專利名稱：由三孢布拉霉菌發(fā)酵生產(chǎn)的天然β-胡蘿卜素或蕃茄紅素發(fā)酵液的樣品處理方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種發(fā)酵液的樣品處理方法，尤其是涉及一種由三孢布拉霉菌發(fā)酵生 產(chǎn)的天然β-胡蘿卜素或蕃茄紅素發(fā)酵液的樣品處理方法。
背景技術(shù)：
類胡蘿卜素(包括β-胡蘿卜素、番茄紅素、葉黃素等)具有增強(qiáng)免疫、抗氧化等 多種重要的生理作用。其中，胡蘿卜素是一種廣泛存在的脂溶性類胡蘿卜素，與人體的 健康密切相關(guān)，不僅具有抗癌、抗氧化、抗輻射等很高的藥用價(jià)值，而且在人和動(dòng)物體內(nèi)可 轉(zhuǎn)化為維生素Α，是人體必需的維生素A的重要來源。因此，胡蘿卜素已被作為食品添 加劑添加于各種食品中起色素和營養(yǎng)強(qiáng)化劑作用，聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)和世界衛(wèi)生組織 (WHO)食品添加劑委員會(huì)一致推薦并認(rèn)定胡蘿卜素為A類營養(yǎng)色素。另外，其中的蕃茄 紅素是胡蘿卜素的異構(gòu)體，由于它沒有胡蘿卜素中的芷香環(huán)結(jié)構(gòu)，不具有維生素A 原活性，但它具有很強(qiáng)的抗氧化、防紫外線輻射等功能，是目前自然界發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的抗氧化 劑之一。二者不僅對(duì)前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌等癌細(xì)胞具有抑制作用，而且對(duì)血管硬化和 冠心病均有防治作用，因而在食品、化妝品以及醫(yī)藥領(lǐng)域具有重要用途?，F(xiàn)胡蘿卜素和 番茄紅素已被廣泛用作食品添加劑、醫(yī)藥原料，或者被制成功能性食品。絲狀真菌三孢布拉霉菌(Blakesleatrispora)是國際公認(rèn)的實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)天 然胡蘿卜素、蕃茄紅素的優(yōu)良菌種?，F(xiàn)已知該發(fā)酵菌菌株有正、負(fù)兩種，一種為誘導(dǎo)菌， 另一種為生產(chǎn)菌，當(dāng)在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)48小時(shí)時(shí)，會(huì)形成2 4厘米的不均勻菌 斑，正菌株和負(fù)菌株只是在培養(yǎng)和形態(tài)上稍微有差異，正菌株菌絲呈灰色，負(fù)菌株菌絲呈黃 色到褐色。但由于它所生產(chǎn)的胡蘿卜素和蕃茄紅素均為胞內(nèi)產(chǎn)物，所以在樣品檢測(cè)之 前通常要采用菌體研磨提取或高速勻漿機(jī)勻漿浸泡，所用溶劑毒性大，且容易造成提取不 完全。本發(fā)明在對(duì)本公司三孢布拉霉菌生產(chǎn)的β -胡蘿卜素和蕃茄紅素發(fā)酵液研究的 基礎(chǔ)上，開發(fā)了一種胡蘿卜素和蕃茄紅素的樣品處理方法，此方法快速簡(jiǎn)便、提取效率
尚ο

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種工藝流程短、提取效率高 的三孢布拉霉菌發(fā)酵生產(chǎn)的天然胡蘿卜素、蕃茄紅素發(fā)酵液的樣品處理方法。根據(jù)本發(fā)明的一方面，本發(fā)明提供了一種由三孢布拉霉菌發(fā)酵生產(chǎn)的天然胡 蘿卜素或蕃茄紅素發(fā)酵液的樣品處理方法，所述樣品處理方法包括以下步驟(1)定量吸取所述發(fā)酵液置于聚塑試管中，并在-10°C以下冷凍；(2)自然融解步驟(1)中冷凍后的發(fā)酵液，加入定量水，20khz頻率以上超聲波處 理，離心，棄上清液；
3
(3)向步驟(2)中離心后的發(fā)酵液中加入無水乙醇，離心，棄上清液；(4)向步驟(3)中離心后的發(fā)酵液中加入乙酸乙酯，45 80°C浸泡，用于定容過濾 檢測(cè)。最好，步驟(1)中將裝有發(fā)酵液的聚塑試管在-10°C以下冷凍至少1小時(shí)，其中，聚 塑試管的容積為15ml。最好，步驟(1)中將裝有發(fā)酵液的聚塑試管在-10 -33°C冷凍1 24小時(shí)。最好，步驟(2)中使用所述超聲波處理加水后的發(fā)酵液5 25分鐘。最好，步驟(2)中將超聲波處理后的發(fā)酵液在3000 5000rpm離心10分鐘。最好，步驟(2)中融解后的發(fā)酵液的加水量與步驟(1)中定量吸取的所述發(fā)酵液 體積比為1 5 10。最好，步驟(3)中所述無水乙醇與步驟(2)中離心后的發(fā)酵液體積比為1 5 10。最好，步驟(3)中將添加無水乙醇后的發(fā)酵液在3000 5000rpm離心10分鐘。最好，步驟(4)中所述乙酸乙酯與步驟(3)中離心后的發(fā)酵液體積比為1 5 10。最好，步驟(4)中將加入乙酸乙酯后的溶液在45 80°C浸泡15 50分鐘。本發(fā)明提供的三孢布拉霉菌發(fā)酵生產(chǎn)的天然β -胡蘿卜素、蕃茄紅素發(fā)酵液的樣 品處理方法，通過將發(fā)酵液冷凍和超聲破碎細(xì)胞后用無水乙醇脫水，再用乙酸乙酯加熱浸 泡的方法處理胡蘿卜素和蕃茄紅素的發(fā)酵液樣品，與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下有益效 果本發(fā)明的處理方法工藝流程短，快速簡(jiǎn)便、過程易于控制，樣品浸泡完全，提取效率高， 并且處理過程中使用的溶劑毒性較小。
具體實(shí)施例方式下面將通過本發(fā)明的具體實(shí)施例來進(jìn)一步詳細(xì)闡述本發(fā)明，但實(shí)施例不是對(duì)本發(fā) 明的限制。實(shí)施例采用同一罐批胡蘿卜素發(fā)酵液進(jìn)行樣品處理比較，蕃茄紅素實(shí)施例 樣品比較也為同一罐批發(fā)酵液?，F(xiàn)有條件實(shí)施例分別精確吸取2ml β-胡蘿卜素發(fā)酵液和蕃茄紅素發(fā)酵液放入50ml聚塑試管中， 加入20ml溶液(5ml吡啶用氯仿稀釋至1000ml)。用勻漿機(jī)(從最小速度逐漸增加至最大速 度15000rpm)勻漿3分鐘，用15ml+15ml丙酮洗滌器具(包括勻漿機(jī))兩次，一同并入50ml 聚塑試管中，將聚塑試管放在水平搖床上240rpm振搖60分鐘后將該試管中所有液體轉(zhuǎn)入 IOOml容量瓶，用丙酮洗滌原試管并定容。β-胡蘿卜素樣品定容過濾稀釋后用455nm波 長分光光度檢測(cè)，β-胡蘿卜素發(fā)酵水平分別為2728，2804，2756，平均2763μ g/ml。同理， 按上述方法，蕃茄紅素樣品定容過濾后用HPLC檢測(cè)，蕃茄紅素發(fā)酵水平分別為1032、1058、 1087，平均為 1059μ g/mL·實(shí)施例1定量吸取Iml三孢布拉霉菌發(fā)酵的β -胡蘿卜素發(fā)酵液至15ml聚塑試管中，吸取 三份；定量吸取Iml三孢布拉霉菌發(fā)酵的蕃茄紅素發(fā)酵液至15ml聚塑試管中，吸取三份。將 試管分別置于-10°C冰箱冷凍1小時(shí)，取出自然融解，加入IOml水超聲處理5分鐘，3000rpm離心10分鐘，棄上清，加入5ml無水乙醇，3000rpm離心10分鐘，棄上清，加入5ml乙酸乙酯 45°C浸泡50分鐘，β-胡蘿卜素樣品定容過濾稀釋后用455nm波長分光光度檢測(cè)，β-胡蘿 卜素發(fā)酵水平分別為2920，2840，3000，平均2920 μ g/ml。蕃茄紅素樣品定容過濾后用HPLC 檢測(cè)，蕃茄紅素發(fā)酵水平分別為1148、1132、1086，平均為1122μβ/πι1。實(shí)施例2定量吸取Iml三孢布拉霉菌發(fā)酵的β-胡蘿卜素發(fā)酵液至15ml聚塑試管中，吸 取三份；定量吸取Iml三孢布拉霉菌發(fā)酵的蕃茄紅素發(fā)酵液至15ml聚塑試管中，吸取三 份。將試管分別置于-10°C冰箱冷凍1小時(shí)，取出自然融解，加入IOml水超聲處理25分 鐘，5000rpm離心10分鐘，棄上清，加入IOml無水乙醇，5000rpm離心10分鐘，棄上清，加入 IOml乙酸乙酯45°C浸泡40分鐘，β -胡蘿卜素樣品定容過濾稀釋后用455nm波長分光光 度檢測(cè)，β-胡蘿卜素發(fā)酵水平分別為2884，3020，2926，平均2943yg/ml。蕃茄紅素樣品 定容過濾后用HPLC檢測(cè)，蕃茄紅素發(fā)酵水平分別為1157、1179、1084，平均為1140μ g/ml。實(shí)施例3定量吸取Iml三孢布拉霉菌發(fā)酵的β -胡蘿卜素發(fā)酵液至15ml聚塑試管中，吸取 三份；定量吸取Iml三孢布拉霉菌發(fā)酵的蕃茄紅素發(fā)酵液至15ml聚塑試管中，吸取三份。將 試管分別置于_18°C冰箱冷凍1小時(shí)，取出自然融解，加入IOml水超聲處理5分鐘，5000rpm 離心10分鐘，棄上清，加入5ml無水乙醇，5000rpm離心10分鐘，棄上清，加入IOml乙酸乙 酯65°C浸泡25分鐘，β-胡蘿卜素樣品定容過濾稀釋后用455nm波長分光光度檢測(cè)，β-胡 蘿卜素發(fā)酵水平分別為2966，3040，2984，平均2997yg/ml。蕃茄紅素樣品定容過濾后用 HPLC檢測(cè)，蕃茄紅素發(fā)酵水平分別為1159、1156、1213，平均為1176 μ g/ml。實(shí)施例4定量吸取Iml三孢布拉霉菌發(fā)酵的β-胡蘿卜素發(fā)酵液至15ml聚塑試管中，吸 取三份；定量吸取Iml三孢布拉霉菌發(fā)酵的蕃茄紅素發(fā)酵液至15ml聚塑試管中，吸取三 份。將試管分別置于_18°C冰箱冷凍24小時(shí)，取出自然融解，加入IOml水超聲處理5分 鐘，3000rpm離心10分鐘，棄上清，加入IOml無水乙醇，3000rpm離心10分鐘，棄上清，加入 IOml乙酸乙酯80°C浸泡25分鐘，β -胡蘿卜素樣品定容過濾稀釋后用455nm波長分光光 度檢測(cè)，β-胡蘿卜素發(fā)酵水平分別為3012，2980，2944，平均2979 μ g/ml。蕃茄紅素樣品 定容過濾后用HPLC檢測(cè)，蕃茄紅素發(fā)酵水平分別為1174、1167、1139，平均為1160 μ g/ml。實(shí)施例5定量吸取Iml三孢布拉霉菌發(fā)酵的β -胡蘿卜素發(fā)酵液至15ml聚塑試管中，吸 取三份；定量吸取Iml三孢布拉霉菌發(fā)酵的蕃茄紅素發(fā)酵液至15ml聚塑試管中，吸取三 份。將試管分別置于_33°C冰箱冷凍10小時(shí)，取出自然融解，加入IOml水超聲處理5分鐘， 3000rpm離心10分鐘，棄上清，加入5ml無水乙醇，3000rpm離心10分鐘，棄上清，加入IOml 乙酸乙酯80°C浸泡15分鐘，β-胡蘿卜素樣品定容過濾稀釋后用455nm波長分光光度檢 測(cè)，β-胡蘿卜素發(fā)酵水平分別為3016，3004，2976，平均2999yg/ml。蕃茄紅素樣品定容 過濾后用HPLC檢測(cè)，蕃茄紅素發(fā)酵水平分別為1183、1203、1175，平均為1188 μ g/ml。實(shí)施例6定量吸取Iml三孢布拉霉菌發(fā)酵的β -胡蘿卜素發(fā)酵液至15ml聚塑試管中，吸取 三份；定量吸取Iml三孢布拉霉菌發(fā)酵的蕃茄紅素發(fā)酵液至15ml聚塑試管中，吸取三份。
5將試管分別置于_33°C冰箱冷凍24小時(shí)，取出自然融解，加入IOml水超聲處理25分鐘， 3000rpm離心10分鐘，棄上清，加入5ml無水乙醇，3000rpm離心10分鐘，棄上清，加入5ml 乙酸乙酯45°C浸泡50分鐘，β-胡蘿卜素樣品定容過濾稀釋后用455nm波長分光光度檢 測(cè)，β-胡蘿卜素發(fā)酵水平分別為2972，2960，3000，平均2977 μ g/ml。蕃茄紅素樣品定容 過濾后用HPLC檢測(cè)，蕃茄紅素發(fā)酵水平分別為1139、1156、1203，平均為1166μ g/ml。實(shí)施例7定量吸取2ml三孢布拉霉菌發(fā)酵的β -胡蘿卜素發(fā)酵液至15ml聚塑試管中，吸取 三份；定量吸取2ml三孢布拉霉菌發(fā)酵的蕃茄紅素發(fā)酵液至15ml聚塑試管中，吸取三份。將 試管分別置于-10°C冰箱冷凍1小時(shí)，取出自然融解，加入IOml水超聲處理5分鐘，3000rpm 離心10分鐘，棄上清，加入IOml無水乙醇，3000rpm離心10分鐘，棄上清，加入IOml乙酸乙 酯45°C浸泡40分鐘，β-胡蘿卜素樣品定容過濾稀釋后用455nm波長分光光度檢測(cè)，β-胡 蘿卜素發(fā)酵水平分別為2956，2968，2896，平均2940yg/ml。蕃茄紅素樣品定容過濾后用 HPLC檢測(cè)，蕃茄紅素發(fā)酵水平分別為1135、1158、1097，平均為lUOyg/ml。實(shí)施例8定量吸取2ml三孢布拉霉菌發(fā)酵的β -胡蘿卜素發(fā)酵液至15ml聚塑試管中，吸 取三份；定量吸取2ml三孢布拉霉菌發(fā)酵的蕃茄紅素發(fā)酵液至15ml聚塑試管中，吸取三 份。將試管分別置于_33°C冰箱冷凍10小時(shí)，取出自然融解，加入IOml水超聲處理25分 鐘，5000rpm離心10分鐘，棄上清，加入IOml無水乙醇，5000rpm離心10分鐘，棄上清，加入 IOml乙酸乙酯80°C浸泡20分鐘，β -胡蘿卜素樣品定容過濾稀釋后用455nm波長分光光 度檢測(cè)，β-胡蘿卜素發(fā)酵水平分別為2996，3008，2984，平均2996 μ g/ml。蕃茄紅素樣品 定容過濾后用HPLC檢測(cè)，蕃茄紅素發(fā)酵水平分別為1167、1138、1159，平均為1155μ g/ml。實(shí)施例9定量吸取2ml三孢布拉霉菌發(fā)酵的β-胡蘿卜素發(fā)酵液至15ml聚塑試管中，吸 取三份；定量吸取2ml三孢布拉霉菌發(fā)酵的蕃茄紅素發(fā)酵液至15ml聚塑試管中，吸取三 份。將試管分別置于_18°C冰箱冷凍3小時(shí)，取出自然融解，加入IOml水超聲處理10分 鐘，4000rpm離心10分鐘，棄上清，加入IOml無水乙醇，4000rpm離心10分鐘，棄上清，加入 IOml乙酸乙酯60°C浸泡30分鐘，β -胡蘿卜素樣品定容過濾稀釋后用455nm波長分光光 度檢測(cè)，β-胡蘿卜素發(fā)酵水平分別為3008，2976，2952，平均2979 μ g/ml。蕃茄紅素樣品 定容過濾后用HPLC檢測(cè)，蕃茄紅素發(fā)酵水平分別為1184、1146、1173，平均為1168μ g/ml。需要聲明的是，上述發(fā)明內(nèi)容及具體實(shí)施方式
意在證明本發(fā)明所提供技術(shù)方案的 實(shí)際應(yīng)用，不應(yīng)解釋為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。本領(lǐng)域技術(shù)人員在本發(fā)明的精神和原理 內(nèi)，當(dāng)可作各種修改、等同替換、或改進(jìn)。本發(fā)明的保護(hù)范圍以所附權(quán)利要求書為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
一種由三孢布拉霉菌發(fā)酵生產(chǎn)的天然β 胡蘿卜素或蕃茄紅素發(fā)酵液的樣品處理方法，其特征在于，所述樣品處理方法包括以下操作步驟(1)定量吸取所述發(fā)酵液置于聚塑試管中，并在 10℃以下冷凍；(2)自然融解步驟(1)中冷凍后的發(fā)酵液，加入定量水，20khz頻率以上超聲波處理，離心，棄上清液；(3)向步驟(2)中離心后的發(fā)酵液中加入無水乙醇，離心，棄上清液；(4)向步驟(3)中離心后的發(fā)酵液中加入乙酸乙酯，45～80℃浸泡，用于定容過濾檢測(cè)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的樣品處理方法，其特征在于，步驟(1)中將裝有發(fā)酵液的聚塑 試管在-10°C以下冷凍至少1小時(shí)，其中，聚塑試管的容積為15ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的樣品處理方法，其特征在于，步驟(1)中將裝有發(fā)酵液的聚塑 試管在-10 -33°c冷凍1 24小時(shí)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的樣品處理方法，其特征在于，步驟(2)中使用所述超聲波處理 加水后的發(fā)酵液5 25分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的樣品處理方法，其特征在于，步驟(2)中將超聲波處理后 的發(fā)酵液在3000 5000rpm離心10分鐘。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的樣品處理方法，其特征在于，步驟(2)中融解后的發(fā)酵液的加 水量與步驟(1)中定量吸取的所述發(fā)酵液體積比為1 5 10。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的樣品處理方法，其特征在于，步驟(3)中所述無水乙醇與步驟(2)中離心后的發(fā)酵液體積比為1 5 10。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的樣品處理方法，其特征在于，步驟(3)中將添加無水乙醇后的 發(fā)酵液在3000 5000rpm離心10分鐘。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的樣品處理方法，其特征在于，步驟(4)中所述乙酸乙酯與步驟(3)中離心后的發(fā)酵液體積比為1 5 10。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的樣品處理方法，其特征在于，步驟(4)中將加入乙酸乙酯后 的溶液在45 80°C浸泡15 50分鐘。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種由三孢布拉霉菌發(fā)酵生產(chǎn)的天然β-胡蘿卜素或蕃茄紅素發(fā)酵液的樣品處理方法，所述樣品處理方法包括以下步驟定量吸取發(fā)酵液置于聚塑試管中，將其在-10℃以下冷凍；自然解凍發(fā)酵液，加定量水，超聲處理，離心，棄上清液；向上述離心后的發(fā)酵液中加無水乙醇，離心，棄上清液；再加乙酸乙酯，45～80℃浸泡，定容過濾后送樣檢測(cè)。本發(fā)明工藝流程短，過程易于控制，樣品浸泡完全，提取效率高，且使用溶劑毒性小，適于三孢布拉霉菌發(fā)酵生產(chǎn)的天然β-胡蘿卜素、蕃茄紅素發(fā)酵液的樣品處理。
文檔編號(hào)C07C7/00GK101955455SQ200910158159
公開日2011年1月26日 申請(qǐng)日期2009年7月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月14日
發(fā)明者吳亞銘, 潘晨曉, 陳迎迎 申請(qǐng)人:浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠