專利名稱：：肝病病情指標糖鏈標記物的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及ー種以上的、具有糖鏈的肝病病情指標糖鏈標記物，具體而言，這種標記物能夠通過肽和蛋白質上的糖鏈變化而成為肝病病情的指標。此外，本發(fā)明還涉及以下標記物該標記物根據(jù)糖鏈的不同檢測出肝細胞癌、炎癥、纖維化這些基礎肝(underlyingliver)狀態(tài)。
背景技術：
：肝癌大致可以分為在肝臟發(fā)生的原發(fā)性肝癌、以及轉移性肝癌，一般說來，原發(fā)性肝癌的90%都是肝細胞癌。在肝細胞癌患者的基礎疾病中，多數(shù)都是感染了丙型肝炎病毒或こ型肝炎病毒，并從急性病毒性肝炎轉為慢性病毒性肝炎、肝硬化，一般來說，患病毒性肝炎后再經(jīng)過很長一段時間才會發(fā)生癌變。在肝硬化中，由于炎癥和再生會反復進行，所以正常肝細胞減少，而變?yōu)橛衫w維組織構成的器官。比如，丙型肝炎患者僅在日本就有300萬人，在中國和非洲據(jù)說有1000多萬人。在こ型和丙型肝炎患者中，從慢性肝炎轉為癌癥的比率如下輕度慢性肝炎(Fl)的年率為O.8%，中度慢性肝炎(F2)的年率為O.9%，而重度慢性肝炎(F3)的年率則達到了3.5%，肝硬化(F4)轉為癌癥的概率ー躍上升為年率7%(圖2、3)。在肝病中，隨著病情的發(fā)展，組織學圖像會發(fā)生變化(圖1)，首先在慢性肝炎時期肝功能開始消失，在肝硬化時期出現(xiàn)病態(tài)結構，肝臟也會逐漸纖維化等。在癌癥治療中，癌癥的早期發(fā)現(xiàn)非常重要，肝細胞癌也是如此，癌癥的早期發(fā)現(xiàn)對治療和術后預后具有很大影響。進行了肝切除治療后的5年存活率在I期為80%，在IV期中則不超過38%。迄今為止已知的肝癌標記物有甲胎蛋白(AFP)和通過維生素K缺乏或拮抗劑II誘守的S白質(PIVKA_II,proteininducedbyVitaminKabsenceorantagonist-IIバ專利文件1、2)，但其特異性和敏感性都不夠。因此，現(xiàn)在為了早期發(fā)現(xiàn)肝癌，檢查和診斷中使用的都是肝癌標記物、超聲波檢查、計算機斷層攝影(CO、核磁共振成像法(MRI)等圖像檢查。先行技術文件專利文件專利文件I:特開平10-26622號專利文件2:特開平8-184594號。發(fā)明概要發(fā)明要解決的課題本發(fā)明的課題在于開發(fā)出能夠檢測肝病的糖鏈標記物，更具體而言，本發(fā)明的課題是開發(fā)出充當肝病病情的指標的糖鏈標記物。本發(fā)明的課題還在于開發(fā)出能夠根據(jù)肝細胞癌的發(fā)展來區(qū)別肝病病情的糖鏈標記物。此外，本發(fā)明的課題在于開發(fā)出充當肝病病情指標糖鏈標記物的肝細胞癌糖鏈標記物、肝硬化糖鏈標記物、慢性肝炎糖鏈標記物、以及肝纖維化糖鏈標記物。以丙型肝炎為例，一般認為從肝硬化轉為肝細胞癌的概率為年率7%左右，現(xiàn)在，為了檢測出上述癌變，肝硬化患者每三個月就要接受一次檢查。為了簡化這種從肝硬化至癌變的檢查，本發(fā)明的課題還在于提供以下能夠通過如血液檢查等來檢測出癌變的肝細胞癌標記物。此外，關于以往的由蛋白質構成的癌標記物等，主要看的是其在癌癥中的表達量的増加，但很多蛋白質在正常細胞中也會進行表達。因此，通過比較表達量的程度來判斷癌變往往比較困難。因此，本發(fā)明還有如下課題提供簡便的肝細胞癌標記物，且在該標記物中不僅僅比較表達量。此外，在向肝細胞癌發(fā)展的過程中，如果能夠確定該發(fā)展過程中的疾病的基礎的話，有望控制癌癥的發(fā)展。因此，本發(fā)明還有如下課題提供能夠確定肝細胞癌的基礎疾病的肝病病情標記物。此外，從蛋白質組學的角度研究以前的疾病病情指標標記物時，如探索癌相關的糖鏈標記物等時，存在ー個問題，即沒有建立在以下兩種技術之上的方法技術①從細胞和病理切片中濃縮具有癌等的疾病病情特異性的糖鏈的蛋白質、技術②鑒別后的標記物候·補蛋白質的糖鏈的結構分析技木。因此，本發(fā)明的課題還在于通過以糖蛋白組學為基礎的疾病標記物的探索方法，來探索肝病病情糖鏈標記物。此外，本發(fā)明的課題還在于開發(fā)出用于檢測肝病病情的發(fā)展程度的標記物。特別是開發(fā)出以下標記物能夠區(qū)分肝病中的Fl和F2組群、以及F3和F4組群的肝臟纖維化標記物、或是能夠區(qū)分F1、F2、F3組群與F4的肝硬化標記物(圖4)。解決課題的手段本發(fā)明人利用糖蛋白組學，從血清糖蛋白中，鑒別出在包括肝細胞癌在內(nèi)的肝病中糖鏈結構發(fā)生特異性變化的糖蛋白群，并將此作為新的肝病病情特異性(糖肽和糖蛋白)糖鏈標記物。本發(fā)明人還提供了用于確定肝細胞癌的基礎肝病的病情的方法及其標記物，在該方法及其標記物中，用質量分析、凝集素陣列等糖鏈分析方法對上述糖鏈標記物進行比較糖鏈分析，以此確定肝細胞癌的基礎肝病的病情。發(fā)明的效果用本發(fā)明的肝病病情指標糖鏈標記物的效果卓越，它通過檢查血清等血液，就能檢測出肝細胞癌等的肝病病情，方法簡便，可信度高。本申請中的肝病病情指標糖鏈標記物還能夠通過比較糖鏈分析來確認肝細胞癌的基礎病情。此外，通過本發(fā)明的肝纖維化進展監(jiān)視技術進行檢查時，正確診斷率比現(xiàn)有的血清標記物高，且用微量的血清即可進行檢查，通過該肝纖維化進展監(jiān)視技術，不僅能把握病情的發(fā)展，還能夠對經(jīng)過了干擾素等抗病毒治療后的肝纖維化和炎癥的改善情況進行評價。[圖I]在丙型肝炎中，從感染起經(jīng)過5年15年會轉為慢性。從感染起經(jīng)過20年會轉為肝硬化，經(jīng)過25年30年則會轉為肝細胞癌。發(fā)展速度雖然因人而異，但隨著時間的推移，患肝細胞癌的危險度上升；[圖2]顯示的是由慢性肝炎轉為肝細胞癌的比率的示圖。肝纖維化的程度為Ff3時歸類為慢性肝炎，纖維化程度越弱，從慢性肝炎轉為肝細胞癌的比率也就越低。Fl中的年率為O.8%，F(xiàn)2中的年率為O.9%，而F3的年率則是3.5%；[圖3]顯示的是肝硬化轉為肝細胞癌的比率示圖。通過病理組織學診斷，當肝活檢標本的纖維化的程度被確認為F4時，癌癥發(fā)病率的年率為7.0%；[圖4]肝臟中出現(xiàn)的丙型肝炎病毒感染會引起受損肝細胞的再生，且會引起切ロ修復，即纖維化。隨著肝臟纖維化的發(fā)展，患癌的風險也隨之升高，因此，“纖維化程度”是ー項向癌癥轉移的指標。在產(chǎn)生癌的基礎肝組織中，由于結構細胞會發(fā)生變化，因此，隨著纖維化的發(fā)展，糖鏈也有望發(fā)生變化；[圖5]顯示的是從感染起，隨著時間的變化而發(fā)展成癌癥的過程。此時，觀察到正常結構和功能的常規(guī)活性喪失，同時看到了以纖維化為特征的病態(tài)結構。在肝細胞癌中，已知從早期肝細胞癌發(fā)展到典型肝細胞癌吋，細胞的性質會發(fā)生變化，超過2cm后，早期肝細胞癌中就會出現(xiàn)典型肝細胞癌；[圖6]對慢性肝炎進行的是聚こニ醇干擾素(peginterferon)+病毒唑(Ribavirin)并用療法(PEG-IFN+RBV療法)，與此相對，對早期肝細胞癌進行的是射頻消融術(RadiofrequencyAblationTherapy,RFA)。對于肝硬化則沒有診斷性的檢查方法及有效的治療方法。本發(fā)明中的生物標記物可以區(qū)分開慢性肝炎、肝硬化、以及肝細胞癌，因此它成為了肝硬化的新治療方法的開發(fā)中的ー項指標。此外，將其與FitooScan(肝臟瞬時弾性探測儀)一起使用，有望能夠對纖維化進行定量評價，因此，用診斷性血清標記物能夠劃定纖維化(F3>4)病例的范圍。再加上纖維化的定量診斷，在g在抑制肝纖維化發(fā)展和抑制癌癥發(fā)病的治療中，臨床導入上述本發(fā)明的標記物，有望將其作為治療效果的血清評價標記物使用；[圖7]是以凝集素微陣列(LectinMicroarray)為基礎的生物標記物候補分子的驗證實驗戰(zhàn)略圖。肝病病情指標標記物從血清中存在的糖蛋白群中選擇。因此，分析對象試樣為血清。以肝炎病毒感染者的血清為對象，進行大規(guī)模分析(large-scaleanalysis),對由此鑒別出的標記物候補分子進行比較糖鏈分析。通過使用核心蛋白質的抗體的免疫沉淀法，能夠簡單地濃縮出候補分子。凝集素微陣列是高靈敏度的比較糖鏈分析裝置，用100毫微克的蛋白質制備出的量就足夠進行分析，因此，可以小規(guī)模進行上述前處理。濃縮后的候補分子迅速添加到凝集素微陣列中，反應一定時間后，通過抗體鋪覆凝集素微陣列法獲得候補分子的糖鏈特征。此時，添加到凝集素陣列中的蛋白質的量因蛋白質而不同，大約為I毫微克到數(shù)十毫微克不等。對正好足以進行統(tǒng)計分析的樣本數(shù)進行陣列分析后，用其數(shù)據(jù)組進行T檢驗(Student-Τ檢驗)或曼-惠特尼U檢驗(Mann-WhitneyUtest)等ニ樣本比較分析。以此，可以客觀地選擇出因病情變化而致使其信號中產(chǎn)生顯著性差異(significantdifference)的凝集素；[圖8]對于肝病病情指標標記物候補分子之一的羧肽酶N，多肽2(CPN2)，通過抗體鋪覆凝集素微陣列(Antibody-overlayLectinMicroarray)對其進行比較糖鏈分析，圖8是其結果圖。左上圖顯示的是凝集素微陣列上的凝集素的配置。粗體字表示的是在本實驗中獲得了顯著(significant)信號的凝集素。在11種凝集素中獲得了信號。右上圖顯示的是來源于肝細胞癌、肝硬化、以及慢性肝炎患者血清、健康人血清的CPN2的典型的掃描圖。下半部分的圖中，通過掃描數(shù)據(jù)，用陣列分析軟件對各信號進行了數(shù)值化，以圖表的形式顯示了11種凝集素的結果。可以看出，信號強度隨著病情的嚴重程度而發(fā)生變化(增強或減弱);[圖9-1]從健康人、手術前、手術后的肝細胞癌患者的血清中制備出肽混合物，通過該肽混合物，對于探針凝集素捕捉的糖肽進行糖肽位點特異性同位素(IGOT，isotope-codedglycosylationsite-specifictagging)標記，大致集齊所有的肽，并分別進行LC/MS分析。通過鑒別后的肽的質量電荷比(m/z)和保留時間，篩選出各標記物肽的離子，并顯示出它們的譜(spectre)。圖9_1到9_8顯示的是手術前試樣中的信號強度明顯居高的例子。另外，圖9-1顯示的是下表I中的肽編號為26的肽的情況；[圖9-2]是表I中妝編號為124的妝的例不；[圖9-3]是表I中妝編號為118的妝的例不；[圖9-4]是表I中妝編號為19的妝的例不；[圖9-5]是表I中妝編號為130的妝的例不；[圖9-6]是表I中妝編號為135的妝的例不；[圖9-7]是表I中肽編號為125的肽的例示；[圖9-8]是表I中妝編號為132的妝的例不；[圖10]簡要地顯示了用凝集素連續(xù)層析(chromatography)法分配血清蛋白質的步驟，還簡要地顯示了用蛋白免疫印跡法對條帶(band)進行的定量和分析。向各個人的血清中添加O.2%SDS，在100°C下加熱15分，將該血清作為加熱處理血清，并用于以后的分析。用LCA柱將其分配為LCA結合成分(LE)和LCA非結合成分(LT)。再用AAL柱將LCA非結合成分分為AAL結合成分(AE)和LCA/AAL非結合成分(LTAT)。其中，·表示GlcNAc(N_こ酰葡糖胺)；〇表示Man(甘露糖)；籲表示Gal(半乳糖)；Λ表示Fuc(巖藻糖)；[圖11]是LCA-AAL凝集素柱連續(xù)層析后獲得的各成分的凝集素陣列分析示圖。在此，在所產(chǎn)生的信號中，對14種凝集素用棒狀圖進行了顯示。縱軸表示凈強度(Netintensity)。健康人混合(pool)血清(NHS)的數(shù)據(jù)用白色棒顯示,HCC患者混合(pool)血清(HCC)的數(shù)據(jù)用黑色棒表示；[圖12]是連續(xù)層析后的各成分中的特定糖蛋白的分析示圖，具體而言，根據(jù)以往的報告，確定了在特定糖蛋白AGP、AAT、ACT中，肝纖維化和肝癌等肝病中會伴隨有巖藻糖基化亢進，以上述特定糖蛋白AGP、AAT、ACT為對象，進行連續(xù)層祈，圖12是連續(xù)層析后的各成分中的特定糖蛋白的分析示圖。在此，圖中顯示的是受到了不同巖藻糖基化修飾的分子群之間的比較、即LCA結合分子(LAC洗脫(LCAelution),LE)和LCA非結合/AAL結合分子(AAL洗脫CAALelution),AE)之間的比較。量的比較采用的是蛋白免疫印跡法；[圖13A]是肝癌狀態(tài)指標糖鏈標記物候補的篩選結果示圖。用實施例3和4列舉的連續(xù)層析法，從健康人和肝細胞癌患者的混合血清中調(diào)制試樣，對于該試樣，用蛋白免疫印跡法對各分配成分中的糖蛋白(SHBG)的量進行分析；[圖13B]是肝癌狀態(tài)指標糖鏈標記物候補的篩選結果示圖。用實施例3和4列舉的連續(xù)層析法，從健康人和肝細胞癌患者的混合血清中調(diào)制試樣，對于該試樣，用蛋白免疫印跡法對各分配成分中的糖蛋白(SEPPl)的量進行分析；[圖13C]是肝癌狀態(tài)指標糖鏈標記物候補的篩選結果示圖。用實施例3和4列舉的連續(xù)層析法，從健康人和肝細胞癌患者的混合血清中調(diào)制試樣，對于該試樣，用蛋白免疫印跡法對各分配成分中的糖蛋白(PlgR)的量進行分析；[圖13D]是肝癌狀態(tài)指標糖鏈標記物候補的篩選結果示圖。用實施例3和4列舉的連續(xù)層析法，從健康人和肝細胞癌患者的混合血清中調(diào)制試樣，對于該試樣，用蛋白免疫印跡法對各分配成分中的糖蛋白(SPARCL1)的量進行分析；[圖13E]是肝癌狀態(tài)指標糖鏈標記物候補的篩選結果示圖。用實施例3和4列舉的連續(xù)層析法，從健康人和肝細胞癌患者的混合血清中調(diào)制試樣，對于該試樣，用蛋白免疫印跡法對各分配成分中的糖蛋白(CSFlR)的量進行分析；[圖13F]是肝癌狀態(tài)指標糖鏈標記物候補的篩選結果示圖。用實施例3和4列舉的連續(xù)層析法，從健康人和肝細胞癌患者的混合血清中調(diào)制試樣，對于該試樣，用蛋白免疫印跡法對各分配成分中的糖蛋白(SERPINA7)的量進行分析；[圖14]從健康人、肝硬化患者、以及肝細胞癌患者各取三例樣本，并對樣本中的各糖蛋白進行了凝集素連續(xù)層析和蛋白免疫印跡分析，分析了其在血清各凝集素成分中的含量。在本圖中，棒狀圖顯示的是糖蛋白的含量有差異的凝集素成分中的各種糖蛋白的含量?？v軸的AAL%含義如下將層析處理前的血清中所含靶分子A的蛋白質的量定為100%，AAL%表示AAL柱層析處理后結合成分中所含靶分子A的蛋白質量的比例。LCA%也同樣。所得到的結果是，在肝癌患者中，CPB2在AAL結合成分(AE)中的含量、plgR在LCA結合成分(LE)中的含量、PlgR在AAL結合成分(AE)中的含量、CSFlR在LCA結合成分(LE)中的含量、以及CSFlR在AAL結合成分(AE)中的含量等,都出現(xiàn)了顯著高(significantly-high)的結果。通過定量、比較這些分子(分子復合物)上的糖鏈變化，特別是通過定量、比較LCA或AAL結合性糖鏈，就可以預測肝臟的疾病狀態(tài)，特別是肝細胞癌；[圖15]從健康人、慢性肝炎、肝硬化患者、以及肝細胞癌患者中各取五例樣本，并對樣本中的各種糖蛋白進行了凝集素連續(xù)層析和蛋白免疫印跡分析，分析了各糖蛋白在血清各凝集素成分中的含量。在本圖中，棒狀圖顯示的是各種糖蛋白在LCA結合成分和AAL結合成分中的含量。所得到的結果是，關于PlgR在LCA結合成分(LE)中的含量、以及plgR在AAL結合成分(AE)中，肝硬化和肝癌患者中的含量比例(含量)比健康人高。另ー方面，關于CSFlR在LCA結合成分(LE沖的含量比例，與健康人進行比較，只有肝癌患者中出現(xiàn)了顯著高(significantly-high)的結果。關于CSFlR在AAL結合成分(AE)中的含量比例(含量)，與健康人和慢性肝炎患者相比較，肝硬化中的結果增高，肝癌患者的結果更高；[圖16]進行了凝集素連續(xù)層析和蛋白免疫印跡分析，圖16顯示的是在該分析中獲得的分配成分中，PlgR含量比例(含量)與肝臟纖維化進展之間的相關性。在此顯示，當纖維化進展到F3或F4(特別是F4)吋，plgR的AAL結合成分(AE)上升。這說明隨著上述纖維化的進展，癌細胞可能已經(jīng)開始生成；[圖17]進行了凝集素連續(xù)層析和蛋白免疫印跡分析，圖17顯示的是在該分析中獲得的分配成分中，CSFlR的含量比例(含量)與肝臟的纖維化進展之間的相關性。可以看出，CSFlR的LCA結合成分(LE)與纖維化的發(fā)展(FfF4)成正比上升。同時可以看出，當纖維化發(fā)展到F3或F4(特別是F4)吋，CSFlR的AAL結合成分(AE)急劇上升。這說明隨著纖維化的進展，癌細胞可能已經(jīng)開始生成；[圖18]用抗體鋪覆凝集素微陣列，對肝病病情指標標記物候補分子之一的PlgR進行了比較糖鏈分析，圖18顯示的是該分析的結果。通過免疫沉淀法，用從血清中濃縮提純出的plgR(IOng)進行了分析。凝集素微陣列上的凝集素配置如左圖。在本實驗中，獲得了顯著(significant)信號的凝集素用粗體字表示。在19種凝集素中獲得了信號。右圖顯示的是來源于肝細胞癌患者血清、健康人血清的PlgR的典型的掃描圖。其結果是，與來源于健康人血清的PlgR相比，在來源于肝細胞癌患者血清的PlgR中，有7種凝集素(AOL、AAL、SNA、SSA、TJA-I，BPL,ΑΒΑ)的信號増加，而5種凝集素(MAL，DSA,EEL,WA,ΗΡΑ)的信號減少；[圖19]用抗體鋪覆凝集素微陣列，對肝病病情指標標記物候補分子之一的PlgR進行了比較糖鏈分析，圖19顯示的是該分析的結果。使用了健康人(NHS:14人的分量)的混合血清和多個肝細胞癌患者的混合血清(HCC5人的分量、HCC-Kl2人的分量、HCC-K26人的分量、HCC-K3:2人的分量)。通過免疫沉淀法，用從上述血清中濃縮提純出的plgR(IOng)進行了分析。與來源于健康人血清的PlgR相比，在來源于肝細胞癌患者血清的PlgR中，有7種凝集素(AOL，AAL,SNA,SSA,TJA-I,BPL,ΑΒΑ)的信號増加，而5種凝集素(MAL，DSA,EEL,WFA,HPA)的信號減少；[圖20]用抗體鋪覆凝集素微陣列，對肝病病情指標標記物候補分子之一的CSFlR進行·了比較糖鏈分析，圖20顯示的是該分析的結果。通過免疫沉淀法，用從血清中濃縮提純出的CSFlR(2ng)進行了分析。凝集素微陣列上的凝集素配置如左圖。在本實驗中，獲得了顯著(significant)信號的凝集素用粗體字表示。在20種凝集素中獲得了信號。右圖顯示的是來源于肝細胞癌患者血清、以及來源于健康人血清的CSFlR的典型的掃描圖。其結果是，與來源于健康人血清的CSFlR相比，在來源于肝細胞癌患者血清的CSFlR中，有5種凝集素(AOL、AAL、ECA、ABA、WFA)的信號增加；[圖21-1]用抗體鋪覆凝集素微陣列，對肝病病情指標標記物候補分子之一的CSFlR進行了比較糖鏈分析，圖21-1顯示的是該分析的結果。通過免疫沉淀法，用從血清中濃縮提純出的CSFlR(2ng)進行了分析。使用健康人(NHS:14人的分量)、比較高齡的健康人(GP:5人的分量)、(病毒性)肝炎患者(CH5人的分量)、肝硬化患者(LC5人的分量)、肝細胞癌患者(HCC5人的分量、Kl2人的分量、K26人的分量、K32人的分量)的混合血清，用同樣的方法提純、濃縮CSFlR蛋白質，并對CSFlR蛋白質(抗CSFlR抗體沉淀物)的糖鏈特征進行了分析。在分析中得知，在AOL、AAL、ECA、ABA、WFA的凝集素中，與健康人(NHS)相比，肝細胞癌患者(HCC)中的信號亢進。特別是在WFA信號中，在健康人(NHS)、比較高齡的健康人(GP)、(病毒性)肝炎患者(CH)、肝硬化患者(LC)中幾乎未檢出WFA信號，而在來源于肝細胞癌患者(HCC)的HCC、K1、K2、K3中卻觀察到了顯著(significant)的信號；[圖21-2]續(xù)圖21-1；[圖22](A)顯示的是在血清中用WFA進行批量分配的方法的簡要流程。(B)用WFA凝集素，對健康人(NHS)和肝細胞癌患者(HCC)的混合血清進行免疫沉淀，并用抗CSFlR抗體進行蛋白免疫印跡分析。以此定量血清中有WFA結合性糖鏈的CSFlR的含量。其結果是，在來源于肝細胞癌患者(HCC)的CSFRl等中，WFA凝集素的信號表現(xiàn)出顯著(significant)的亢進。幾乎未檢出來源于NHS的WFA結合性CSFRl。(C)分別取健康人(正常，Nomal)、(病毒性)肝炎患者(CHC)、肝硬化患者(LC)、以及肝細胞癌患者(HCC)的血清各5例，并將其作為樣本組使用，就血清中的WFA結合性CSFlR的含量進行了研究。根據(jù)其結果，定量了在蛋白免疫印跡中獲得的條帶(band)的強度，并以棒狀圖的形式進行了顯示。各種疾病的平均值顯示在各疾病的最左邊。結果表明，與健康人(正常，Nomal)和(病毒性)肝炎患者(CHC)相比較，肝硬化患者(LC)中的WFA結合性CSFlR的含量亢進。與健康人(正常，Nomal)、(病毒性)肝炎患者(CHC)、及肝硬化患者(LC)相比，肝細胞癌患者(HCC)的WFA結合性CSFlR的量也有顯著(significant)亢進。(D)為了研究與纖維化發(fā)展之間的關聯(lián)，用上述方法，將輕度慢性肝炎(Fl)、中度慢性肝炎(F2)、重度慢性肝炎(F3)、肝硬化(F4)患者的血清作為樣本組使用，先用未進行分配的未處理血清，分析了血清中的WFA結合性CSFlR的量。關于WFA分配成分的CSF1R，在FfF3中基本上都未檢出，在F4患者的血清中卻檢測到了。對在蛋白免疫印跡中獲得的WFA結合性CSFlR的強度進行定量，用棒狀圖顯示。優(yōu)選實施方式I.慢性肝病的現(xiàn)狀1-1.肝病的病情感染こ型肝炎病毒或丙型肝炎病毒后，從急性炎癥起，經(jīng)過5—15年會發(fā)展為慢性炎癥。特別是在轉為慢性后的丙型肝炎中，自愈的例子很少，一般肝功能會逐漸降低，直至肝硬化。為了定義性慢性肝炎到肝硬化之間的病情，從病理形態(tài)學的角度捕捉肝臟的格利森區(qū)域(Glisson)和肝小葉中出現(xiàn)的的纖維性變化，并將其分類為輕度(F1)、中度(F2)、重度(F3)和肝硬化期(F4)。纖維化的發(fā)展、以及肝細胞癌的患癌風險的上升之間有相關性，F(xiàn)l或2中的年率為1%以下，與此相対，F(xiàn)3中的年率則上升到3-4%。若纖維化程度進ー步發(fā)展，通過組織學圖像診斷為肝硬化(F4)時，肝細胞癌出現(xiàn)的概率為年率7%。因此，為了有效地發(fā)現(xiàn)并治療肝細胞癌，需要簡便地甄別處于F3及F4狀態(tài)的患者，并將其作為精密檢查的對象進行跟蹤。在日本的こ型肝炎和丙型肝炎患者醫(yī)療補助事業(yè)中，主要針對的對象是在肝活檢樣本的病理組織學診斷中，確定了其纖維化的程度為Ff3的患者。當診斷為F4時，患者被歸類為肝硬化，在干擾素治療的こ型肝炎和丙型肝炎患者醫(yī)療補助事業(yè)中，僅有其中的一部分成為補助對象，無法取得滿意的治療成績。1-2.用抗病毒療法控制纖維化的評估慢性丙型肝炎適用于PEG-IFN+RBV療法，而丙型肝炎硬化代償期則適合單獨用干擾素治療。另ー方面，在こ型肝炎(慢性肝炎、肝硬化)的治療中主要用的是核酸類似物，因此必須有炎癥和纖維化評估標記物。尤其是血清生物標記物有望廣泛應用于臨床診斷和評估。1-3.肝細胞癌一般認為，患肝細胞癌是由于以下兩種因子活躍地交互作用所致こ型肝炎病毒或丙型肝炎病毒感染產(chǎn)生的微生物學因子、以及環(huán)境因子。在日本，已知肝細胞癌患者的約9成曾經(jīng)感染過こ型肝炎或丙型肝炎病毒，且發(fā)展為了慢性肝炎和肝硬化患者。據(jù)認為，肝細胞癌的癌變危險因子中，除病毒以外還有男性、高齡、大量飲酒、抽煙、以及毒枝菌素中的黃曲霉毒素等(肝癌診療指南，(財)國際醫(yī)學情報中心)。1-4.肝細胞癌的早期診斷目前，肝細胞癌的發(fā)現(xiàn)主要靠以下方法測定受檢者血清樣本中的AFP和PIVKA-II等的肝癌標記物、以及以超聲波檢查(回聲檢查)為中心的圖像診斷。在圖像診斷中，一般初檢中進行超聲波檢查或CT，在這些檢查中發(fā)現(xiàn)某種異常時，再做MRI和血管造影。1-5.從預防肝細胞癌的觀點出發(fā)，篩查癌癥高危人群在日本，肝細胞癌患者的約9成是感染了こ型肝炎病毒或丙型肝炎病毒的肝炎患者，以病毒感染和肝功能下降為指標，就能夠篩查成為精密檢查的對象的患者。然而，即使是肝細胞癌以年率7%的概率出現(xiàn)的肝硬化(F4)患者，為了及早發(fā)現(xiàn)并治療癌癥，每隔三個月便需要進行一次高額、高侵襲性的精密檢查，不得不說這對患者的經(jīng)濟和身體都是很大的負擔。毎年癌變率為3-4%的F3更是如此?？紤]到通過干擾素治療丙型肝炎病毒的成功率只是5成左右，就更需要對干擾素治療未奏效的眾多慢性肝炎患者進行臨床跟蹤，明確其處于肝硬化和肝細胞癌進程中的哪個階段。即，在目前的肝炎肝細胞癌的疾病的治療中，需要通過血液檢查等簡易的檢查，對肝炎肝硬化患者的癌變風險進行評估，并進行與之相應的肝細胞癌的診治。在臨床病理學上，纖維化的程度與肝硬化和肝細胞癌的風險之間存在著相關性，從這一點入手，我們發(fā)現(xiàn)，開發(fā)出ー種能夠以血清學方式對纖維化進展進行定量測定的檢查技術，就有可能解決這ー問題。2.獲取新肝細胞癌糖鏈標記物等的新肝病病情指標糖鏈標記物2-1.包括肝細胞癌糖鏈標記物在內(nèi)的新肝病病情指標糖鏈標記物本發(fā)明中的肝細胞癌糖鏈標記物有時也表述為糖鏈相關腫瘤標記物或腫瘤特異性糖鏈標記物，但都是指糖蛋白中的肝細胞癌特異性糖鏈結構，包含具有這種糖鏈的糖蛋白。根據(jù)數(shù)百種糖鏈相關基因的表達平衡(expressionbalance),細胞分泌的蛋白質上的糖鏈的成分和結構的多祥性受到控制，且該糖鏈的成分和結構的多祥性會隨著細胞的分化、癌的進展程度而變化。這種糖鏈結構會發(fā)生變化的糖蛋白可以用作疾病病情指標標記物，該疾病病情指標標記物中也包括腫瘤標記物在內(nèi)。因此，人們對以蛋白質組學為基礎的糖鏈相關腫瘤標記物進行了研究探索。在以蛋白質組學為基礎的標記物的探索途徑中，在第一階段中，通過大規(guī)模分析，鑒別候補分子。第二階段中，通過定量分析，驗證并鎖定候補分子。第三階段中，進行驗證試驗。在以糖蛋白組學為基礎的糖鏈相關標記物的探索中，也同樣以上述途徑為基礎進行探索。此外，本發(fā)明中還包括新肝病病情指標糖鏈標記物。在上述肝細胞癌糖鏈標記物中，檢測出賦予下述疾病以特征的糖鏈變化，并將其作為標記物候補其中上述疾病為病毒感染引起的疾病在發(fā)病與發(fā)展中生成的慢性肝炎、肝硬化和肝細胞癌。如上所述，我們將以下標記物稱為肝病病情指標糖鏈標記物以病毒性肝病的病情發(fā)展中所伴隨的糖鏈變化為指標，能夠判斷肝病病情的標記物。本發(fā)明的新肝病病情指標糖鏈標記物對病毒性肝病的各種病情表現(xiàn)出不同特征，對鑒別各種疾病均有效果，其中上述病毒性肝病的各種病情是指肝細胞癌、肝硬化、肝纖維化(F3和F4標記物)或慢性肝炎。此外，本發(fā)明的新肝病病情指標糖鏈標記物中包括肝病病情指標糖鏈標記物糖肽、以及肝病病情指標糖鏈標記物糖蛋白。比如，可以使用肝細胞癌患者或肝病患者的樣本或癌細胞株、以及健康人樣本，通過凝集素捕獲IGOT法，特異性地鑒別前者中的糖肽，并將該糖肽作為肝細胞癌標記物或肝病病情指標糖鏈標記物候補糖肽。使用100例患者樣本(或不同病期的患者樣本各20例)以及100例健康者樣本，通過包括穩(wěn)定性同位素導入糖肽的比較糖蛋白組學技術方法在內(nèi)的糖肽的比較糖鏈分析技木，對該糖肽進行驗證，可以將表現(xiàn)出有用性的糖肽作為確定的標記物糖肽。此外，還可以如下以含有肝病病情指標糖鏈標記物候補糖肽的序列的糖蛋白為對象，使用包括抗體鋪覆凝集素微陣列法在內(nèi)的比較糖鏈分析技術，對上述對象進行驗證，將表現(xiàn)出有用性的糖蛋白作為確定的標記物糖蛋白。2-2.肝病病情指標糖鏈標記物的獲取方法2-2-1.糖蛋白的大規(guī)模鑒別糖肽的大規(guī)模選擇性捕獲、濃縮大體來說可以使用以下方法中的某ー種方法(i)使用與糖鏈具有親和性的探針；方法(ii)利用與糖鏈的化學反應(ZhangH.等，《自然生物技術》21、660-666(2003));方法(iii)向糖鏈導入親和性標簽(tag)等。最好使用探針。下面就使用探針的方法進行詳細闡述。(I)用探針進行捕獲探針可以使用凝集素或抗糖鏈抗體。具體而言，首先，使用探針凝集素或抗體探針，從來源于肝細胞癌的細胞株的培養(yǎng)基上清中捕獲糖蛋白，然后，再使用探針凝集素或抗體探針，從健康人的血清中捕獲糖蛋白，與此同時，用探針凝集素以外的凝集素全面地捕獲糖蛋白。(2)選擇探針凝集素時，可以主要通過上述凝集素微陣列進行糖鏈特征統(tǒng)計分析，以此選出。此外，也可以參考糖鏈基因的表達特征(實時定量的PCR的結果)和文獻信息(如癌變中伴隨的巖藻糖基化亢進等，有時可以想象出應該使用的探針凝集素)來選擇探針?；旧鲜歉鶕?jù)特征的統(tǒng)計分析來進行選擇，再根據(jù)所選凝集的結合特異性來判斷選擇是否妥當。當以肝細胞癌為靶時，比如可以使用以下凝集素從能夠檢出巖藻糖基化的橙黃網(wǎng)孢盤菌(Aleuriaaurantia)中獲得的凝集素(AAL)、或是從能夠檢出糖鏈的超支化的蔓陀羅(Daturastramonium)中獲得的凝集素(DSA)等?？贵w探針可以在弄清抗原(糖鏈)的結構之后再制作，但這不是必須條件，也可以在不知道抗原糖鏈(或糖肽)結構的情況下制作。(3)在確定生物標記物時，全面捕獲中所用的凝集素會根據(jù)對照試樣中的糖鏈結構的分布而發(fā)生變化。比如，已知將血清作為對照吋，已知血清糖蛋白上的糖鏈幾乎全部為唾液酸化雙糖鏈，因此，經(jīng)唾液酸酶處理的話，通過從蓖麻(Ricinuscommunis)中獲得的凝集素(RCA120)，能夠對血清糖蛋白(肽)中的絕大部分進行全面捕獲，因此，可以使用RCA120。不用識別唾液酸的凝集素是為了避免以下情況因人為操作和試樣因時間的劣化而造成唾液酸脫落，并因此受到影響。當用于對照的試樣不是血清時，比如是其他體液吋，可以選擇其他凝集素。也可以不使用凝集素，而是通過親水性相互作用層析或凝膠過濾來進行全面捕獲。2-2-2.糖肽或糖蛋白的鑒別對于捕獲的糖蛋白，可以采用下述文獻中的Lec-IGOT-LC/MS法來對候補(糖肽)進行分析特開2004-233303號公報(特許第4220257號)、或是KajiH,等人所著的“用凝集素親合捕獲的N-結合的糖肽的質譜鑒別以及糖基化位點的穩(wěn)定同位素標記”，《自然-實驗手■〉〉(MassspectrometricidentificationofN-Iinkedglycopeptidesusing丄ectin—mediatedafnnitycaptureandglycosylationsite—speciiicstableisotopetagging.《NatureProtocols)))1，3019-3027(2006)。(I)糖鏈切除以及糖基化位點的穩(wěn)定同位素標記用蛋白酶消化探針捕獲的糖蛋白群，從如此獲得的肽群中，用同樣的探針重新捕獲充當試樣的糖肽群。或者也可以不分離試樣粗蛋白質混合物，用蛋白酶進行消化，并在如此獲得的粗肽群中直接用探針進行捕獲。在用同位素氧標記過(label)的水中，用糖肽酶等酶對獲得的糖肽群進行處理，以此離解糖鏈。于是，糖基化部分的天冬酰胺轉為天冬氨酸，此時，水中的同位素氧(18O)被攝入肽中。如此，將用同位素標記糖基化位點的行為稱為糖基化位點的特異性同位素標記(isotope-codedglycosylationsite-specifictagging,IGOT)。(2)標記肽的LC-MS鳥槍法分析通過LC分離，對IGOT法標記的肽進行分離，導入MS，通過串聯(lián)質譜法全面鑒別肽的序列。(3)肽的鑒別比如，可以使用標準技術集(特許廳編)、質量分析3-6-2-2氨基酸序列分析中介紹的MS/MS離子檢索法，對于所得肽混合物的MS/MS肽測定結果，將其與數(shù)據(jù)庫中登錄的MS/MS特征進行比較，以此進行檢索。在檢索中，需要考慮以下氨基酸的修飾(蛋氨酸殘基側鏈氧化、氨基末端谷氨酰胺焦化(脫酰氨基化、環(huán)化)、氨基末端去氨基化(脲甲基半胱氨酸)、天冬酰胺殘基側鏈去酰氨基化(攝入了穩(wěn)定性同位素氧的部分))。(4)糖基化位置的鑒別在用MS/MS離子檢索法鑒別出的肽中，天冬酰胺殘基側鏈中發(fā)生了脫酰氨基化(攝入穩(wěn)定同位素)、且含有N結合型糖基化共有序列(Asn-Xaa-[Ser/Thr]、但Xaa非Pro)的肽用于充當候補糖肽(當Xaa是Lys/Arg,且鑒別的肽序列在此位點被切斷時,在參照全部蛋白質的氨基酸序列，如果能確認Xaa的下ー個殘基是[Ser/Thr]的情況下，也包含此肽)，將該糖肽的共有序列天冬酰胺殘基作為糖基化位點。當有數(shù)個共有序列，且脫酰氨基化(標記)天冬酰胺殘基的數(shù)少于共有序列、且通過MS/MS譜無法確定標記位點吋，同時記錄這些標記位點(糖基化位點)，以表示無法區(qū)別。(5)糖肽的表示方法關于權利要求中的表I和以下表I所列舉的肽，以IG0T-LC/MS法中鑒別出的結果為基礎，在用該方法進行鑒別的過程中，要考慮到有無上述(3)所述的修飾。因此，該標記物糖肽不僅是由氨基酸序列所規(guī)定的，還包含肽中所含官能基的實際的修飾情況。對實際的修飾情況，通過數(shù)列進行如下表述。(I)肽部分的氨基酸序列用以下列來表示有氨基酸的一個文字的列。(2)修飾位置和修飾的種類以數(shù)列表示。數(shù)列的開頭表示肽的末端氨基，最后表示末端羧基，中間的數(shù)字表示構成的各氨基酸殘基側鏈的位置。數(shù)值表示修飾的種類?！癘”表示未修飾，“I”表示氨基末端谷氨酰胺殘基焦化(脫酰氨基化、環(huán)化)、“2”表示蛋氨酸殘基側鏈氧化，“3”表示氨基末端脲甲基化半胱氨酸殘基的焦化(脫酰氨基化、環(huán)化)，”4”表示天冬酰胺的脫酰氨基化(IGOT標記)、即糖基化位點。序列表根據(jù)以下表I繪制。2-2-3.肝病病情指標糖鏈標記物候補糖肽的鎖定通過癌探針(凝集素)，從(i)來源于肝細胞癌的細胞株培養(yǎng)液、及(ii)肝細胞癌患者血清(采集于癌切除手術前和手術后)中捕獲肝病病情指標糖鏈標記物候補糖肽，可以用上述2-2-1,2-2-2中的糖肽大量鑒別法進行鑒別。鑒別后的糖肽即可作為該糖鏈標記物的初期候補。接著，按照同樣的步驟，使用探針凝集素和能夠進行全面鑒別的其他凝集素，從(iii)健康人血清中捕獲糖肽，在鎖定標記物候補糖肽時，可以如上獲得的該糖肽用作參考。即，在候補糖肽中，用癌探針鑒別的肽，其候補順序在健康人血清后面，相反，使用了全面的凝集素鑒別出的肽在血清中的量比較高，可以將其評價為易檢測候補。此外，同樣地，使用探針凝集素和其他凝集素，從(iv)癌切除手術后的肝細胞癌患者的血清中捕獲并鑒別糖肽，以該糖肽為參照，可以分別鎖定與每種適用的肝病病情相應的標記物。即，從癌切除手術前的試樣鑒別糖肽，從手術后患者和健康人血清中不鑒別糖肽，則該糖肽可以視為以下標記物暗示有肝細胞癌存在的標記物；從手術前手術后的患者血清中進行鑒別糖肽，而不從健康人血清鑒別糖肽，則該糖肽可視為以下標記物候補用于反映肝細胞癌的基礎(肝炎和向肝硬化轉化的纖維化)的標記物候補。此時，通過比較LC/MS分析中的標記肽的信號強度，可以估算出血清中的該糖肽的大致含量或變化。經(jīng)驗證實驗后，如此鎖定的標記物候補糖肽可以用作以下標記物以各種病情為對象的肝病病情指標糖鏈標記物。包含該肽序列的糖蛋白也同樣，在蛋白質的狀態(tài)下經(jīng)過驗證實驗后，可以作為各種病情的肝病病情指標糖鏈標記物使用。2-2-4.肝病病情指標糖鏈標記物候補糖肽經(jīng)過上述步驟選出的肝病病情指標糖鏈標記物候補糖肽群見以下表I。表I.....................................................................................I—麗麗麗S..E漏..............................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................K序列與修tti信息*編號數(shù)列的汗頭省Jiifi中W表示a基·ts鍵κι修飾情O太德飾；丨N*端Gln的焦化，2IvktMatt親3N宋端騰￥基化Cysft焦化，4糖.位點(Asn0gJIFNSS\1級nxom湖M職職職》7vsKvsrQ.vsvsR(mmmitm3CfTAGXMAHXfASQIΛ!Ul:Xto0X)(UWjau0XXMUU4n\iiiinmixrrcirt(^miimmmnmm5IRili'l(imii,KCi(TCKKiRUmwWW(l)tIttXWi6VNFTEiOM職腳7[L\lGSNM:m!ffiUrQM.級ακ職職.Χ麗^^^^8GlNVH5STGRX^mXXWX)9MixivsKvicixsRiamwmTOiοirnHGivui.xc—tvRiOGmumxtMmwrnII$Η^ΙΑΓΓ8(L.VYSXA沾TDSAKVYRTG謂MMMOOMOMMMBmm13GMmNfSMrvmKmMmamm14GMmNFSMrvmKmmmmmm15GmM16L(;A('Niynw*-、_通雙SEw.m繼卿細郎17IjaiummmmmmBCXPOMmmmmmmmmitQvmmKmMmmjmmjKmamMmmmam9TljrNASKETONTrm￡3MMmui21MMMMGWIGKiMMMOOe22(ΧΝΧ^；!11Κ)α3!^'ΚΜΜωΙΟ23rmwQmcMmhTmj^^^mxmmmmmrn24AXiXKsnmmmumnnm25[AEEDIMETLKDMY￥NDSMGSH￥WMMIBM0lM00(MWM0ra26l·"講AUTMJBLHNISVMSAHYSCVYVDIMfCKS^ESlSmraiMMMIMmiOTOBMiaQnmwYnBBYhmqmm^m^m2h^MMNGSGmMQmmmmmmmh29AHLNVSatrcSVLLMWlDUQQQiSKDT^HyxaHCOQOOOOGGOOOOOGOOOOGOOCOCOGDDM>vmx^nvMMmmxmmスIMiEmHmMcrcFGqGmxmommmxm:'iDmixxsDHKGHimi)(mmnmmmmm51’ΠΛ’Κ·Π·ΛΒΤΙ)^Μ8Λ\ΚιΠΙΛ!_)Φ.UlKXIVKtlYI.WORΚΚ0ΜΕΧ*0Ι)35QiKKira-iTLNVQKiiXim.sRKiiirittiiriuiWiiiiii36λu^mm^^i^XSSiVXKummmimmtmMinxmi^yKAnYSASiKammimiumvJosi^\i\\simsnuyix>ynmmmmimnmim4i>IΧΛ('ΝΙ3IWlAlliNVKJi^HSIΚαΛΗ-ΜΛ.ΜΛΠ->4Vl'iiNAS.\l.FiIJsIXiDKXIIiAI-.VNII.1.Η；Π.ΚΚΙΜΙΧΙΙ(ΙΠΙ.ΙΠΗΙΙ.ΙΚ0.ΙΙ42VI；Π.NiJX^Vni'OHAUXVSlΛΛΗ\Λ\Η'*Κ4Ι)ΚΜχα)431-；ΙΚΑΧ*Κl^!XLUAVi-l-i'KK'l.R4WI(TOQHllUHlli.X^44TLNcmsrmuiしSMGX人難)a*miiisu>jm>45(xnAimMiK\i<K%DSiimwACAii\\A\\%Kmmmxnmximmmmmmi4hνΓ{ΝΛΗ,\Ι,·'1!.!ΧΜ)Κλ1ΚΗ\Κν\ΙΙ.ΙΒ-ΓΙΚΚ)Ι*ΗΗΙΜαακΠ0ΠΚ)47Nisixnix;iprmTxvy.yj>yis\miR!iiniunninininiHmiii4HiiQiQYfKSNrQmHii-MixvxKwmxmmimiimmm49sHiamiiiSfivsHixxnixvsfwuxwffnittwxwttX)50ΝΡΙ^ΚΚΝΛ'\1Ι')1ΛΙΧ(.)-Ι·.η<ΧΒ(Κ0Ι1αΗΧΧΧΧΙΙΙΧΙ.ΧΠΧ>Π)51υκ}λΛXimSGYX^iySYnmmmmimnXmmm5253LSX'DKl^Q^^'miNlllCX-TOGVGN^'Gi^SITC'SCiXRiKJKttMnaX^IUXOXItaMXWXWMMtX)54CxiiAmi^-NYxKsDxT1IayiHiAini7AWWNK(im*u0wwxinxiwmnx55CHici-NLnrrsivliailQsixilllj-RftHlMiiilI(HKlKIIXHin)56siXiN\'Ki'iTSAi'；^MSQVirGTVx\>s\mKMmimmBmtmmmnmmmi57DivhYYKD^KQmxiK^mmmMxxmxxm58EII&\QSKASIl)\Tl.XilfI^"EEL%lKXXiiMXWirttWrttXMrt)59DVQirafDGHffiトへ7F腳腳腳XttX麵》60\\細IVtCQM卿)ρ.ω桃{mmwmmxmt61[λo-Af^Ii,SCima3GKimmmmum權利要求1.一種肝病病情指標糖鏈標記物糖肽，其特征在于該糖肽具有表I所列糖鏈，[表I]2.表2所列肝病病情指標糖鏈標記物糖蛋白，其特征在于該糖蛋白含有選自權利要求1所述的(1)至(157沖的任意的、一種以上的糖肽序列(但是，以下表2中的蛋白質編號為97和98(AGP)以及65(M2BP)的蛋白質除外)，[表2]3.選自以下(1)至(8)中的一種以上的肝病病情指標糖鏈標記物糖肽或其組合(1)一種肝病病情指標糖鏈標記物糖肽，即表1中的肽編號19所表示的多肽；(2)一種肝病病情指標糖鏈標記物糖肽，即表1中的肽編號26所表示的多肽；(3)一種肝病病情指標糖鏈標記物糖肽，即表1中的肽編號118所表示的多肽(4)一種肝病病情指標糖鏈標記物糖肽，即表1中的肽編號124所表示的多肽(5)一種肝病病情指標糖鏈標記物糖肽，即表1中的肽編號125所表示的多肽(6)—種肝病病情指標糖鏈標記物糖肽,即表1中的肽編號130所表不的多肽(7)一種肝病病情指標糖鏈標記物糖肽，即表1中的肽編號132所表示的多肽(8)一種肝病病情指標糖鏈標記物糖肽，即表1中的肽編號135所表示的多肽。4.選自以下(1)至(14)中的一種以上的肝病病情指標糖鏈標記物糖蛋白或其組合(1)一種肝病病情指標糖鏈標記物糖蛋白，即表2中的蛋白質編號22所表示的含多肽的糖蛋白，其特征為該糖蛋白具有伴隨有巖藻糖修飾的糖鏈變化；(2)—種肝病病情指標糖鏈標記物糖蛋白，即表2中的蛋白質編號89或90所表不的含多肽的糖蛋白，其特征為該糖蛋白具有伴隨有巖藻糖修飾的糖鏈變化；(3)—種肝病病情指標糖鏈標記物糖蛋白，即表2中的蛋白質編號145-LR所表不的含多肽的糖蛋白，其特征為該糖蛋白具有伴隨有巖藻糖修飾的糖鏈變化；(4)一種肝病病情指標糖鏈標記物糖蛋白，即表2中的蛋白質編號9所表示的含多肽的糖蛋白，其特征為該糖蛋白具有伴隨有巖藻糖修飾的糖鏈變化；(5)—種肝病病情指標糖鏈標記物糖蛋白，即表2中的蛋白質編號8所表不的含多肽的糖蛋白，其特征為該糖蛋白具有伴隨有巖藻糖修飾的糖鏈變化；(6)—種肝病病情指標糖鏈標記物糖蛋白，即表2中的蛋白質編號103或104所表不的含多肽的糖蛋白，其特征為該糖蛋白具有伴隨有巖藻糖修飾的糖鏈變化；(7)—種肝病病情指標糖鏈標記物糖蛋白，即表2中的蛋白質編號47所表不的含多肽的糖蛋白，其特征為該糖蛋白具有伴隨有巖藻糖修飾的糖鏈變化；(8)—種肝病病情指標糖鏈標記物糖蛋白，即上述表2中的蛋白質編號105所表不的含多肽的蛋白質plgR，其特征為該蛋白質具有伴隨有巖藻糖修飾的糖鏈變化；(9)一種肝病病情指標糖鏈標記物糖蛋白，即上述表2中的蛋白質編號32所表不的含多肽的蛋白質CSF1R，其特征為該蛋白質具有伴隨有巖藻糖修飾的糖鏈變化；(10)一種肝病病情指標糖鏈標記物糖蛋白，即上述表2中的蛋白質編號129所表不的含多肽的蛋白質SHBG，其特征為該蛋白質具有伴隨有巖藻糖修飾的糖鏈變化；(11)一種肝病病情指標糖鏈標記物糖蛋白，即上述表2中的蛋白質編號122或123所表示的含多肽的蛋白質SEPP1，其特征為該蛋白質具有伴隨有巖藻糖修飾的糖鏈變化；(12)—種肝病病情指標糖鏈標記物糖蛋白，即上述表2中的蛋白質編號130所表的含多肽的蛋白質SPARCL1，其特征為該蛋白質具有伴隨有巖藻糖修飾的糖鏈變化；(13)一種肝病病情指標糖鏈標記物糖蛋白，即上述表2中的蛋白質編號126所表示的含多肽的蛋白質SERPINA7，其特征為該蛋白質具有伴隨有巖藻糖修飾的糖鏈變化；(14)一種肝病病情指標糖鏈標記物糖蛋白，即上述表2中的蛋白質編號92所表不的含多肽的蛋白質MANA2，其特征為該蛋白質具有伴隨有巖藻糖修飾的糖鏈變化。5.一種纖維化進展的判斷方法，其特征在干，使用采自受檢者的試樣，分析選自權利要求3所述(I)至(8)中的ー種以上的肝病病情指標糖鏈標記物糖肽，以此判斷纖維化的進展。6.一種纖維化進展的判斷方法，其特征在干，使用采自受檢者的試樣，分析選自權利要求4所述(I)至(14)中的ー種以上的肝病病情指標糖鏈標記物糖蛋白，以此判斷纖維化的進展。7.ー種肝硬化的檢測方法，其特征在干，使用采自受檢者的試樣，分析選自權利要求3所述(I)至(8)中的ー種以上的肝病病情指標糖鏈標記物糖肽，以此檢測肝硬化。8.ー種肝硬化的檢測方法，其特征在干，使用采自受檢者的試樣，分析選自權利要求4所述(I)至(14)中的ー種以上的肝病病情指標糖鏈標記物糖蛋白，以此檢測肝硬化。9.ー種肝細胞癌的檢測方法，其特征在干，使用采自受檢者的試樣，分析選自權利要求3所述(I)至(8)中的ー種以上的肝病病情指標糖鏈標記物糖肽，以此檢測肝細胞癌。10.ー種肝細胞癌的檢測方法，其特征在干，使用采自受檢者的試樣，分析選自權利要求4所述(I)至(14)中的ー種以上的肝病病情指標糖鏈標記物糖蛋白，以此檢測肝細胞癌。11.一種對肝細胞癌的發(fā)病和復發(fā)進行早期預測的方法，其特征在于，使用采自受檢者的試樣，就權利要求4所述(9)的CSF1R，測定AOL、AAL、ECA、ABA及WFA分別對應的結合性CSFlR的量，以此對肝細胞癌的發(fā)病和復發(fā)進行早期預測。12.—種對肝細胞癌的發(fā)病和復發(fā)進行早期預測的方法，其特征在于，使用采自受檢者的試樣，就權利要求4所述(8)的plgR，測定AOL、ML、SNA、SSA,TJA-I,BPL、ABA、MAL、DSA、EEL、WFA、及HPA分別對應的結合性plgR的量，以此對肝細胞癌的發(fā)病和復發(fā)進行早期預測。全文摘要本發(fā)明的課題在于提供一種能夠檢測出肝病的糖鏈標記物。具體而言，本發(fā)明的課題在于開發(fā)出一種能充當肝病病情指標的糖鏈標記物。此外，本發(fā)明的課題還在于開發(fā)出一種能夠隨著肝細胞癌的進展區(qū)分出肝病病情的糖鏈標記物。對于血清糖蛋白，本申請的發(fā)明人鑒別出了在包括肝細胞癌在內(nèi)的肝病中，其糖鏈結構發(fā)生特異性變化的糖肽和糖蛋白質的群，并將其作為新肝病病情特異性(糖肽和糖蛋白質)糖鏈標記物。文檔編號C07K9/00GK102695716SQ20108004097公開日2012年9月26日申請日期2010年7月12日優(yōu)先權日2009年7月14日發(fā)明者久野敦,大倉隆司,安形高志,平林淳,成松久,曾我部萬紀,栂谷內(nèi)晶,梶裕之,池原讓,溝上雅史,田中靖人,雄長誠,鹿內(nèi)俊秀申請人:公立大學法人名古屋市立大學,獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術綜合研究所,獨立行政法人國立國際醫(yī)療研究中心