專利名稱：粉防己堿有機(jī)酸鹽及制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檸檬酸粉防己堿(Tetrandrine citmte)和制備，以及含有它們的藥 物組合在制備治療腫瘤性疾病藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)告2007年全世界大約2500萬人患有各種各樣的癌癥， 790萬人死于這些癌癥(約占所有死亡人數(shù)的13%)。預(yù)計(jì)全世界癌癥死亡將 繼續(xù)增加，2030年估計(jì)將有1200萬人死于癌癥。2006年，癌癥在中國(guó)奪去了 近180萬人的生命，比2005年的數(shù)字多出了約30萬。癌癥已成為人類健康的 第一殺手。然而，令人遺憾的是，目前常用的藥物并不能有效控制和治療這些 癌癥，因此研究新的更好的藥物來預(yù)防和治療這些癌癥有著十分重要的意義。
粉防己堿，又名漢防己甲素(Tetrandrine，簡(jiǎn)稱Tet)，是存在于中草藥粉 防己的根塊中的雙芐基異喹啉生物堿，具有消炎、鎮(zhèn)痛、降壓、抗矽肺、抗腫 瘤等多種藥理作用[Xie QM，et al. Acta Pharmacol Sin. 2002， 23:1107-13; Choi HS， et al. J Ethnopharmacol. 2000， 69:173-9; Pang L, et al. Biochem Pharmacol. 1997;53:773-82]。在抗腫瘤研究領(lǐng)域，粉防己堿已被證實(shí)具有逆轉(zhuǎn)P-糖蛋白 (P-glycoprotein，P-gp)介導(dǎo)的腫瘤多藥耐藥(multidrugresistance, MDR)作用[Wen-Lin Xu et al. Leuk Res， 2006， 30:407-13; Zhu X， et al. Anticancer Res. 2005; 25:1953-62; Liu ZL, et al. J Pharm Pharmacol. 2003;55:1531-7 ]。也有文獻(xiàn)報(bào)道， 粉防己堿能直接誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的多種人腫瘤細(xì)胞死亡[Ng LT, et al. Am J Chin Med. 2006;34:125-35; Meng LH， et al. Cancer Res. 2004;64:9086-92; Kuo PL et al. Life Sci. 2003; 73:243-52]。但這些文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果顯示，盡管粉防己堿能逆轉(zhuǎn)體 外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥，以及誘導(dǎo)一些腫瘤細(xì)胞死亡，但它在體內(nèi)逆轉(zhuǎn)腫瘤 細(xì)胞耐藥作用和抗腫瘤效果并不理想。
已知， 一些化合物的水溶性是決定其生物利用度和藥效的關(guān)鍵因素之一。 生物堿在植物體內(nèi)常與有機(jī)酸(檸檬酸，果酸，草酸，琥珀酸，醋酸，丙酸等) 結(jié)合成鹽而存在，而目前大多數(shù)研究中所用的粉防己堿是不溶于水的游離生物 堿，這種粉防己堿的疏水性無疑會(huì)影響其體內(nèi)抗腫瘤效果。因此，有必要研制 具有高水溶性的新型粉防己堿鹽類，以提高其生物利用度和藥效。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種具有以下結(jié)構(gòu)通式的粉防己堿有機(jī)酸鹽類:
"CH3 3HCO,w
(1)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供上述粉防己堿有機(jī)酸鹽的制備方法，通過以 下步驟實(shí)現(xiàn)-
(1) 室溫下，將粉防己堿加入一水檸檬酸(或者無水檸檬酸)溶液中進(jìn) 行成鹽反應(yīng)，粉防己堿和檸檬酸的優(yōu)選比例為2 10: 1 (重量比)，但不限于 此比例，得粉防己堿檸檬酸鹽溶液；
(2) 將上述粉防己堿檸檬酸鹽溶液干燥，得白色檸檬酸粉防己堿鹽結(jié)晶。 本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供上述檸檬酸粉防己堿鹽在制備治療腫瘤性疾
病藥物中的應(yīng)用。例如但不限于制備治療造血系統(tǒng)惡性腫瘤白血病、多發(fā)性骨 髓瘤、淋巴瘤和實(shí)體腫瘤肝癌、膽管細(xì)胞癌、胰腺癌、乳腺癌、骨肉瘤等藥物 中的應(yīng)用。
本發(fā)明所述的檸檬酸粉防己堿鹽不僅能選擇性誘導(dǎo)造血系統(tǒng)惡性腫瘤如 白血病、多發(fā)性骨髓瘤、淋巴瘤等腫瘤細(xì)胞死亡(見實(shí)施例5-10)，而且也能 誘導(dǎo)多種人實(shí)體腫瘤如肝癌、膽管細(xì)胞癌、胰腺癌、乳腺癌、骨肉瘤等腫瘤細(xì) 胞的死亡(見實(shí)施例11-15)。更有意義的是，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)口服檸檬酸粉防己 堿鹽能顯著抑制動(dòng)物體內(nèi)人異種移植瘤生長(zhǎng)，對(duì)其中的一些腫瘤，例如白血病 顯示出完全清除，達(dá)到根治腫瘤效果，體內(nèi)抗腫瘤效果明顯高于不溶于水的粉 防己堿游離堿(見實(shí)施例16)。值得一提的是，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，本發(fā)明所 述的檸檬酸粉防己堿在抗腫瘤有效劑量下對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無明顯毒性反應(yīng)(見實(shí)施 例16)。
本發(fā)明所述含有通式(I)檸檬酸粉防己堿的藥物，該藥物包括一種如上 所述的檸檬酸粉防己堿，和任選的藥學(xué)上可以接受的賦型劑。
本發(fā)明的檸檬酸粉防己堿可以以口服的形式給藥，例如但不限于普通片劑 和腸溶片、膠囊、藥丸、粉劑、粒劑、酊劑、溶液、懸浮液和糖漿劑。它們也 可以以腸胃外的形式給藥，例如但不限于藥學(xué)領(lǐng)域的普通人熟知的靜脈內(nèi)、腹膜腔內(nèi)、皮下和肌肉等形式。
目前常用的粉防己堿是一種未成鹽的游離生物堿，不溶于水，而事實(shí)上， 大多數(shù)生物堿在植物體內(nèi)常與有機(jī)酸(檸檬酸，果酸，草酸，琥珀酸，醋酸， 丙酸等)結(jié)合成鹽而發(fā)揮作用。因此，本發(fā)明的發(fā)明人應(yīng)用可食用的強(qiáng)有機(jī)酸
檸檬酸設(shè)計(jì)和制備水溶性(Water-solubility)更好的粉防己堿有機(jī)酸鹽，通過體外 和動(dòng)物體內(nèi)抗腫瘤活性篩選，以期獲得抗腫瘤活性更高、毒性更低的新型粉防 己堿鹽，供進(jìn)一步開發(fā)成新的藥物。本發(fā)明人驚奇的發(fā)現(xiàn)，檸檬酸粉防己堿不 僅具有很好的水溶性，而且在動(dòng)物體內(nèi)對(duì)多種腫瘤性疾病具有很好的治療作 用。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之一是提供藥理上可接受的、治療效果好的新
型粉防己堿有機(jī)酸鹽檸檬酸粉防己堿及其制備方法。選用商品化的粉防己堿 游離堿作為原料，在室溫條件下，應(yīng)用可食用的強(qiáng)有機(jī)酸(檸檬酸)按一定比 例進(jìn)行成鹽反應(yīng)，獲得水溶性好的新型有機(jī)酸粉防己堿鹽擰檬酸粉防己堿鹽
(Tetrandrine citrate)。
同時(shí)，本發(fā)明還提供含有上述檸檬酸粉防己堿鹽的治療腫瘤性疾病藥物組 合，例如但不限于治療白血病藥物組合、治療多發(fā)性骨髓瘤藥物組合、治療淋 巴瘤藥物組合、治療肝癌藥物組合、治療膽管細(xì)胞癌藥物組合、治療胰腺癌藥 物組合、治療乳腺癌藥物組合、治療骨肉瘤藥物組合等等。
按上述方法和步驟制備的檸檬酸粉防己堿鹽的特點(diǎn)是應(yīng)用可食用的強(qiáng)有 機(jī)酸檸檬酸制備粉防己堿有機(jī)酸鹽，獲得的檸檬酸粉防己堿鹽其水溶性大于 200mg/ml (見實(shí)施例3)，而且用上述檸檬酸粉防己堿鹽配制的溶液的pH值在 4.5左右(見實(shí)施例4)。
使用本發(fā)明的檸檬酸粉防己堿的劑量方案由本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù) 各種因素來選擇所述因素包括但不限于年齡、體重、性別和接受者的體格狀 況、需要治療的疾病的嚴(yán)重程度、給藥的途徑、接受者的代謝水平和排泄功能、 采用的劑量形式、采用的具體化合物。
本發(fā)明的藥物組合可以進(jìn)一步包含另外一種或多種抗癌藥物，例如市場(chǎng)上 供應(yīng)的現(xiàn)有抗癌藥物。
抗癌藥物通常在聯(lián)合使用時(shí)更為有效。此外，最好以大多數(shù)藥物的最大耐 受劑量，兩次給藥之間的時(shí)間間隔最小進(jìn)行給藥。
本發(fā)明的檸檬酸粉防己堿優(yōu)選在給藥之前與一種或多種藥學(xué)上可以接受 的賦型劑一起配制。賦型劑是惰性物質(zhì)，例如但不限于載體、稀釋液、調(diào)味劑、甜味劑、潤(rùn)滑劑、增溶劑、懸浮劑、粘合劑、藥品崩解劑和膠囊材料。
本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案是藥物制劑，該制劑包括本發(fā)明的檸檬酸粉 防己堿和一種或多種藥學(xué)上可以接受的賦型劑，該賦型劑可以與該制劑中的其 它成分相容且對(duì)其接受者無害。本發(fā)明的藥物制劑通過將治療有效量的本發(fā)明 的檸檬酸粉防己堿與一種或多種藥學(xué)上可以接受的賦型劑組合來制備。在制備 本發(fā)明的組合物過程中，所述活性成分可以與稀釋劑混合、或被封閉在載體內(nèi)， 該載體可以是膠囊、小袋、包裝紙或其它容器。該載體可以用作稀釋劑，可以 是用作運(yùn)載體的固體、半固體或液體材料；或是藥片、藥丸、粉劑、錠劑、懸 浮液、乳劑、溶液、糖漿、軟和硬的凝膠膠囊、栓劑、無菌的注射溶液和無菌 的包裝粉劑。
對(duì)于口服給藥，所述活性成分可以與口服的、非毒性的藥學(xué)上可以接受的 載體組合，該載體例如但不限于乳糖、淀粉、蔗糖、葡萄糖、碳酸鈉、甘露 醇、山里糖醇、碳酸鈣、磷酸鈣、硫酸鈣、甲基纖維素等；任選地還可以與崩 解劑、結(jié)合劑、潤(rùn)滑劑組合，該崩解劑例如但不限于玉米、淀粉、甲基纖維 素、瓊脂潤(rùn)土、黃原膠、褐藻酸等；結(jié)合劑例如但不限于凝膠、天然食糖、卩-乳糖、玉米甜料、天然和合成橡膠、阿拉伯樹膠、羧甲基纖維素、聚乙二醇、 石蠟等；潤(rùn)滑劑例如但不限于硬脂酸鎂、硬脂酸鈉、硬脂酸、油酸鈉、苯甲 酸鈉、乙酸鈉等。
在粉劑形式中，所述載體可以是與細(xì)碎的活性成分混合的細(xì)碎的固體。該 活性成分可以以合適的比例與具有結(jié)合屬性的載體混合，并壓成希望的形狀和 大小，從而形成片劑。所述粉劑和片劑優(yōu)選含有1%到99%重量的活性成分， 該活性成分是本發(fā)明的檸檬酸粉防己堿。合適的固體載體是羧甲基纖維素鎂、 低熔點(diǎn)的蜂臘和可可油。
無菌的液體制劑包括懸浮液、乳狀液和糖漿。所述活性成分能夠溶解或懸 浮在藥學(xué)上可接受的載體中，例如無菌水、無菌有機(jī)溶劑、或無菌水和無菌有 機(jī)溶劑的混合物。
上述制劑可以以單位劑型存在，該單位劑型是含有單位劑量的物理分散單 元，適于向人體和其它哺乳動(dòng)物體給藥。單位劑型可以是膠囊或片劑，或是很 多膠囊或片劑。"單位劑量"是本發(fā)明的活性化合物的預(yù)定量，經(jīng)過計(jì)算使其與 一種或多種賦型劑組合能產(chǎn)生理想的治療效果。根據(jù)所涉及的具體治療，活性 成分的單位劑量的量可以在約0.1到約1000毫克或更多之間進(jìn)行變化或調(diào)整。
本發(fā)明所述的檸檬酸粉防己堿鹽與目前常用的粉防己堿游離堿相比，具有
6以下一些優(yōu)點(diǎn)和特性(1)具有很好的水溶性和接近人體血液生理狀態(tài)pH值， 有利于提高其生物利用度和藥效(實(shí)施例3-4); (2)制備工藝簡(jiǎn)單易行，成功 率高，成本低，適合規(guī)?；a(chǎn)(實(shí)施例l-2); (3)采用可食用的有機(jī)酸檸檬
酸制備粉防己堿鹽，具有比無機(jī)酸鹽酸制備的鹽酸粉防己堿鹽更高的安全性； (4)具有更廣和更強(qiáng)的抗腫瘤活性，已證實(shí)敏感的腫瘤有但不限于白血病、
多發(fā)性骨髓瘤、淋巴瘤、肝癌、膽管細(xì)胞癌、胰腺癌、骨肉瘤、乳腺癌等(實(shí)
施例5-16); (5)毒付作用更低，體外細(xì)胞培養(yǎng)體系和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，檸檬酸
粉防己堿在有效抗腫瘤劑量下對(duì)正常人細(xì)胞生長(zhǎng)和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物沒有明顯毒副作
用(實(shí)施例16)。
本發(fā)明所用的制備檸檬酸粉防己堿鹽的方法，成功率高，簡(jiǎn)單易行，成本
低，適合規(guī)?；a(chǎn)(實(shí)施例1-2)。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明結(jié)合下列實(shí)施例，將更加具體地解釋本發(fā)明。但應(yīng)理解，下列實(shí)施 例旨在說明本發(fā)明而不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。 實(shí)施例1 一水檸檬酸粉防己堿鹽制備
在室溫下，稱取10克粉防己堿，放入玻璃燒杯中，然后加入100毫升2.5% 的一水檸檬酸(C6H507.H20)溶液，攪拌，待粉防己堿完全溶解，溶液完全透 明，然后將檸檬酸粉防己堿鹽溶液進(jìn)行干燥，得白色檸檬酸粉防己堿鹽粉末。
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(I)
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示應(yīng)用這一方法制備的一水檸檬酸粉防己堿鹽不僅成功率高 (100%);而且，所需試劑少，只需檸檬酸和水，操作步驟少而簡(jiǎn)單，普通實(shí) 驗(yàn)室即可操作，成功率100%。
實(shí)施例2無水檸檬酸粉防己堿鹽制備
在室溫下，稱取IO克粉防己堿，放入玻璃燒杯中，然后加入IOO毫升2.5% 的無水檸檬酸(C6H507)溶液，攪拌，待粉防己堿完全溶解，溶液完全透明，然后將檸檬酸粉防己堿鹽溶液進(jìn)行干燥，得白色粉防己堿檸檬酸鹽粉末< 反應(yīng)式
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實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示應(yīng)用這一方法制備的無水檸檬酸粉防己堿鹽不僅成功率 高(100%);而且，所需試劑少，只需檸檬酸和水，操作步驟少而簡(jiǎn)單，普通 實(shí)驗(yàn)室即可操作。
實(shí)施例3檸檬酸粉防己堿鹽水溶性測(cè)定
在室溫下稱取O.l克檸檬酸粉防己堿，放入10ml試管內(nèi)，然后慢慢加入去 離子水或蒸餾水，邊加邊搖勻，直至加入的檸檬酸粉防己堿鹽充分溶解，溶液 呈現(xiàn)完全透明為止。然后，測(cè)定完全溶解檸檬酸粉防己堿鹽所需的水，計(jì)算檸 檬酸粉防己堿鹽在水溶性中的溶解度。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示檸檬酸粉防己堿鹽在水中的溶解度大于200mg/ml。
實(shí)施例4檸檬酸粉防己堿鹽水溶性pH值測(cè)定
在室溫下稱取O.l克檸檬酸粉防己堿鹽，放入10ml試管內(nèi)，然后慢慢加入 去離子水或蒸餾水，邊加邊搖勻，直至加入的檸檬酸粉防己堿鹽充分溶解，溶 液呈現(xiàn)完全透明為止。然后，用精密pH試紙測(cè)定溶液pH值。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示檸檬酸粉防己堿鹽水溶液的pH值為4.5左右。與鹽酸小 檗胺鹽水溶液pH值(2.0)相比，檸檬酸粉防己堿鹽水溶液pH值更接近正常 人血液生理pH值(7.3-7.4)。
實(shí)施例5:檸檬酸粉防己堿鹽抗人慢性髓系白血病細(xì)胞K562活性測(cè)定
(1)實(shí)驗(yàn)材料
白血病細(xì)胞株人K562白血病細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。 主要試劑檸檬酸粉防己堿為我們自己合成。 主要儀器細(xì)胞培養(yǎng)箱，酶標(biāo)儀取生長(zhǎng)良好的白血病細(xì)胞8000個(gè)，接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板孔內(nèi)。培養(yǎng)液 為含10%胎牛血清的1640細(xì)胞培養(yǎng)液。加入不同濃度的檸檬酸粉防己堿，混 勻后，置二氧化碳(5%C02)細(xì)胞培養(yǎng)箱37'C培養(yǎng)48小時(shí)。然后用MTT法 測(cè)定活細(xì)胞濃度。在本實(shí)驗(yàn)中對(duì)照組(不加藥物處理)細(xì)胞活力設(shè)為100。％， 并計(jì)算出藥物作用后細(xì)胞活力(％)和48小時(shí)白血病細(xì)胞半數(shù)生長(zhǎng)抑制濃度 (48小時(shí)IC50值)。
(3) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明檸檬酸粉防己堿能誘導(dǎo)人白血病細(xì)胞系K562細(xì)胞死亡和抑 制白血病細(xì)胞生長(zhǎng)，其48小時(shí)白血病細(xì)胞半數(shù)生長(zhǎng)抑制濃度(48小時(shí)IC50)分 別約為1.5嗎/ml。
實(shí)施例6:檸檬酸粉防己堿鹽抗人急性髓系白血病細(xì)胞NB4活性測(cè)定
(1) 實(shí)驗(yàn)材料
白血病細(xì)胞株人NB4白血病細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。 主要試劑檸檬酸粉防己堿為我們自己合成。 主要儀器細(xì)胞培養(yǎng)箱，酶標(biāo)儀
(2) 實(shí)驗(yàn)方法
取生長(zhǎng)良好的白血病細(xì)胞8000個(gè)，接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板孔內(nèi)。培養(yǎng)液 為含10%胎牛血清的1640細(xì)胞培養(yǎng)液。加入不同濃度的檸檬酸粉防己堿，混 勻后，置二氧化碳(5%C02)細(xì)胞培養(yǎng)箱37。C培養(yǎng)48小時(shí)。然后用MTT法 測(cè)定活細(xì)胞濃度。在本實(shí)驗(yàn)中對(duì)照組(不加藥物處理)細(xì)胞活力設(shè)為100%， 并計(jì)算出藥物作用后細(xì)胞活力(％)和48小時(shí)白血病細(xì)胞半數(shù)生長(zhǎng)抑制濃度 (48小時(shí)IC50值)。
(3) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明檸檬酸粉防己堿能誘導(dǎo)人急性髓系白血病細(xì)胞系NB4細(xì)胞 死亡和抑制白血病細(xì)胞生長(zhǎng)，其48小時(shí)白血病細(xì)胞半數(shù)生長(zhǎng)抑制濃度(48小時(shí) IC50)分別約為23g/ml。
實(shí)施例7檸檬酸粉防己堿鹽抗耐藥人慢性髓系白血病細(xì)胞K562/ADR活 性測(cè)定
(1)實(shí)驗(yàn)材料
9白血病細(xì)胞株多藥耐藥人K562/ADR白血病細(xì)胞系由浙江大學(xué)腫瘤研究
所提供。
主要試劑檸檬酸小檗胺為我們自己合成。 主要儀器細(xì)胞培養(yǎng)箱，酶標(biāo)儀
(2) 實(shí)驗(yàn)方法
取生長(zhǎng)良好的白血病細(xì)胞8000個(gè)，接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板孔內(nèi)。培養(yǎng)液 為含10%胎牛血清的1640細(xì)胞培養(yǎng)液。加入不同濃度的藥物，混勻后，置二 氧化碳(5%C02)細(xì)胞培養(yǎng)箱37"培養(yǎng)48小時(shí)。然后用MTT法測(cè)定活細(xì)胞 濃度。在本實(shí)驗(yàn)中對(duì)照組(不加藥物處理)細(xì)胞活力設(shè)為100%，并計(jì)算出藥 物作用后細(xì)胞活力(％ )和48小時(shí)白血病細(xì)胞半數(shù)生長(zhǎng)抑制濃度(48小時(shí)IC50 值)。
(3) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明檸檬酸粉防己堿同樣能誘導(dǎo)耐藥的人白血病細(xì)胞系 K562/ADR細(xì)胞死亡和抑制白血病細(xì)胞生長(zhǎng)，其48小時(shí)白血病細(xì)胞半數(shù)生長(zhǎng) 抑制濃度(48小時(shí)IC50)分別約為2.5ng/ml。
實(shí)施例8檸檬酸粉防己堿鹽抗人淋系白血病細(xì)胞Jurkat活性測(cè)定
(1) 實(shí)驗(yàn)材料
人白血病細(xì)胞株:人淋系白血病細(xì)胞系Jurkat購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。
主要試劑檸檬酸粉防己堿為我們自己合成。 主要儀器細(xì)胞培養(yǎng)箱，酶標(biāo)儀
(2) 實(shí)驗(yàn)方法
取生長(zhǎng)良好的白血病細(xì)胞8000個(gè)，接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板孔內(nèi)。培養(yǎng)液 為含10%胎牛血清的1640細(xì)胞培養(yǎng)液。加入不同濃度的藥物，混勻后，置二 氧化碳(5%C02)細(xì)胞培養(yǎng)箱37'C培養(yǎng)48小時(shí)。然后用MTT法測(cè)定活細(xì)胞 濃度。在本實(shí)驗(yàn)中對(duì)照組(不加藥物處理)細(xì)胞活力設(shè)為100。％，并計(jì)算出藥 物作用后細(xì)胞活力(。％ )和48小時(shí)白血病細(xì)胞半數(shù)生長(zhǎng)抑制濃度(48小時(shí)IC50 值)。
(3) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明擰檬酸粉防己堿能誘導(dǎo)人淋系白血病細(xì)胞系Jurkat細(xì)胞死亡 和抑制白血病細(xì)胞生長(zhǎng)，其48小時(shí)白血病細(xì)胞半數(shù)生長(zhǎng)抑制濃度(48小時(shí)IC50) 分別約為L(zhǎng)53路/ml。實(shí)施例9檸檬酸粉防己堿鹽抗人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞RPMI8226活性測(cè)定
(1) 實(shí)驗(yàn)材料
人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株系RPMI8226由浙江大學(xué) 血液病研究所提供。
主要試劑檸檬酸粉防己堿為我們自己合成。
主要儀器細(xì)胞培養(yǎng)箱，酶標(biāo)儀
(2) 實(shí)驗(yàn)方法
取生長(zhǎng)良好的人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系RPMI8226細(xì)胞8000個(gè)，接種到96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板孔內(nèi)。培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的1640細(xì)胞培養(yǎng)液。加入不同 濃度的藥物，混勻后，置二氧化碳(5%C02)細(xì)胞培養(yǎng)箱37'C培養(yǎng)48小時(shí)。 然后用MTT法測(cè)定活細(xì)胞濃度。在本實(shí)驗(yàn)中對(duì)照組(不加藥物處理)細(xì)胞活 力設(shè)為100%，并計(jì)算出藥物作用后細(xì)胞活力(％)和48小時(shí)白血病細(xì)胞半數(shù) 生長(zhǎng)抑制濃度(48小時(shí)IC50值)。
(3) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明擰檬酸粉防己堿能誘導(dǎo)人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系RPMI8226 細(xì)胞死亡，其48小時(shí)半數(shù)生長(zhǎng)抑制濃度(48小時(shí)IC50)為1.26|ig/ml，表明檸檬 酸粉防己堿具有抗人多發(fā)性骨髓瘤活性。
實(shí)施例10檸檬酸粉防己堿鹽抗人淋巴瘤瘤細(xì)胞DOHH2活性測(cè)定
(1) 實(shí)驗(yàn)材料
人淋巴瘤細(xì)胞株人淋巴瘤細(xì)胞株由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院血液科 吳東博士提供。
主要試劑檸檬酸粉防己堿為我們自己合成。 主要儀器細(xì)胞培養(yǎng)箱，酶標(biāo)儀
(2) 實(shí)驗(yàn)方法
取生長(zhǎng)良好的白血病細(xì)胞8000個(gè)，接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板孔內(nèi)。培養(yǎng)液
為含10%胎牛血清的1640細(xì)胞培養(yǎng)液。加入不同濃度的藥物，混勻后，置二 氧化碳(5%C02)細(xì)胞培養(yǎng)箱37。C培養(yǎng)48小時(shí)。然后用MTT法測(cè)定活細(xì)胞 濃度。在本實(shí)驗(yàn)中對(duì)照組(不加藥物處理)細(xì)胞活力設(shè)為100%，并計(jì)算出藥 物作用后細(xì)胞活力(％ )和48小時(shí)白血病細(xì)胞半數(shù)生長(zhǎng)抑制濃度(48小時(shí)IC50 值)。
ii實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明檸檬酸粉防己堿能誘導(dǎo)人淋巴瘤細(xì)胞死亡，其48小時(shí)半數(shù)
生長(zhǎng)抑制濃度(48小時(shí)IC50)約為0.50pg/ml，表明檸檬酸粉防己堿具有抗人淋 巴瘤細(xì)胞活性。
實(shí)施例ll檸檬酸粉防己堿鹽抗人肝癌細(xì)胞HepG2活性測(cè)定
(1) 實(shí)驗(yàn)材料
人肝癌細(xì)胞株HepG2:人肝癌細(xì)胞株HepG2購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。 主要試劑檸檬酸小檗胺為我們自己合成。 主要儀器細(xì)胞培養(yǎng)箱，酶標(biāo)儀
(2) 實(shí)驗(yàn)方法
取生長(zhǎng)良好的人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞4000個(gè)，接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng) 板孔內(nèi)。培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的1640細(xì)胞培養(yǎng)液。置二氧化碳(5XC02) 細(xì)胞培養(yǎng)箱37"C培養(yǎng)24小時(shí)后，加入不同濃度的藥物，混勻后，繼續(xù)置二氧 化碳(5%C02)細(xì)胞培養(yǎng)箱37'C培養(yǎng)48小時(shí)。然后用MTT法測(cè)定活細(xì)胞濃 度，并計(jì)算出藥物作用后細(xì)胞活力(％)。在本實(shí)驗(yàn)中對(duì)照組(不加藥物處理) 細(xì)胞活力設(shè)為100%。
(3) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明檸檬酸粉防己堿鹽能明顯誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞死亡， 并抑制其生長(zhǎng)，其48小時(shí)半數(shù)生長(zhǎng)抑制濃度(48小時(shí)IC50)為8.0ng/ml，表明 檸檬酸小檗胺具有抗人肝癌細(xì)胞活性。
實(shí)施例12:檸檬酸粉防己堿鹽抗人膽管癌細(xì)胞株FRH0201活性測(cè)定
(1) 實(shí)驗(yàn)材料
人膽管癌細(xì)胞株FRH0201:由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院外科提供。
主要試劑檸檬酸粉防己堿為我們自己合成。 主要儀器細(xì)胞培養(yǎng)箱，酶標(biāo)儀
(2) 實(shí)驗(yàn)方法
取生長(zhǎng)良好的人膽管癌細(xì)胞株FRH0201細(xì)胞5000個(gè)，接種到96孔細(xì)胞 培養(yǎng)板孔內(nèi)。培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的1640細(xì)胞培養(yǎng)液。置二氧化碳(5 %C02)細(xì)胞培養(yǎng)箱37t:培養(yǎng)24小時(shí)后，加入不同濃度的藥物，混勻后，繼 續(xù)置二氧化碳(5%C02)細(xì)胞培養(yǎng)箱37。C培養(yǎng)48小時(shí)。然后用MTT法測(cè)定 活細(xì)胞濃度，并計(jì)算出藥物作用后細(xì)胞活力(％)。在本實(shí)驗(yàn)中對(duì)照組(不加藥物處理)細(xì)胞活力設(shè)為100%。 (3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明檸檬酸粉防己堿能明顯誘導(dǎo)人膽管癌細(xì)胞株FRH0201細(xì)胞 死亡，并抑制其生長(zhǎng)，其48小時(shí)半數(shù)生長(zhǎng)抑制濃度(48小時(shí)IC50)約為4.0pg/ml，
表明檸檬酸粉防己堿具有抗人膽管癌細(xì)胞活性。
實(shí)施例13擰檬酸粉防己堿鹽抗人乳腺癌細(xì)胞MCF7活性測(cè)定
(1) 實(shí)驗(yàn)材料
人乳腺癌細(xì)胞株MCF7:人乳腺癌細(xì)胞株MCF7購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。
主要試劑檸檬酸粉防己堿為我們自己合成。 主要儀器細(xì)胞培養(yǎng)箱，酶標(biāo)儀
(2) 實(shí)驗(yàn)方法
取生長(zhǎng)良好的人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7細(xì)胞5000個(gè)，接種到96孔細(xì)胞培 養(yǎng)板孔內(nèi)。培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的1640細(xì)胞培養(yǎng)液。置二氧化碳(5% C02)細(xì)胞培養(yǎng)箱37'C培養(yǎng)24小時(shí)后，加入不同濃度的藥物，混勻后，繼續(xù) 置二氧化碳(5%C02)細(xì)胞培養(yǎng)箱37"C培養(yǎng)48小時(shí)。然后用MTT法測(cè)定活 細(xì)胞濃度，并計(jì)算出藥物作用后細(xì)胞活力(％)。在本實(shí)驗(yàn)中對(duì)照組(不加藥 物處理)細(xì)胞活力設(shè)為100%。
(3) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明擰檬酸粉防己堿能明顯誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7細(xì)胞死 亡，并抑制其生長(zhǎng)，其48小時(shí)半數(shù)生長(zhǎng)抑制濃度(48小時(shí)IC50)約為6.96|ig/ml， 表明檸檬酸粉防己堿具有抗人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7活性。
實(shí)施例14檸檬酸粉防己堿鹽抗人骨肉瘤細(xì)胞MG63活性測(cè)定
(1) 實(shí)驗(yàn)材料
人骨肉瘤細(xì)胞株MG63:人骨肉瘤細(xì)胞株MG63由浙江大學(xué)骨科研究所提供。
主要試劑檸檬酸粉防己堿為我們自己合成。 主要儀器細(xì)胞培養(yǎng)箱，酶標(biāo)儀
(2) 實(shí)驗(yàn)方法
取生長(zhǎng)良好的人骨肉瘤細(xì)胞系MG63細(xì)胞5000個(gè)，接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板孔內(nèi)。培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的1640細(xì)胞培養(yǎng)液。置二氧化碳(5XC02) 細(xì)胞培養(yǎng)箱37"C培養(yǎng)24小時(shí)后，加入不同濃度的藥物，混勻后，繼續(xù)置二氧 化碳(5%C02)細(xì)胞培養(yǎng)箱37。C培養(yǎng)48小時(shí)。然后用MTT法測(cè)定活細(xì)胞濃 度，并計(jì)算出藥物作用后細(xì)胞活力(％)。在本實(shí)驗(yàn)中對(duì)照組(不加藥物處理) 細(xì)胞活力設(shè)為100%。 (3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明檸檬酸粉防己堿能明顯誘導(dǎo)人骨肉瘤細(xì)胞系MG63細(xì)胞死 亡，并抑制其生長(zhǎng)，其48小時(shí)半數(shù)生長(zhǎng)抑制濃度(48小時(shí)IC50)約為5.03pg/ml， 表明檸檬酸粉防己堿具有抗人骨肉瘤細(xì)胞系MG63活性。
實(shí)施例15檸檬酸粉防己堿鹽抗人胰腺癌PANC-1細(xì)胞活性測(cè)定
(1) 實(shí)驗(yàn)材料
人胰腺癌PANC-1細(xì)胞株由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院外科提供。 主要試劑檸檬酸粉防己堿為我們自己合成。 主要儀器細(xì)胞培養(yǎng)箱，酶標(biāo)儀
(2) 實(shí)驗(yàn)方法
取生長(zhǎng)良好的人胰腺癌PANC-1細(xì)胞5000個(gè)，接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板孔 內(nèi)。培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的1640細(xì)胞培養(yǎng)液。置二氧化碳(5%C02)細(xì) 胞培養(yǎng)箱37'C培養(yǎng)24小時(shí)后，加入不同濃度的藥物，混勻后，繼續(xù)置二氧化 碳(5%C02)細(xì)胞培養(yǎng)箱37'C培養(yǎng)48小時(shí)。然后用MTT法測(cè)定活細(xì)胞濃度， 并計(jì)算出藥物作用后細(xì)胞活力(％)。在本實(shí)驗(yàn)中對(duì)照組(不加藥物處理)細(xì) 胞活力設(shè)為100%。
(3) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明檸檬酸粉防己堿能明顯誘導(dǎo)人胰腺癌PANC-1細(xì)胞死亡，并 抑制其生長(zhǎng)，其48小時(shí)半數(shù)生長(zhǎng)抑制濃度(48小時(shí)IC50)約為8.2ng/ml，表明
檸檬酸粉防己堿具有抗人胰腺癌PANC-1細(xì)胞活性。
實(shí)施例16擰檬酸粉防己堿和粉防己堿人白血病K562/ADR裸鼠體內(nèi)異
種移植瘤生長(zhǎng)和動(dòng)物毒性影響比較
(1)實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物裸鼠購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海動(dòng)物中心
試劑檸檬酸粉防己堿為自己合成，粉防己堿購(gòu)上海融禾醫(yī)藥科技有限公司。
儀器細(xì)胞培養(yǎng)箱
(2) 實(shí)驗(yàn)方法
取7周齡裸鼠，在其背部皮下接種人白血病細(xì)胞K562 5xlO々每只鼠。24 小時(shí)后，隨機(jī)分3組。用藥組檸檬酸粉防己堿和粉防己堿組采用口服給藥途
徑，按每公斤體重100mg劑量進(jìn)行，每天3次(灌渭)。對(duì)照組用生理鹽水 代替，連用10天。共觀察30天，期間測(cè)量裸鼠瘤重、體重以及活動(dòng)與飲食等 情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，處死小鼠，取腫瘤組織，測(cè)實(shí)際重量。
(3) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明擰檬酸小檗胺對(duì)人白血病裸鼠體內(nèi)異種移植瘤生長(zhǎng)具有明 顯抑制作用，在45天實(shí)驗(yàn)周期中，6只接種腫瘤細(xì)胞裸鼠經(jīng)檸檬酸小檗胺治療， 無1只長(zhǎng)瘤，無瘤率達(dá)100% (6/6)，而粉防己堿組，6只裸鼠中有2只出現(xiàn)腫 瘤生長(zhǎng)，無瘤率66.67% (4/6)。對(duì)照組6只裸鼠均出現(xiàn)明顯腫瘤生長(zhǎng)，成瘤率 100% (7/7)。檸檬酸粉防己堿組裸鼠平均體重為20.64克，粉防己堿組裸鼠平 均體重為16.87克，對(duì)照組為15.0克。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，檸檬酸粉防己堿在 動(dòng)物體內(nèi)抗腫瘤活性明顯好于粉防己堿，而且未見明顯毒性反應(yīng)。
1權(quán)利要求
1. 一種粉防己堿有機(jī)酸鹽，其特征在于具有以下結(jié)構(gòu)通式
2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的粉防己堿有機(jī)酸鹽的制備方法，其特征在于通 過以下步驟實(shí)現(xiàn)(1) 室溫下，將粉防己堿加入一水檸檬酸或無水檸檬酸溶液中進(jìn)行成鹽 反應(yīng)，粉防己堿和檸檬酸的重量比為2 10: 1，得粉防己堿檸檬酸鹽溶液；(2) 將上述粉防己堿檸檬酸鹽溶液干燥，得白色檸檬酸粉防己堿鹽結(jié)晶，反應(yīng)式
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的粉防己堿有機(jī)酸鹽在制備治療腫瘤性疾病藥物 中的應(yīng)用。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的粉防己堿有機(jī)酸鹽的應(yīng)用，其特征在于所制 備的藥物還含有制劑允許的藥物賦形劑或載體。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的粉防己堿有機(jī)酸鹽的應(yīng)用，其特征在于所述 藥物的制劑形式包括液體制劑、顆粒劑、片劑或膠丸。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的粉防己堿有機(jī)酸鹽的應(yīng)用，其特征在于所述 藥物的給藥方式包括口服給藥或注射給藥。嚴(yán)
全文摘要
本發(fā)明提供一種粉防己堿有機(jī)酸鹽類，通過將粉防己堿加入檸檬酸溶液中進(jìn)行成鹽反應(yīng)，將得到的粉防己堿檸檬酸鹽溶液干燥，得白色檸檬酸粉防己堿鹽結(jié)晶。本發(fā)明經(jīng)藥理實(shí)驗(yàn)證實(shí)具有更廣和更強(qiáng)的抗腫瘤活性，體外細(xì)胞培養(yǎng)體系和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在有效抗腫瘤劑量下對(duì)正常人細(xì)胞生長(zhǎng)和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物沒有明顯毒副作用，安全性好；具有很好的水溶性和接近人體血液生理狀態(tài)pH值，有利于提高其生物利用度和藥效，可在制備治療腫瘤性疾病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明制備方法工藝簡(jiǎn)單易行，成功率高，成本低，適合規(guī)?；a(chǎn)。本發(fā)明粉防己堿有機(jī)酸鹽類結(jié)構(gòu)通式如上所示。
文檔編號(hào)C07D491/00GK101423519SQ20081016269
公開日2009年5月6日 申請(qǐng)日期2008年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月28日
發(fā)明者瑩 古, 干小仙, 張旭照, 徐榮臻 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)