專利名稱：一種使用聚酰胺氫鍵吸附色譜分離純化胸腺五肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種胸腺五肽的分離方法，具體的是涉及一種使用聚酰胺氫鍵吸附色 譜分離純化胸腺五肽的方法。
背景技術(shù)：
胸腺五肽(TP5)是一種人工合^g多肽，其氨基酸順序和結(jié)構(gòu)與胸腺生成素(TP) 中第32-36位的氨基酸組成相同，它的基本序列為H-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr - OH。 胸腺五肽是胸腺生成素的重要功能活性部分，具有與其相似的生物活性。TP5能夠誘 導T細胞分化，促進T淋巴細胞亞群發(fā)育并活化，對機體的免疫功能具有雙向調(diào)節(jié)作用， 能使過高或過低的免疫反應(yīng)趨向正常。動物實驗和臨床研究證明胸腺五肽對免疫功能 低下和自身免疫病患者的免疫功能具有重要的調(diào)節(jié)作用。目前，胸腺五肽在臨床上主 要應(yīng)用于免疫缺陷、自身免疫性疾病、傳染病、腫瘤和艾滋病等疾病。
胸腺五肽的合成包括液相合成法和固相合成法兩種。在TP5液相合成過程中，由 于每次接肽后都需要對產(chǎn)物進行分離純化或結(jié)晶以便除去未反應(yīng)的原料和副產(chǎn)物
(申請?zhí)?31343554)，這增加了操作步驟和復雜性，并導致最終收率較低，因此， 胸腺五肽的合成多采用固相合成法。傳統(tǒng)的胸腺五肽固相合成法是利用Merrifidd樹脂 和叔丁氧羰基保護的酪氨酸反應(yīng)生成酪氨酸樹脂，以此為起始原料，依次保護纈氨酸、 天冬氨酸、賴氨酸和精氨酸起縮合反應(yīng)，生成保護TP5樹脂，在用液態(tài)氟化氫將其從 樹脂上脫除以獲得胸腺五肽粗品。但是由于該方法采用液態(tài)氟化氫作為作為TP5樹脂 的脫除劑，使得反應(yīng)條件苛刻且較為危險，因而人們在此基礎(chǔ)上進行了一些改進，如 用溴乙酰胺樹脂(Int. J. Peptide Protein Res. 28,1986,22-28)或wang樹脂 (CN1534042A)作為新的固相載體進行合成以獲得大量的胸腺五肽粗品。
但是，合成所得的胸腺五肽粗品中還含有部分雜質(zhì)，因此仍需純化后才能應(yīng)用于 臨床治療。作為化學合成多肽，胸腺五肽的分離純化方法以離子交換色譜法和反相液 相色譜法為主。 一些研究者采用離子交換凝膠SPSepharoseFF，在pH4.4的醋酸緩沖體 系中分離TP5，經(jīng)HPLC檢測純度為98.23M，純化收率為67.03% (南京工業(yè)大學學報， 2005， 27 (2) : 13-17.)另外，也有研究者采用C18柱，以三乙胺磷酸甲醇體系作為
3流動相進行分離。隨后用sephadexG25柱脫鹽后獲得的純度在90。/。以上，回收率也相對 較高(CN1733797A)。這些方法存在分離介質(zhì)價格昂貴、擔載量低、分離設(shè)備要求 高等缺點，尤其是RP-HPLC大規(guī)模分離多肽時，會產(chǎn)生大量的有機溶劑，既是影響環(huán) 保，又增加后處理成本。另有研究者采用離子交換、納濾和結(jié)晶相結(jié)合的工藝進行分 離，純化后TP5的純度為99.12M，但由于操作步驟較多，其最終收率僅為48.35% (高 ?；瘜W工程學報，2008， 22 (4) : 709-713)。因此，仍需一種成本合算且操作簡單 的胸腺五肽純化工藝。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明方法針對目前純化工藝中所存在的純化效率和回收率低以及純化成本較高 等諸多問題，通過聚酰胺氫鍵吸附色譜一步分離純化獲得較高純度的胸腺五肽。 本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的。
本發(fā)明提供一種使用聚酰胺氫鍵吸附色譜分離純化胸腺五肽的方法，具體步驟如
下
1) 胸腺五肽合成物離心去除可見顆粒物；
2) 取聚酰胺粉末，加入95%乙醇于室溫110轉(zhuǎn)/分鐘振蕩洗錄40-50分鐘，傾出95% 乙醇，用水洗至無醇味，再分別用5%氫氧化鈉溶液及30%乙酸溶液按相同方法 洗滌，最后用20%乙醇洗滌，裝柱平衡至初始流動相，采用干法或濕法裝填成柱；
3) 聚酰胺氫鍵吸附色譜流動相包括水，乙醇-水，乙醇-乙酸-水，乙醇-三氟乙酸-水， 甲醇-水，甲醇-乙酸-水，甲醇-三氟乙酸-水，乙腈-水，乙腈-乙酸-水，乙腈-三氟 乙酸-水等體系，采用不同溶劑配比；流動相超聲脫氣或真空脫氣10-30 min，室 溫靜置0.5-1 h;
4) 洗脫方式包括等度洗脫、線性梯度洗脫和分步洗脫；
5) 采用初始流動相平衡聚酰胺色譜柱兩個柱體積，線性流速0.1-10 ml/min，紫外檢 測器210-280 nm或采用示差檢測器在線監(jiān)測，自動收集餾分；
6) 將步驟8)收集的餾分干燥后用C18分析柱檢測純度，并計算回收率。 本發(fā)明提供了一種使用聚酰胺色譜分離胸腺五肽的方法，該方法與現(xiàn)有技術(shù)相比
具有以下優(yōu)勢 一步分離可獲得較高純度的胸腺五肽，回收率高；工藝過程操作簡單， 成本低；介質(zhì)對粗樣品耐受強，樣品載量高，介質(zhì)可多次重復利用，易于規(guī)模放大， 生物安全性好。


圖1.聚酰胺色譜分離化學合成胸腺五肽的色譜圖
圖2.聚酰胺色譜分離從豬腦垂體后葉提取的胸腺五肽的色譜圖
具體實施例方式
實施例l、使用聚酰胺色譜分離固相合成的胸腺五肽
1) 胸腺五肽溶液的制備稱取10mg固相合成的胸腺五肽粗品，將其溶于lml水中 配制成10 mg/ml的胸腺五肽溶液，離心去除顆粒物；
2) 取300目聚酰胺粉末，加入95%乙醇于室溫110轉(zhuǎn)/分鐘振蕩洗滌40-50分鐘，傾 出95%乙醇，用水洗至無醇味，再分別用5%氫氧化鈉溶液及30%乙酸溶液按相 同方法洗滌，最后用20%乙醇洗滌，裝柱平衡至初始流動相，釆用干法或濕法裝 填成柱；
3) 聚酰胺介質(zhì)濕法裝柱，層析柱內(nèi)徑16 mm，裝填高度250 mm，接入Akta Prime Plus 層析系統(tǒng)，壓力限2.5MPa，層析柱用流動相平衡2個柱床體積；
4) 步驟l)制備好的胸腺五肽溶液，通過自動進樣閥進樣lml;
5) 等度洗脫，流速為0.8 ml/min，紫外檢測器280 nm監(jiān)測，收集洗脫峰；
6) 聚酰胺色譜分離胸腺五肽的譜圖如圖1所示，分別收集各個洗脫峰，凍干后重新 溶解，經(jīng)RP-HPLC (C18柱)檢測，其中所標示的峰為聚酰胺色譜峰，其純度 大于95%,收率大于90%。
實施例2、使用聚酰胺色譜分離豬腦垂體后葉提取的胸腺五肽
1) 胸腺五肽溶液的制備量取lml濃縮過的豬腦垂體后葉提取的胸腺五肽，經(jīng)0.45 pm濾膜過濾后備用，離心去除顆粒物；
2) 取400目聚酰胺粉末，加入95%乙醇于室溫110轉(zhuǎn)/分鐘振蕩洗滌40-50分鐘，傾 出95%乙醇，用水洗至無醇味，再分別用5%氫氧化鈉溶液及30%乙酸溶液按相 同方法洗滌，最后用20%乙醇洗滌，裝柱平衡至初始流動相，采用干法或濕法裝 填成柱；
3) 聚酰胺介質(zhì)濕法裝柱，層析柱內(nèi)徑16 mm，裝填高度250 mm，接入Akta Prime Plus 層析系統(tǒng)，壓力限2.5MPa，層析柱用流動相平衡2個柱床體積；
4) 步驟l)制備好的胸腺五肽溶液，通過自動進樣閥進樣lml;5) 等度洗脫，流速為1.0ml/min，紫外檢測器280 nm監(jiān)測，收集洗脫峰；
6) 聚酰胺色譜分離胸腺五肽的譜圖如圖2所示，分別收集各個洗脫峰，凍干后重新 溶解，經(jīng)RP-HPLC (C18柱)檢測，其中所標示的峰為聚酰胺色譜峰，其純度 大于95%，收率大于85%。
權(quán)利要求
1、一種使用聚酰胺色譜法分離胸腺五肽的方法，利用聚酰胺介質(zhì)與胸腺五肽及其混合物中雜質(zhì)之間吸附作用的差異，對不同來源的胸腺五肽進行純化。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述使的使用聚酰胺色譜分離胸腺五肽的方法，其包括如下的 步驟1) 胸腺五肽溶液的制備稱取10mg固相合成的胸腺五肽粗品，將其溶于lml水中 配制成10 mg/ml的胸腺五肽溶液，離心去除顆粒物；2) 取300目聚酰胺粉末，加入95%乙醇于室溫110轉(zhuǎn)/分鐘振蕩洗滌40-50分鐘，傾 出95%乙醇，用水洗至無醇味，再分別用5%氫氧化鈉溶液及30%乙酸溶液按相 同方法洗滌，最后用20%乙醇洗滌，裝柱平衡至初始流動相，采用干法或濕法裝 填成柱；3) 聚酰胺介質(zhì)濕法裝柱，層析柱內(nèi)徑16 mm，裝填高度250 mm，接入Akta Prime Plus 層析系統(tǒng)，壓力限2.5MPa，層析柱用流動相平衡2個柱床體積；4) 步驟l)制備好的胸腺五肽溶液，'通過自動進樣閥進樣1 ml;5) 等度洗脫，流速為0.8 ml/min,紫外檢測器280 nm監(jiān)測，收集洗脫峰；6) 聚酰胺色譜分離胸腺五肽的譜圖如圖1所示，分別收集各個洗脫峰，凍干后重新 溶解，經(jīng)RP-HPLC (C18柱)檢測，其中所標示的峰為聚酰胺色譜峰，其純度 大于95%，收率大于90%。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種使用聚酰胺氫鍵吸附色譜分離純化胸腺五肽的方法。該方法根據(jù)聚酰胺介質(zhì)對胸腺五肽及其混合物中雜質(zhì)吸附作用的差異，針對目前純化工藝中所存在的純化效率低、回收率低、以及純化成本高等諸多問題，通過聚酰胺色譜一步分離了獲得較高純度的胸腺五肽。提供了一種純度較高，回收率高，成本低，樣品載量高，對粗樣品耐受強，工藝簡單，易于規(guī)模放大的胸腺五肽分離純化方法。
文檔編號C07K7/00GK101643498SQ20091008756
公開日2010年2月10日 申請日期2009年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月30日
發(fā)明者孟桂鳳, 邢思亮 申請人:北京康銘優(yōu)盛生化技術(shù)有限公司