專(zhuān)利名稱(chēng)：：用于多型人乳頭瘤病毒檢測(cè)的多肽及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于診斷學(xué)范疇，涉及免疫診斷學(xué)、實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)、腫瘤診斷學(xué)基礎(chǔ)3個(gè)
技術(shù)領(lǐng)域：
，同時(shí)還涉及生物醫(yī)藥工程
技術(shù)領(lǐng)域：
。具體地，本發(fā)明涉及用于多型人乳頭瘤病毒(HPV)感染的檢測(cè)及HPVLl的純化，所述的多肽衍生自HPV主要外殼蛋白l(HPVLl)。
背景技術(shù)：
：1933年人類(lèi)首次發(fā)現(xiàn)乳頭瘤病毒，1978年，第一例生殖道HPV被鑒定[l]。目前，根據(jù)HPVDNA序列表達(dá)基因不同，已確定的HPV亞型超過(guò)200種，其中，85種HPV的基因克隆被鑒定，另有120種的部分基因型被鑒定，并且，有30余種是從生殖道組織中分離得到[2]。根據(jù)HPV感染的部位，分為皮膚型和粘膜型；根據(jù)其致病性的大小，分為高危型和低危型。高危型主要有HPV16、18、33、31、58和52等，與宮頸癌的發(fā)病有關(guān)；低危型主要有HPV6、11、42和44等，與生殖道疣狀物有關(guān)。目前，隨著宮頸癌病因?qū)W的研究進(jìn)展，其防治方法也在不斷地提高和發(fā)展。在HPV疫苗尚未在人群中應(yīng)用之前，普查仍是預(yù)防和控制宮頸癌的主要手段。大量研究表明HPV持續(xù)感染是引起宮頸上皮癌變的主要危險(xiǎn)因素，尤其是高危型HPV。隨著檢測(cè)技術(shù)的提高，宮頸癌組織中HPV的檢出率高達(dá)99%，其中，HPV16占55。/。至60%，HPV18占10%至12%，HPV31和HPV45分別占有4%至5%[3]。因此許多學(xué)者提出把檢測(cè)HPV作為宮頸癌的篩查手段。目前，HPV的檢測(cè)主要有病理學(xué)變化、免疫組化、分子生物學(xué)技術(shù)和血清學(xué)檢測(cè)等方法。l.HPV感染宮頸的病理學(xué)改變細(xì)胞病理學(xué)改變?cè)趯m頸移行區(qū)取材，行巴氏染色，可見(jiàn)由HPV引起的挖空細(xì)胞，即可診斷。此方法簡(jiǎn)單易行，無(wú)痛苦，經(jīng)濟(jì)實(shí)用，可用于大規(guī)模普查和篩查。但其敏感性低，假陰性率高。近年來(lái)，已由傳統(tǒng)的巴氏涂片發(fā)展成薄層巴氏涂片和涂片自動(dòng)檢測(cè)系統(tǒng)。此方法應(yīng)用新的收集和制作過(guò)程，大大降低了結(jié)果的假陰性率。主要有以下PAPNET系統(tǒng)、AutoP即3000Qc、Thi叩r印2000和CYT0RICH等。組織病理學(xué)改變對(duì)宮頸無(wú)明顯癌變的可疑區(qū)取材做病理檢査，當(dāng)發(fā)現(xiàn)挖空細(xì)胞，就可診斷有HPV的感染，并可發(fā)現(xiàn)宮頸細(xì)胞是否有異型性，是宮頸癌及其癌前病變確診的依據(jù)。2.免疫組化檢測(cè)HPV感染取少量病變組織制成涂片，用特異抗人類(lèi)乳頭瘤病毒的抗體作染色。如病損中有病毒抗原，則抗原抗體結(jié)合。常用過(guò)氧化物酶抗過(guò)氧化物酶方法(即PAP)，此方法有較好的特異性，還能顯示出病毒感染的部位，操作簡(jiǎn)單，有一定的診斷價(jià)值，但是檢測(cè)率低，敏感性不高，且不能分型。另外，有學(xué)者在不典型鱗狀細(xì)胞(ASCIIS)患者的宮頸涂片和活檢組織中加入抗P16抗體和克隆E6H4后進(jìn)行免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)巴氏涂片為ASCUS并且活檢為鱗狀上皮內(nèi)瘤樣變(SILs)的患者P16表達(dá)的強(qiáng)弱與HRHPV的病毒量密切相關(guān)，P16免疫染色檢測(cè)服HPV病毒量的靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值(PPV)和陰性預(yù)測(cè)值(NPV)分別為95°/。、96%、91%、98°/。[4]。P16的過(guò)度表達(dá)是服HPV致病活躍的指示器。此法可作為宮頸癌普査中檢測(cè)宮頸上皮細(xì)胞是否感染高危型HPV的可靠簡(jiǎn)單的方法。3.分子生物學(xué)技術(shù)3.1樣本分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)的樣本通常是宮頸部的上皮組織，可以是用于細(xì)胞學(xué)檢查的宮頸刮片或?qū)m頸細(xì)胞拭子，這些生殖道脫落細(xì)胞為檢材避免了活檢取材、研磨組織繁雜操作。但如果樣本量不夠，會(huì)影響結(jié)果的靈敏度，故大多數(shù)還是通過(guò)陰道鏡下宮頸活檢來(lái)獲得樣本。也有學(xué)者提出，宮頸癌患者的血液也可用來(lái)檢測(cè)HPVDNA。但是，PattiKey通過(guò)實(shí)驗(yàn)指出宮頸癌患者晚期，HPVDNA才釋放到血液，即使被檢測(cè)到，也無(wú)診斷學(xué)意義，它只對(duì)判定有無(wú)宮頸癌血液轉(zhuǎn)移具有一定的參考價(jià)值[5]。最近，B.K.Prusty等提出，宮頸外周的上皮及陰道正常的脫落細(xì)胞進(jìn)入尿液，當(dāng)有HPV感染時(shí)，這些脫落細(xì)胞中也會(huì)含有病毒基因或毒粒。收集尿液可直接用于PCR檢測(cè)HPVDNA，他們對(duì)55名已婚婦女的尿液、宮頸刮片、活檢組織分別進(jìn)行PCR檢查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三者中檢測(cè)到的HPV陽(yáng)性符合率接近100%[6]。用尿液作為檢測(cè)生殖性HPV的感染是一種有用簡(jiǎn)單無(wú)創(chuàng)傷性的方法，可進(jìn)一步證實(shí)并被采用。3.2檢測(cè)指標(biāo)目前，檢測(cè)的指標(biāo)主要有以下三種(1)HPVDNA檢測(cè)是最常用的檢測(cè)指標(biāo)，作為宮頸癌的初篩手段可更靈敏地檢出宮頸癌及其癌前病變，其方法簡(jiǎn)單，客觀性強(qiáng)。但是不能區(qū)分是持續(xù)性感染還是重新感染。(2)HPVmRNA檢測(cè)可以監(jiān)測(cè)致癌基因如E6、E7的表達(dá)，這與疾病的惡化進(jìn)程相關(guān)，當(dāng)病變惡化，E6、E7mRNA的水平升高，但RNA穩(wěn)定性差，不宜儲(chǔ)存。HPVmRNA檢測(cè)的敏感度高達(dá)100%，特異性為70%,但假陽(yáng)性率較高[l]。LieM等通過(guò)實(shí)驗(yàn)指出，對(duì)于低度病變，DNA檢測(cè)的陽(yáng)性率較高，而對(duì)于高度病變，mRNA檢測(cè)的陽(yáng)性率很高，mRNA檢測(cè)似乎更適合預(yù)測(cè)宮頸病變的危險(xiǎn)程度[7]。(3)HPV病毒量HPV病毒量被提出作為識(shí)別疾病的危險(xiǎn)性的手段，但是存在爭(zhēng)議，大多數(shù)研究還不能為每份樣本的細(xì)胞數(shù)定下統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，因此，在進(jìn)行有效的HPV病毒量評(píng)估前應(yīng)調(diào)整標(biāo)本中的細(xì)胞數(shù)。3.3影響分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素HPV檢測(cè)的結(jié)果會(huì)受諸多因素的影響。主要有以下幾方面(1)樣品的來(lái)源HPV檢測(cè)的陽(yáng)性率與取樣患者的年齡段有關(guān)。另外，還與宮頸病變程度有關(guān)，收集樣本的量也影響HPV檢測(cè)的成敗。(2)樣本運(yùn)輸和儲(chǔ)存的穩(wěn)定性也很重要，檢測(cè)的假陰性可由于內(nèi)生的核酸內(nèi)切酶使其核酸降解所造成?，F(xiàn)有一些商業(yè)性樣品儲(chǔ)存液，如PreservCyt(CytycCorp.)，它可延長(zhǎng)核酸在室溫下的儲(chǔ)存時(shí)間。(3)檢測(cè)的方法不同分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)宮頸中HPV的靈敏度和特異度也不同。引物為PGMY09/11和GP576+(PGMY/GP》的巢式PCR檢測(cè)宮頸樣品中的HPVDNA，與以MY/GP+為引物的巢式PCR相比較，發(fā)現(xiàn)前者更具有型特異性和敏感性，可檢測(cè)更廣泛的型別和復(fù)制低下的病毒。更好發(fā)現(xiàn)樣本的多型病毒感染[8]。(4)實(shí)驗(yàn)儀器和設(shè)備發(fā)展中國(guó)家的儀器設(shè)備收集和分析樣本，進(jìn)行HPV檢測(cè)的敏感性普遍低于發(fā)達(dá)國(guó)家。3.4臨床常用檢測(cè)方法3.4.l核酸分子雜交技術(shù)原位核酸雜交(ISH):此技術(shù)是一種敏感、特異、相對(duì)簡(jiǎn)便的方法，又有細(xì)胞定位準(zhǔn)的優(yōu)點(diǎn)，能在亞細(xì)胞水平上定位特異性核酸分子序列，從細(xì)胞分子水平上來(lái)探討HPV感染。例如NariniatsuR等利用熒光原位雜交法(FISH)檢測(cè)高度鱗狀上皮內(nèi)瘤樣病變(HSIL)標(biāo)本中HPVE6、E7mRNA，結(jié)果顯示，其靈敏度為83.3%,特異度為91.3%，均高于雜交捕獲法(HC)(Digene公司)[9]。雜交捕獲試驗(yàn)(HC):它利用化學(xué)發(fā)光對(duì)抗體捕獲的信號(hào)加以放大。能檢測(cè)13種高危型HPV,包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68。ZoltdnHernc5di等用HC(Digene，USA)檢測(cè)61名上皮內(nèi)瘤樣病變(CIN)患者治療后宮頸中HPVDNA，發(fā)現(xiàn)43例HPV陰性者，最終沒(méi)有發(fā)展成為CIN和持續(xù)性細(xì)胞不典型性增生(NPV400y。)，結(jié)果提示，CIN治療后HPV陰性說(shuō)明消除了復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)[IO]。第二代雜交捕獲試驗(yàn)(HC2):試驗(yàn)采用RNA探針，能特異性確定一定型別的高危HPV型(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68)或低危HPV型(6、11、42、43、44)，可對(duì)病毒量進(jìn)行半定量測(cè)定。對(duì)于檢測(cè)CIN2、3和浸潤(rùn)癌中的HPV，其敏感度為66%至100%，特異度為61%至96%[11]。3.4.2聚合酶聯(lián)反應(yīng)(PCR)PCR:此方法特異性敏感性高，是目前最好的HPV檢測(cè)方法，簡(jiǎn)單易行，標(biāo)本來(lái)源不受限，可用型特異性引物進(jìn)行HPV分型，但可發(fā)生樣品間的交叉反應(yīng)，從而導(dǎo)致假陽(yáng)性率。H.DeVuyst等對(duì)653名婦女進(jìn)行HPVDNAPCR檢測(cè)，結(jié)果對(duì)于CIN2及以下的病人，HPVPCR和HRHPVPCR靈敏度分別為94.4%和73.3%，特異度分別為69.3%和77.6%[12]。實(shí)時(shí)定量PCR:該方法靈敏度高，漏診率低，可一次性完成生殖道HPV的檢測(cè)，但其設(shè)備和儀器較貴，限制了其臨床應(yīng)用。LoKW等用實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)HPV16陽(yáng)性的宮頸贅生物標(biāo)本中的病毒加載進(jìn)行定量檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高度病變組(HG-L)、低度病變組(LG-L)和正常組中DNA復(fù)制明顯不同，其程度與病情嚴(yán)重程度呈正比。HPV16E6/7在三組中的陽(yáng)性率分別為88.6%、58.8%和5.9%。實(shí)驗(yàn)表明，實(shí)時(shí)定量PCR在區(qū)分上述三組人中具有診斷價(jià)值[13]。多重巢式PCR(MNP):檢測(cè)15種HRHPV(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68和70)，它的引物是針對(duì)HPV基因的早期區(qū)，它比其它巢式HRHPVPCR檢測(cè)CIN中HPV的陽(yáng)性率高。另外，可通過(guò)對(duì)其產(chǎn)物分析進(jìn)行HPV分型。BrianBrestovac等用MNP對(duì)282個(gè)常規(guī)刮片進(jìn)行HPV檢測(cè)，HPV陽(yáng)性率為17%。對(duì)于CIN1，CIN2和CIN3患者超薄細(xì)胞樣品，HRHPV陽(yáng)性率為91.7%均高于限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(R服P)(12.5%和57.0%)[14]。6PCR-酶免疫測(cè)定法[PCR-EIA]:此法特異性強(qiáng)，靈敏度高，可大量樣本同時(shí)檢測(cè)，且操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)成本低。Soderlund-StrandA等用PCR-EIA對(duì)患者進(jìn)行HPVDNA檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PCR-EIA對(duì)CINIII和CIN11+診斷的靈敏度分別為100.0%和92.9%,是CINII/III診斷的有效手段[15]。半巢式PCR結(jié)合反向雜交一種簡(jiǎn)單便宜的高危型HPV的檢測(cè)及分型方法。HaoLin等用純化的SiHaDNA連續(xù)稀釋10倍后作為半巢式PCR結(jié)合反向雜交及熒光檢測(cè)的模板進(jìn)行半巢式PCR結(jié)合反向雜交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正常者、CIN和浸潤(rùn)癌中HPV陽(yáng)性率分別為15%、89.7%和96.4%[16]。3.4.3HPV檢測(cè)新的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法AMPLIC0RHPV檢測(cè)方法(Roche公司)它是利用PCR和分子核酸雜交技術(shù)對(duì)HPV-DNA進(jìn)行擴(kuò)增，可檢測(cè)高危型HPV16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59和68等13種基因型。Jos印hMonsonego等人用AMPLICOR方法對(duì)270名巴氏涂片檢查異常(MAPS)的患者和234名參與宮頸癌普査的患者進(jìn)行檢査，發(fā)現(xiàn)對(duì)于中重度上皮內(nèi)瘤樣病變(CIN2、3)患者，RocheAMPLIC0RHPV檢測(cè)特異度為42.4%(35.7%-49.2%)，靈敏度為95.2%(89.9%-100.0%)[17]。INF0固(R):LayfieldLJ等比較了第二代雜交捕獲(R)(HCII(R))和INFORM(R)兩種方法對(duì)ASCUS患者診治的價(jià)值，他們用這兩種方法對(duì)431位ASCUS患者進(jìn)行HPVDNA檢查，通過(guò)治療費(fèi)和診斷精確性表明，INFORM方法優(yōu)于HCII，盡管前者比后者費(fèi)用增加了16%,但減少了41%的患者進(jìn)行陰道鏡檢查，且前者特異性較高[18]。短PCR片段PCR結(jié)合線(xiàn)狀探針排列反向雜交法(SPF10/LiPA):可檢測(cè)11種低危型HPV(6、11、34、40、42、43、44、53、54、70、74)和14種高危型HPV(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68)，并且，SPF10/LiPA系統(tǒng)可判斷高危型HPV持續(xù)感染及型別。ChrisPerrons等用SPF10/LiPA對(duì)138名因?qū)m頸病變做陰道鏡檢查和6個(gè)月后再?gòu)?fù)查陰道鏡的患者進(jìn)行HPV檢測(cè)。兩次檢測(cè)HPV陽(yáng)性率分別為81%(112/138)和51°/。(142/276)。通過(guò)宮頸涂片，將患者分為正常組、臨界病變組(BNC)、LSIL和HSIL四組，其HPV陽(yáng)性率分別為55%,69%，50%，72%。并且，SPF10/LiPA可檢測(cè)低量HPVDNA，具有高敏感性[19]。HPVDNA芯片最近出現(xiàn)的一種新的HPV分型方法。它通過(guò)大量固化的寡核苷酸探針與生物樣品的靶系列進(jìn)行分子雜交，根據(jù)產(chǎn)生的雜交圖譜排列出靶DNA的序列?？梢钥焖俑咝?duì)已知序列進(jìn)行重測(cè)序。HaiKwangLee等用一種以寡核苷酸微集陣列系統(tǒng)為基礎(chǔ)的HPVDNA芯片檢測(cè)20個(gè)HPV為陽(yáng)性的婦科臨床標(biāo)本，此HPVDNA芯片可檢測(cè)22種高危型HPV(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、69)和7種低危型HPV(6、11、34、40、42、43、44)，結(jié)果證明HPVDNA芯片的精確性和重復(fù)性幾乎高達(dá)100%[20]。3.5HPVDNA檢測(cè)臨床價(jià)值HPVDNA檢測(cè)的臨床價(jià)值主要有幾個(gè)方面(l)單獨(dú)應(yīng)用HPV檢測(cè)進(jìn)行宮頸癌普査。很多研究發(fā)現(xiàn)，HPVDNA檢測(cè)的靈敏度很高，特別對(duì)于高度病變。但是，其特異性低，特別是對(duì)于年輕已婚婦女。(2)HPV檢測(cè)聯(lián)合細(xì)胞學(xué)進(jìn)行宮頸癌普查。在宮頸普查中，細(xì)胞學(xué)檢查有效但缺乏敏感性，高危型HPVDNA檢測(cè)可有效地、極大地減少細(xì)胞學(xué)檢查的假陰性結(jié)果。對(duì)于CIN1，兩者聯(lián)合使用，靈敏度、特異度、PPV和NPV分別為100%、97.2%、30.8°/。和100%[21]。(3)決定低度病變進(jìn)一步診斷和治療。減少陰道鏡檢查及病理活檢率，延長(zhǎng)復(fù)査間隔時(shí)間。(4)作為宮頸病變治療后的隨訪(fǎng)指標(biāo)。4.血清學(xué)檢査因HPV不能在體外組織細(xì)胞中增殖，故血清學(xué)檢査發(fā)展緩慢。并且，血清學(xué)方法準(zhǔn)確性不高，不能區(qū)別是現(xiàn)在還是過(guò)去感染。目前，尚不能用血清學(xué)方法對(duì)HPV進(jìn)行確診及分型。但是，隨著不斷的研究，在血清中可檢測(cè)到一些具有參考價(jià)值的指標(biāo)，作為宮頸癌診斷治療檢測(cè)及隨診中的標(biāo)志物。先前，有研究指出，HPV16/52/58DNA陽(yáng)性的CIN有顯著的針對(duì)自身LI衣殼蛋白的抗體反應(yīng)。針對(duì)HPV16抗原的IgGl和IgG2在宮頸癌中明顯高于CIN患者，因此，對(duì)血清學(xué)反應(yīng)為陽(yáng)性的患者進(jìn)行IgG亞類(lèi)分析或直接檢測(cè)針對(duì)病毒抗原的細(xì)胞免疫可以有效預(yù)測(cè)CIN的自然消退，但是，KojiMatsumoto通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LI衣殼蛋白的IgG抗體與2年后CIN的消退無(wú)關(guān)聯(lián)，因此指出HPVLI衣殼蛋白的IgG反應(yīng)不能預(yù)測(cè)未治療的CINI/II的自然消退[22]。另外，最近發(fā)現(xiàn)，宮頸病變患者的血清之中，LI表面暴露區(qū)縮氨酸18283("PNN匿ILVPKVSGLQYRVFR74)(SEQIDNO:10)和18294(284LYIKGSGSTANLASSNYFPT3°°)(SEQIDNO:11)可被抗體特異性識(shí)別，有學(xué)者用EILSA法對(duì)這兩個(gè)縮氨酸進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)抗縮氨酸18283和18294抗體與HRHPV所致宮頸病變密切相關(guān)，其靈敏度和特異度分別為94.5-97.2%和90.9-97.5%，并且，EILSA法簡(jiǎn)單、便宜、快速，可用于大規(guī)模血清學(xué)普查[23]。85.展望近年來(lái)，HPV的檢測(cè)發(fā)展迅速，在宮頸癌的篩查和宮頸癌前病變的預(yù)報(bào)中發(fā)揮了的重要作用。目前的觀點(diǎn)是聯(lián)合應(yīng)用薄層巴氏涂片法和HPV檢測(cè)，對(duì)所有高危婦女定期復(fù)查，逐漸消除宮頸癌的可能。此外，HPV檢測(cè)技術(shù)的改進(jìn)方向是使其靈敏度和特異度進(jìn)一步提高，可以大規(guī)模應(yīng)用，同時(shí)可分型，能夠自動(dòng)化，減少財(cái)力、人力和物力，成為宮頸病變篩查中不可少的輔助手段?，F(xiàn)有的HPV檢測(cè)的研究成果，最大的不足就是目前的血清學(xué)檢測(cè)方法缺乏同時(shí)針對(duì)多種型別的簡(jiǎn)便的檢測(cè)手段，例如同時(shí)針對(duì)頻率最高的高危型HPV16和18以及同時(shí)針對(duì)頻率最高的低危型HPV6和11的檢測(cè)手段。因此，本領(lǐng)域迫切需要開(kāi)發(fā)針對(duì)多型HPV的簡(jiǎn)便的血清學(xué)檢測(cè)方法，以便有效控制與HPV相關(guān)疾病的傳播與發(fā)生。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的就是提供一種能同時(shí)誘導(dǎo)針對(duì)多種型別'尤其是同時(shí)誘導(dǎo)對(duì)高危型和低危型均能產(chǎn)生免疫反應(yīng)的誘免疫原，其可以誘導(dǎo)形成針對(duì)多種型別HPV的HPVLl的抗體，以便用于多種型別HPV或HPVLl的檢測(cè)。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種多肽，該多肽選自下組(a)SEQIDNO:1氨基酸序列的多肽；(b)將SEQIDNO:1氨基酸序列經(jīng)過(guò)卜3個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有引發(fā)針對(duì)至少3種(較佳地至少4種，更佳地至少5種，如4-11種)HPV型別的免疫應(yīng)答的由(a)衍生的多肽；(c)SEQIDNO:1的長(zhǎng)度至少為15個(gè)氨基酸的片段，并且所述片段具有引發(fā)針對(duì)至少3種(較佳地至少4種，更佳地至少5種)HPV型別的免疫應(yīng)答的功能；(d)由(a)、(b)和/或(c)所構(gòu)成的融合蛋白。在另一優(yōu)選例中，所述多肽的氨基酸序列為SEQIDNO:1、2、3、4、5、6、7、8或9。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種抗體，所述的抗體特異性地與本發(fā)明所述的多肽結(jié)合。在另一優(yōu)選例中，所述的抗體是單克隆抗體、多克隆抗體、或抗血清。在本發(fā)明的第三方面，提供了本發(fā)明所述多肽的用途，它們被用于制備抗至少3種(較佳地至少4種，更佳地至少5種)HPV型別的抗體。在另一優(yōu)選例中，所述的多肽用于制備抗HPV16、18、6和11型的抗體。在本發(fā)明的第四方面，提供了本發(fā)明所述多肽的用途，它們被用于制備預(yù)防或治療至少3種(較佳地至少4種，更佳地至少5種)HPV型別的藥物組合物。在另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物是疫苗組合物。在本發(fā)明的第五方面，提供了一種藥物組合物，含有本發(fā)明所述的多肽以及藥學(xué)上可接受的載體。在另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物含有免疫有效量本發(fā)明所述的多肽以及藥學(xué)上可接受的佐劑。在本發(fā)明的第六方面，提供了一種檢測(cè)人乳頭瘤病毒的試劑盒，它包括容器以及位于容器內(nèi)的抗SEQIDNO:1所述多肽的抗體(如抗血清)。在本發(fā)明的第七方面，提供了本發(fā)明所述的特異性抗體的用途，它們用于制備檢測(cè)至少3種HPV型別的檢測(cè)試劑盒。在另一優(yōu)選例中，所述的檢測(cè)試劑盒同時(shí)檢測(cè)抗HPV16、18、6和11型的抗體。更佳地，所述的檢測(cè)試劑盒同時(shí)檢測(cè)抗HPV16、18、6、11型，以及HPV31，33，35，45，52，58，和68型。圖l.WesternBlot檢測(cè)。1帶為表達(dá)重組HPV16Ll的sf9培養(yǎng)細(xì)胞；2帶為Marker。圖2.兔抗血清對(duì)細(xì)胞裂解物的ELISA檢測(cè)圖3.WesternBlot檢測(cè)。1，4帶為Caski細(xì)胞；3,5帶為Hela細(xì)胞；2帶為Marker。圖4.兔抗血清對(duì)臨床標(biāo)本的ELISA檢測(cè)。HPV16、18型的樣本為宮頸癌組織；HPV6、11型的樣本為尖銳濕疣組織；HPV其他型別的樣本為尋常疣組織。圖5.鼠抗血清對(duì)臨床標(biāo)本的WesternBlot檢測(cè)。l帶為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)條帶分別對(duì)應(yīng)119KD、79.0KD、46.0KD、31.0KD、24.0KD、19.0KD;2帶HPV16型；3帶HPV18;4帶HPV6型；5帶HPV11型；6帶其他型別。圖6.兔抗血清對(duì)臨床標(biāo)本的組化檢測(cè)。HPV11型的尖銳濕疣標(biāo)本。陽(yáng)性主要見(jiàn)于表面的角化層，某些挖空細(xì)胞核內(nèi)呈陽(yáng)性反應(yīng)。圖7.兔抗血清對(duì)臨床標(biāo)本的組化檢測(cè)。HPV16型的宮頸上皮內(nèi)病變標(biāo)本。陽(yáng)性見(jiàn)于上皮各層，細(xì)胞胞質(zhì)或核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。圖8.短肽內(nèi)優(yōu)勢(shì)表位的ELISA試驗(yàn)確定。對(duì)照為抗短肽抗血清對(duì)短肽的反應(yīng)。圖9.4個(gè)小肽對(duì)抗短肽抗血清封閉效能的ELISA檢測(cè)。對(duì)照為抗短肽抗血清對(duì)短肽的反應(yīng)。圖10.對(duì)PCR初步分型確定為非HPV6，11，16和18的其它型的標(biāo)本進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增。具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過(guò)多年廣泛而深入的研究，對(duì)多種HPV病毒潛在抗原蛋白的序列分析，在一段可誘導(dǎo)針對(duì)多型HPV抗體的多肽基礎(chǔ)上，找到了兼具很強(qiáng)抗原性和廣譜性的氨基酸序列。通過(guò)多肽合成，制得該靶向性的HPV廣譜性多肽，并對(duì)多肽進(jìn)行的免疫研究表明該多肽可同時(shí)誘導(dǎo)針對(duì)多種型別HPV，尤其是同時(shí)誘導(dǎo)對(duì)高危型HPV和低危型HPV均能產(chǎn)生免疫反應(yīng)。因此可用于制備有效的抗多型別HPV的抗體(包括多克隆抗體和單克隆抗體)。用本發(fā)明多肽制備的多抗(如抗血清)，進(jìn)行多型別HPV的檢測(cè)，用于臨床HPV感染的篩查。此外，本發(fā)明多肽還可用于制備抗多型別HPV的疫苗，所述疫苗可用于預(yù)防多種型別HPV感染和/或治療部分型別HPV所致感染性疾病。如本文所用，"本發(fā)明多肽"、"本發(fā)明短肽"、"HPV多特異性多肽"、"抗多型別HPV的免疫原性短肽"等可互換使用，指序列如SEQIDN0:1所示的多肽或其長(zhǎng)度至少為14個(gè)氨基酸的片段、或其保守性衍生多肽，該多肽可引發(fā)針對(duì)至少3種(較佳地至少4種，更佳地至少5種)HPV型別的免疫應(yīng)答。優(yōu)選的本發(fā)明多肽是以HPV16Ll448-477aa區(qū)段的蛋白序列為基礎(chǔ)，其序列為N端-EVNLKEKFSADLDQFPLGRKFLLQAGLKAK—C端(SEQIDNO:1)，長(zhǎng)度為30個(gè)氨基酸。11優(yōu)選的本發(fā)明多肽片段是氨基酸序列如下所示的多肽(SEQIDNO:1-9)。表1優(yōu)選的本發(fā)明多肽<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>本發(fā)明多肽可用常規(guī)方法人工合成，也可用重組方法生產(chǎn)。因此本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明多肽的核酸序列、含所述核酸序列的表達(dá)載體、以及含所述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。例如，SEQIDN0:1序列或其片段和保守性衍生多肽可作為基本結(jié)構(gòu)單元，借連接段肽鏈連接，形成具有多個(gè)重復(fù)結(jié)構(gòu)的蛋白(或長(zhǎng)肽)。無(wú)論是單體還是多體形式的本發(fā)明多肽，都可用于制備預(yù)防性和/或治療性疫苗，用于各型HPV的感染預(yù)防和/或多種低危型HPV感染性疾病的治療。此外，本發(fā)明多肽還與其它具有佐劑效應(yīng)的蛋白相聯(lián)接，形成融合蛋白。該融合蛋白也可用于制備預(yù)防性和/或治療性疫苗，用于各型HPV的感染預(yù)防和/或多種低危型HPV感染性疾病的治療。此外，本發(fā)明多肽還可與化學(xué)合成佐劑或生物佐劑混合后使用，用于各型HPV的感染預(yù)防和/或多種低危型HPV感染性疾病的治療。此外，本發(fā)明多肽還可與BSA等分子量的蛋白偶聯(lián)，從而形成多肽偶聯(lián)物。通常，所述的偶聯(lián)物由多肽、交聯(lián)劑、和BSA構(gòu)成，其中所述的交聯(lián)劑優(yōu)選戊二醛(當(dāng)與本發(fā)明多肽的N-端偶聯(lián)時(shí))、EDAC(當(dāng)與本發(fā)明多肽的C-端偶聯(lián)時(shí))。本發(fā)明多肽或其偶聯(lián)物可用于免疫兔、鼠等動(dòng)物，從而獲得抗本發(fā)明多肽的抗體("本發(fā)明抗體")。本發(fā)明抗體包括特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，"特異性"是指抗體能結(jié)合于HPV病毒、基因產(chǎn)物或片段。本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段(如Fab'或(Fab)2片段)、抗體重鏈、抗體輕鏈、嵌合抗體、人源化抗體等。本發(fā)明的抗體可以通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的本發(fā)明多肽或偶聯(lián)物，可被施用于動(dòng)物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。對(duì)于單克隆抗體，可利用雜交瘤技術(shù)來(lái)制備(見(jiàn)Kohler等人，Nature256;495,1975;Kohler等人，EurJ.Immunol.6:511，1976;Kohler等人，Eur.J.Immunol.6:292,1976;Hammerling等人，InMonoclonalAntibodiesandTCellHybrido隨s,Elsevier,N.Y.,1981)。本發(fā)明的抗體可用檢測(cè)樣品中是否存在HPV病毒。本發(fā)明的多肽和偶聯(lián)物還可用于制備治療性的藥物組合物或預(yù)防性的疫苗組合物。因此，另一方面，本發(fā)明還提供了一種組合物(包括藥物組合物如疫苗組合物)，它含有(a)安全有效量的本發(fā)明多肽、偶聯(lián)物或其組合物；以及(b)藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類(lèi)載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、佐劑、及其組合。本發(fā)明的組合物可通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行制備。此外，載體和配制方法的例子可以參見(jiàn)《Remington藥物科學(xué)》(Remington'sPhamaceuticalScience)。以本發(fā)明多肽計(jì)，其用量例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的多肽還可與佐劑或其他治療劑一起使用。在優(yōu)選例中，本發(fā)明的組合物是疫苗組合物。本發(fā)明的疫苗可以是預(yù)防性的(即預(yù)防感染)或治療性的(即在感染后治療疾病)。本發(fā)明的疫苗組合物包含本發(fā)明的針對(duì)多型別HPV的免疫性短肽(如SEQIDNO:1-7，較佳地SEQIDN0:1)和"藥學(xué)上可接受的載體"。這些載體包括本身不誘導(dǎo)產(chǎn)生對(duì)接受該組合物的個(gè)體有害的抗體的任何載體。合適的載體通常是大的、代謝緩慢的大分子，如多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、氨基酸聚合物、氨基酸共聚物、脂質(zhì)凝集物(如油滴或脂質(zhì)體)以及無(wú)活性的病毒顆粒。這些載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。另外，這些載體可起免疫刺激劑("佐劑")作用。另外，抗原或免疫原可以和細(xì)菌類(lèi)毒素(如白喉、破傷風(fēng)、霍亂、幽門(mén)螺桿菌等病原體的類(lèi)毒素)偶聯(lián)。增強(qiáng)組合物效果的較佳的佐劑包括但不局限于(l)鋁鹽(alum)，如氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁等；(2)水包油型乳劑配方(有或沒(méi)有其它特異性的免疫刺激劑，如胞壁酰肽(見(jiàn)下文)或細(xì)菌細(xì)胞壁成分)，例如，(a)MF59(PCT出版物No.WO90/14837)，其含有5%鯊烯、0.5%吐溫80和0.5%Span85(任選地含有不同量的MTP-PE(見(jiàn)下文)，雖然并不需要)，用微量流化器(如110Y型微量流化器(Microfluidics，Newton,MA))制成亞微米級(jí)顆粒;(b)SAF，其含有10%鯊烯、0.4%吐溫80、5。/。普盧蘭尼克(pluronic)嵌段聚合物L(fēng)121以及thr-MDP(見(jiàn)下文)，微量流化成亞微米級(jí)乳劑或渦流振蕩產(chǎn)生粒徑較大的乳劑，和(C)RibiTM佐劑系統(tǒng)(RAS)(RibiImmunochem，Hamilton,MT)，其含有2%鯊烯、0.2%吐溫80以及取自單磷酰脂A(MPL)、二霉菌酸海藻糖酯(TDM)、和細(xì)胞壁骨架(CWS)的一種或多種細(xì)菌細(xì)胞壁組分，較佳的是MPL+CWS(Detox);(3)皂素佐劑，例如可采用Stimulon(CambridgeBioscience,Worcester,MA)或從其產(chǎn)生的顆粒，如ISC0M(免疫刺激性復(fù)合物)；(4)Freund完全佐劑(CFA)和Freund不完全佐劑(IFA);(5)細(xì)胞因子，如白介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)、干擾素(如Y干擾素)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CFS)、腫瘤壞死因子(TNF)等；(6)細(xì)菌ADP-核糖基化毒素(如霍亂毒素CT，百日咳毒素PT或大腸桿菌熱不穩(wěn)定毒素LT)的脫毒變異體，尤其是LT-K63、LT-R72，CT-S109、PT-K9/G129;參見(jiàn)例如W093/13302和W092/19265;以及(7)作為免疫刺激劑來(lái)增強(qiáng)組合物效果的其它物質(zhì)。包括免疫原性組合物在內(nèi)的疫苗組合物(如可包括抗原，藥學(xué)上可接受的載體以及佐劑)，通常含有稀釋劑，如水，鹽水，甘油，乙醇等。另外，輔助性物質(zhì)，如潤(rùn)濕劑或乳化劑、pH緩沖物質(zhì)等可存在于這類(lèi)運(yùn)載體中。本發(fā)明的疫苗組合物包含免疫學(xué)有效量的本發(fā)明免疫原性多肽以及上述其它所需的組分。"免疫學(xué)有效量"指以單劑或連續(xù)劑一部分給予個(gè)體的量對(duì)治療或預(yù)防是有效的。該用量根據(jù)所治療個(gè)體的健康狀況和生理狀況、所治療個(gè)體的類(lèi)別(如非人靈長(zhǎng)類(lèi)等)、個(gè)體免疫系統(tǒng)合成抗體的能力、所需的保護(hù)程度、疫苗的配制、治療醫(yī)師對(duì)醫(yī)療狀況的評(píng)估、及其它的相關(guān)因素而定。預(yù)計(jì)該用量將在相對(duì)較寬的范圍內(nèi)，可通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定。通常，可將疫苗組合物或免疫原性組合物制成可注射劑，例如液體溶液或懸液；還可制成在注射前適合配入溶液或懸液、液體賦形劑的固體形式。該制劑還可乳化或包封在脂質(zhì)體中，在上述藥學(xué)上可接受的載體下增強(qiáng)佐劑效果。常規(guī)方法是從腸胃外(皮下或肌內(nèi))途徑通過(guò)注射給予免疫原性組合物。適合其它給藥方式的其它配方包括口服、或透皮給藥。治療劑量可以是單劑方案或多劑方案。疫苗可以結(jié)合其它免疫調(diào)節(jié)劑一起給予?？贵w及其應(yīng)用用本發(fā)明多肽制備的抗體的形式可以是多克隆抗血清，也可以是多克隆抗體，也可以是單克隆抗體。本發(fā)明的這些抗體(尤其是抗血清)可用于同時(shí)檢測(cè)多型別的HPV，尤其是同時(shí)檢測(cè)頻率最高的高危型HPV16和18以及頻率最高的低危型HPV6和11。因此，本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)試劑盒，該試劑盒包括容器以及位于容器內(nèi)的抗本發(fā)明多肽SEQIDNO:1的抗體(如抗血清)。該試劑盒可用于同時(shí)檢測(cè)標(biāo)本中是否存在頻率最高的高危型HPV16和18以及同時(shí)針對(duì)檢測(cè)頻率最高的低危型HPV6和11。此外，本發(fā)明的抗體還用于生物制藥工程，以及用于多種型別HPV或HPVLl的純化、制備。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于(a)本發(fā)明多肽可同時(shí)誘導(dǎo)針對(duì)多種型別HPV，尤其是同時(shí)誘導(dǎo)對(duì)高危型HPV和低危型HPV均能產(chǎn)生免疫反應(yīng)。所誘導(dǎo)的高滴度的抗短肽抗血清能分別與重組HPV6bLl，重組HPV16Ll，培養(yǎng)細(xì)胞和臨床標(biāo)本內(nèi)的HPV6、11、16、18及其它型別的病毒或Ll發(fā)生反應(yīng)。(b)本發(fā)明的多肽易于大規(guī)模基因工程生產(chǎn)和化學(xué)合成，并且純化簡(jiǎn)便。實(shí)施例下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠(chǎng)商所建議的條件。實(shí)施例1(a)HPVLl短肽的合成本實(shí)施例中，以HPV16Llaa448-477區(qū)段的蛋白序列為基礎(chǔ)，肽長(zhǎng)度為30個(gè)氨基酸，序列為EVNLKEKFSADLDQFPLGRKFLLQAGLKAK(SEQIDNO:1)。委托北京賽百盛基因技術(shù)有限公司在美國(guó)GenemedSynthesisInc.公司用常規(guī)方法合成該序列短肽。(b)抗血清的制備將合成短肽以PBS溶解后，1:1加Furend.s完全佐劑，乳化后分別以25ug及10ug的劑量免疫日本長(zhǎng)耳大白兔及Balb/c小鼠，共3次。于最后一次免疫的第14天，處死動(dòng)物，取抗短肽的兔抗血清及鼠抗血清。實(shí)施例2抗短肽抗血清對(duì)重組HPV16Ll反應(yīng)性的WesternBlot檢測(cè)表達(dá)重組HPV16Ll的sf9細(xì)胞由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所獲得。將表達(dá)重組HPV16Ll的sf9培養(yǎng)細(xì)胞的裂解液進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，將電泳后的凝膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜，再以兔或小鼠的抗短肽抗血清為一抗與之進(jìn)行反應(yīng)。結(jié)果，小鼠及兔的短肽免疫抗血清能使表達(dá)重組HPV16Ll的sf9培養(yǎng)細(xì)胞裂解液的電泳泳道上，在56KD的位置上出現(xiàn)特異性的反應(yīng)條帶(圖1)。實(shí)施例3抗短肽抗血清對(duì)含HPV病毒培養(yǎng)細(xì)胞反應(yīng)性的ELISA檢測(cè)及WesternBlot檢測(cè)含HPV16病毒的Caski細(xì)胞和含HPV18病毒的Hela細(xì)胞購(gòu)自武漢大學(xué)中國(guó)細(xì)胞保藏中心。進(jìn)口服P標(biāo)記及熒光標(biāo)記二抗購(gòu)于北京中山生物技術(shù)有限公司(sigma產(chǎn)品)。分別將含HPV16病毒的Caski培養(yǎng)細(xì)胞及含HPV18的Hela培養(yǎng)細(xì)胞裂解液包被塑料板，以兔或小鼠的抗短肽抗血清為一抗與之進(jìn)行反應(yīng)。結(jié)果，小鼠及兔的抗短肽抗血清能使Caski培養(yǎng)細(xì)胞及Hela培養(yǎng)細(xì)胞裂解液包被的塑料板呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)(圖2)。將含HPV16病毒的Caski培養(yǎng)細(xì)胞及含HPV18的Hela培養(yǎng)細(xì)胞的裂解液進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，將電泳后的凝膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜，再以兔或小鼠的抗短肽抗血清為一抗與之進(jìn)行反應(yīng)。結(jié)果，小鼠及兔的短肽免疫抗血清能使Caski培養(yǎng)細(xì)胞及Hela培養(yǎng)細(xì)胞裂解液的電泳泳道上，在56KD的位置上出現(xiàn)特異性的反應(yīng)條帶(圖3)。實(shí)施例4抗短肽抗血清對(duì)PCR鑒定HPV陽(yáng)性臨床標(biāo)本反應(yīng)性的ELISA檢測(cè)分別將經(jīng)PCR鑒定的臨床標(biāo)本中篩選出的HPV6、11、16、18四種主要HPV型別及除此以外的其它型別的5種類(lèi)型的標(biāo)本進(jìn)行裂解，將裂解液包被塑料板，以兔或小鼠的抗短肽抗血清與之進(jìn)行反應(yīng)。結(jié)果，小鼠及兔的短肽免疫抗血清，能使標(biāo)本裂解液包被的塑料板呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)(圖4)。實(shí)施例5抗短肽抗血清對(duì)HPV陽(yáng)性臨床標(biāo)本反應(yīng)性的WesternBlot檢測(cè)分別將經(jīng)PCR鑒定的臨床標(biāo)本中篩選出的HPV6、11、16、18四種主要HPV型別及除此以外的其它型別的5種類(lèi)型的標(biāo)本進(jìn)行裂解，裂解液作SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后以兔抗短肽抗血清作一抗，結(jié)果于蛋白分子量約為56K的區(qū)間，均可見(jiàn)有一條陽(yáng)性反應(yīng)帶(圖5)。實(shí)施例6抗短肽抗血清對(duì)HPV陽(yáng)性臨床標(biāo)本反應(yīng)性的免疫組織化學(xué)檢測(cè)將臨床病理檢驗(yàn)為腫瘤，或尖銳濕疣的病理組織進(jìn)行PCR鑒定，取PCR鑒定為HPV6，11，16，和18陽(yáng)性的進(jìn)行反應(yīng)。結(jié)果抗短肽抗血清可使HPV6，11陽(yáng)性的尖銳濕疣組織內(nèi)的一些細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，可見(jiàn)陽(yáng)性反應(yīng)僅出現(xiàn)于胞漿之內(nèi)，胞質(zhì)被染成棕黃色，胞核透亮，呈負(fù)染狀態(tài)'反應(yīng)越近表層越強(qiáng)，角化層反應(yīng)最強(qiáng)。抗血清可使HPV16，18陽(yáng)性的病變組織內(nèi)的一些細(xì)胞出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，反應(yīng)常呈巢狀，陽(yáng)性細(xì)胞與陰性細(xì)胞分界明顯，胞質(zhì)內(nèi)反應(yīng)強(qiáng)(圖6，7)。實(shí)施例1-6的結(jié)果表明，用本發(fā)明SEQIDNO:1所示的多肽所產(chǎn)生的多克隆抗血清能與多種類(lèi)型HPVL1(HPV6，11，l6，18，和其它一些未知型別)發(fā)生反應(yīng)。實(shí)施例7(a)短肽序列內(nèi)的小肽合成由吉爾生化(上海)有限公司以上述短肽氨基酸序列為基礎(chǔ)、合成15個(gè)氨基酸殘基長(zhǎng)、相互錯(cuò)開(kāi)5個(gè)氨基酸殘基的4個(gè)小肽，序列分別為EVNLKEKFSADLDQF,EKFSADLDQFPLGRK,DLDQFPLGRKFLLQA和PLGRKFLLQAGLKAK(以下簡(jiǎn)稱(chēng)為EF、EK、DA、PK)(SEQIDNO:2-5)。(b)抗血清的制備按實(shí)施例1的方法取得上述4個(gè)小肽的抗血清。實(shí)施例8短肽內(nèi)優(yōu)勢(shì)表位的ELISA試驗(yàn)確定以上述4個(gè)小肽包被塑料板，以抗短肽抗血清(1:100)作為一抗與之結(jié)合，檢測(cè)抗短肽抗血清與包被在塑料板上的小肽的反應(yīng)能力，通過(guò)對(duì)4個(gè)小肽反應(yīng)能力，確定短肽內(nèi)的優(yōu)勢(shì)表位存在的區(qū)段。結(jié)果顯示，抗短肽抗血清對(duì)4個(gè)小肽的反應(yīng)強(qiáng)度基本相近，僅對(duì)EK區(qū)段的小肽反應(yīng)稍強(qiáng)，平均反應(yīng)強(qiáng)度僅為12.8%。說(shuō)明短肽內(nèi)表位分布相對(duì)比較均衡，沒(méi)有明顯的優(yōu)勢(shì)線(xiàn)性表位，短肽內(nèi)可能有獨(dú)立的構(gòu)象表位(圖8)。實(shí)施例94個(gè)小肽對(duì)抗短肽抗血清封閉效能的ELISA檢測(cè)以短肽包被塑料板，以4個(gè)小肽與抗短肽抗血清(2:900)共同孵育，37°C封閉lh后作為一抗，檢測(cè)抗短肽抗血清與包被在塑料板上的短肽的反應(yīng)能力，通過(guò)4個(gè)小肽對(duì)抗短肽抗血清的封閉效應(yīng)，確定短肽內(nèi)的優(yōu)勢(shì)表位。結(jié)果4個(gè)小肽對(duì)抗短肽抗血清的封閉效應(yīng)基本相近，僅EK區(qū)段的小肽封閉作用稍強(qiáng)，平均封閉效能約為33.6°/。。這也說(shuō)明短肽內(nèi)表位分布相對(duì)比較均衡，沒(méi)有明顯的優(yōu)勢(shì)線(xiàn)性表位(圖9)。實(shí)施例7-9的結(jié)果表明，雖然15個(gè)氨基酸殘基長(zhǎng)的4個(gè)小肽也具有免疫原性，但是30個(gè)氨基酸殘基長(zhǎng)的短肽的免疫原性顯著強(qiáng)于15個(gè)氨基酸殘基長(zhǎng)的4個(gè)小肽，由30個(gè)氨基酸殘基長(zhǎng)的短肽誘導(dǎo)的抗血清其檢測(cè)HPV的能力或與HPV的反應(yīng)能力強(qiáng)于這4個(gè)小肽誘導(dǎo)的抗血清。實(shí)施例IO類(lèi)似于HPVLl短肽的其他免疫原性多肽按照實(shí)施例i的類(lèi)似方式，合成SEQIDNO:6、7、8和9所示的類(lèi)似于HPVLl短肽的其他免疫原性多肽。按照實(shí)施例1相同的方式制備小鼠的抗血清，按實(shí)施例4相同方式測(cè)試抗血清與HPV6bLl、HPV16Ll、HPV16、HPV18的免疫特異性，結(jié)果如下表3所表3免疫特異性測(cè)試結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>注其它型別經(jīng)鑒定為HPV31，33，35，45和52。實(shí)施例ll對(duì)實(shí)施例4中經(jīng)PCR鑒定為除HPV6、11、16、18四種主要HPV型別以外的其它型別的臨床標(biāo)本再以巢式PCR進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增后的產(chǎn)物加入酶標(biāo)微孔板，進(jìn)行反向雜交，對(duì)標(biāo)本再次進(jìn)行定型分析。結(jié)果證明上述的"其它型別"或"未知型別"分別含有31'33，35，化，52，58，和68各型(標(biāo)本1-8)。這表明，用本發(fā)明SEQIDNO:1所示的多肽所產(chǎn)生的多克隆抗血清能與多種類(lèi)型HPV或HPVL1(HPV6，11，16，18，31，33，35，45，52，58和68型)發(fā)生反應(yīng)(圖10)。實(shí)施例12疫苗組合物按以下配方，通過(guò)常規(guī)的混合法制備一疫苗組合物50ug短肽(SEQIDNO:l)+50ulPBS乳化后，再與50"1氫氧化鋁Al(OH)3混合，于l、2、4周給Balb/c小鼠在背部皮下分別注射3次。于末次注射后的第14天，處死小鼠，取小鼠血清，可測(cè)得有抗短肽抗體產(chǎn)生，滴度大于1:1600;取小鼠脾細(xì)胞測(cè)定CD4+、CD8+T細(xì)胞亞群，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD4+/CD8+的比值明顯增高；取小鼠脾細(xì)胞體外培養(yǎng)，用短肽或提取病毒刺激后，可使培養(yǎng)液內(nèi)IL-4的濃度明顯增高。上述結(jié)果說(shuō)明，該疫苗組合物可明顯誘導(dǎo)受接種動(dòng)物產(chǎn)生針對(duì)短肽或病毒的體液免疫反應(yīng)。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。參考文獻(xiàn)SATORUMOTOYAMA,CECILIAA，LADINES-LLAVE,etal.TheRoleofHumanPapillomaVirusintheMolecularBiologyofCervicalCarcinogenesis.KobeJMedSci2004;50(1):9-19.BurdEM.HumanPapillomavirusandCervicalCancer.ClinMicroRev2003;16(1):1-17AnhangRMS，GoodmanA,etal.HPVCommunication:ReviewofExistingResearchandRecommendationsforPatientEducation.CACancer_JClin2004;54:248-259NiehS,ChenSu-Feng,ChuTang-Yuan,etal.Ispl6'NK4Aexpressionmoreusefulthanhumanpapillomavirustesttodeterminetheoutcomeofatypicalsquamouscellsofundeterminedsignificance—categorizedPapsmearAcomparativeanalysisusingabnormalcervicalsmearswithfollow-upbiopsies.GynecolOncol2005;97(1):35KayP，AllanB'etal.DetectionofHPV16andHPV18DNAinthebloodofpatientswithcervicalcancer.JMedVirol2005:75(3):435-439PrustyBK，KumarA，AroraR，etal.Humanpapillomavirus(HPV)腿detectioninself-collectedurine.IntJGynecolObstet2005;6:4UeAK,RisbergB，BorgeB，etal.DNA-versus■-basedmethodsforhumanpapillomavirusdetectionincervicalneoplasia.GynecolOncol2005;97(3):908-915FuesselHawsAL,HeQ，RadyPL，etal.NestedPCRwiththePGMY09/11andGP5+/6+primersetsimprovesdetectionofHPVDNAincervicalsamples.JVirolMeth2004;122(1):87-93NarimatsuR,PattersonBK.High-throughputcervicalcancerscreeningusingintracellularhumanpapillomavirusE6andE7mRNAquantificationbyflowcytometry.AmJClinPathol2005;123(5):716-23HernddiZ,Sz6keK,Sdpy'T,etal.Roleofh腦anpapillomavirus(HPV)testinginthefollow-upofpatientsaftertreatmentforcervicalprecancerouslesions.EurJObstGynecR印rodBiol2005;118(2):229-234[11]SankaranarayananR,GaffikinL，JacobM，etal.Acriticalassessmentofscreeningmethodsforcervicalneoplasia.InternJGynecolObstet2005:89(2):S4-S12DeVuystH，ClaeysP,NjiruS,etal.Comparisonofpapsmear,visualinspectionwithaceticacid,humanpapillomavirusDNA—PCRtestingandcervicogr即hy.InternJGynecolObstet2005;89(2):120-126Wing-KitK,YeungS，CheungT，etal.Quantitativeanalysisofhumanpapillomavirustype16incervicalneoplasm:AstudyinChinesepopulation._JClinVirol2005;5:6BrestovacB,HarnettGB，SmithDW,etal.MultiplexnestedPCR(MNP)assayforthedetectionof15highriskgenotypesofhumanpapillomavirus.JClinVirol2005;33(2):116-122Soderlund-StrandA，RymarkP，AnderssonP，etal.ComparisonbetweentheHybridCaptureIITestandaPCR-BasedHumanPapillomavirusDetectionMethodforDiagnosisandPosttreatmentFollow-UpofCervicalIntraepithelialNeoplasia.JClinMicrobiol2005;43(7):3260-6.LinH，MohJ，0uY，etal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