物質(zhì)；上清液用孔徑為0. 45 μ m的膜進行過濾，收集濾液，得到含有 His Taq和甲酸水解位點的融合蛋白的粗提物；所述的溶解緩沖液A的組成為6M尿素、 25 50mM Na2HPO4,300 500mM NaCl，ρΗ8· O。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述大規(guī)模純化含有HisTaq和甲酸水解位點的融合蛋白的方法，其特征在于步驟I中所述PH 7. 4、50mM的PBS緩沖液的使用體積優(yōu)選為相當于工程菌菌體質(zhì)量的 10倍；步驟I中所述所述的收集不溶性物質(zhì)的方法為離心；步驟II中所述的洗滌的條件為以50rpm的速度攪拌IOmin ；步驟II中所述的洗滌液A的使用體積為相當于工程菌菌體質(zhì)量的10倍；步驟II中所述的洗滌液B的使用體積為相當于工程菌菌體質(zhì)量的10倍；步驟III中所述的溶解緩沖液的使用體積為相當于工程菌菌體質(zhì)量的10倍；步驟III中所述的除去其中仍不能溶解的物質(zhì)的方式為離心。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述大規(guī)模純化含有HisTaq和甲酸水解位點的融合蛋白的方法， 其特征在于所述離心的條件為4°C、IOOOOrpm離心30min。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述大規(guī)模純化含有HisTaq和甲酸水解位點的融合蛋白的方法，其特征在于所述含有His Taq和甲酸水解位點的融合蛋白的目的基因為公開號為 “CN101294187A”、發(fā)明名稱為“一種緩釋生物活性多肽的方法與應(yīng)用”中所涉及的GLP-I衍生物；所述含有His Taq和甲酸水解位點的融合蛋白在進行重組載體構(gòu)建時所用的載體為 PMFH載體；所述的工程菌為細菌；步驟⑵k中所述去離子水的用量為至少4倍柱體積； 步驟中所述的pH值通過冰醋酸進行調(diào)節(jié)； 步驟中所述的C18反向疏水柱的規(guī)格為徑高比為0. 4 ； 步驟中所述的濃縮為使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行濃縮，條件為水浴溫度45°C ； 步驟(3)中所述的濃縮為使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行濃縮，條件為水浴溫度45°C ； 步驟G) A中所述的含10 20mM咪唑的溶解緩沖液A與甲酸水解蛋白的用量比例為 IOOml Ig ；步驟(6)中所述HPLC的耗時為30min 60min。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述大規(guī)模純化含有HisTaq和甲酸水解位點的融合蛋白的方法， 其特征在于所述的細菌為大腸桿菌。
8.權(quán)利要求1 7任一項所述大規(guī)模純化含有HisTaq和甲酸水解位點的融合蛋白的方法的應(yīng)用，其特征在于該方法應(yīng)用于His Taq、甲酸水解位點和目的多肽依次連接、且目的多肽本身不含有His Taq和甲酸水解位點的融合蛋白。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述大規(guī)模純化含有HisTaq和甲酸水解位點的融合蛋白的方法的應(yīng)用，其特征在于所述融合蛋白的長度為40 100個氨基酸。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種大規(guī)模純化含有His Taq和甲酸水解位點的融合蛋白的方法與應(yīng)用。該方法包括如下步驟對表達含有His Taq和甲酸水解位點的融合蛋白的工程菌發(fā)酵液進行預(yù)處理，得到含有His Taq和甲酸水解位點的融合蛋白粗提物，通過Ni-NTA柱親和層析和C18反向疏水柱脫鹽，得到融合蛋白粗提物的初次純化蛋白，接著甲酸水解，再通過Ni-NTA柱親和層析和C18反向疏水柱脫鹽，得到初級純化的目的多肽，HPLC精制后可得純度高于95％的目的多肽。本發(fā)明所述的方法有效地對含有His Taq和甲酸水解位點的融合蛋白進行大規(guī)模的制備，最終目的多肽的得率高、純度高、耗時短、成本低，可達到g級別以上生產(chǎn)規(guī)模，可以滿足動物實驗以及臨床前的實驗研究。
文檔編號C07K1/22GK102174068SQ201110032128
公開日2011年9月7日 申請日期2011年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月29日
發(fā)明者冉艷紅, 周天鴻, 李弘劍, 蘇正定, 鄭飛 申請人:暨南大學(xué)