專利名稱：一種rna性質(zhì)egs的化學(xué)修飾方法及其在制備抗病毒藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及核酸分子在基因治療領(lǐng)域的應(yīng)用，具體涉及一種RNA性質(zhì) EGS的化學(xué)修飾方法及其在制備抗病毒藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
RNaseP是廣泛存在于各種細(xì)胞內(nèi)的一種核蛋白復(fù)合體，它可以在體內(nèi)特 異性的剪切tRNA前體(ptRNA)的5'末端，形成成熟的tRNA。 RNase P具 有識(shí)別底物二級(jí)結(jié)構(gòu)而非識(shí)別底物核苷酸序列這一特點(diǎn)，因此只要兩個(gè)RNA 分子形成類似于ptRNA分子結(jié)構(gòu)的復(fù)合物，即可被RNase P識(shí)別并切割。
能夠引導(dǎo)RNase P識(shí)別耙mRNA上的切割位點(diǎn)的RNA分子被稱為外部引 導(dǎo)序列(External Guide S叫uences， EGSs)。理論上說，只要耙mRNA上存在 RNase P潛在的切割位點(diǎn)，那么使用適合的EGS與靶mRNA上潛在的切割位 點(diǎn)互補(bǔ)，即可引導(dǎo)RNase P對(duì)復(fù)合物中耙mRNA進(jìn)行特異性切割，從而能夠 沉默靶基因的表達(dá)。
EGS分子能夠介導(dǎo)RNase P核酶特異地沉默目的基因的表達(dá)，因此EGS 分子成為藥物研發(fā)的熱點(diǎn)。
EGS是一種核酸分子，與RNA干涉分子等一樣要有效地解決其在機(jī)體內(nèi) 的穩(wěn)定性問題，以希望在一定范圍內(nèi)有效地抑制靶基因的表達(dá)，因此尋求一種 能夠提高EGS分子在體內(nèi)半衰期、而又不影響其活性的策略是非常必要的。
為了提高EGS分子在體內(nèi)的穩(wěn)定性，磷酸化修飾、甲基化修飾等化學(xué)修 飾的方式已經(jīng)被運(yùn)用到EGS分子的修飾中，但這些修飾方式存在較大的毒性，同時(shí)不能提高體內(nèi)細(xì)胞對(duì)核酸分子的吸收。
現(xiàn)有報(bào)道對(duì)siRNA分子進(jìn)行膽固醇修飾后可以提高其血清穩(wěn)定性，同時(shí) 增加了細(xì)胞對(duì)其的吸收效率。目前尚未有對(duì)EGS分子進(jìn)行膽固醇修飾的相關(guān) 報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種對(duì)RNA性質(zhì)EGS進(jìn)行 修飾，且修飾后EGS的血清穩(wěn)定性提高，而基因沉默效率未受影響的化學(xué)修 飾方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供上述RNA性質(zhì)EGS化學(xué)修飾方法在制備抗 病毒藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的上述目的是通過如下方案予以實(shí)現(xiàn)的
一種RNA性質(zhì)EGS的化學(xué)修飾方法，該修飾方法是采用膽固醇對(duì)RNA 性質(zhì)EGS分子進(jìn)行修飾。
本發(fā)明人分別對(duì)RNA性質(zhì)EGS進(jìn)行3'末端和5'末端的膽固醇修飾，并 以未修飾的RNA性質(zhì)EGS分子為對(duì)照，采用熒光定量RT-PCR和western blot 等常用試驗(yàn)方法檢測(cè)修飾后RNA性質(zhì)EGS分子對(duì)耙基因的抑制效率，同時(shí)測(cè) 定修飾后的RNA性質(zhì)EGS分子血清穩(wěn)定性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RNA性質(zhì)EGS分子的 5'末端進(jìn)行膽固醇修飾后不僅不會(huì)影響EGS的基因沉默活性而且可提高EGS 在血清中的半衰期12倍以上，RNA性質(zhì)EGS分子的3，末端進(jìn)行膽固醇修飾 后EGS的基因沉默效率有所降低，因此本發(fā)明采用5'末端為最佳的膽固醇修 飾部位。
根據(jù)靶基因篩選得到RNA性質(zhì)EGS，通過化學(xué)合成方法對(duì)該EGS分子的5'末端進(jìn)行膽固醇修飾，膽固醇修飾后的EGS分子進(jìn)入機(jī)體后直接與靶基 因的核苷酸互補(bǔ)結(jié)合，形成被RNaseP核酶識(shí)別的底物分子，弓l導(dǎo)RNaseP對(duì) 靶基因的RNA進(jìn)行切割，從而有效沉默該靶基因的表達(dá)。
本發(fā)明的一種RNA性質(zhì)EGS的化學(xué)修飾方法可用于制備抗乙肝病毒、丙 肝病毒和人類巨細(xì)胞病毒等病毒性疾病的藥物。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果
1. 本發(fā)明的化學(xué)修飾方法其操作簡(jiǎn)單，而且修飾后的RNA性質(zhì)EGS分子 具有很好的血清穩(wěn)定性，尤其是在RNA性質(zhì)EGS的5'末端進(jìn)行膽固醇修飾可 提高EGS在血清中的半衰期12倍以上，從而使得修飾后的EGS能夠在一段 時(shí)間內(nèi)有效抑制靶基因的表達(dá)；
2. 本發(fā)明采用膽固醇修飾，從而使得被修飾的RNA性質(zhì)EGS分子可以 更加容易地透過細(xì)胞到達(dá)耙基因上，再加上RNaseP核酶對(duì)靶基因RNA的切 割是不可逆的，所以可以實(shí)現(xiàn)對(duì)特定耐藥基因的破壞；
3. 本發(fā)明在對(duì)RNA性質(zhì)EGS進(jìn)行膽固醇修飾后并不會(huì)影響EGS的沉默 基因效率，因此對(duì)于各種可采用EGS制備藥物進(jìn)行治療的疾病，都可采用本 發(fā)明的方法對(duì)其所用EGS進(jìn)行化學(xué)修飾，故而本發(fā)明的方法可用于治療各種 疾病的藥物研發(fā)和制備，尤其是病毒性疾病的藥物研發(fā)和生產(chǎn)，適于大規(guī)模的 醫(yī)藥學(xué)推廣。


圖1為熒光定量RT-PCR檢測(cè)未被修飾RNA性質(zhì)EGS對(duì)UL49基因mRNA 的抑制作用柱狀圖2為熒光定量RT-PCR檢測(cè)3'末端膽固醇修飾RNA性質(zhì)EGS對(duì)UL49基因mRNA的抑制作用柱狀圖3為熒光定量RT-PCR檢測(cè)5'末端膽固醇修飾RNA性質(zhì)EGS對(duì)UL49 基因mRNA的抑制作用柱狀圖4為Western blot檢測(cè)未被修飾RNA性質(zhì)EGS對(duì)UL49基因蛋白表達(dá) 的抑制結(jié)果電泳圖5為Western blot檢測(cè)3'末端膽固醇修飾RNA性質(zhì)EGS對(duì)UL49基因 蛋白表達(dá)的抑制結(jié)果電泳圖6為Western blot檢測(cè)5'末端膽固醇修飾RNA性質(zhì)EGS對(duì)UL49基因 蛋白表達(dá)的抑制結(jié)果電泳圖7為膽固醇修飾RNA性質(zhì)EGS血清穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)電泳其中，l為轉(zhuǎn)染試劑對(duì)照組，2為未被修飾RNA性質(zhì)EGS對(duì)照組，3為 突變對(duì)照組，4為無義對(duì)照組，5為陽性對(duì)照組，6為Hela對(duì)照組，7為3，末 端膽固醇修飾RNA修飾EGS實(shí)驗(yàn)組，8為5'末端膽固醇修飾RNA性質(zhì)EGS 實(shí)驗(yàn)組。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明，但具體實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做 任何限定。
實(shí)施例l RNA性質(zhì)EGS分子的膽固醇修飾
在現(xiàn)有的已公開EGS分子中，隨意選擇一種RNA性質(zhì)的EGS分子，本 實(shí)施例選擇能有沉默UL49基因的一種RNA性質(zhì)的EGS分子，然后送交合成 公司，分別合成在該EGS的3'末端加膽固醇和在該EGS分子5'末端加膽固醇 這兩組實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)合成未做任何修飾的該EGS分子作為對(duì)照組。實(shí)施例2 建立鑒定EGS作用效率的平臺(tái)
本實(shí)施例先利用載體克隆UL49基因，然后構(gòu)建可穩(wěn)定表達(dá)UL49的細(xì)胞系，實(shí)施例中所用載體、細(xì)胞系、酶以及各種試劑等均為市售產(chǎn)品，如載體可選擇pcDNA3.1(+)/myc質(zhì)粒，細(xì)胞系可選擇Hela細(xì)胞系，雙酶切可采用B"m///禾口勘/等。
1、 UL49基因的獲得
從已知序列基因組中PCR擴(kuò)增出UL49基因，如可選擇從AD169病毒株基因組中PCR擴(kuò)增UL49基因。
PCR反應(yīng)體系總體積為100 u 1: LA Taq酶1 u 1，反應(yīng)buffer 50 u 1， AD169基因組DNA模板5p1， UL49上游引物(核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示)5 ul， UL49下游引物(核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示)5 u 1，用滅菌蒸餾水補(bǔ)充至100 ul。
PCR反應(yīng)條件先95。C預(yù)處理3min，然后95°C 30 s， 60°C 45s， 72°C45s，共30個(gè)循環(huán)，再72。C 5min， 4°C 10min。
瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR結(jié)果后，凝膠回收純化UL49基因片段，這里的操作參考試劑盒說明書即可。
2、 構(gòu)建pcDNA3.l-UL49-myc質(zhì)粒
接種保存pcDNA3.1(+)/myc質(zhì)粒的菌株并擴(kuò)大培養(yǎng)后，采用市售質(zhì)粒抽提試劑盒，按照試劑盒說明抽提pcDNA3.1(+)/myc質(zhì)粒。
分別對(duì)上述pcDNA3.1(+)/myc質(zhì)粒和UL49基因進(jìn)行Baw///禾Q J^o /雙酶切，然后用T4 DNA連接酶連接UL49和pcDNA3.1(+)/myc載體的雙酶切片段，接著將DNA連接液轉(zhuǎn)化到DH5a大腸桿菌宿主菌中，在Amp+培養(yǎng)基挑克隆，并用PCR方法和&m/// 、 ^T7o/雙酶切鑒定重組子，測(cè)序結(jié)果說明已成功構(gòu)建pcDNA3.1-UL49-myc質(zhì)粒。這里所涉及的雙酶切、感受態(tài)細(xì)胞的制備、T4連接、連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a以及PCR鑒定和雙酶切鑒定等試驗(yàn)
均采用本領(lǐng)域人員所共知的通用方法。
3、穩(wěn)定表達(dá)UL49的HeLa細(xì)胞系的建立
本實(shí)施例根據(jù)pcDNA3.1 (+)/myc質(zhì)粒商品操作指南構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)UL49的Hda細(xì)胞系，作為驗(yàn)證EGS基因沉默效率的平臺(tái)。
a. 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的Hda細(xì)胞轉(zhuǎn)移到24孔板中，用無血清無抗生素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，在孔板中的細(xì)胞長(zhǎng)到50~80%后開始進(jìn)行轉(zhuǎn)染；
b. 取3 li g上述pcDNA3.1-UL49-myc質(zhì)粒，12 u 1轉(zhuǎn)染試劑PlusReagent和3 y 1脂質(zhì)體LipofectamineTMReagent，全部溶于400 U 1無血清無抗生素DMEM培養(yǎng)基中得到混合液；
c. 用無血清無抗生素DMEM清洗孔板中的Hda細(xì)胞，然后將上述混合液已每孔400 P 1的量加到孔板上，加樣完畢37。C處理5小時(shí)；
d. 洗去脂質(zhì)體，加入完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)；
e. 轉(zhuǎn)染48小時(shí)之后，往上述培養(yǎng)基中添加G418 (G418的濃度為800mg/ml)，三周后挑選具有抗G418的細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)基中添加200mg/ml的G418作為維持穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞培養(yǎng)之用。
實(shí)施例3 EGS沉默UL49基因表達(dá)
l.將實(shí)施例2得到的穩(wěn)定表達(dá)UL49的Hda細(xì)胞系在37°C、5% C02的條件下置于DMEM培養(yǎng)基(含100mg/ml青霉素、lOOmg/ml鏈霉素和200ml/mlG418)中培養(yǎng)；2. 轉(zhuǎn)染試劑采用市售Lipofectamine2000，按試劑盒操作指南，將實(shí)施例1制備的3'末端膽固醇修飾RNA性質(zhì)EGS、 5'末端膽固醇修飾RNA性質(zhì)EGS和未做任何修飾的RNA性質(zhì)EGS都以終濃度為2.5nM轉(zhuǎn)染上述Hela細(xì)胞。
3. 熒光定量RT-PCR檢測(cè)RNA性質(zhì)EGS對(duì)UL49基因mRNA的抑制作
用
轉(zhuǎn)染EGS 24小時(shí)后，收集細(xì)胞進(jìn)行RNA抽提，RNA抽提可采用Invitrogen公司的TRizol法，詳細(xì)的操作按說明書進(jìn)行。
利用Applied Biosystem's 7300系統(tǒng)進(jìn)行熒光定量RT-PCR檢測(cè)EGS對(duì)UL49基因mRNA的抑制作用，具體實(shí)驗(yàn)步驟如下
a. 先根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作說明，將上述TRizol法抽提的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA;
b. 采用TAKARA公司的SYBR熒光染料的定量PCR試劑盒(含ROX);UL49基因的上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO: 3所示；
UL49基因的下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO: 4所示；內(nèi)參(3-actin的上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO: 5所示；內(nèi)參P-actin的下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO: 6所示；熒光定量PCR的反應(yīng)體系以及反應(yīng)條件均可參考試劑盒中的操作說明。熒光定量RT-PCR檢測(cè)EGS對(duì)UL49基因mRNA的抑制作用，其結(jié)果可以通過圖l、圖2和圖3看出，5'末端膽固醇修飾RNA性質(zhì)EGS和未做任何修飾的RNA性質(zhì)EGS對(duì)mRNA的抑制作用非常顯著，在未被修飾的EGS作用下mRNA下降98%，在3'末端膽固醇修飾的RNA性質(zhì)EGS作用下mRNA下降8%，在5'末端膽固醇修飾的RNA性質(zhì)EGS作用下mRNA下降98%，由此可得出5'末端膽固醇修飾的RNA性質(zhì)EGS并不會(huì)影響EGS對(duì)靶基因 mRNA的抑制作用。
4. Western blot檢測(cè)RNA性質(zhì)EGS對(duì)UL49基因蛋白表達(dá)的抑制作用
轉(zhuǎn)染EGS 24小時(shí)之后收集Hela細(xì)胞作為蛋白樣品，并用PBS沖洗蛋白 樣品，然后將蛋白樣品和4X上樣緩沖液以3:1的體積比混合后，IO(TC水中煮 沸5min使蛋白質(zhì)變性。
采用Bio-Rad公司的微型垂直板電泳裝置制備凝膠，按說明書安裝好玻璃 板，并依次配制12%分離膠和5%濃縮膠制得凝膠板。凝膠板放入電泳槽后將 上述蛋白樣品點(diǎn)樣于凝膠板上，120V恒壓跑電泳，約90min后結(jié)束，接著參 照分子克隆指南的操作說明對(duì)該凝膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，恒壓15V，電轉(zhuǎn)移30min。
對(duì)轉(zhuǎn)移好的膜進(jìn)行封閉以及抗原抗體反應(yīng)均可參考教科書以及相關(guān)試劑 盒的操作說明進(jìn)行，抗原抗體反應(yīng)中， 一抗溶液為山羊抗myc IgG和山羊抗 Actin IgG，都用封閉液作1:500 (體積比)的稀釋， 一抗溶液的用量至少為 0.1ml/cm"莫面積，第二抗體采用辣根過氧化物酶標(biāo)記牛抗山羊IgG，并用封閉 液作1:4000 (體積比)的稀釋，二抗的用量也為0.1ml/cn^膜面積。
按照本領(lǐng)域通用做法對(duì)上述抗原抗體反應(yīng)的結(jié)果進(jìn)行發(fā)光顯影，如圖4、 圖5和圖6所示，5'末端膽固醇修飾RNA性質(zhì)EGS和未做任何修飾的RNA 性質(zhì)EGS對(duì)UL49基因的表達(dá)抑制作用非常顯著，在UL49基因蛋白處均未 有條帶顯示，在未被修飾的RNA性質(zhì)EGS作用下蛋白水平下降99。/。，在3' 末端膽固醇修飾的RNA性質(zhì)EGS作用下蛋白水平下降8°/。，在5'末端膽固醇 修飾的RNA性質(zhì)EGS作用下蛋白水平下降99%，由此可見，對(duì)RNA性質(zhì)EGS 的5'末端進(jìn)行膽固醇修飾并不會(huì)影響EGS對(duì)靶基因蛋白表達(dá)的抑制作用。實(shí)施例4膽固醇修飾對(duì)EGS穩(wěn)定性的影響
根據(jù)實(shí)施例3的檢測(cè)結(jié)果，對(duì)RNA性質(zhì)EGS進(jìn)行膽固醇修飾的最佳位點(diǎn) 是EGS的5'末端，因此本實(shí)施例對(duì)實(shí)施例1制備的5'末端膽固醇修飾RNA 性質(zhì)EGS和未被修飾RNA性質(zhì)EGS進(jìn)行血清穩(wěn)定性的測(cè)試。
本實(shí)施例采用T4 RNA連接酶將同位素P32分別標(biāo)記到未被修飾RNA性 質(zhì)EGS和5'末端膽固醇修飾RNA性質(zhì)EGS中，T4RNA連接酶和同位素P32 均為市售，試驗(yàn)操作可參考試劑說明進(jìn)行。
將上述標(biāo)記好的EGS分子分別加入到含15體積％小牛血清的DMEM培 養(yǎng)基中37。C孵育，分別在孵育到O、 2、 4、 8、 16、 24、 32、 40小時(shí)時(shí)，取出 樣品進(jìn)行SDS電泳，SDS電泳的操作按照本領(lǐng)域的常規(guī)方法即可，然后將跑 好的SDS膠放射自顯影，測(cè)定各時(shí)間段殘留的RNA，結(jié)果如圖7所示，未修 飾的EGS在2小時(shí)后檢測(cè)不到殘留，5末端膽固醇修飾后的EGS在24小時(shí)后 仍能檢測(cè)到EGS殘留，由此說明RNA性質(zhì)的EGS在采用本發(fā)明的膽固醇修 飾方法修飾后，其血清穩(wěn)定性得到了顯著的提高。一種RNA性質(zhì)EGS的化學(xué)修飾方法及其在制備抗病毒藥物中的應(yīng)用序列表 SEQUENCE LISTING
<110>暨南大學(xué)
<120〉一種RNA性質(zhì)EGS的化學(xué)修飾方法及其在制備抗病毒藥物中的應(yīng)用
<130〉
<160〉6
<170〉Patentln version 3.5
<210〉1
<211>37
<212>腿
〈213〉人工序列
〈400>1
aggcgaattc gccaccatgg ccagtcgtcg tctccga<210〉2
<211>27
<212>腿
〈213〉人工序列
<400>2
cggctcgagg acatggggca ggccgtg<210>3
<211>20
〈212〉眺
〈213〉人工序列
<400>3
cgttcttgcg tcct"tcatct<210>4
<211〉21
<212〉腿
<213〉人工序列
<400>4
cacaaagtag ggcttggtca t<210〉5
〈211〉23
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉 5
tcgtccaccg caaatgcttc tag 23
<210> 6
〈211〉 23
<212> DNA <213>人工序列
<400> 5
actgctgtca ccttcaccgt tec 23
1權(quán)利要求
1、一種RNA性質(zhì)EGS的化學(xué)修飾方法，其特征在于該修飾方法是采用膽固醇對(duì)RNA性質(zhì)EGS分子進(jìn)行修飾。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述化學(xué)修飾方法，其特征在于該修飾方法是對(duì)RNA 性質(zhì)EGS的5'末端進(jìn)行膽固醇修飾。
3、 權(quán)利要求1所述化學(xué)修飾方法在制備抗病毒性疾病藥物中的應(yīng)用。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述應(yīng)用，其特征在于所述抗病毒性疾病藥物是抗乙 肝病毒藥物、抗丙肝病毒藥物或抗人類巨細(xì)胞病毒藥物。
全文摘要
本發(fā)明公開一種RNA性質(zhì)EGS的化學(xué)修飾方法，該修飾方法是采用膽固醇對(duì)RNA性質(zhì)的EGS分子進(jìn)行修飾，優(yōu)選RNA性質(zhì)EGS的5’末端為最佳的膽固醇修飾部位。本發(fā)明可用于制備抗乙肝病毒、丙肝病毒和人類巨細(xì)胞病毒等病毒性疾病的藥物。本發(fā)明操作簡(jiǎn)單，且修飾后的EGS分子不但具有很好的血清穩(wěn)定性而且沉默基因效率并未受影響，對(duì)于各種可采用RNA性質(zhì)EGS制備藥物進(jìn)行治療的疾病，都可采用本發(fā)明的方法對(duì)其所用EGS進(jìn)行化學(xué)修飾，故而本發(fā)明的方法可用于治療各種疾病的藥物研發(fā)和制備，適于大規(guī)模的醫(yī)藥學(xué)推廣。
文檔編號(hào)C07H21/00GK101463057SQ20091003659
公開日2009年6月24日 申請(qǐng)日期2009年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月13日
發(fā)明者周天鴻, 曾志鋒, 李弘劍, 李月琴, 奕 鄒 申請(qǐng)人:暨南大學(xué)