專利名稱：：用于抑制金屬蛋白活性的抗體和含有所述抗體的藥物組合物的制作方法用于抑制金屬蛋白活性的抗體和含有所述抗體的藥物組合物發(fā)明領(lǐng)域和背景本發(fā)明涉及半抗原分子和可以用于抑制金屬蛋白(例如金屬蛋白酶)活性的針對所述半抗原的抗體，以及利用抗體治療與金屬蛋白活性異常有關(guān)的疾病(例如轉(zhuǎn)移癌)的方法?；|(zhì)金屬蛋白(匪P)是參與胞外基質(zhì)(ECM)重塑的關(guān)鍵酶。這些酶能夠破壞關(guān)節(jié)軟骨的多種結(jié)締組織組分或基底膜。人匪P基因家族由至少28種結(jié)構(gòu)上相關(guān)的蛋白質(zhì)組成(參見圖l)，它們共有類似的總體為球形的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)(圖2禾PBorkakoti，1998)。每種匪P均以無活性的潛在酶原分泌出來。催化性鋅結(jié)構(gòu)域(catalyticzincdomain)由大約180個(gè)氨基酸組成，其中高度保守序列HE-GH-LGL-H提供3個(gè)與金屬Zn(2+)離子結(jié)合的組氨酸(即H)殘基。酶原中催化性鋅離子的第四結(jié)合部位與半胱氨酸殘基結(jié)合(Morg皿ova等，1999)，它在酶激活時(shí)從活性部位解離出來(VanWart和Birkedal-Hansen，1990)。結(jié)果，活化匪P中的第四結(jié)合部位被一個(gè)水分子占據(jù)，該水分子還與保守的谷氨酸殘基以氫鍵連接。這個(gè)過程促使活化水分子水解靶底物的肽鍵。金屬蛋白酶不受控制地分解結(jié)締組織是許多病理病癥的特征，或許是由過度的匪P活性引起的，或者是由天然匪P組織抑制劑(TIMP)與匪P的比率失調(diào)引起。TIMP通過與匪P的活性鋅結(jié)合部位形成化學(xué)計(jì)量復(fù)合物來抑制匪P(Gomez等，1997;Henriet等，1999;Bode等，1999;Will等，1996)。當(dāng)T頂P水平不足時(shí)，ECM的進(jìn)行性緩慢降解可以在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Walakovits等，ArthritisRheum，35:35-42,1992)和骨關(guān)節(jié)炎(Dean等，J.Clin.Invest.84:678-685，1989)中導(dǎo)致軟骨基質(zhì)喪失，或者在骨質(zhì)疏松癥中導(dǎo)致骨基質(zhì)降解(Hill等，Biochem.J.308:167-175，1995)。在其它情況下，例如充血性心力衰竭，可能發(fā)生心臟ECM的快速降解(Armstrong等，CanadianJ.Cardiol.10:214-220，1994)。另夕卜，已知匪P在例如以下細(xì)胞因子和趨化因子成熟中起作用半乳凝素-3(0chiengJ.，Biochemistry,199433(47):14109-14)、纖溶酶原(Patterson,BC.，JBC，1997272(46):28823-5)、白介素-8、結(jié)締組織激活肽III、血小板因子-4(VandenSteen，2000BloocL2000年10月15日；96(8):2673-81)、白介素_1P前體(pro-interleukin-1P)(Schonbeck，1998)、白介素_2受體a鏈[Sheu，B.C，Hsu，S.M.，Ho，H.，Lien，H.C.，Huang，S.C.，Lin，R.H.Anovelroleofmetalloproteinaseincancer-mediatedimmunosuppression(金屬蛋白酶在癌癥介導(dǎo)的免疫抑制中的新作用)CancerResearch(2001)61，237-242]以及轉(zhuǎn)化生長因子-P前體(pro-transforminggrowthfactor-P)[TGF_P，Yu，Q.Stamenkovic，I.Cellsurface-localizedmatrixmetalloproteinase—9proteolyticallyactivatesTGF—betaandpromotestumorinvasionandangiogenesis(細(xì)胞表面定位的基質(zhì)金屬蛋白酶_9蛋白水解性激活TGF-P并促進(jìn)腫瘤侵襲和血管生成)GenesDev(2000)14，163-176]。還與匪P活性不受控制有關(guān)的其它病理病癥包括轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞ECM的快速重塑。在這種情況下，活化匪P由癌細(xì)胞或周圍組織表達(dá)。有相當(dāng)多的證據(jù)表明，匪P參與腫瘤的生長和擴(kuò)散(例如參見Davidson等，Chemistry&Industry,258-261，1997，以及其中的參考文獻(xiàn))。在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中，匪P被用于分解ECM，使得原發(fā)性腫瘤癌細(xì)胞侵入附近血管，在血管中被轉(zhuǎn)運(yùn)到不同器官中，并建立繼發(fā)性腫瘤。在這些繼發(fā)性部位的侵襲性生長是由匪P介導(dǎo)的，可破壞組織。另外，匪P活性對新血管侵襲性向內(nèi)生長(亦稱血管生成)產(chǎn)生影響，這是腫瘤生長超過一定大小時(shí)所必需的。研究表明，匪P家族成員之一，即分泌的人匪P-9(亦稱明膠酶B)，不僅在胞外基質(zhì)(ECM)分解代謝中，而且還在與多發(fā)性硬化(MS)等神經(jīng)病有關(guān)的蛋白質(zhì)底物加工中起關(guān)鍵作用(0pdenakker，2003)。最新研究表明，匪P-9在通過裂解加工前的II型膠原而促進(jìn)自身免疫病方面具有至關(guān)重要的作用(VandenSteen，2004)。裂解產(chǎn)物是膠原II型片段，一般認(rèn)為這些片段是發(fā)生自身免疫病的殘留表位。倘若匪P在人類生理學(xué)和病理學(xué)中具有廣泛作用，那么對于為了設(shè)計(jì)抑制匪P過高活性的藥物而付諸大量努力也就不足為奇。藥物開發(fā)的努力集中在含有與鋅離子配位從而使靶匪P失活的官能團(tuán)的抑制劑類別。這類抑制劑中的一種為異羥肟酸抑制劑(hydroxamateinhibitor)，這是一種纖維膠原的小肽類似物，以二配位基的方式，通過異羥肟酸基上的羥基和羰基氧與催化部位的鋅離子發(fā)生特異性相互作用[Grams等(1995)，Biochem.34:14012-14020;Bode等(1994)，EMB0J.，13:1263-1269]。基于異羥肟酸的匪P抑制劑通常包括碳主鏈(W095/29892、W097/24117、W097/49679和EP0780386)、月太基主鏈(W090/05719、W093/20047、W095/09841和WO96/06074)或肽模擬物主鏈(p印tidomimeticback-bone)[Schwartz等，Progr.Med.Chem.，29:271-334(1992);Rasmussen等，Pharmacol.Ther.，75:69-75(1997);Denis等，Invest.NewDrugs,15:175-185(1997)]?；蛘?，它們含有磺酰氨基磺?；?，該基團(tuán)的一側(cè)與苯環(huán)結(jié)合，且磺酰氨基的氮通過l-4個(gè)碳原子的鏈與異羥肟酸基結(jié)合(EP0757984Al)。其它基于肽的匪P抑制劑為具有膠原酶抑制活性的巰基酰胺類化合物(美國專利第4，595，700號)；抑制匪P-3、匪P-2和膠原酶的含有聯(lián)苯乙基甘氨酸(biphenylethylglycine)的N-羧基烷基衍生物(Durette等，W0-9529689);抑制匪P、TNF-a和可聚蛋白聚糖酶的內(nèi)酰胺衍生物(參見US6，495，699)以及三環(huán)磺酰胺化合物類(參見US6，492，422)。雖然基于肽的匪P抑制劑具有明確的治療潛力，但是它們在臨床治療中的應(yīng)用有限。基于肽的異羥肟酸的生產(chǎn)非常昂貴，且代謝穩(wěn)定性和口服生物利用度低[例如巴馬司他(batimastat)(BB_94)]。這些化合物被快速葡糖醛酸化、氧化成羧酸并在膽汁中分泌[Singh等，Bioorg.Med.Chem.Lett.5:337—342，1995;Hodgson，"Remodelling匪PIs(匪PI的重塑)"，Biotechnology13:554-557，1995)]。另外，基于肽的匪P抑制劑常常對每個(gè)匪P酶都具有相同或相似的抑制作用。例如，據(jù)報(bào)道，巴馬司他針對匪P-l、匪P-2、匪P-3、匪P-7和匪P-9中的每一種的IC50值為約lnM至約20nM[Rasmussen等，Pharmacol.Ther.，75(1):69-75(1997)]。此外，若干異羥肟酸抑制劑的應(yīng)用與嚴(yán)重副作用相關(guān)，例如肌肉骨骼問題與馬立馬司他(marimastat)(BB-2516)、泛發(fā)性斑丘疹(widespreadmaculop即ularrash)與CGS27023A(Novartis)[Levitt等，2001，Clin.CancerRes.7:1912-1922]和肝臟異常、貧血癥、肩背疼痛、血小板減少癥、惡心、疲勞、腹瀉和深靜脈血栓形成與BAY12-9566(Bayer)[Heath等，2001，CancerChemother.Pharmacol.48:269-274]相關(guān)。此外，用馬立馬司他、普啉司他(prinomastat)(AG3340，Agouron)禾PBay12-9566對晚期癌癥患者進(jìn)行的III期臨床試驗(yàn)證實(shí)在抑制轉(zhuǎn)移方面沒有臨床功效(Zucker等，2000，Oncogene19:6642-50)。其它匪P抑制劑是化學(xué)修飾的非微生物源四環(huán)素類(chemicallymodifiednonmicrobialtetracyclines,CMTs)，該抑制劑顯示體外阻斷若干匪P的表達(dá)。然而，發(fā)現(xiàn)這些化合物的體內(nèi)功效有限，例如，CMT抑制劑多西環(huán)素降低人類患者頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中匪P-l的組織水平，但不降低匪P-2、匪P-3或匪P-9的組織水平(Axisa等，2002，Stroke33:2858-2864)。最近，根據(jù)匪P活性部位的X射線晶體學(xué)信息設(shè)計(jì)出基于機(jī)制的匪P抑制劑(mechanism-based匪Pinhibitor)，即SB-3CT(Brown等，2000)。X射線吸收研究顯示，該分子與催化性鋅的結(jié)合使活性部位金屬離子周圍的構(gòu)象環(huán)境重構(gòu)回到酶原的構(gòu)象環(huán)境[Kleifeld等，2001，JBiol.Chem.276:17125-31]。然而，用該藥物獲得的治療功效仍有待核實(shí)。另一類天然抑制劑是單克隆抗體。已經(jīng)生產(chǎn)出針對匪P-1催化結(jié)構(gòu)域內(nèi)特定肽序列的若干抗體(Galvez等，2001，J.Biol.Chem.，276:37491-37500)。然而，雖然這些抗體可抑制匪P的體外活性，但是結(jié)果表明這類抗體的體內(nèi)功效尚未得到證實(shí)。如上文中所述，匪P的催化部位包括在酶活化之后可用于底物結(jié)合的配位金屬離子(參見圖2a-c)。因此可以理解，針對酶的一級氨基酸序列的常規(guī)抗體不能將酶的活性形式與無活性形式區(qū)別開來，因此不能用作這類酶的有效抑制劑。本發(fā)明的發(fā)明人之前曾經(jīng)提出，同時(shí)識別匪P催化部位的電子決定子和結(jié)構(gòu)決定子(determinant)的抗體是它的有效抑制劑，因此可以用于治療與匪P活性失調(diào)有關(guān)的疾病(參見PCT公開文本W(wǎng)02004/087042)。因此，對于模擬金屬蛋白催化部位的電子決定子和結(jié)構(gòu)決定子的特異性半抗原化合物以及針對所述半抗原化合物的特異性抗體存在普遍公認(rèn)的需要，并且十分理想的是獲得所述特異性半抗原化合物及其特異性抗體。發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供具有以下通式(I)的化合物其中R=_CH2-C(=0)NH-CH2-CH2_NH2。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供具有下式(II)的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>其中m禾Pn各自獨(dú)立地為1-6的整數(shù)；XrX3和各自獨(dú)立地為0或S;R「R3各自獨(dú)立選自氫、烷基和環(huán)烷基；禾口R為(CH2)x-C(=0)NR'-(CH2)y-NR'R〃其中x禾Py各自獨(dú)立地為1-6的整數(shù)；禾口R'和R〃各自獨(dú)立選自氫、烷基和環(huán)烷基。根據(jù)本發(fā)明下述優(yōu)選實(shí)施方案的進(jìn)一步特征，本發(fā)明的化合物具有下式(II)結(jié)構(gòu)其中R=_CH2-C(=0)NH-CH2-CH2_NH2。根據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)方面，提供包含能夠特異性結(jié)合上述化合物的抗原識別區(qū)的抗體。根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案更進(jìn)一步的特征，所述抗原識別區(qū)包含選自SEQIDNO:7、8、9、10、11和12的CDR氨基酸序列。根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案更進(jìn)一步的特征，所述CDR氨基酸序列由選自SEQIDNO:13、14、15、16、17和18的核酸序列編碼。根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案更進(jìn)一步的特征，所述抗體能夠抑制金屬蛋白的活性。根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案更進(jìn)一步的特征，所述金屬蛋白是基質(zhì)金屬蛋白酶。根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案更進(jìn)一步的特征，所述基質(zhì)金屬蛋白酶是明膠酶。根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案更進(jìn)一步的特征，所述明膠酶選自MMP-2和MMP-9。根據(jù)本發(fā)明的再一個(gè)方面，提供產(chǎn)生金屬蛋白抑制劑的方法，該方法包括產(chǎn)生針對上述化合物的抗體，從而制備金屬蛋白抑制劑。根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案更進(jìn)一步的特征，所述抗體為多克隆抗體。根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案更進(jìn)一步的特征，所述抗體為單克隆抗體。根據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)方面，提供包含所述抗體和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。根據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)方面，提供治療有需要的受治療者的與金屬蛋白活性失調(diào)或異常有關(guān)的疾病的方法，該方法包括給予受治療者治療有效量的權(quán)利要求4-10中任一項(xiàng)的抗體，從而治療受治療者的與金屬蛋白活性失調(diào)或異常有關(guān)的疾病。根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案更進(jìn)一步的特征，所述疾病是炎性腸病(inflammatoryboweldisease)。根據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)方面，提供抑制細(xì)胞的基質(zhì)金屬蛋白酶活性的方法，該方法包括使細(xì)胞與權(quán)利要求4-10中任一項(xiàng)的抗體接觸，從而抑制細(xì)胞的基質(zhì)金屬蛋白酶活性。本發(fā)明通過提供新的半抗原組合物而成功地克服了現(xiàn)有已知構(gòu)型的缺點(diǎn)，所述半抗原組合物可以用于產(chǎn)生同時(shí)識別金屬蛋白催化部位的電子決定子和結(jié)構(gòu)決定子的抗體。除非另有定義，否則本文所用的所有科技術(shù)語都具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常所理解的含義。雖然類似或等同于本文所述方法和材料的方法和材料可用于本發(fā)明的實(shí)施或檢驗(yàn)，但是下面描述了合適的方法和材料。萬一發(fā)生抵觸，則以本專利說明書(包括定義)為準(zhǔn)。另外，所述材料、方法和實(shí)施例僅是示例性的，而不是限制性的。本文僅通過舉例并參考附圖對本發(fā)明進(jìn)行描述。要強(qiáng)調(diào)的是，就現(xiàn)在具體參考附圖細(xì)節(jié)而言，僅以本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案為例且僅為了說明性地論述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案而給出細(xì)節(jié)，并且是為了提供我們認(rèn)為是對本發(fā)明的原理和構(gòu)思方面最有用和最易理解的描述而提供這些細(xì)節(jié)。在這點(diǎn)上，我們沒有試圖以比基本理解本發(fā)明所必需的更為詳細(xì)的方式來說明本發(fā)明的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)，附圖中的說明，可使本領(lǐng)域技術(shù)人員了解本發(fā)明的幾種形式如何具體體現(xiàn)在實(shí)施中。附圖中圖1A-D是以下分子結(jié)構(gòu)的示意圖Co/ZnTCPP-[間_四(4-羧基苯基)-口卜啉]鈷/鋒(II)([meso_Tetrakis(4-carboxyphenyl)-porphyrinato]cobalt/zinc(II))(圖1A-B)、111118(^-[2-(2-氨基乙基氨基甲酰基)-乙氧基甲基]-三-[2-(N-(3-咪唑-1-基-丙基))-乙氧基甲基]甲烷([2-(2-minoethylcarbomoyl)-ethoxymethyl]-tris-[2-(N-(3-imidazol-l-yl-propyl))-ethoxymethyl]methane)及匪P催化性鋅部位的保守鋅-蛋白連接。圖1E-H是圖1A-D中所示結(jié)構(gòu)的三維示意圖。注意，ZnTCPP保持平面構(gòu)象，而CoTCPP具有扭曲的微周期構(gòu)象(distortedmicrocycleconformation)。顯然，Imisdp結(jié)構(gòu)與圖1G中所示的匪P-9催化性鋅離子的最接近的環(huán)境十分相似。圖2A是Imisdp(綠色碳原子)與MMP-9活性部位3個(gè)保守組氨酸(PDB代碼1GKC，灰色碳原子)的三維計(jì)算結(jié)構(gòu)之間的結(jié)構(gòu)疊加圖(overlay)。催化性鋅離子被描繪成橙色球，水分子被描繪成藍(lán)色球，氮被涂成藍(lán)色，氧為紅色。圖2B是ZnTCPP嚇啉環(huán)(CSD代碼AKIC0M)(綠色碳原子)與MMP-9活性部位3個(gè)保守組氨酸(灰色碳原子PDB代碼1GKC)之間的結(jié)構(gòu)疊加圖，催化性鋅離子被描繪成橙色球，氮被涂成藍(lán)色。圖3A-C蛋白質(zhì)印跡圖像顯示小鼠IgG-瓊脂糖(IgG-Agarose)固定化mAb使重組匪P-2催化結(jié)構(gòu)域(匪P-2cat)或Pro-匪P-2和Pro-匪P-9從溶液中沉淀出來(pul1down)的能力。用于各實(shí)驗(yàn)的抗體為6C6、13E11和13E15。圖3A-將匪P-2cat(2yg)與抗小鼠IgG-瓊脂糖(cntl，泳道1)或抗CoTCPP、抗ZnTCPP和抗ImisdpmAb(10yg)-抗小鼠IgG-瓊脂糖一起在2(TC下溫育2小時(shí)，免疫沉淀物(泳道2、3、5)經(jīng)離心后洗滌三次，用SDS/PAGE凝膠分離，通過考馬斯染色觀測。圖3B-按與A相同的方式，將Pro-匪P-2、Pro-匪P-9與mAb-抗小鼠IgG-瓊脂糖一起溫育。免疫沉淀物(泳道2、4、6左和泳道1、3、5右)和未結(jié)合組分(泳道1、3、5左和2、4、6右)用SDS/PAGE凝膠分離，通過考馬斯染色觀測。圖3C-將用APMA進(jìn)行活化(左)或未進(jìn)行活化(右)的HT1080細(xì)胞的條件培養(yǎng)液與抗CoTCPPmAb進(jìn)行免疫沉淀，并用抗匪P-2的特異性抗體通過蛋白質(zhì)印跡進(jìn)行分析。圖4A-B是抗CoTCPPmAb抑制MMP-2(A)和匪P-9(B)的Lineweaver-Burk圖。速度單位為ymo1/秒鐘—、底物單位為yM—、圖4A-MAb濃度為6yM(實(shí)心三角)、18yM(實(shí)心方塊)、24iiM(空心圓)和0iiM(空心方塊)。匪P-2cat濃度為200nM。圖4B-抑制全長APMA激活的匪P-9，mAb濃度為6yM(空心方塊)、12yM(實(shí)心三角)、24yM(空心方塊)和0iiM(實(shí)心方塊)。匪P-9濃度為20nM。抑制模式表明抗CoTCPPmAb作為匪P-2和匪P-9的競爭性抑制劑起作用。圖5是顯示抗ImisdpmAb抑制MMP-2和MMP-9的曲線圖。將MMP-9催化結(jié)構(gòu)域(20nM)(實(shí)心圓)或全長APMA激活的匪P-2(實(shí)心三角，5nM)加到熒光底物0CAcPLGLA2pr(Dnp)_AR_NH2(10yM)與含有濃度遞增的mAb的緩沖液R的混合物中。曲線表示采用Origin程序的與以下方程擬合的非線性最小二乘方vi/vo=(Km+[S])/(Km(l+[I]/Ki)+[S])。圖6A是顯示匪P-2cat活性形式和匪P-2cat的抗CoTCPPmAb抑制形式的鋅k-邊(k-edge)光譜的光譜圖。圖中顯示活性匪P-2cat(虛線)和匪P-2cat-mAb復(fù)合物(實(shí)線)的鋅K-邊區(qū)的歸一化原始XAS數(shù)據(jù)。圖6B顯示相對于活性匪P-2cat(虛線)，匪P-2cat-mAb復(fù)合物(實(shí)線)移動(dòng)到較高能量的邊緣位置。圖6C表示所顯示的匪P-2cat活性(黑色)和抑制(綠色)形式的EXAFS結(jié)果。結(jié)果用R空間(R-space)和反轉(zhuǎn)換至k空間表示。圖7A-B照片顯示抗CoTCPPmAb抑制細(xì)胞表面明膠酶活性的能力。在1pM13E11mAb存在或不存在下，放置在用DQ-明膠包被的蓋玻片上的HT1080細(xì)胞的代表性熒光顯微圖。作為由降解明膠發(fā)射的熒光的量度，對細(xì)胞表面明膠分解活性進(jìn)行了分析。未處理細(xì)胞具有顯著的細(xì)胞表面明膠酶活性，在1pM抗CoTCPPmAb存在下受到明顯抑制。藍(lán)色的4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色，表示細(xì)胞核的位置。圖8是顯示不同匪P活性部位(Sl口袋)構(gòu)型的示意圖。圖9是Imisdp的合成流程圖。圖10顯示本發(fā)明抗體的氨基酸序列，其中突出顯示的為CDR區(qū)。圖11A-D是說明僅與匪P9和匪P2活性構(gòu)象結(jié)合的6C6的照片和模型。圖11A:與得自小鼠腹水的6C6共純化的活性匪P9的檢測。使用市售的抗匪P9抗體，對由含有匪P9的小鼠腹水純化的MAb(10iig)進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡(WB)分析。按相同方式純化的非相關(guān)IgGmAb(NonrelatedIgGmAb)用作陰性對照(MAb對照)。由Hilla轉(zhuǎn)染細(xì)胞純化的人Pro匪P9用作分子量標(biāo)記以分辨活性種類。純化通過親合層析法進(jìn)行，使用通過其恒定區(qū)結(jié)合mAb的G蛋白微珠，使抗原結(jié)合部位游離出來與抗原相互作用。圖11B、圖IIC:分析固定在A蛋白微珠上的6C6mAb使Pro匪P2、Pro匪P9或匪P2催化性片段(缺乏血紅素結(jié)合蛋白和前域(prodomains))從溶液中沉淀出來的能力。將固定在A蛋白瓊脂糖微珠的MAb6C6(10iig)與匪P2催化性片段(1iig)(圖11B)、Pro匪P9(圖IIC上圖)或Pro匪P2(2iig)(圖IIC下圖)一起在2(TC下溫育2小時(shí)。微珠結(jié)合的mAb復(fù)合物經(jīng)離心分離，并洗滌三次，用SDS/PAGE凝膠分離后，通過考馬斯染色觀測。免疫沉淀物(6C6)和未結(jié)合組分用SDS/PAGE凝膠分離，通過考馬斯染色觀測。將作為僅非特異性吸收酶的陰性對照與A蛋白瓊脂糖微珠一起溫育。圖11D:表面圖像中顯示有前域(pro-domain)(下圖)和無前域(上圖)的缺乏血紅素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域的匪P2的三維結(jié)構(gòu)(PDBID:1CK7)。催化結(jié)構(gòu)域和纖連蛋白結(jié)構(gòu)域用藍(lán)綠色表示，前肽(pro-p印tide)用紅色表示。催化性鋅離子被描繪成橙色球體，與如在空間上阻斷活性部位。圖12A-B是與6C6mAb對匪P-9抑制機(jī)制有關(guān)的曲線圖和數(shù)據(jù)。圖12A:將匪P-9重組催化性片段(無血紅素結(jié)合蛋白和前域)與變化量的mAb—起預(yù)溫育。在加入熒光肽底物(10yM)后測量殘留的酶活性。通過擬合到競爭性抑制方程式(vi/vo=Km+[S]/(Km(l+I/Ki)+[S])Km=9.14±0.8)求出Ki(插圖)。在mAb不存在(參)，或者在0.7iiM(B)mAb或2iiM(0)mAb存在下，將活性匪P-9(固定濃度為2nM)在100mMNaCl、10mMCaCl2、100mMTris(pH7.5)中于37。C預(yù)溫育60分鐘。然后加入熒光肽底物(Mca-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-NHJ以達(dá)到所需的0-30yM范圍內(nèi)的終濃度(S)，底物水解的初始速度通過測量熒光的增加來確定。通過將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合到Michaelis-Menten方程式推導(dǎo)出表觀Km值和Vmax值。將推導(dǎo)值用來重新繪制雙倒數(shù)Linweaver-Burk圖，交叉點(diǎn)表示6C6競爭性抑制匪P-9。圖12B:將不同的匪P與變化量的mAb預(yù)溫育。加入熒光肽底物(10iiM)后，測量殘留的酶活性。通過擬合到競爭性抑制方程式(vi/vo=Km+[S]/(Km(l+I/Ki)+[S])求出Ki，對于由Hila細(xì)胞純化的全長匪P2，Km=2.46±0.34，對于MT1-匪P的催化結(jié)構(gòu)域，Km=16±1。還使用全長匪P-2和匪P-9檢測了6C6的有效抑制(數(shù)據(jù)未顯示)。圖13是不同匪P的結(jié)構(gòu)疊加圖，顯示活性部位保守的整體拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，其中主要在周邊環(huán)(peripheralloops)內(nèi)有變化。匪P9(PDB1GKC)-藍(lán)綠色，匪P2(PDB1QIB)-紅紫色，MT1-匪P(PDB1BUV)-橙色，匪P7(PDB1匪Q)-紅色，TACE(PDB2147)-黃色。保守組氨酸用條棒表示，催化性鋅離子被描繪成橙色球體。顯然，匪P-2和匪P-9周邊環(huán)的整體拓?fù)鋱D類似。這就可以解釋受測組的酶中6C6對匪P-2和匪P-9的選擇性。圖14A-C是說明6C6抑制細(xì)胞表面明膠酶活性的熒光顯微圖。在5yMmAb不存在(圖14A)或在5yMmAb存在(圖14B)下，或者在15yM基于機(jī)制的納摩爾明膠酶抑制劑SB-3CT存在(圖14C)下，置于用DQ-明膠包被的蓋玻片上的HT1080細(xì)胞的代表性熒光顯微圖(由原位酶譜法測定(insituzymogr即hyassay)產(chǎn)生)。作為由降解明膠發(fā)射的熒光量度，對細(xì)胞表面明膠分解活性進(jìn)行了分析。未處理細(xì)胞具有顯著的細(xì)胞表面明膠酶活性(green)，它在mAb存在下被顯著抑制。圖15A-C是表示6C6處理對C57BL/6小鼠急性DSS結(jié)腸炎各種表現(xiàn)的作用的圖。通過2%DSS誘發(fā)疾病達(dá)5天，從第0天開始每日經(jīng)腹膜內(nèi)注射5或1.5mg/kg小鼠給予6C6處理。圖15A:每日監(jiān)測DAI(這是體重、直腸出血和大便粘稠度的綜合評分，數(shù)值范圍為0-4)，求出臨床分值。數(shù)據(jù)用第6天至第10天每只動(dòng)物平均值的點(diǎn)分布表示。圖15B:結(jié)腸長度。圖15C:死亡率。所提供的數(shù)據(jù)是兩次實(shí)驗(yàn)的綜合結(jié)果，每組共15只小鼠*，相對于結(jié)腸炎未治療小鼠作用顯著(P<0.05)。圖16是得自活性匪P9(黑色)和抑制匪P9-6C6復(fù)合物(紅色)于鋅K邊X射線吸收光譜法的結(jié)果的曲線圖。結(jié)果用鋅離子徑向分布的形式表示。相對于活性匪P-9，匪P-9催化結(jié)構(gòu)域-mAb復(fù)合物(紅色)的位置移動(dòng)到較高能量(插圖)，這就表明了與催化性鋅離子結(jié)合。X射線光譜數(shù)據(jù)的結(jié)構(gòu)分析表明，6C6與鋅離子直接結(jié)合，并形成五配位鋅_蛋白復(fù)合物。顯然，這種結(jié)合模式類似于在匪P活性部位與TIMP的結(jié)合。優(yōu)選實(shí)施方案的描述本發(fā)明涉及可用于抑制金屬蛋白活性的抗體及其片段。準(zhǔn)確地講，本發(fā)明抗體可以用于治療與基質(zhì)金屬蛋白酶活性失調(diào)有關(guān)的疾病，例如多發(fā)性硬化、自身免疫病和轉(zhuǎn)移癌。參照附圖和，可以更好地理解本發(fā)明的原理和操作。在詳細(xì)說明至少一個(gè)本發(fā)明的實(shí)施方案之前，應(yīng)該了解本發(fā)明在其應(yīng)用于以下說明書中所述細(xì)節(jié)或?qū)嵤├兴e細(xì)節(jié)時(shí)并無限制。本發(fā)明可有其它實(shí)施方案，或者能夠以各種方式實(shí)施或?qū)崿F(xiàn)。同樣，還應(yīng)了解本文所用措辭和術(shù)語是為了說明目的，不應(yīng)視為限制?；|(zhì)金屬蛋白酶參與許多生物學(xué)過程，范圍從細(xì)胞增殖、分化和胞外基質(zhì)重塑(ECM)到血管生成和細(xì)胞遷移。這些過程在基質(zhì)金屬蛋白酶的功能(匪P)及其天然組織抑制劑(TIMP)之間需要精妙的平衡。失去這種平衡是包括轉(zhuǎn)移性腫瘤、神經(jīng)變性性疾病和骨關(guān)節(jié)炎在內(nèi)的多種病理病癥的標(biāo)志。本領(lǐng)域已知多種匪P抑制劑，包括小肽抑制劑，例如異羥肟酸、非微生物源四環(huán)素和單克隆抗體。雖然前者受生長成本高、降解性強(qiáng)、口服生物利用度低和缺乏特異性的限制，但是后者中無一證實(shí)有體內(nèi)治療功效。本發(fā)明的發(fā)明人之前曾提出，同時(shí)識別金屬酶催化部位的電子決定子和結(jié)構(gòu)決定子的抗體可以用作金屬酶的有效抑制劑。使用半抗原模擬作為免疫原的金屬酶金屬結(jié)合催化部位，使得能夠產(chǎn)生高效治療性抗體，可用來治療以金屬蛋白活性升高為特征的臨床病癥(參見本發(fā)明人的W02004/087042)。在將本發(fā)明付諸實(shí)施時(shí)，本發(fā)明的發(fā)明人設(shè)計(jì)出精確模擬匪P中反應(yīng)性鋅部位的局部結(jié)構(gòu)和構(gòu)象的新的半抗原化合物?；衔颷2-(2-氨基乙基氨基甲?；?-乙氧基甲基]_三_[2-(N-(3-咪唑-1-基_丙基))_乙氧基甲基]甲烷，簡稱Imisdp(參見圖1)，可以模擬4-配位幾何結(jié)構(gòu)以及由與3個(gè)組氨酸排列和水配位的鋅離子所引起的類似力場。由3個(gè)咪唑堿基和作為第4個(gè)配體的水分子形成大致的四面體構(gòu)象。圖2A顯示所構(gòu)建的具有匪P-9(PDB1GKC)催化部位的Imisdp化合物的構(gòu)建的3D模型疊加圖，它已被修飾以代表鋅配體的四面體幾何結(jié)構(gòu)。該修飾包括將存在于X射線結(jié)構(gòu)的配體(異羥肟酸抑制劑)用水分子置換，并應(yīng)用多層QM/匪方法(multilayerQM/匪a卯roach)(參見材料和方法)使整個(gè)酶最優(yōu)化成局部最小化。根據(jù)組氨酸的e-氮與鋅離子的距離(分別為2.04士0.06和2.02)以及3個(gè)組氨酸對于金屬的相對取向，計(jì)算得出的匪P-9中組氨酸鋅模體和Imisdp之間存在高度相似性。正如在下文以及在隨后的實(shí)施例部分中所述一樣，本發(fā)明的發(fā)明人用Imisdp使小鼠免疫，篩選出與匪P-2和MMP-9交叉反應(yīng)的MMP抗體。該抗體稱為6C6(參見圖10和隨后的實(shí)施例部分的實(shí)施例1-2)。發(fā)現(xiàn)6C6結(jié)合匪P-2/9，并競爭性地抑制匪P-9、匪P-2(Ki范圍1iiM-5iiM)和MT1-匪P(Ki為15iiM，參見下表4)的活性。通過各種生物化學(xué)和生物物理學(xué)工具體外和原位證實(shí)了結(jié)合并抑制匪P-9和匪P-2(參見實(shí)施例4-7和實(shí)施例9)。重要的是，6C6僅與活化形式的匪P-9和匪P-2結(jié)合(參見實(shí)施例3和實(shí)施例8)。該酶形式缺乏前域，該前域保護(hù)存在于酶部分內(nèi)的催化性鋅復(fù)合物。本發(fā)明的發(fā)明人指出，按照本發(fā)明方法所產(chǎn)生的抗體能夠體內(nèi)結(jié)合匪P-9(圖IIA)。此外，本發(fā)明的發(fā)明人指出，本發(fā)明抗體具有用于治療炎性腸病的治療潛力(實(shí)施例10)?？傊?，本發(fā)明的結(jié)果支持Imisdp作為用于產(chǎn)生金屬蛋白抑制劑的重要試劑(平臺)、以及6C6及衍生肽和模擬肽(p印tidomimetics)作為有價(jià)值的治療工具的用途。這些結(jié)果表明，通過噬菌體展示和mAb或其片段的點(diǎn)突變，使用這些抗體作為設(shè)計(jì)各匪P的選擇性肽抑制劑的平臺的潛力。因此，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供具有以下通式(I)的化合物其中m禾Pn各自獨(dú)立地為1_6的整數(shù)；XrX3和YfYg各自獨(dú)立地為0或S;R「R3各自獨(dú)立選自氫、烷基和環(huán)烷基；禾口R為(CH2)x-C(=0)NR'-(CH2)y-NR'R〃其中x禾Py各自獨(dú)立地為1-6的整數(shù)；禾口R'和R〃各自獨(dú)立選自氫、烷基和環(huán)烷基。根據(jù)本發(fā)明這個(gè)方面的優(yōu)選實(shí)施方案，所述化合物是[2-(2-氨基乙基氨基甲酰基)_乙氧基甲基]_三_[2-(N-(3-咪唑-1-基_丙基))_乙氧基甲基]甲烷，簡述Imisdp，具有以下通式(II):<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>其中<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>。在隨后的實(shí)施例部分的實(shí)施例7中描述了Imisdp的合成。因?yàn)镮misdp模擬MMP-9和MMP-2中反應(yīng)性鋅部位的局部結(jié)構(gòu)和瞬時(shí)構(gòu)象，所以它可用來產(chǎn)生金屬蛋白抑制劑。因此，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供產(chǎn)生金屬蛋白抑制劑的方法。該方法通過產(chǎn)生針對上述化合物(即Imisdp)的抗體或抗體片段來實(shí)現(xiàn)。參見隨后實(shí)施例部分的實(shí)施例1-2以及"材料和方法"部分。本發(fā)明的"金屬蛋白"是指結(jié)合金屬的蛋白質(zhì)，其中金屬結(jié)合部位構(gòu)成酶催化結(jié)構(gòu)域的組成部分，它在電子上和結(jié)構(gòu)上都與Imisdp的類似。本發(fā)明這個(gè)方面的金屬蛋白優(yōu)選為金屬蛋白酶-匪P(例如明膠酶，例如匪P-2和匪P-9)。應(yīng)當(dāng)了解的是，匪P家族的所有成員均被翻譯成潛在酶，在激活時(shí)轉(zhuǎn)化成活性酶，其中活性部位的金屬離子易于達(dá)到底物結(jié)合的目的。例如，以前提出的解釋匪P體外活化的"半胱氨酸轉(zhuǎn)換模型(cysteineswitchmodel)"。半胱氨酸轉(zhuǎn)換模型提出，在激活時(shí)，通過由鋅原子上解離出帶有巰基(Cys)的前肽，使?jié)撛诘匿\結(jié)合部位轉(zhuǎn)化成催化性鋅結(jié)合部位。前肽的裂解導(dǎo)致酶的前域結(jié)構(gòu)水解，催化性鋅離子的屏蔽被去除。從而，金屬離子和活性部位口袋易于達(dá)到底物結(jié)合和水解的目的[VanWart和Birkedal-Hansen(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87,5578—5582]。根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)內(nèi)容產(chǎn)生的抗體和抗體片段用作匪P的有效抑制劑，這是由于它們具有同時(shí)結(jié)合催化性鋅部位內(nèi)的金屬離子和配位氨基酸的能力，從而特異性抑制直接參與上述病理過程的這些酶的活性構(gòu)象。本文所用術(shù)語"抗體"是指完整的抗體分子，術(shù)語"抗體片段"是指其功能性片段，例如能夠結(jié)合巨噬細(xì)胞的Fab、F(ab'^和Fv。這些功能性抗體片段如下定義(i)Fab，該片段含有抗體分子的單價(jià)抗原結(jié)合片段，可通過用酶即木瓜蛋白酶消化完整抗體產(chǎn)生，得到完整的輕鏈和一條重鏈的一部分；(ii)Fab'，可通過用胃蛋白酶處理完整抗體后還原來獲得抗體分子的這個(gè)片段，得到完整輕鏈和重鏈的一部分；每個(gè)抗體分子得到2個(gè)Fab'片段；(iii)(Fab')2，可以用酶即胃蛋白酶處理完整抗體但無需隨后的還原獲得該抗體片段；F(ab'h是2個(gè)Fab'片段由2個(gè)二硫鍵連接在一起的二聚體；(iv)Fv，定義為含有表達(dá)成2條鏈的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的遺傳工程片段；(v)單鏈抗體("SCA")，是一種遺傳工程分子，含有由合適的多肽接頭連接的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)作為遺傳融合的單鏈分子；和(vi)編碼單一互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的肽。抗體(即單克隆和多克隆抗體)的制備方法是本領(lǐng)域眾所周知的?？贵w可以通過本領(lǐng)域已知的若干方法中的任一種來制備，這些方法可采用誘導(dǎo)體內(nèi)產(chǎn)生抗體分子，篩選文獻(xiàn)所公開的高度特異性結(jié)合反應(yīng)物的免疫球蛋白文庫或組，或者通過傳代細(xì)胞系培養(yǎng)產(chǎn)生單克隆抗體分子。這些包括但不限于雜交瘤技術(shù)、人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)和EB病毒(EBV)雜交瘤技術(shù)[KohlerG.等(1975)Nature256:495-497，KozborD.等(1985)J.Immunol.Methods81:31-42，CoteR.J.等(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.80:2026-2030，ColeS.P.等(1984)Mol.Cell.Biol.62:109-120]。如果本發(fā)明化合物太小不能引起強(qiáng)免疫原性反應(yīng)(immunogenicresponse)，則這類抗原(半抗原)可與抗原中性載體(antigenicallyneutralcarrier)例如匙孔蜮血藍(lán)蛋白(KLH)或血清白蛋白[例如牛血清白蛋白(BSA)]載體偶聯(lián)(參見美國專利號5，189，178和5，239，078以及實(shí)施例部分的實(shí)施例2)。與載體的偶聯(lián)可以采用本領(lǐng)域眾所周知的方法進(jìn)行；例如，可以實(shí)現(xiàn)與氨基的直接偶聯(lián)，并任選接著使所形成的亞氨基鍵還原。或者，可以采用縮合劑(例如二環(huán)己基碳二亞胺)或其它碳二亞胺脫水劑使載體偶聯(lián)。接頭化合物也可用于實(shí)現(xiàn)偶聯(lián)；同雙功能接頭和異雙功能接頭均可獲自PierceChemicalCompany,Rockford，111。然后，可將所得免疫原性復(fù)合物注射到例如小鼠、兔等合適的哺乳動(dòng)物受治療者體內(nèi)。合適的方案包括按照加強(qiáng)血清中抗體產(chǎn)生的時(shí)間表，在佐劑存在下重復(fù)注射免疫原。應(yīng)用本領(lǐng)域眾所周知的免疫測定法，可容易地測定出免疫血清的效價(jià)。所獲得的抗血清可以直接使用，或者按照上文中所述獲得單克隆抗體。可以應(yīng)用本領(lǐng)域眾所周知的方法，獲得抗體片段(參見例如Harlow和Lane，Antibodies:ALaboratoryMa皿al，ColdSpringHarborLaboratory，NewYork，1988，通過引用結(jié)合到本文中)。例如，可以通過蛋白水解抗體，或者通過在大腸桿菌(E.coli)或哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如中國倉鼠卵巢細(xì)胞培養(yǎng)物或其它蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng))中表達(dá)編碼該片段的DNA，來制備本發(fā)明的抗體片段?；蛘撸梢酝ㄟ^常規(guī)方法由胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化完整抗體獲得抗體片段。例如，可以通過用胃蛋白酶對抗體進(jìn)行酶促切割提供表示為F(ab'h的5S片段，來產(chǎn)生抗體片段。還可以使用巰基還原劑，任選使用巰基(由切割二硫鍵所產(chǎn)生)的封閉基團(tuán)，對該片段進(jìn)行進(jìn)一步切割以產(chǎn)生3.5SFab'單價(jià)片段?；蛘撸褂梦傅鞍酌高M(jìn)行酶促切割來直接產(chǎn)生2個(gè)單價(jià)Fab'片段和Fc片段。這些方法參見例如Goldenberg，美國專利號4，036，945和4，331，647及其中所包括的參考文獻(xiàn)，所述專利通過引用全部結(jié)合到要本文中。另參見Porter,R.R.，Biochem.J.，73:119-126,1959。切割抗體的其它方法，例如分離重鏈形成單價(jià)輕鏈_重鏈片段，進(jìn)一步切割片段，或者還可以使用其它酶促技術(shù)、化學(xué)或遺傳技術(shù)，只要該片段與被完整抗體識別的抗原結(jié)合。Fv片段包含VH鏈和、鏈的締合物。該締合物可以是非共價(jià)的，參見Inbar等，Proc.Nat'1Acad.Sci.USA69:2659-62,1972?；蛘?，可變鏈可以通過分子間的二硫鍵連接，或者通過化學(xué)試劑(例如戊二醛)交聯(lián)。優(yōu)選Fv片段包含通過肽接頭連接的VH和、鏈。這些單鏈抗原結(jié)合蛋白(sFv)通過構(gòu)建結(jié)構(gòu)基因來制備，該結(jié)構(gòu)基因包含編碼由寡核苷酸連接的Vh和、區(qū)的DNA序列。將該結(jié)構(gòu)基因插入表達(dá)載體中，隨即將表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，例如大腸桿菌。重組宿主細(xì)胞合成具有橋接2個(gè)V區(qū)的接頭肽的單一多肽鏈。有關(guān)產(chǎn)生sFv的方法參見例如Whitlow和Filpula，Methods，2:97-105,1991;Bird等，Science242:423-426，1988;Pack等，Bio/Technology11:1271-77，1993;以及Ladner等，美國專利第4，946，778號。CDR肽("最小識別單位")可以通過編碼構(gòu)建目標(biāo)抗體CDR的基因獲得。例如，通過采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)以合成抗體生成細(xì)胞RNA的可變區(qū)，來制備這類基因。參見例如Larrick禾PFry,Methods,2:106-10，1991。應(yīng)當(dāng)了解的是，用于人的療法或診斷劑，優(yōu)選使用人源化抗體。非人類(例如鼠)抗體的人源化形式是免疫球蛋白的嵌合分子、免疫球蛋白鏈或其片段(例如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗體的其它抗原結(jié)合亞序列)，其含有衍生自非人類免疫球蛋白的最小序列的。人源化抗體包括人免疫球蛋白(受體抗體)，其中得自受體互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的殘基被得自小鼠、大鼠或兔等非人類物種的CDR(供體抗體)的殘基置換，所述非人類物種的CDR具有所需要的特異性、親和力和性能。在某些情況下，人免疫球蛋白的Fv構(gòu)架殘基被相應(yīng)的非人類殘基置換。人源化抗體還可包含在受體抗體、引入的CDR或構(gòu)架序列中都不存在的殘基。一般而言，人源化抗體可包含基本上所有的至少一個(gè)、通常2個(gè)可變區(qū)，其中所有或基本上所有的CDR區(qū)都相當(dāng)于非人類免疫球蛋白的CDR區(qū)，所有或基本上所有的FR區(qū)都是人免疫球蛋白共有序列的FR區(qū)。人源化抗體最理想還可包括至少免疫球蛋白恒定區(qū)的一部分(Fc)，通常為人免疫球蛋白恒定區(qū)的一部分[Jones等，Nature,321:522-525(1986);Riechmann等，Nature,332:323-329(1988);以及Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2:593-596(1992)]。使非人類抗體人源化的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。人源化抗體一般具有一個(gè)或多個(gè)從非人類來源引入其中的氨基酸殘基。這些非人類氨基酸殘基常被稱為輸入殘基(importresidue)，通常得自輸入可變區(qū)?？梢曰旧习凑誛inter及同事的方法[Jones等，Nature,321:522-525(1986);Riechmann等，Nature332:323-327(1988);Verhoeyen等，Science,239:1534-1536(1988)]，用嚙齒動(dòng)物的一個(gè)或多個(gè)CDR序列取代相應(yīng)的人抗體序列，來進(jìn)行人源化。因此，這類人源化抗體是嵌合抗體(美國專利第4，816，567號)，其中基本上不超過一個(gè)完整的人可變區(qū)被相應(yīng)的得自非人類物種的序列取代。在實(shí)踐中，人源化抗體通常是其中一些CDR殘基及可能一些FR殘基被得自嚙齒動(dòng)物抗體相似位點(diǎn)的殘基取代的人抗體。還可以采用本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)制備人抗體，包括噬菌體展示文庫[Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.，227:381(1991);Marks等，J.Mol.Biol.，222:581(1991)]。Cole等人和Boerner等人的技術(shù)也可用于制備人單克隆抗體(Cole等，MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,AlanR丄iss，第77頁(1985)禾口Boerner等，J.Immunol.，147(1):86-95(1991)]。同樣，可以通過將人免疫球蛋白基因座導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中來制備人抗體，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物例如其中內(nèi)源免疫球蛋白基因已部分或完全被失活的小鼠。在攻擊后，觀察到人抗體的產(chǎn)生，這在包括基因重排、裝配和抗體所有組成成分在16內(nèi)的所有方面都與在人體內(nèi)觀察到的十分相似。該方法參見例如美國專利號5，545，807、5，545，806、5，569，825、5，625，126、5，633，425、5，661，016和下列科技出版物:Marks等，Bio/Technology10,779-783(1992);Lonberg等，Nature368856-859(1994);Morrison，Nature368812-13(1994);Fishwild等，NatureBiotechnology14,845-51(1996);Neuberger，NatureBiotechnology14,826(1996);Lonberg禾口Huszar，Intern.Rev.Immunol.1365-93(1995)。—旦獲得抗體，便可測定它們的金屬蛋白抑制活性。金屬蛋白抑制活性合適的測定條件參見Knight等，F(xiàn)EBSLetters296(3):263-266(1992)，Cawston等，Anal.Biochem，99:340-345(1979)，Cawston等，MethodsinEnzymology80:771以及下列等等(1981);Cawston等，Biochem.J.，195:159-165(1981)，Weingarten等，Biochem.Biophys.Res.Comm.，139:1184-1187(1984)和美國專利號4，743，587和5，240，958。如上所述，采用上述方法，本發(fā)明的發(fā)明人能夠制備匪P-2和匪P-9的基質(zhì)金屬蛋白酶(匪P)抑制性抗體，簡稱6C6，這是SEQIDN0:1中所提供的序列。SEQIDNO:7、8、9、10、11和12中提供CDR序列。因此，本發(fā)明提供包含上述CDR序列和同源物及其片段中的至少一個(gè)的任何(多)肽序列，只要它保持金屬蛋白抑制活性(特異性抑制金屬蛋白的催化活性)。這類多肽的實(shí)例是抗體(見上文)。本文所用術(shù)語"多肽"包括天然肽類(或?yàn)榻到猱a(chǎn)物，或?yàn)楹铣呻幕蛑亟M肽)和模擬肽類(通常為合成肽)，以及作為肽類似物的擬肽和半擬肽(semip印toid)，它們具有這類修飾例如使得肽在體內(nèi)更穩(wěn)定或者更能夠透過細(xì)胞。這類修飾包括但不限于N端修飾、C端修飾、肽鍵修飾(包括但不限于CH2-NH、CH2-S、CH2-S=0、0=C_NH、CH2_0、CH2_CH2、S=C-NH、CH=CH或CF=CH)、主鏈修飾和殘基修飾。用于制備肽模擬化合物的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，具體參見例如QuantitativeDrugDesign,C.A.RamsdenGd.，第17.2章，F(xiàn).ChoplinPergamonPress(1992)，該文獻(xiàn)通過引用并入，如同其全篇公布于本文。下文中將提供這個(gè)方面的更多詳情。肽內(nèi)的肽鍵(-C0-NH-)可以被例如以下化學(xué)鍵和衍生物取代N-甲基化鍵(-N(CH3)-C0-)、酯鍵(-C(R)H-C-0-0-C(R)_N_)、酮基亞甲基鍵(_C0-CH2-)、a-氮雜鍵(-NH-N(R)-C0-)(其中R為甲基等任何烷基)、碳(carba)鍵(_CH2-NH_)、羥基亞乙基鍵(_CH(0H)-CH2_)、硫代酰胺鍵(-CS-NH-)、烯烴雙鍵(_CH=CH-)、逆酰胺鍵(-NH-C0-)、肽衍生物(-N(R)-CH廠C0-)，其中R為"正常"側(cè)鏈，天然存在于碳原子上。這些修飾可發(fā)生在沿肽鏈的任何鍵上，甚至同一時(shí)間發(fā)生在若干鍵上(2-3)。天然的芳族氨基酸Trp、Tyr和Phe還可以用例如以下非天然的合成酸取代苯基甘氨酸、Tic、萘基甘氨酸(n即htylalanine、Nal)、苯基異絲氨酸、去酮蘇氨酸(threoninol)、Phe的環(huán)甲基化衍生物、Phe或鄰甲基-Tyr的鹵化衍生物。除上述的以外，本發(fā)明的肽還可包括一個(gè)或多個(gè)修飾氨基酸或一個(gè)或多個(gè)非氨基酸單體(例如脂肪酸、復(fù)合糖等)。要了解的是，在本說明書和下面的權(quán)利要求書部分中，所用術(shù)語"氨基酸"包括20個(gè)天然存在的氨基酸；翻譯后常在體內(nèi)被修飾的氨基酸，包括例如羥脯氨酸、磷酸絲氨酸和磷酸蘇氨酸；以及其它不常用的氨基酸，包括但不限于2-氨基己二酸、羥賴氨酸、異鎖鏈素、正纈氨酸、正亮氨酸和鳥氨酸。此外，術(shù)語"氨基酸"同時(shí)包括D-氨基酸和L-氨基酸。下表1和表2列出可用于本發(fā)明的天然存在的氨基酸(表l)和不常用或修飾的氨基酸(例如合成的氨基酸，表2)。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>可通過本領(lǐng)域眾所周知的方法，包括噬菌體展示和計(jì)算生物學(xué)，來產(chǎn)生對目標(biāo)金屬蛋白酶的親和力改進(jìn)或生物活性提高的肽。可以通過肽合成領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何技術(shù)合成本發(fā)明的肽。對于固相肽合成，多項(xiàng)技術(shù)的概述可參見Stewart，J.M.和Young，J.D.(1963)，"SolidPhaseP印tideSynthesis(固相月太合成法)，，，W.H.FreemanCo.(SanFrancisco);及Meienhofer，J(1973)，"HormonalProteinsandP印tides(激素蛋白禾口肽)，，第2巻，第46頁，AcademicPress(NewYork)。有關(guān)經(jīng)典液相合成的綜述參見Schroder,G.和Lupke，K.(1965)。TheP印tides，第1巻，AcademicPress(NewYork)。有關(guān)重組技術(shù)還可參見下面更多的參考文獻(xiàn)。本發(fā)明還包括編碼上述多肽序列的核酸序列(參見SEQIDNO:13、14、15、16U7和18)。如上文中所述，本發(fā)明抗體的一個(gè)具體用途是預(yù)防或治療與金屬蛋白(例如金屬蛋白酶)活性失調(diào)或異常有關(guān)的疾病。這類疾病的實(shí)例包括但不限于關(guān)節(jié)炎疾病，例如骨關(guān)節(jié)炎(OA)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、膿毒性關(guān)節(jié)炎、軟組織風(fēng)濕病、多軟骨炎和腱炎；轉(zhuǎn)移性腫瘤；牙周??；角膜潰瘍，例如由堿灼傷或其它灼傷引起的角膜潰瘍、由輻射引起的角膜潰瘍、由維生素E或類視色素缺乏引起的角膜潰瘍；腎小球病，例如蛋白尿；營養(yǎng)不良性大皰性表皮松解(dytrophobicepidermolysisbullosa);骨再吸收疾病(boneresorptiondiseases)，例如骨質(zhì)疏松癥；佩吉特病(Paget'sdisease);甲狀旁腺功能亢進(jìn)和膽脂瘤；通過防止排卵或著床的節(jié)育；與腫瘤生長有關(guān)或與伴發(fā)糖尿病性視網(wǎng)膜病和黃斑變性的新血管形成有關(guān)的血管生成；伴發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化斑破裂的冠狀動(dòng)脈血栓形成；肺氣腫；傷口愈合和HIV感染。如實(shí)施例10中所述，本發(fā)明的發(fā)明人證實(shí)，本發(fā)明的抗體可用于治療腸易激病(irritableboweldisease)。炎性腸病(IBD)是嚴(yán)重的胃腸疾病，其特征是腸炎和組織重塑，發(fā)病頻率高，對于患者結(jié)果可能是致殘的。IBD的主要形式，即潰瘍性結(jié)腸炎(UC)和克羅恩病(Crohn'sdisease)是慢性復(fù)發(fā)性疾病，其臨床特征是腹痛、腹瀉、直腸出血和發(fā)熱。因此，根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供抑制有需要的受治療者的基質(zhì)金屬蛋白酶活性的方法。本發(fā)明優(yōu)選的個(gè)體受治療者為動(dòng)物，例如哺乳動(dòng)物(例如犬、貓、綿羊、豬、馬、牛、靈長類)，優(yōu)選為人。該方法包括向受治療者提供治療有效量的本發(fā)明匪P抑制劑(即上文所述的抗體或抗體片段)。正如下文中的進(jìn)一步詳述，可通過直接給藥來提供匪P抑制劑(例如口服給藥或注射)，或者可由所給予個(gè)體靶細(xì)胞的多核苷酸構(gòu)建體表達(dá)。將本發(fā)明的匪P抑制劑本身提供給個(gè)體，或者可作為其中與藥學(xué)上可接受的載體相混合的藥物組合物的組成部分提供給個(gè)體。本文所用的"藥物組合物"是指一種或多種本文所述的活性成分與生理上合適的載體和賦形劑等其它化學(xué)組分的制劑。藥物組合物的目的是有助于將化合物給予生物。本文術(shù)語"活性成分"是指負(fù)責(zé)生物效應(yīng)的抗體制備物。下文術(shù)語"生理上可接受的載體"和"藥學(xué)上可接受的載體"可以互換使用，是指不會(huì)對生物產(chǎn)生明顯剌激性并且不會(huì)削弱所給予化合物的生物活性和性能的載體或稀釋劑。佐劑包括在這些術(shù)語內(nèi)。包括在藥學(xué)上可接受的載體中的成分之一可為例如聚乙二醇25(PEG)、多種同時(shí)可溶于有機(jī)介質(zhì)和水性介質(zhì)的生物相容性聚合物(Mutter等(1979)。本文術(shù)語"賦形劑"是指加到藥物組合物中以進(jìn)一步促進(jìn)活性成分給藥的惰性物質(zhì)。賦形劑的實(shí)例包括但不限于碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖和淀粉類型、纖維素衍生物、明膠、植物油和聚乙二醇類。藥物的制備禾口給藥技術(shù)可參見"Remington'sPharmaceuticalSciences"，MackPublishingCo.，Easton，PA，最新版本，該文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中。例如，合適的給藥途徑可包括口服、直腸、經(jīng)黏膜，尤其是經(jīng)鼻、經(jīng)腸或胃腸外遞送，包括肌內(nèi)、皮下和髓內(nèi)注射以及鞘內(nèi)、直接腦室內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)或眼內(nèi)注射?；蛘?，可以按局部方式而不是按全身方式給予制劑，例如通過將制劑直接注射到患者體內(nèi)的特定部位。本發(fā)明的藥物組合物可通過本領(lǐng)域眾所周知的方法制備，例如通過常規(guī)的混合、溶解、制粒、包糖衣(dragee-making)、水飛(levigating)、乳化、包囊、包封或凍干步驟。本發(fā)明的藥物組合物可以按常規(guī)方式，使用一種或多種生理上可接受的載體(包括賦形劑和助劑)來配制，所述賦形劑和助劑促進(jìn)活性成分加工成可以藥用的制劑。合適的劑型取決于所選擇的給藥途徑。對于注射，可以在水溶液中，優(yōu)選中在生理上相容的緩沖液(例如Hank溶液(Hank'ssolution)、林格液(Ringer'ssolution)或生理鹽緩沖液)中配制本發(fā)明的活性成分。對于經(jīng)黏膜給藥，在劑型中使用適于待滲透屏障的滲透劑。這類滲透劑一般為本領(lǐng)域所知。對于口服給藥，可容易地通過將活性化合物與本領(lǐng)域眾所周知的藥學(xué)上可接受的載體相混合來配制所述化合物。這類載體能夠使本發(fā)明的化合物配制成片劑、丸劑、錠劑、膠囊劑、液體制劑、凝膠劑、糖漿劑、膏劑、混懸劑等，以用于患者口服攝取。可以使用固體賦形劑，任選將所得混合物研磨，并對顆?；旌衔镞M(jìn)行加工，如有需要在加入合適的助劑之后，得到片劑或錠劑片芯，從而制備口服使用的藥物制劑。合適的賦形劑尤其為填充劑，例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纖維素制品，例如玉米淀粉、小麥淀粉、稻米淀粉、馬鈴薯淀粉、明膠、西黃蓍膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉；和/或生理上可接受的聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如有需要，可以加入崩解劑，例如交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂或海藻酸或其鹽，例如藻酸鈉。錠劑片芯包有合適的包衣。為此，可以使用濃縮的糖溶液，它可任選含有阿拉伯樹膠、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、卡波普膠、聚乙二醇、二氧化鈦、清漆溶液(lacquersolution)和合適的有機(jī)溶劑或溶劑混合物。還可將染料或顏料加到片劑或錠劑包衣中以鑒定或鑒別活性化合物劑量的不同組合?？梢钥诜褂玫乃幬锝M合物包括由明膠制成的推合式膠囊劑(push-fitcapsules)以及由明膠和增塑劑(例如甘油或山梨醇)制成的密封膠囊劑。推合式膠囊劑可含有活性成分以及與之混合的填充劑例如乳糖、粘合劑例如淀粉類、潤滑劑例如滑石粉或硬脂酸鎂以及任選穩(wěn)定劑。在軟膠囊劑中，可將活性成分溶于或懸浮于合適的液體中，例如脂肪油、液狀石蠟或液態(tài)聚乙二醇。另外，可加入穩(wěn)定劑。用于口服給藥的所有劑型都應(yīng)為適于所選擇的給藥途徑的劑量。對于口腔給藥，組合物可采用按常規(guī)方式配制的片劑或糖錠劑形式。對于通過經(jīng)鼻吸入給藥，根據(jù)本發(fā)明使用的活性成分便于以氣溶膠噴霧劑的形式由使用合適拋射劑的壓縮包裝或噴霧器遞送，合適的拋射劑例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氟四氟乙烷或二氧化碳。在壓縮氣溶膠的情況下，可以通過提供以定量遞送的閥門來確定劑量單位。用于分配器的例如明膠的膠囊和筒，可以制成裝有化合物和合適的粉末基質(zhì)(例如乳糖或淀粉)的粉末混合物。可以配制本文所述制劑用于胃腸外給藥，例如通過推注注射或連續(xù)輸注。用于注射的劑型可呈單位劑型，例如安瓿或多劑量容器，任選加入防腐劑。組合物可以是油性或水性溶媒中的混懸劑、溶液劑或乳劑，并可含有調(diào)配劑(formulatoryagent)，例如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。胃腸外給藥的藥物組合物包括水可溶形式的活性制劑水溶液。另外，活性成分的混懸劑可制備成合適的油基或水基注射混懸劑。合適的親脂性溶劑或溶媒包括脂肪油(例如芝麻油)或合成脂肪酸酯(例如油酸乙酯、甘油三酯)或脂質(zhì)體。水性注射混懸劑可含有增加混懸劑粘度的物質(zhì)，例如羧甲基纖維素鈉、山梨醇或葡聚糖。任選地，混懸劑還可含有合適的穩(wěn)定劑或增加活性成分溶解度的物質(zhì)供制備高度濃縮的溶液劑。或者，活性成分可以是粉針劑的形式，在使用前用合適的溶媒(例如無熱原的無菌水基溶液)配制。本發(fā)明的制劑還可以使用例如常用的栓劑基質(zhì)(例如可可脂或其它甘油酯)配制成直腸用組合物，例如栓劑或滯留型灌腸劑。適用于本發(fā)明這個(gè)方面的藥物組合物包括這樣組合物，其中活性成分以可達(dá)到既定目的的有效量包含于其中。更準(zhǔn)確地講，治療有效量是指活性成分的量可有效地預(yù)防、減輕或改善疾病癥狀或延長待治療的受治療者的存活時(shí)間。治療有效量的確定盡在本領(lǐng)域技術(shù)人員掌握之中。對于用于本發(fā)明方法的任何制劑，治療有效量或劑量可從體外實(shí)驗(yàn)中作出初步估計(jì)。例如，可以在動(dòng)物模型中配制的劑量以及這類信息可以用來更準(zhǔn)確的確定在人體中的有益劑量。本文所述活性成分的毒性和治療功效可通過體外標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)方法，在細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中確定。從這些體外實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)及動(dòng)物研究中獲得的數(shù)據(jù)，可以用于配制用于人的各種劑量。劑量可根據(jù)所使用的劑型和所采用的給藥途徑而變化。確切的劑型、給藥途徑和劑量可由各醫(yī)師考慮患者病況后做出選擇[參見例如Fingl等，(1975)"ThePharmacologicalBasisofTherapeutics",第1章，第1頁]。根據(jù)待治療疾病的嚴(yán)重程度和反應(yīng)性，給藥可以是單次給藥或多次給藥，其中療程持續(xù)數(shù)天至數(shù)周，或者直到達(dá)到治愈，或者達(dá)到減輕疾病的狀態(tài)。待給予的組合物的量必然將取決于待治療的受治療者、疾病的嚴(yán)重程度、給藥方式、處方醫(yī)師的判斷等等。還可以制備包括配制在與之相容的藥物載體中的本發(fā)明的制備物的組合物，將其裝入合適的容器中，并貼上用于治療指定疾病的標(biāo)簽。如有需要，本發(fā)明的組合物可以存在于包裝或分配裝置中，例如經(jīng)FDA核準(zhǔn)的藥盒，藥盒可裝有一種或多種含有活性成分的單位劑型。例如，包裝可包括金屬或塑料薄膜(plastic)，例如泡罩包裝。包裝或分配裝置可隨附給藥說明書。包裝或分配器還可隨容器附上通知書，通知書的格式由監(jiān)管藥品的生產(chǎn)、使用或銷售的政府機(jī)構(gòu)規(guī)定，通知書上注明組合物的形式或者人用或獸用給藥已獲政府機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)。例如，這類通知書可以是經(jīng)美國食品與藥物管理局(U.S.FoodandDrugAdministration)批準(zhǔn)的處方藥物標(biāo)簽或核準(zhǔn)的藥品插頁。如上文中所述，本發(fā)明的抗體抑制劑可以由核酸構(gòu)建體表達(dá)。應(yīng)當(dāng)了解的是，編碼本發(fā)明抗體的多核苷酸優(yōu)選還編碼使抗體分泌或運(yùn)輸?shù)礁信d趣的亞細(xì)胞或胞外定位的信號肽。例如，當(dāng)靶金屬蛋白為匪P時(shí)，分泌信號肽優(yōu)選符合讀框地與編碼抗體區(qū)段的多核苷酸綴合。還要進(jìn)一步了解的是，重組單鏈Fv(ScFv)片段可以優(yōu)選表達(dá)，因?yàn)榕c完整抗體分子相比，它們的結(jié)構(gòu)復(fù)雜度明顯降低。如上文中所述，ScFv是由、和VH抗體多肽鏈組成的蛋白質(zhì)，其中、的羧基端通過肽橋與VH的氨基端連接而合成為單鏈。重組產(chǎn)生這些肽的方法是本領(lǐng)域眾所周知的[參見Bird等，Science242:423-426(1988);Huston等，Proc.Nat'1Acad.Sci.USA85:5879-5883(1988);及deKruif等，J.Mol.Biol.248:97-105(1995)]。根據(jù)本發(fā)明這個(gè)方面的實(shí)施方案，在用本發(fā)明化合物免疫后，由經(jīng)免疫的動(dòng)物中收獲脾臟mRNA，并用來在展示ScFv片段的噬菌體中產(chǎn)生cDNA文庫。然后篩選噬菌體顆粒，以確定特異性并優(yōu)選與目標(biāo)金屬蛋白活化形式發(fā)生相互作用的噬菌體顆粒。從這些噬菌體顆粒中回收ScFv區(qū)段，并克隆到表達(dá)構(gòu)建體中(參見美國專利第5，800，814號)?？梢詫⒈景l(fā)明這個(gè)方面的核酸構(gòu)建體給予個(gè)體受治療者的靶細(xì)胞(即體內(nèi)基因療法)?；蛘?，通過合適的基因遞送溶媒/方法(轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、同源重組等)和所需要的表達(dá)系統(tǒng)將核酸構(gòu)建體導(dǎo)入合適的細(xì)胞，然后使修飾細(xì)胞在培養(yǎng)中增殖，再送回到個(gè)體體內(nèi)(即離體基因療法)。為了使本發(fā)明的抗體或抗體片段能夠進(jìn)行細(xì)胞表達(dá)，本發(fā)明的核酸構(gòu)建體還包括至少一個(gè)順式作用調(diào)節(jié)元件。本文所用術(shù)語"順式作用調(diào)節(jié)元件"是指多核苷酸序列，優(yōu)選為啟動(dòng)子，它與反式作用調(diào)節(jié)子結(jié)合并調(diào)節(jié)位于其下游的編碼序列的轉(zhuǎn)錄。本發(fā)明的方法可以使用任何可利用的啟動(dòng)子。在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明核酸構(gòu)建體所用的啟動(dòng)子在特定的轉(zhuǎn)化細(xì)胞群中具有活性。細(xì)胞類型特異性和/或組織特異性啟動(dòng)子的實(shí)例包括例如以下啟動(dòng)子肝臟特異性的白蛋白[Pinkert等(1987)GenesDev.1:268-277]、淋巴特異性啟動(dòng)子[Calame等(1988)Adv.Immunol.43:235-275];特別是T細(xì)胞受體的啟動(dòng)子[Winoto等(1989)EMB0J.8:729-733]和免疫球蛋白的啟動(dòng)子[Banerji等(1983)Cell33729-740];神經(jīng)元特異性啟動(dòng)子，例如神經(jīng)絲啟動(dòng)子[Byrne等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:5473-5477];胰腺特異性啟動(dòng)子[Edlunch等(1985)Science230:912-916]或乳腺特異性啟動(dòng)子，例如乳清啟動(dòng)子(美國專利第4，873，316號和歐洲申請公布號264，166)。本發(fā)明的核酸構(gòu)建體可進(jìn)一步包括增強(qiáng)子，它可以接近或遠(yuǎn)離啟動(dòng)子序列，并可在上調(diào)由此開始的轉(zhuǎn)錄中起作用。本發(fā)明方法的構(gòu)建體優(yōu)選進(jìn)一步包括合適的選擇標(biāo)記和/或復(fù)制起點(diǎn)。優(yōu)選所用的構(gòu)建體是穿梭載體，它既可以在大腸桿菌中擴(kuò)增(其中構(gòu)建體包含合適的選擇標(biāo)記和復(fù)制起點(diǎn))，又可與細(xì)胞增殖相容或整合到所選的基因和組織中。例如，本發(fā)明的構(gòu)建體可以是質(zhì)粒、桿粒(bacmid)、噬菌粒、黏粒、噬菌體、病毒或人工染色體?，F(xiàn)行優(yōu)選的體內(nèi)核酸轉(zhuǎn)移技術(shù)包括用病毒或非病毒構(gòu)建體轉(zhuǎn)染，所述構(gòu)建體例如腺病毒、慢病毒、單純皰疹I(lǐng)病毒或腺伴隨病毒(AAV)及基于脂質(zhì)體的系統(tǒng)。用于脂質(zhì)_介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移的有益的脂質(zhì)為例如DOTMA、DOPE和DC-Choi[Tonkinson等，CancerInvestigation,14(1):54_65(1996)]。用于基因療法的最優(yōu)選的構(gòu)建體為病毒，最優(yōu)選為腺病毒、AAV、慢病毒或反轉(zhuǎn)錄病毒。病毒構(gòu)建體(例如反轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建體)包括至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子/增強(qiáng)子或基因座限定元件(locus-definingelement)或通過其它方法(例如可變剪接、核RNA輸出或信使的翻譯后修飾)控制基因表達(dá)的其它元件。這類載體構(gòu)建體還包括包裝信號、長末端重復(fù)序列(LTR)或其部分以及適于所用病毒的正鏈和負(fù)鏈引物結(jié)合部位，除非它已存在于病毒構(gòu)建體中。另外，這類構(gòu)建體通常還包括用于肽或抗體從其所處宿主細(xì)胞中分泌出來的信號序列。優(yōu)選用于此目的的信號序列是哺乳動(dòng)物信號序列。任選構(gòu)建體還可包括指導(dǎo)聚腺苷酸化的信號，以及一個(gè)或多個(gè)限制位點(diǎn)和翻譯終止序列。舉例來說，這類構(gòu)建體通常可包括5'LTR、tRNA結(jié)合部位、包裝信號、DNA第二鏈合成起點(diǎn)和3'LTR或其部分?？梢允褂檬欠遣《镜钠渌d體，例如陽離子脂質(zhì)、聚賴氨酸和樹狀聚體。實(shí)施基因療法方案的優(yōu)選模型可參見Somia和Verma[(2000)NatureReviews1:91-99]、Is證(2002)Myocardialgenetherapy(心肌基因療法).Nature415:234-239;High(2001)Genetherapy:a2001perspective(基因療法2001年展望).Haemophilia7:23-27;及Hammond禾口McKirnan(2001)Angiogenicgenetherapyforheartdisease:areviewofanimalstudiesandclinicaltrials(用于心臟病的血管生成基因療法動(dòng)物研究與臨床試驗(yàn)綜述).49:561-567。由于本發(fā)明抗體差異性識別金屬蛋白活化形式的能力(參見實(shí)施例部分的實(shí)施例3)，因此可用作有效的診斷和預(yù)后工具，例如通過監(jiān)測生物樣品[即任何身體樣品，例如血液(血清或血漿)、唾液、腹水、胸膜積液、尿液、活檢樣品、分離細(xì)胞和/或細(xì)胞膜制備物]中的匪P活性。當(dāng)評價(jià)其中匪P活化失調(diào)促使腫瘤侵襲的癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移特點(diǎn)時(shí)，這就變得特別重要。同樣，本發(fā)明的抗體可以用于監(jiān)測匪P抑制劑的治療劑量。對于這類應(yīng)用，本發(fā)明的抗體優(yōu)選采用在本領(lǐng)域有標(biāo)準(zhǔn)用途的放射性、熒光、生物或酶標(biāo)簽或標(biāo)記的任一種標(biāo)記。有關(guān)這類標(biāo)記用途的美國專利包括美國專利號3，817，837、3，850，752、3，939，350、3，996，345、4，277，437、4，275，149和4，366，241。應(yīng)當(dāng)了解的是，這類檢測方法還可用于高通量篩選新的匪P。簡單地說，可使多個(gè)生物樣品與本發(fā)明的抗體接觸，其中活化匪P與所述抗體連接。采取措施來使用包括例如得自腫瘤細(xì)胞系的活化匪P的生物樣品。通常，使用放射性標(biāo)記以減少實(shí)驗(yàn)體積?；蛘撸景l(fā)明的抗體可以用來純化生物樣品中的活性金屬酶。多種蛋白質(zhì)純化方法為本領(lǐng)域所知。例如，本發(fā)明的抗體或抗體片段可用于親合層析法以分離金屬酶?？梢灾苽淦渲兴隹贵w與固體基材連接的柱子，固體基材例如瓊脂糖、交聯(lián)葡聚糖(S印hadex)等顆粒，使細(xì)胞裂解物等生物樣品過柱，洗滌柱子后，通過濃度遞增的溫和變性劑，從而可釋放出純的金屬酶。診斷或治療藥盒內(nèi)可包括根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)內(nèi)容產(chǎn)生的抗體或其片段?？贵w或抗體片段可與適當(dāng)?shù)木彌_劑和防腐劑一起包裝在一個(gè)或多個(gè)容器中，用于診斷或用于直接的治療性治療。因此，抗體或其片段各自可以在單一容器中混合，或者放在各自的容器中。優(yōu)選容器包括包裝標(biāo)簽。合適的容器包括例如瓶、小瓶、注射器和試管。容器可由多種材料(例如玻璃或塑料)制成。另外，還可以加入其它添加劑，例如穩(wěn)定劑、緩沖劑、阻斷劑等。這類藥盒中的抗體還可與固體支持體(例如微珠、陣列基材(例如芯片)等)連接，并用于診斷目的。藥盒還可包括說明書，以確定受試對象是否患有與目標(biāo)匪P表達(dá)有關(guān)的病癥、障礙或疾病，或者是否有患與目標(biāo)匪P表達(dá)有關(guān)的病癥、障礙或疾病的風(fēng)險(xiǎn)。考察以下實(shí)施例，本發(fā)明的其它目的、優(yōu)勢和新的特征對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是顯而易見的，這些實(shí)施例并不是限制性的。另外，本文上述的，以及所附權(quán)利要求書部分所要求保護(hù)的本發(fā)明各個(gè)不同的實(shí)施方案和方面，都可以在下述實(shí)施例中找到實(shí)驗(yàn)支持。實(shí)驗(yàn)例下面參考以下實(shí)施例并結(jié)合上述說明書，以非限制性方式對本發(fā)明進(jìn)行說明。—般而言，本文所用術(shù)語和本發(fā)明所采用的實(shí)驗(yàn)室方法包括分子學(xué)、生物化學(xué)、微生物學(xué)和重組DNA技術(shù)。文獻(xiàn)中有對這類技術(shù)的詳細(xì)說明。參見例如"MolecularCloning:AlaboratoryMa麗l(分子克隆實(shí)驗(yàn)指南)，，Sambrook等，(1989);"CurrentProtocolsinMolecularBiology(現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南)"，第I-III巻，Ausubel，R.M.編著(1994);Ausubel等，"CurrentProtocolsinMolecularBiology(現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南)"，JohnWiley禾口Sons,Baltimore,Maryland(1989);Perbal，"APracticalGuidetoMolecularCloning(分子克隆實(shí)驗(yàn)指南)"，JohnWiley&Sons,NewYork(1988);Watson等，"RecombinantDNA(重組DNA)，，，ScientificAmericanBooks,NewYork;Birren等(編著)"GenomeAnalysis:ALaboratoryManualSeries(基因組分析試驗(yàn)手冊系列)"，第1-4巻，ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork(1998);美國專利號4，666，828;4，683，202、4，801，531、5，192，659和5，272，057中公開的方法;"CellBiology:ALaboratoryHandbook(細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊)"，第I-III巻，Cellis，J.E.編著(1994);"CurrentProtocolsinImmunology(現(xiàn)代免疫學(xué)指南)，，第I-III巻，ColiganJ.E.編著(1994);Stites等(編著)，"BasicandClinicalImmunology(基礎(chǔ)和臨床免疫學(xué))"(第8版)，Appleton&Lange，Norwalk，CT(1994);MishellShiigi(編著)，"SelectedMethodsinCellularImmunology(細(xì)胞免疫學(xué)精選方法)"，W.H.FreemanandCo.，NewYork(1980);專利和科技文獻(xiàn)中披露了可應(yīng)用的大量免疫測定法，參見例如美國專利號3，791，932、3，839，153、3，850，752、3，850，578、3，853，987、3，867，517、3，879，262、3，901，654、3，935，074、3，984，533、3，996，345、4，034，074、4，098，876、4，879，219、5，011，771和5，281，521;"01igo皿cleotideSynthesis(寡核苷酸合成)"Gait，M.J.編著(1984);"NucleicAcidHybridization(核酸雜交)，，Hames，B.D.禾口HigginsS.J.編著(1985);"TranscriptionandTranslation(轉(zhuǎn)錄禾口番羽i華)，，Hames，B.D.禾口HigginsS.J.編著(1984);"AnimalCellCulture(動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng))"Freshney，R.I.編著(1986);"ImmobilizedCellsandEnzymes(固定化細(xì)胞禾口酶)"IRLPress，(1986);"APracticalGuidetoMolecularCloning(分子克隆實(shí)踐指南)"Perbal，B.，(1984)禾口"MethodsinEnzymology(酶學(xué)方法)，，第1-317巻，AcademicPress;"PCRProtocols:AGuideToMethodsAndApplications(PCR方案方法禾口應(yīng)用指南)"，AcademicPress,SanDiego，CA(199Q);Marshak等，"StrategiesforProteinPurificationandCharacterization_APress(1996);所有文獻(xiàn)都通過引用結(jié)合到本文，正如本文中全部列出的一樣。還提供貫穿本文的其它一般性參考文獻(xiàn)。我們認(rèn)為其中的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，僅為了方便讀者而在此提供。所有包括在其中的資料都通過引用結(jié)合到本文中。材料與方法重組酶-使匪P-2的催化結(jié)構(gòu)域(GenBank檢索號NP032636.1的氨基酸110-467)在T7啟動(dòng)子控制下在BL-21細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。細(xì)胞用lmM異丙基-e-D-硫代半乳吡喃糖苷誘導(dǎo)5小時(shí)。按緩沖液與最初培養(yǎng)體積為1:25的比率，將細(xì)胞沉淀重新懸浮于50mMTris(pH8.0)、0.5mMEDTA、50mMNaCl、5X甘油和1%曲通(Triton)X-100中。該懸液以15，000rpm離心10分鐘，將沉淀溶于50mMTris(pH8.0)、0.5mMEDTA、50mMNaCl、5X甘油和0.2%肌氨酰后，在冰上溫育30分鐘。將上清液部分加到5ml明膠-瓊脂糖柱(預(yù)裝，AmershamBiosciences)上，預(yù)平衡后用透析緩沖液(50mMTris(pH8.0)、50mMNaCl、5mMCaCl2、10iiMZnCl2、0.02%節(jié)澤(Brij))洗滌。蛋白質(zhì)用50mMTris(pH8.0)、1MNaCl、5mMCaCl2、10iiMZnCl2、0.02%節(jié)澤和15%Me2SO洗脫[Rosen，0.，Inhibitionof匪PsbyMonoclonalAntibodies(通過單克隆抗體抑制匪P)2001]，用SDS-PAGE測定，通過熒光肽降解測定其催化活性[Knight，C.G.，F(xiàn).Willenbrock和G.Murphy，Anovelcoumarin—labelledpeptideforsensitiveconti皿ousassaysofthematrixmetalloproteinases(用于基質(zhì)金屬蛋白靈敏性連續(xù)測定的新的香豆素標(biāo)記的肽).FEBSLett,1992.296(3):第263-6頁]。將pTWIN表達(dá)載體中的Pro-MMP-9[缺乏鉸鏈區(qū)和血紅素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域，Alal-Gly424|P14780|MMP9人基質(zhì)金屬蛋白酶_9前體(MMP-9)(EC3.4.24.35)]在大腸桿菌ER2566中表達(dá)，并按照較早文獻(xiàn)中所述方法從包含體中純化至均質(zhì)[Bjorklund，M.，P.Heikkila禾口E.Koiv皿en，Peptideinhibitionofcatalyticandnoncatalyitcactivitiesofmatrixmetalloproteinase_9blockstumorcellmigrationandinvasion(肽抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-9的催化和非催化活性阻斷腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲).JBiolChem，2004.279(28):第29589-97頁]。Pro-匪P-9用ImM對氨基苯乙酸滎(APMA，ICNBiomedicalsInc.，Ohio,USA)激活，在37。C下溶于200mMTris達(dá)30分鐘。使人重組pro-匪P-2和pro_MMP-9在用相應(yīng)的重組痘苗病毒感染的HeLaS3細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，并按前述方法純化至均質(zhì)。四羧基苯基嚇啉Co(II)/Zn(n)(CoTCPP/ZnTCPP)-按文獻(xiàn)所述方法，使ZnCl2與TCPP的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液反應(yīng)合成ZnTCPP[Harada，A.等，Controlofphotoinducedelectrontransferfromzinc-porphyrintomethylviologenbysupramolecularformationbetweenmonoclonalantibodyandzinc_porphyrin(通過在單克隆抗體與鋅-卟啉之間形成超分子來控制光誘導(dǎo)的電子由鋅-卟啉轉(zhuǎn)移到甲基紫羅堿上)PhotochemPhotobiol，1999.70(3):第298-302頁]。按文獻(xiàn)所述方法，使Co(OAc)24H20與TCPP的DMF溶液反應(yīng)來合成CoTCPP[Harada，A.等，Controlofphotoinducedelectrontransferfromzinc-porphyrintomethylviologenbysupramolecularformationbetweenmonoclonalantibodyandzinc_porphyrin(通過在單克隆抗體與鋅_卟啉之間形成超分子來控制光誘導(dǎo)的電子由鋅_卟啉轉(zhuǎn)移到甲基紫羅堿上)PhotochemPhotobiol，1999.70(3):第298-302頁]，并純化。Imisdp的合成-見下文實(shí)施例7中所述。半抗原與蛋白質(zhì)綴合-通過加入l，l'-羰基二咪唑的DMF溶液(摩爾比率為1:l)，并溫育1小時(shí)，激活半抗原(4mg)用于綴合。將1-50moles的活化半抗原加到20mg/mLBSA或匙孔蛾血藍(lán)蛋白(KLH)的0.1M碳酸鹽緩沖液(pH8)中。將該溶液在室溫下攪拌3小時(shí)后，針對PBS充分透析。免疫和融合_使用綴合CoTCPP、ZnTCPP或Imisdp的各佐劑(KLH)使BALB/c小鼠免疫。按照標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行免疫，隨后與NSO骨髓瘤細(xì)胞系融合[Harlow，E.和Lane，D.，UsingAntibodies:ALaboratoryManualPortableProtocolNo.I.1998]?？贵w篩選ELISA-采用直接ELISA，其中相應(yīng)的半抗原-BSA(3iig/ml/PBS)包被在Nuncmaxisorp板上，篩選生長的雜交瘤上清液中與ZnTCPP、CoTCPP或Imisdp有反應(yīng)性的抗體。在4t:下進(jìn)行包被過夜，在2(TC下與抗體溫育1小時(shí)。HRP綴合的抗小鼠mAb(Sigma)用作第二抗體，2，2'-連氮基-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸，ABTS，Sigma)用作底物。含有0.005%(體積/體積)吐溫20(Tween20)的PBS(PBST)用作洗滌劑。稀釋緩沖液為PBS。在SPECTRAFluorPlus分光計(jì)(Tecan，Austria)中用微量板讀板儀記錄A602。按同樣方式，使對照上清液與BSA包被板一起溫育。0.5毫光密度(milliopticaldensity)以上的吸光度值被視為陽性。競爭ELISA-根據(jù)早前所述步驟，將不同的稀釋度的雜交瘤上清液用半抗原-BSA包被板溫育。繪制滴定曲線，在50%結(jié)合時(shí)測定滴定稀釋度(titerdilution)。根據(jù)之前所述步驟，將稀釋至滴定濃度的上清液與可溶性ZnTCPP、CoTCPP或Imisdp化合物一起預(yù)溫育30分鐘后，轉(zhuǎn)移到半抗原包被的微量滴定板。估算的解離常數(shù)為達(dá)到50%結(jié)合所需的可溶性半抗原的濃度。制備與純化-所選擇的雜交瘤通過有限稀釋亞克隆兩次，接著將姥鮫烷(pristine)(2，6，10，14-四甲基十五碳烷)預(yù)處理的腹水瘤給BALB/c小鼠注射，來進(jìn)行大規(guī)模制備。MAb用G蛋白瓊脂糖(S印harose)4FastFlow(AmershamBiosciences)親合層析法純化。按12，000g將腹水離心15分鐘，除去不溶性顆粒和脂質(zhì)。lmL腹水用PBS稀釋至5倍體積后，加到5mL柱體積G蛋白瓊脂糖中。通過SDS-PAGE對洗脫峰進(jìn)行分析。同種型測定-將從生長在培養(yǎng)瓶中經(jīng)克隆的雜交瘤中獲得的培養(yǎng)物上清液用作mAb源。通過小鼠單克隆抗體同種型測定試劑盒(MouseMonoclonalAntibodyIsotypingKit)(HyCultbiotechnologyb.v.，TheNetherlands)確定各抗體的同種型。純化抗體的免疫印跡分析_用8%SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離出純化抗體，轉(zhuǎn)印到NC膜(Bio-Rad)上，隨后使用抗匪P-9抗體(Sigma)進(jìn)行免疫印跡分析。與辣根過氧化物酶(Sigma)綴合的山羊抗小鼠IgG被用作第二抗體。應(yīng)用ECL(Pierce)對信號進(jìn)行檢測。使用純化蛋白質(zhì)的結(jié)合測定法-將MAb(lOyg)與抗小鼠IgG瓊脂糖微珠(Sigma)一起在PBS中于fC溫育過夜。洗滌未結(jié)合的抗體之后，在室溫下溫育2小時(shí)后，加入純化的Pro-匪P-2、Pro-匪P-9、匪P-2催化結(jié)構(gòu)域、MT1催化結(jié)構(gòu)域或TACE(2iig)。微珠經(jīng)離心收集，并用PBS洗滌三次。保持與微珠結(jié)合的蛋白質(zhì)用SDS樣品緩沖液洗脫，通過SDS-PAGE分級分離后，用考馬斯藍(lán)染色進(jìn)行檢測。免疫沉淀與蛋白質(zhì)印跡-將HT1080細(xì)胞接種到培養(yǎng)皿中。達(dá)到80%匯合后，更換培養(yǎng)基(補(bǔ)充了10XFCS、非必需氨基酸、青霉素、鏈霉素、丙酮酸鈉和L-谷氨酰胺的DMEM)為無血清培養(yǎng)基(無FCS)。再溫育24小時(shí)后，由貼壁細(xì)胞收獲條件培養(yǎng)液(CM)后，使用MilliporeCentricon-10(Bedford,MA)濃縮。將濃縮的上清液用于免疫沉淀。將CM與抗1(CoTCPP)mAb(15iig/ml)—起在4。C下溫育過夜。將A蛋白瓊脂糖(CL-4BAmershamBiosciences)加到樣品中，并在室溫下混合2小時(shí)。微珠用PBS洗滌3次后，懸浮于SDS樣品緩沖液中，加熱到95t:達(dá)3分鐘。通過離心回收免疫沉淀物，并進(jìn)行SDS/PAGE。分離之后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到硝化纖維(NC)膜上，用抗匪P-2抗體探查。為了激活由HT1080細(xì)胞產(chǎn)生的Pro匪P-2，將lmM4-氨基苯乙酸滎(APMA)加到濃縮的CM中后，在37t:下溫育6小時(shí)?；罨?，將CM在4t:下針對PBS透析(3次)，除去APMA。如上所述用活化培養(yǎng)基進(jìn)行免疫沉淀。采用直接ELISA與活性匪P-9結(jié)合-使MMP-9催化結(jié)構(gòu)域(2yg/ml)固定在微量滴定板各孔中。根據(jù)ELISA篩選中所述相同方法，將mAb(lmg/ml)加到各孔中。抗匪P-9抗體(Sigma)用作陽性對照，由腹水中純化的非相關(guān)小鼠IgG親和力用作陰性對照。動(dòng)力學(xué)分析_按照之前所述，測量酶促匪P活性[Solomon,A.等，Pronounceddiversityinelectronicandchemicalpropertiesbetweenthecatalyticzincsitesoftumornecrosisfactor—alpha—convertingenzymeandmatrixmetalloproteinasesdespitetheirhighstructuralsimilarity(月中瘤壞死因子一a—轉(zhuǎn)化醇與基質(zhì)金屬蛋白酶催化性鋅部位間盡管結(jié)構(gòu)相似性高但其電化學(xué)性質(zhì)仍具有顯著的多樣性).JBiolChem，2004.279(30):第31646-54頁]。按照Knight等人所述[FEBSLett,1992.296(3):第263_6頁]，通過在Aex=MOnm和Aem=390nm下監(jiān)測熒光肽Mca-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-NH2(購自Calbiochem-NovabiochemAG)的降解，來測定匪P-9、匪P-2和MT1-匪P的活性。標(biāo)準(zhǔn)測定混合物含有50mMTris緩沖液(pH7.5)、200mMNaCl、5mMCaCl2、20iiMZnCl2和0.05%節(jié)澤。通過監(jiān)測熒光肽QF-45(Mca-Ser-Pro-Leu-Ala-Gln-Ala-Val-Arg-Ser-Ser-Ser-Arg-Lys(二硝基苯基)-NH2)(購自Calbiochem-NovabiochemAG)的降解，來測定TACE的酶活性。原位酶譜法-為了通過原位酶譜法確定匪P的凈明膠分解活性的位置，將分子內(nèi)猝滅的異硫氰酸熒光素標(biāo)記的DQ明膠(MolecularProbes)用作由明膠酶降解的底物。通過明膠酶的蛋白酶解得到切割的異硫氰酸熒光素_明膠肽，該熒光定位表明凈明膠分解活性的部位。簡單來講，將人纖維肉瘤HT1080細(xì)胞(它產(chǎn)生匪P-2、匪P-9和MT1-匪P)置于12mm蓋玻片上。在24小時(shí)溫育后，細(xì)胞用liiM13E11mAb在37"下處理30分鐘。未處理細(xì)胞用作本實(shí)驗(yàn)的陰性對照。細(xì)胞用PBS洗滌后，與含有60iig/mlDQ明膠的酶譜法反應(yīng)緩沖液(0.05MTris-HCl、0.15MNaCl、5mMCaCl2禾P0.2mMNaN3(pH7.6)—起在37。C下溫育過夜，高濃度的疊氮化物防止明膠被吞噬，因此使細(xì)胞表面明膠分解活性得以出現(xiàn))。對于處理細(xì)胞，酶譜法緩沖液含有1PMCoTCPPmAb。溫育期結(jié)束時(shí)，無需固定或進(jìn)一步洗滌，確定匪P的明膠分解活性的位置，并用熒光顯微鏡拍照，并通過Spot數(shù)碼照相機(jī)拍攝影像。33實(shí)施例1鋅活性部位通過小型有機(jī)金屬化合物的構(gòu)象模擬匪P活性部位的鋅離子是通過3個(gè)保守組氨酸殘基均勻配位的。在酶原活化和底物蛋白酶解期間，鋅配位由處于非催化階段的4-配位四面體幾何結(jié)構(gòu)變化成為處于催化階段的5-配位三角雙錐體[Auld，D.S.，Zinccoordinationsphereinbiochemicalzincsites(生物化學(xué)鋅部位的鋅配位球體).Biometals，2001.14(3_4):第271-313頁]。因此，保守組氨酸相對于鋅離子可呈不同的幾何結(jié)構(gòu)。為了取得這些構(gòu)象，選出2種化合物作為模擬Imisdp和Co/ZnTCPP鋅環(huán)境的模型(圖1)。Imisdp(按以下實(shí)施例7提供的方法合成)化合物可以模擬4-配位幾何結(jié)構(gòu)。在這種情況下，由3個(gè)咪唑堿基和作為第四配體的水分子構(gòu)成大致的四面體構(gòu)象。圖2A表示構(gòu)建的具有匪P-9(PDB1GKC)催化部位的Imisdp分子3D模型的疊力口圖[Rowsell，S.等，Crystalstructureofhuman匪P9incomplexwithareversehydroxamateinhibitor(與反向異羥肟酸抑制劑形成復(fù)合物的人匪P9的晶體結(jié)構(gòu)).JMolBiol，2002.319(1):第173-81頁]，它已被修飾以代表鋅配體的四面體幾何結(jié)構(gòu)。該修飾包括將存在于X射線結(jié)構(gòu)中的配體(異羥肟酸抑制劑)用水分子置換，并通過多層QM/匪方法(參見材料與方法)使全酶最優(yōu)化到局部最小化。根據(jù)組氨酸的e-氮與鋅離子的距離(分別為2.04±0.06和2.02)及3個(gè)組氨酸對于金屬的相對取向，計(jì)算得出的MMP_9的組氨酸鋅模體和Imisdp之間存在高度相似性。第二種分子即Zn/CoTCPP在相對于金屬離子的共面構(gòu)象中，與鋅或其類似金屬鈷的配位上具有4個(gè)咪唑堿基[Stevens,E.D.'ElectronicStructureofMetalloporphyrins丄ExperimentalElectronDensityDistributionof(meso-Tetraphenylporphinato)cobalt(II)(金屬卟啉1的電子結(jié)構(gòu)(間_四苯基卟啉)鈷(II)的實(shí)驗(yàn)電子密度分布).J.Am.Chem.S0C，1981.103(17):第5087-5095頁]。該構(gòu)型模擬5-配位三角雙錐體幾何結(jié)構(gòu)中3個(gè)組氨酸中2個(gè)的構(gòu)象，其中金屬幾乎與構(gòu)成該角錐底基的2個(gè)組氨酸共面。圖2B顯示匪P-9(PDB1GKC)的晶體結(jié)構(gòu)，其中鋅被5個(gè)配體配位(2個(gè)額外的配體是由異羥肟酸抑制劑提供的)，該角錐底基的2個(gè)組氨酸的取向和它們與鋅離子的距離(對于匪P-9、ZnTCPP和CoTCPP分別為2.2±0.02、2.03±0.04和1.95)與Co/ZnTCPP分子的相當(dāng)。實(shí)施例2單克隆抗體的產(chǎn)生和篩選通過使免疫小鼠后，用相應(yīng)的化合物作為包被抗原，通過ELISA篩選選出特異性抗體，來產(chǎn)生針對CoTCPP、ZnTCPP和Imisdp的單克隆抗體(圖1)。選出三種抗體用于深入的研究。需要注意的是，之所以選出這些克隆，是因?yàn)榛诟偁嶦LISA篩選，它們分別對其免疫性半抗原顯示出最佳親和力。它們的范圍為0.01-0.09iiM的結(jié)合常數(shù)(下表3)是高親和力mAb的特征。將MAb在小鼠腹水中增殖，并用G蛋白微珠純化。表3-抗CoTCPP、ZnTCPP和Imisdp單克隆抗體的同種型和ELISA競爭分析一覽免疫性半抗原抗體同種型Kd[iiMr命名CoTCPPIgG2b0.0913E11ZnTCPPIgG2a0.0115E12ImisdpIgG2a0.096C6*-通過競爭ELISA測定抗體對于其免疫性半抗原的結(jié)合親合力(Kd)(有關(guān)詳情參見材料與方法)。實(shí)施例3單克隆抗體與匪P-2和MMP-9交叉反應(yīng)為了確定抗模擬匪P催化部位的鋅組氨酸構(gòu)象的合成化合物而產(chǎn)生的mAb，是否與匪P-2和匪P-9活性部位中暴露出來的鋅組氨酸模體發(fā)生交叉反應(yīng)，首先采用直接ELISA篩選結(jié)合匪P-9的單克隆抗體。使3種結(jié)合匪P-9催化結(jié)構(gòu)域的mAb直接吸附到微量滴定板各孔中(市售的抗匪P-9抗體用作陽性對照，非相關(guān)IgG用作陰性對照)。有趣的是，在小鼠腹水中增殖的mAb與存在于小鼠腹水中的活性匪P-9共純化出來。僅純化抗體與作為第一抗體的抗匪P-9抗體的蛋白質(zhì)印跡分析顯示清晰的條帶，對應(yīng)于活性匪P-9約82KDa的預(yù)期分子量。因此，mAb在體內(nèi)與天然酶形成復(fù)合物。接著采用基于免疫親和力的測定法，篩選結(jié)合匪P-2的單克隆抗體。將抗體與匪P-2催化結(jié)構(gòu)域(匪P-2cat)—起體外溫育，然后用抗小鼠IgG瓊脂糖微珠沉淀出來。如圖3A顯示，所有mAb均結(jié)合匪P-2cat。為了確定結(jié)合發(fā)生在與活性部位直接相互作用的整個(gè)過程中，對mAb結(jié)合Pro-匪P-2和Pro-匪P-9的能力進(jìn)行了分析。在潛在酶中，前域結(jié)構(gòu)保護(hù)催化性裂隙(catalyticcleft)。因此，倘若前域結(jié)構(gòu)識別活性部位內(nèi)的組氨酸鋅模體，則通過前域結(jié)構(gòu)阻斷活性部位可防止mAb結(jié)合。在相同條件下，未檢測到與酶原的結(jié)合(圖3B)。對這種與活性匪P-2結(jié)合但不與Pro-匪P-2結(jié)合的模式，進(jìn)一步在類似于體內(nèi)環(huán)境下用由人纖維肉瘤(HT1080)細(xì)胞培養(yǎng)物分泌出來的全長天然匪P-2進(jìn)行仔細(xì)的研究。HT1080條件培養(yǎng)液與抗CoTCPP抗體免疫沉淀后，進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析顯示，與活性匪P-2但不與Pro-匪P-2結(jié)合(圖3C)。這些結(jié)果表明，所有3種抗體均與匪P-2和匪P-9發(fā)生交叉反應(yīng)?；钚圆课涣严兜谋┞妒强贵w結(jié)合必不可少的，這就驗(yàn)證了mAb直接與匪P-2和匪P-9的活性部位相互作用。實(shí)施例4抗CoTCPP和抗ImisdpmAb體外抑制MMP-2和匪P-9抗Imisdp和抗CoTCPPmAb在微摩爾范圍內(nèi)抑制匪P-2和匪P-9的蛋白水解活性(圖5)。在連續(xù)熒光測定法中，用猝滅的熒光肽底物，進(jìn)行了mAb抑制匪P的動(dòng)力學(xué)分析。預(yù)料不到的是，抗ZnTCPPmAb沒有顯示抑制作用。為了測定通過抗CoTCPPmAb的抑制性質(zhì)，在mAb存在或不存在時(shí)，使用酶與不同濃度的熒光肽底物進(jìn)行了該實(shí)驗(yàn)。圖4A-B中所示的Lineweaver-Burk圖中的數(shù)據(jù)是特有的競爭性抑制曲線，其中匪P-9和MMP-2的Ki值分別為13iiM和24iiM。競爭性抑制曲線表明，mAb結(jié)合的部位與肽底物結(jié)合的部位相同。這種抑制模式進(jìn)一步證實(shí)了與活性部位的直接相互作用。顯然，抗ImisdpmAb對匪P-2和匪P-9顯示濃度依賴性抑制作用，表現(xiàn)出競爭性抑制，針對匪P-9和匪P-2的計(jì)算Ki值分別為5.8iiM和3iiM(圖5)。因?yàn)閙Ab識別匪P-2和匪P-9的結(jié)合部位，通過親和力成熟方法，可同時(shí)在結(jié)構(gòu)上和靜電上，進(jìn)一步達(dá)至IJmAb禾口MMP之間界面互補(bǔ)的最優(yōu)化(PaulJ.CarterNatureReviewsImmun.第6巻，2006343-357)。采用這個(gè)方法可得到高特異性的抑制劑，它將同時(shí)利用活性部位內(nèi)部或外部的特異性特征。為了證實(shí)抗CoTCPPmAb在細(xì)胞水平上的抑制活性，通過原位酶譜法，研究了抗體對組成型分泌匪P-2和匪P-9的人纖維肉瘤HT1080細(xì)胞的明膠分解活性的作用。為了通過原位酶譜法確定匪P的明膠分解活性的位置，將分子內(nèi)猝滅的異硫氰酸熒光素標(biāo)記的明膠(DQ-明膠)用作底物。通過明膠酶的蛋白酶解得到切割的異硫氰酸熒光素-明膠肽，該熒光的定位表明凈明膠分解活性的部位。未處理人纖維肉瘤HT1080細(xì)胞(圖7A)具有明顯的細(xì)胞表面明膠分解活性。在1iiMmAb(圖7B)存在下，與對照細(xì)胞中所觀察到的相比，明膠酶活性降低。這些結(jié)果表明，抗CoTCPPmAb在細(xì)胞水平上抑制MMP-2和匪P-9。實(shí)施例6本發(fā)明mAb的選擇性通過研究抗CoTCPP和抗ImisdpmAb針對MMP-14(MT1mmP)和TNF-a-轉(zhuǎn)化酶(TACE)的結(jié)合和抑制作用，對抗體選擇性進(jìn)行了測定，TNF-a-轉(zhuǎn)化酶是一種屬于相關(guān)ADAM(整聯(lián)蛋白和金屬蛋白酶)家族的鋅依賴性金屬蛋白酶(ADAM-17)。通過用合適肽底物的體外熒光酶活性實(shí)驗(yàn)，測定了針對MT1匪P和TACE的抑制作用?？笴oTCPPmAb顯示對MT1匪P或TACE沒有抑制作用。為了確定它是否結(jié)合TACE和MT1匪P但卻沒有相應(yīng)發(fā)生的抑制作用，用純化的酶進(jìn)行了基于免疫親和力的實(shí)驗(yàn)，仍未檢測到結(jié)合。與抗CoTCPPmAb相反，抗ImisdpmAb抑制MTl匪P，Ki值為10yM，但是對TACE沒有顯示抑制作用。結(jié)果見下表4。表4匪P6C6(IC50iiM)13Ell(IC50iiM)15E12(IC50iiM)匪P-23±0.224±1NI匪P-94.5±0.215±0.8NIMT1-匪P14.4±0.7NINITACENINININI，在高達(dá)30iiM濃度時(shí)"不抑制"在匪P家族成員與TACE之間，在活性部位存在高度的結(jié)構(gòu)相似性，具體而言，鋅結(jié)合部位周圍的三維結(jié)構(gòu)元件幾乎相同，這歸因于適應(yīng)底物肽主鏈的需要和保守鋅-結(jié)合模體EXXHXXGXXH的存在[Solomon,A.等，Pronounceddiversityinelectronicandchemicalpropertiesbetweenthecatalyticczincsitesoftumornecrosisfactor_alpha_convertingenzymeandmatrixmetalloproteinasesdespitetheirhighstructuralsimilarity(月中瘤壞死因子一a—轉(zhuǎn)化醇與基質(zhì)金屬蛋白酶催化性鋅部位間盡管結(jié)構(gòu)相似性高但其電化學(xué)性質(zhì)仍具有顯著的多樣性).JBiolChem，2004.279(30):第31646-54頁；Lukacova，V.等，Acomparisonofthebindingsitesofmatrixmetalloproteinasesandtumornecrosisfactor—alphdconvertingenzyme-implicationsforselectivity(基質(zhì)金屬蛋白酶禾口月中瘤壞死因子—a轉(zhuǎn)化酶結(jié)實(shí)施例5原位酶譜法合部位的比較涉及選擇性).JMedChem，2005.48(7):第2361-70頁]。因此，不指望匪P間mAb的選擇性僅基于保守組氨酸鋅模體的識別。然而，與小分子量合成抑制劑不同，作為大蛋白質(zhì)分子的抗體必須限制對包埋在蛋白質(zhì)構(gòu)架內(nèi)活性部位裂隙的可及性。特別是因?yàn)閙Ab與催化性鋅離子具有特異性相互作用，鋅離子暴露于溶液的程度對于抗體結(jié)合必然十分關(guān)鍵。MT1匪P與在很大程度上的TACE，是通過與相對于包埋起來的催化性鋅離子有關(guān)的縱深的S1口袋(如其晶體結(jié)構(gòu)所示)來區(qū)分的?；钚圆课簧疃鹊倪@種差異可說明抗體為什么對TACE缺乏抑制作用。這些結(jié)果表明，可根據(jù)催化性鋅離子的暴露程度達(dá)到選擇性。當(dāng)比較匪P和TACE時(shí)，應(yīng)當(dāng)考慮的另一個(gè)重要因素是活性部位口袋在疏水性和極性等化學(xué)性質(zhì)方面的差異(參見圖8)。例如，TACE的活性部位的極性比大多數(shù)匪P的活性部位的大。Solomon等人證實(shí)，活性部位極性的這類變化直接影響活性部位組氨酸咪唑環(huán)針對催化性鋅離子的取向[Solomon,A.等，Pronounceddiversityinelectronicandchemicalpropertiesbetweenthecatalyticzincsitesoftumornecrosisfactor_alpha_convertingenzymeandmatrixmetalloproteinasesdespitetheirhighstructuralsimilarity(腫瘤壞死因子-a-轉(zhuǎn)化酶與基質(zhì)金屬蛋白酶催化性鋅部位間盡管結(jié)構(gòu)相似性高但其電化學(xué)性質(zhì)仍具有顯著的多樣性).JBiolChem，2004.279(30):第31646-54頁]。通過測定抗CoTCPP和抗Imisdp與非相關(guān)鋅依賴性酶-碳酸酐酶(CA)和布氏熱厭氧菌(brockii)醇脫氫酶(TbADH)的交叉反應(yīng)性，進(jìn)一步仔細(xì)研究了抗CoTCPP和抗Imisdp的選擇性。與匪P類似，CA含有與3個(gè)組氨酸殘基和1個(gè)水分子四面體配位的鋅離子，TbADH含有與4個(gè)不同的氨基酸殘基(組氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸和谷氨酸)四面體配位的催化性鋅離子。進(jìn)行了合適的體外功能性抑制實(shí)驗(yàn)以及相似的基于免疫親和力的實(shí)驗(yàn)，以研究與這些酶的交叉反應(yīng)性，然而未觀察到結(jié)合或抑制。還對抗CoTCPPmAb與相關(guān)生理性卟啉(例如肌紅蛋白和血紅蛋白和維生素等內(nèi)的血紅素基)的交叉反應(yīng)性進(jìn)行了測定。在競爭ELISA以及免疫親和力測定法中未檢測到交叉反應(yīng)。碳酸酐酶、醇脫氫酶都具有相當(dāng)程度包埋的活性部位，同樣，肌紅蛋白和血紅蛋白的卟啉部分也不暴露。維生素B12在平面咪唑結(jié)構(gòu)中心含有金屬，但是軸向配體可能干擾mAb的結(jié)合?？傊?，這些結(jié)果證實(shí)，抗CoTCPPmAb識別無軸向金屬_配位殘基干擾的相對暴露的金屬-咪唑構(gòu)型。實(shí)施例7-三-[2-(^(3-咪唑-1-基-丙基))-乙氧基甲基]甲烷鋅(II)的合成，圖9(3)(i)四(2-五氯-苯氧基羰基_乙氧基甲基)甲烷的合成按照HaimWeizma皿等人的方法(JACS1996，118，12368-12375)，進(jìn)行五氯苯酚_取代四_活性酯(pentachlorophenol-substitutiontetra-activeester)的合成。(a)單取代的三活性酉旨的制備將四活性酉旨(1)(lg，O.69mmo1)和BocNHCH2CH2NH2(100mg，0.62mmol)溶于20ml無水二氯甲烷。在用三乙胺保持pH8的同時(shí)，將該溶液攪拌過夜。使該溶液濃縮后，用快速色譜法純化(CHC13:乙酸乙酉旨(90:10))，得至lj(152mg，收率15%)。NMR250MHz(CDC13)S:1.4(s，9H，Boc);2.4(t，2H，J=6Hz，-CH2-CH2-C0NH);2.9(t，6H，J=6Hz，_CH2-CH2-C00PCP);3.2(q，2H，37J=6Hz，-C0NH-CH2-CH2-NHBoc);3.31(t，2H，J=6Hz，-C0NH_CH2-CH2-NHBoc);3.38(s，2H，-C-CH2-0-CH2-CH2-C0NH_);3.42(s，6H，-C-CH2-0_CH2-CH2-C00PCP);3.61(t，2H，J=6Hz，-C-CH2-0-CH2-CH2-C0NH_);3.78(t，6H，J=6Hz，-C-CH2-0-CH2-CH2-C0NH_);5.03(t，1H，NH);6.7(t，1H，NH)。(b)三(咪唑)的制備將單取代的三活性酯(150mg，0.llmmol)和l-(3-氨基丙基)-咪唑(33iilt，0.39mmol)溶于(20ml)無水THF中后，在室溫下攪拌過夜。使白色溶液濃縮后，用硅膠(0.063-0.200mm)柱色譜法純化(采用CHC13:甲醇(50-90%))，得到(45mg，收率44%)。'HNMR250MHz(CDCl3/MeOD)S:1.45(s，9H，Boc);2.0(m，6H，J=6Hz，-CONH-CH2-CH2-CH2-imi);2.4(t，6H，J=6Hz，-0-CH2-CH2-CONH_);2.5(t，2H，J=6Hz，-CH2-CH2-CONH-CH2-CH2-NHBoc);3.0(m，8H，J=6Hz，-CONH_CH2-CH2-CH2-imi，-CH2-CH2_CONH-CH2-CH2-NHBoc);3.1(t，2H，J=6Hz，-CONH_CH2-CH2-NHBoc);3.4(b，8H，-C_CH2-0-CH2-CH2-CONH-CH2-CH2-NHBoc，-C-CH2-0-CH2-CH2-CONH_);3.6(m，8H，J=6Hz，-C-CH2-0_CH2-CH2-CONH-，-C-CH2-0-CH2-CH2-CONH-CH2-CH2-NHBoc，)；4.0(t，6H，J=6Hz，-CONH_CH2-CH2-CH2-imi);5.5(t，1H，NH);6.98(s，3H，Imi);7.06(s，3H，Imi)7.32(t，3H，NH);7.57(s，3H，Imi)。ESI-MS:910.87[M+Na]+，925.98[M+K]+。(c)具有游離胺的三(咪唑)(2)的制備將三(咪唑)(40mg，0.045mmol)溶于6ml二氯甲烷和三氟乙酸(2:1)的混合物中后攪拌1小時(shí)。使反應(yīng)混合物濃縮，與四氯化碳蒸發(fā)數(shù)次后，經(jīng)高真空干燥從混合物中除去TFA，得到(30mg，收率85X，b)。4畫R250MHz(CDCl3/MeOD)S:1.9(m，6H，J=6Hz，_CONH_CH2_CH2_CH2_imi);2.3(m，8H，J=6Hz，-0_CH2-CH2-CONH-，-CH2-CH2-CONH_CH2-CH2-NH2);2.9(t，2H，J=6Hz，-CONH-CH2-CH2-CH2-imi);3.0(t，2H，J=14Hz，-CONH_CH2-CH2-NH2);3.31(t，2H，J=6Hz，-CH2-CH2-CONH-CH2-CH2-NH2);3.4(b，8H，-C-CH2-0-CH2-CH2-CONH_CH2-CH2-NH2，-C_CH2-0-CH2-CH2-CONH_);3.6(m，8H，J=6Hz，-C-CH2-0_CH2-CH2-CONH-，-C-CH2-0-CH2-CH2-CONH_CH2-CH2-NH2);4.0(t，6H，J=6Hz，-C0NH-CH2-CH2-CH2-imi);7.26(s，3H，Imi);7.32(s，3H，Imi);8.82(s，3H，Imi)。3.三(咪唑)-Zn(II)復(fù)合物(3)的制備將化合物2(30mg，0.038mmol)溶于1ml甲醇。向該溶液加入2-3滴INNaOH溶液和ZnCl2(5mg，0.04mmol)后攪拌半小時(shí)。經(jīng)過濾得到白色沉淀(12mg，收率37%)。力NMR250MHz(MeOD/D20)S:1.8(m，6H，J=6Hz，-CONH-CH2-CH2-CH2-imi);2.4(m，8H，J=6Hz，-0_CH2-CH2-CONH-，_CH2_CH2-CONH-CH2-CH2-NH2);3.0(t，2H，J=6Hz，-CONH-CH2-CH2-CH2_imi);3.0(t，2H，J=6Hz，-CONH-CH2-CH2-NH2);3.31(b，2H，-CH2-CH2-CONH_CH2-CH2-NH2);3.4(b，8H，-C_CH2-0-CH2-CH2-CONH-CH2-CH2-NH2，-C-CH2-0-CH2-CH2-CONH_);3.6(m，8H，-C-CH2-0_CH2-CH2-CONH-，_C-CH2-0-CH2-CH2-CONH-CH2-CH2-NH2);4.2(b，6H，-CONH_CH2-CH2-CH2-imi);7.19(s，3H，Imi);7.28(s，3H，Imi);8.55(s，3H，Imi).ESI—MS:852.09[M+l]+。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage39</formula>R=0-CH2-CH2-CONH-CH2-CH2_NH2-三-[2-(^(3-咪唑-1-基-丙基))-乙氧基甲基]甲烷。實(shí)施例86C6與明膠酶催化部位的交叉反應(yīng)現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，一定量的6C6與得自腹水的活性匪P9共純化。通過蛋白質(zhì)印跡和明膠酶譜法(數(shù)據(jù)未顯示)表明，腹水瘤中存在可檢測量的匪P9，誘導(dǎo)小鼠mAb增殖。用G蛋白親合層析法(G蛋白與抗體恒定區(qū)結(jié)合，留下游離的可變區(qū)與抗原相互作用)，從小鼠腹水中純化出匪P9-抗體復(fù)合物。如圖11A所示，使用市售的抗匪P9抗體，通過蛋白質(zhì)印跡法純化的6C6匪P9復(fù)合物，對共純化的匪P9進(jìn)行了檢測。鑒定出對應(yīng)于活性匪P9的分子量為82kDa的條帶缺乏前域。在按相同方式純化和分析的非相關(guān)小鼠mAb對照中，未檢測出此條帶。這些結(jié)果表明，6C6與內(nèi)源活性小鼠匪P9形成了特異性體內(nèi)復(fù)合物。為了進(jìn)一步檢查與高度同源的匪P2酶的活性形式的結(jié)合，體外進(jìn)行了類似的免疫沉淀實(shí)驗(yàn)。將6C6與純化的匪P2催化性片段按3:l摩爾比率一起溫育。A蛋白瓊脂糖免疫沉淀物的SDS-PAGE分析顯示，6C6與活性匪P2催化性片段形成特異性復(fù)合物(圖IIB)。僅A蛋白微珠無法使匪P2免疫沉淀。其次，測定了與無活性酶原(潛在酶)形式MMP2和匪P9的結(jié)合。由于所有匪P都作為無活性的酶原產(chǎn)生，因此它們具有阻礙活性部位的約80-90氨基酸的N端前肽[Bode，W.和K.Maskos，BiolChem，2003.384(6):第863-72頁](圖11D)。以相同方式，用pro匪P2和pro匪P9進(jìn)行了免疫沉淀實(shí)驗(yàn)。重要的是，抗體不與潛在酶結(jié)合(圖IIC)。引人注目的是，6C6僅與其中活性部位鋅蛋白質(zhì)復(fù)合物暴露于溶液的活性酶構(gòu)象結(jié)合。這些結(jié)果證實(shí)，針對模擬活性部位的生物無機(jī)化學(xué)半抗原產(chǎn)生和篩選的6C6抗體，與匪P2和匪P9的蛋白質(zhì)活性部位發(fā)生交叉反應(yīng)。顯然，鋅三角架半抗原能夠模擬天然蛋白質(zhì)中相應(yīng)鋅-組氨酸表位的三維結(jié)構(gòu)。顯然，識別這個(gè)最小金屬-蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)表位足以引起與天然酶發(fā)生交叉反應(yīng)。僅與活化酶結(jié)合而不與其中前域阻礙接近催化性鋅蛋白表位的它們的潛在形式結(jié)合(圖11D)，這就表明6C6與鋅催化部位的直接相互作用。需要注意的是，6C6在體內(nèi)結(jié)合天然的匪P9證實(shí)，抗體可以在復(fù)雜的蛋白質(zhì)環(huán)境中與酶形成特異性復(fù)合物。將活化酶種類與潛在形式區(qū)分開來是6C6獨(dú)特而有價(jià)值的功能性質(zhì)。這種活性是6C6獨(dú)有的，與針對匪P9產(chǎn)生的其它抗體不同。這是因?yàn)橛玫鞍踪|(zhì)免疫通常得到針對表面環(huán)的表位，而催化性氨基酸大多包埋在酶表面的裂隙內(nèi)部。該分子這個(gè)組成部分被視為低免疫原性的。因此，通過常規(guī)方法產(chǎn)生的中和單克隆抗體(抗天然蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段)一般與活性部位的鄰接區(qū)或鄰近區(qū)而不是與活性部位催化性殘基相互作用，并通過空間位阻機(jī)制抑制。這類抗體除與活性形式結(jié)合外，通常還與無活性的前體結(jié)合。本發(fā)明獨(dú)特的活性部位模擬半抗原免疫方法能夠產(chǎn)生識別匪P中的催化性金屬蛋白質(zhì)殘基的抗體，這不是通過常規(guī)蛋白質(zhì)免疫方法可獲得的。實(shí)施例96C6在體外和原位選擇性抑制明膠酶為了確定6C6針對匪P9和匪P2的酶抑制能力，采用跨明膠酶活性部位裂隙的小熒光肽底物(7個(gè)氨基酸)，進(jìn)行了抑制實(shí)驗(yàn)。測定了數(shù)個(gè)濃度mAb的初始反應(yīng)速度。6C6抑制兩種酶的催化活性(圖12A-B)。通過分析在不同濃度的抑制性抗體存在下隨底物濃度而變化的匪P9活性，來確定競爭性抑制機(jī)制。圖12A中所示的雙倒數(shù)Linweaver-Burk圖形式的數(shù)據(jù)，展現(xiàn)出競爭性抑制曲線。將抑制數(shù)據(jù)擬合到競爭性抑制系統(tǒng)方程式，分別得到匪P9禾P匪P2的Ki為1±0.liiM禾P1.4±0.16iiM。還確定了在與高濃度(30iiM)的匪P9一起溫育過夜后，6C6不被匪P-9裂解，這就表明所觀察到的6C6抑制匪P9不是由競爭劑底物的裂解所致。匪P9的動(dòng)力學(xué)分析被視作代表性的6C6抑制機(jī)制，因?yàn)樗潜辉O(shè)計(jì)來識別不同MMP中的相同表位的。抑制作用對于MMP2和MMP9的催化性片段種類以及明膠酶的全長酶形式都是一致的。準(zhǔn)確地講，含有催化結(jié)構(gòu)域以及纖連蛋白結(jié)構(gòu)域但是不含血紅素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域的重組匪P9和匪P2催化性片段；以及僅含有催化結(jié)構(gòu)域并缺乏纖連蛋白和血紅素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域兩者的匪P9重組最小催化單元都同樣抑制全長(對氨基苯乙酸汞(APMA)激活的)明膠酶，如前所述，從被重組痘苗病毒感染的HeLaS3細(xì)胞的培養(yǎng)基中純化出明膠酶，所述重組痘苗病毒編碼人pro匪P2和pro匪P9的全長cDNA。這些結(jié)果證實(shí)，抑制是由與催化結(jié)構(gòu)域的直接相互作用介導(dǎo)的，不依賴于與血紅素結(jié)合蛋白或纖連蛋白結(jié)構(gòu)域的相互作用。競爭性抑制曲線提供了與催化性鋅部位直接的相互作用的又一依據(jù)。以相同方式制備的非相關(guān)mAb不干擾酶的光解活性。因此，所觀察到的抑制不是由痕量的共純化的污染物所產(chǎn)生的。這些實(shí)驗(yàn)的抗體由組織培養(yǎng)物中純化，在純化的抗體組分中不含可檢測量的活性匪P9。為了考察6C6的選擇性，測定了其針對不同基質(zhì)金屬蛋白酶亞類的反應(yīng)性，所述亞型包括溶基質(zhì)蛋白(匪P7)、膜型匪P(MT1匪P)和相關(guān)的解聯(lián)蛋白(ADAM)、腫瘤壞死因子-a-轉(zhuǎn)化酶(TACE)。這些酶的核心結(jié)構(gòu)非常相似，變化大多在周邊環(huán)內(nèi)發(fā)生。特異性鋅_組氨酸支架結(jié)構(gòu)非常保守，顯示出一個(gè)共有螺旋之后接著一個(gè)環(huán)，該環(huán)用作與催化性鋅離子配位的3個(gè)組氨酸殘基的支架結(jié)構(gòu)(圖13)。用合適的熒光肽底物進(jìn)行了類似的抑制試驗(yàn)。有趣的是，在按高達(dá)30yM的濃度與6C6—起溫育時(shí)，匪P-7或TACE兩者都沒有在任何可測量的程度上受到抑制，這就表明了針對明膠酶選擇性的實(shí)質(zhì)上的水平。MT1匪P被6C6抑制，效價(jià)強(qiáng)度較低，Ki為14.4±0.75iiM。有趣的是，不能只根據(jù)抗體識別保守鋅_組氨酸支架結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)來說明這40種選擇性的起源，因?yàn)楹诵慕Y(jié)構(gòu)，尤其是活性部位非常相似。大多在周邊環(huán)內(nèi)的序列改變規(guī)定了鋅_組氨酸模體的暴露程度，活性部位的形狀及其表面靜電上的差異，可以解釋這種選擇性抑制模式。還測定了6C6與不同的鋅依賴性金屬蛋白酶即碳酸酐酶和醇脫氫酶的交叉反應(yīng)性。與匪P類似，碳酸酐酶(CA)具有與3個(gè)組氨酸配體和1個(gè)水分子四面體形式配位的催化性鋅離子。因此，若干強(qiáng)效的小分子匪P抑制劑(磺?；被岙惲u肟酸類型的匪P抑制劑)也可用作有效的CA抑制劑，反之亦然。之前研究的作為CA抑制劑的一些N-羥基磺酰胺也具有針對匪P的抑制特性[Scozzafava，A.和C.T.Supuran，JMedChem，2000.43(20):第3677-87頁]。得自嗜熱菌(TbADH)醇脫氫酶的活性部位包括不同的鋅_蛋白部分，其中鋅與裂隙內(nèi)的組氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸和谷氨酸結(jié)合。在濃度高達(dá)30M的mAb存在下，適當(dāng)?shù)墓δ芤种茖?shí)驗(yàn)顯示，針對兩種酶都無抑制作用。需要注意的是，位于10鏈、扭型P折疊中心區(qū)的CA的活性部位，由錐形裂隙構(gòu)成，深15A，其中四面體Zn2+離子位于裂隙底部。與小分子抑制劑不同，鋅離子必需包埋得非常深以致不與抗體相互作用。重要的是，這些實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步展現(xiàn)6C6的選擇性抑制曲線。在細(xì)胞環(huán)境中，通過原位酶譜法，使用明膠酶的天然底物-明膠，進(jìn)一步測定了6C6針對明膠酶的抑制作用。將生長在培養(yǎng)基中表達(dá)膜結(jié)合的MT1匪P并分泌匪P-2和匪P-9的人纖維肉瘤HT1080細(xì)胞[Giambernardi,T.A.等，MatrixBiol，1998.16(8):第483-96頁]用熒光素綴合的明膠(DQ明膠)覆蓋。如圖14A-C中所示，未處理的HT1080細(xì)胞具有顯著的細(xì)胞表面明膠分解活性。用5yMmAb處理顯著降低表面明膠分解活性，與基于機(jī)制的明膠酶抑制劑即SB-3CT所觀察到的抑制類似。SB-3CT具有類似的抑制曲線，因?yàn)樗纫种泼髂z酶，又抑制MT1匪P(對于匪P2、匪P9和MT1匪P，Ki值分別為28nM、400nM和110nM)?？傊?，6C6既體外抑制合成肽裂解，又原位抑制天然大分子底物。6C6針對匪P9顯示競爭性抑制模式，與抑制的TIMP機(jī)制類似。競爭性抑制曲線是與催化性鋅部分直接相互作用的又一個(gè)依據(jù)。重要的是，6C6顯示針對明膠酶的選擇性抑制曲線。該選擇性的起源無法通過保守鋅_組氨酸模體的抗體靶向作用來解釋。這些結(jié)果表明，抗體與另外的酶表面決定子相互作用，這可解釋所觀察到的特異性。實(shí)施例106C6MAb治療對小鼠中DSS誘發(fā)的結(jié)腸炎的作用有越來越多的證據(jù)表明，匪P參與組織重塑和與幾種炎癥性疾病(包括炎性腸病(IBD))有關(guān)的破壞[Baugh，M.D.等，Gastroenterology,1999.117(4):第814-22頁;Heuschkel，R.B.等，Gut，2000.47(1):第57-62頁；vonLampe，B.等，Gut，2000.47(1):第63-73頁；Kirkegaard，T.等，Gut，2004.53(5):第701-9頁]。因此，本發(fā)明的發(fā)明人研究了炎性腸病小鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?C6的體內(nèi)抗明膠酶抑制作用。為了探測6C6的抑制活性，研究了mAb治療改善DSS誘發(fā)的急性結(jié)腸炎的能力。具體地講，向高易感性小鼠品系C57BL/6提供2%DSS達(dá)5天。通過腹膜內(nèi)注射，1.5或5mg/kg小鼠，從誘導(dǎo)當(dāng)天起每日給予6C6治療。暴露于2XDSS的小鼠出現(xiàn)急性結(jié)腸炎的癥狀，伴有腹瀉、直腸出血和體重嚴(yán)重下降。在每日監(jiān)測疾病活性指數(shù)(DAI)的基礎(chǔ)上(體重、出血和大便粘稠度的綜合評41分)，mAb治療的作用如圖15A所示。與對照相比，MAb治療的小鼠具有降低疾病活性(從第6天起十分明顯)。DSS誘發(fā)的結(jié)腸炎的另一種肉眼可見的表現(xiàn)是結(jié)腸長度縮短(圖15B)。因此，與幼稚小鼠相比，在DSS誘導(dǎo)后11天，發(fā)現(xiàn)未治療小鼠的結(jié)腸長度縮短30%。相比之下，分別給予1.5和5mg/kg小鼠的6C6治療小鼠僅平均縮短22%或16%。由該病的死亡率也證實(shí)了6C6的保護(hù)作用。誘發(fā)疾病后11天，發(fā)現(xiàn)未治療小鼠的死亡率為60%，而在6C6治療小鼠中觀察到的死亡率僅為33%(圖15C)。因此，C57BL/6小鼠用6C6治療，除了減輕DSS誘發(fā)的結(jié)腸炎出現(xiàn)的癥狀外，還使存活率得到提高?？偟膩碚f，這些結(jié)果表明6C6作為明膠酶抑制劑的治療潛力。實(shí)施例11通過X射線吸收光譜法表征匪P9-6C6mAb復(fù)合物為了進(jìn)一步研究活性匪P9和受抑制的匪P9-6C6復(fù)合物間的差異，進(jìn)行了X射線吸收光譜測定。圖16顯示采集的熒光XAS數(shù)據(jù)。該數(shù)據(jù)以傅里葉變換(Fouriertransform,FT)光譜的形式表示，以提供匪P9催化性鋅離子中第一和第二配位殼內(nèi)各個(gè)原子的徑向分布?？梢栽谠胍羲街嫌^察到游離酶和受抑制酶徑向分布光譜的表觀變化。這些光譜變化表明催化性鋅離子的局部環(huán)境在與6C6結(jié)合時(shí)經(jīng)歷了結(jié)構(gòu)變化。在活性酶和受抑制酶間觀察到的FT光譜特征的空間分布和峰強(qiáng)度兩者的差異明確表明在mAb復(fù)合物形成時(shí)催化性鋅的局部結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。應(yīng)當(dāng)了解的是，為了清楚起見，在不同的實(shí)施方案內(nèi)容中加以描述的本發(fā)明的某些特征，同樣也可合并起來在一個(gè)實(shí)施方案中提供。相反，為簡明起見在一個(gè)實(shí)施方案內(nèi)容中加以描述的本發(fā)明的各種特征，同樣也可單獨(dú)或以任何合適的再合并方式予以提供。盡管已結(jié)合其具體的實(shí)施方案對本發(fā)明加以描述，但是十分明顯的是，許多替換、修改和變化對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，本發(fā)明意在包括所有落入所附權(quán)利要求書的精神和廣大范圍內(nèi)的這些替換、修改和變動(dòng)。本說明書所提及的所有出版物、專利、專利申請都通過引用全部結(jié)合到本說明書中，其程度與每個(gè)獨(dú)立出版物、專利、專利申請具體而單獨(dú)指明通過引用結(jié)合到本文中一樣。另外，在本申請中，任何參考文獻(xiàn)的引用或標(biāo)示都不得解釋為承認(rèn)這樣的參考文獻(xiàn)都可用作本發(fā)明現(xiàn)有技術(shù)。參考文獻(xiàn)一覽(另外的參考文獻(xiàn)引用于正文中)1.Nagase，H.禾口Woessner，J.F.Jr.(1999).Matrixmetalloproteiases.Minireview(基質(zhì)金屬蛋白酶小型綜述).J.Biol.Chem.274:21491-21494。2.Bode，W.，F(xiàn)er腿dez-Catalan，C.，Nagase，H.禾口Maskos，K.(1999).Endoproteinase-proteininhibitorinteractions(內(nèi)切蛋白酶-蛋白質(zhì)抑制齊,的相互作用)APMIS107,3-10。3.Bode，W.，F(xiàn)ernandez-Catalan,C.，Tschesche，H.，Grams,F.，Nagase，H.禾口Maskos，K.(1999).Structuralpropertiesofmatrixmetalloproteinases(基質(zhì)金屬蛋白酶的結(jié)構(gòu)特征)Cell.Mol.Life.Sci.55,639-652。4.Borkakoti，N.(1998).Matrixmetalloproteases-variationsonatheme(基質(zhì)金屬蛋白酶主題變異).Prog.Biophys.Mol.Biol.70,73-94。5.Brown,S.，Bernardo,M.M.，Li，Z.H.，Kotra，L.P.，Tanaka，Y.，F(xiàn)ridman，R.禾口Mobashery，S.(2000).PotentandSelectiveMechanism-BasedInhibitionofGelatinases(基于有效的選擇性機(jī)制的明膠酶抑制)J.Am.Chem.Soc.，122，6799-6800。6.Fridman，R.，F(xiàn)uerst，T.R.，Bird,R.E.，Hoyhtya，M.，0elkuct，M.，Kraus，S.，Komarek，D.，Liotta，L.A.，Berman，M丄禾口Stetler-Stevenson，W.G.(1992).Domainstructureofhuman72_kDagelatinase/typeIVcollagenase.Characterizationofproteolyticactivityandidentificationofthetissueinhibitorofmetalloproteinase-2(TIMP-2)bindingregions(人72-kDa明膠酶/IV型膠原酶的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)。蛋白水解活性的表征與金屬蛋白酶-2(TIMP-2)結(jié)合區(qū)的組織抑制劑的鑒定).JBiol.Chem.267，15398-405。7.Gogly，B.，G麗lt，N.，Ho潔beck，W.，Godeau，G.禾口Pellat，B.(1998).CollagenZymogr即hyasaSensitiveandSpecificTechniquefortheDeterminationofSubpicogramLevelsofInterstitialCollagenase(作為測定間質(zhì)內(nèi)膠原酶微微克水平的特異性靈敏技術(shù)的膠原酶譜法).Anal.Biochem.255,211-216。8.Gomez，D.E.，Alo固，D.F.，Yoshiji，H.禾口Thorgeirsson，U.P.(1997).Tissueinhibitorsofmetalloproteinases-structure,regulationandbiologicalfunctions(組織金屬蛋白酶抑制劑結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)和生物功能).Eur.J.Cell.Biol.74，111-122。9.Henriet，P.，Blavier，L禾口Declerck，Y.A.(1999).Tissueinhibitorsofmetalloproteinases(TIMP)ininvasionandproliferation(侵襲禾口增殖中的組織金屬蛋白酶(TMP)抑制劑).APMIS107,111-119。10.Kleifeld，0.，Kotra，L.P.，Gervasi，D.C.，Brown，S.，Bernardo,M.M.，F(xiàn)ridman，R.，Mobashery，S.禾口Sagi，I.(2001).X_rayAbsorptionStudiesofHumanMatrixMetalloproteinase-2(MMP-2)BoundtoaHighlySelectiveMechanism-basedInhibitor.Comparisonwiththelatentandactiveformsoftheenzyme(與基于高選擇性機(jī)制的抑制劑結(jié)合的人基質(zhì)金屬蛋白酶-2(匪P-2)的X射線吸收研究).J.Biol.Chem.276，17125-17131。11.Korkhin，Y.，Kalb(Gilboa)，A.J.，Peretz，M.，Bogin，0.，Burstein，Y.禾口Frolow，F(xiàn).Q998).NADP-dependentBacterialAlcoholDehydrogenases:CrystalStructure,Cofactor-bindingandCofactorSpecificityoftheADHsofClostridiumbeijerinckiiandThermo,erobacterbrockii(NADP_依賴性細(xì)菌醇脫氫酶拜式梭菌(Clostridiumbeijerinckii)禾口布氏熱厭氧菌(Thermoanaerobacterbrockii)的晶體結(jié)構(gòu)、輔因子結(jié)合和輔因子特異性).J.Mol.Biol.278,967-981。12.Morgunova，E.，Tuuttila，A.，Bergmann，U.，Is卯ov，M.，Lindqvist，Y.，Schneider,G.禾口Tryggvason，K.(1999).StructureofHumanPro-MatrixMetalloproteinase_2:ActivationMechanismRevealed(人基質(zhì)金屬蛋白酶_2前體的結(jié)構(gòu)揭示活化機(jī)制)Science284，1667-1670。13.Bode，W.，F(xiàn)ernandez-Catalan,C.，Tschesche，H.，Grams,F.，Nagase，H.禾口Maskos，K.(1999).Structuralpropertiesofmatrixmetalloproteinases(基質(zhì)金屬蛋白酶的結(jié)構(gòu)性質(zhì))Cell.Mol.Life.Sci.55,639-652。4314.Netzel-A潔tt，S.，Mallya，S.K.，Nagase，H.，Birkedal-Hansen，H.禾口VanWart，H.E.(1991).Continuouslyrecordingfluorescentassaysoptimizedforfivehumanmatrixmetalloproteinases(5種人基質(zhì)金屬蛋白酶最優(yōu)化的連續(xù)記錄熒光測定法).Anal.Biochem.195,86-92。15.Rehr，J.J.，Mustredeleon，J.，Zabinsky，S.I.禾口Albers，R.C.(1991).J.Am.Chem.Soc.USA113,5135-5138。16.R印o體，P.，Sahlberg，C.，Huhtala，P.，Hurs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