專利名稱：：固相多肽合成海沙瑞林的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及海沙瑞林(包括醋酸鹽、三氟乙酸鹽)的制備方法，尤其涉及固相多肽合成海沙瑞林的制備方法。
背景技術(shù)：
：海沙瑞林，中文名海沙瑞林，英文名Hexarelin結(jié)構(gòu)式His-D-2-Me-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2分子式及分子量C47H58N1206;887.0近幾年研究發(fā)現(xiàn)，凋亡引起心肌細胞丟失是心力衰竭發(fā)生的重要機制之一，血管緊張素II(AngiotensionII)是心力衰竭發(fā)生時的一種重要神經(jīng)內(nèi)分泌因子,可誘導(dǎo)心肌細胞凋亡。大量資料表明,hexarelin對心血管系統(tǒng)有明顯保護作用。通過研究表明Hexardin可明顯抑制AngII誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡。心肌細胞肥大是心力衰竭的重要發(fā)病過程之一，而hexarelin有明顯抗AngII誘發(fā)的心肌細胞肥大以及對SHR心肌肥厚的作用。通常合成GHRH系列多肽如GHRH-2，GHRH-6等采用Boc法，每步脫Boc均需用TFA，使用MBHA或AMResin，用強刺激、巨毒的氟化氫切割，還有是通過液相法片斷縮合，周期比較長。相對于以上二種，限制了海沙瑞林的大規(guī)模生產(chǎn)和使用。而隨著Fmoc氨基酸的商品化程度越來越高，成本的下降，F(xiàn)moc固相法是比較快速，方便，可以大量規(guī)?；a(chǎn)的方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種相多肽合成海沙瑞林的方法，主要解決現(xiàn)有合成方法存在的合成周期長、在合成中使用劇毒物的技術(shù)問題。本發(fā)明的技術(shù)方案為一種相多肽合成海沙瑞林的方法，包括如下步驟以Fmoc-Linker-AM-Resin或Fmoc-Linker-MBHA-Resin為起始原料，按照固相合成的方法依次連接具有Fmoc保護的氨基酸，獲的保護的六肽樹脂，其間依次脫去Fmoc保護基團，用DIC/HOBt或DIC/HOAt或BOP/HOBt或BOP/HOAt或HBTU/HOBt或HBTU/HOAt或HATU/HOBt或HATU/HOAt或HCTU/HOBt其中的一種為縮合劑進行接肽反應(yīng)，得保護的六肽樹脂后，同步進行脫側(cè)鏈保護基團及切肽，獲得海沙瑞林粗品，并經(jīng)C18色譜柱進行分離純化，獲得所說的海沙瑞林，然后可再經(jīng)過冷凍干燥，獲得海沙瑞林醋酸鹽或三氟乙酸鹽產(chǎn)品。按照本發(fā)明，依次連接具有保護基團的氨基酸，獲得保護六肽樹脂，其間依次脫去Fmoc保護基團的方法包括如下步驟(1)制備Fmoc-Lys(Boc)-LinkerAMResin選用Fmoc-Linker-AM-Resin或Fmoc-Linker-MBHA-Resin倒入接肽瓶，加入大約樹脂2.5倍體積的DCM，浸泡10分鐘(常溫)后用真空泵抽干，加入脫帽試劑放入恒溫振蕩器反應(yīng)5分鐘，用真空泵抽干，重新加入脫帽劑反應(yīng)15分鐘(30°C~40°C),用真空泵抽干，用工業(yè)級的DMF洗滌3次，無水甲醇洗滌3次，重蒸過的DCM洗滌3次，加入Fmoc-Lys(BOC)-OH、HOBt、分析級的DMF、DIC、Collidine反應(yīng)40分鐘(3(TC5(TC)，用真空泵抽干，用工業(yè)級的DMF洗滌3次，無水甲醇洗滌3次，重蒸過的DCM洗滌3次,抽干,獲得Fmoc-Lys(Boc)-LinkerAMResin;這里所說的脫帽試劑的組分和體積比為PIP:DMF(工業(yè)級)=1:4;下同；Fmoc-Linker-AM-Resin或Fmoc-Linker-MBHA-Resin的重量與脫帽試劑的加入量的比例為8-12ml/g;下同；Fmoc-Lys(Boc)-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2-3倍;下同；HOBt的摩爾數(shù)為樹脂的2-3倍;下同；DIC的摩爾數(shù)為樹脂的2-3倍;下同；Fmoc-Linker-AMResin或Fmoc-Linker-MBHAResin的重量與分析級的DMF的加入量的比例為8-10ml/g;下同；Fmoc-Linker-AMResin或Fmoc-Linker-MBHAResin的重量與用工業(yè)級的DMF、無水甲醇洗滌、重蒸過的DCM的加入量的比例為8-10ml/g;下同；(2)制備Fmoc-D-Phe隱Lys(Boc)-LinkerAMResin在步驟(l)的Fmoc-Lys(Boc)-LinkerAMResin樹脂中，加入脫帽試劑，3060°C反應(yīng)5分鐘，抽干，重新加入脫帽劑306(TC反應(yīng)15分鐘，抽干，洗滌，加入Fmoc-D-Phe-OH、HOBt、分析級的DMF、DIC、Collidine反應(yīng)40分鐘(30。C50。C),抽干，洗滌,抽干，獲得Fmoc-D-Phe-Lys(Boc)-LinkerAMResin;Fmoc-D-Phe-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2-3倍;下同其余操縱以及工藝條件同上；(3)制備Fmoc-Trp(Boc)隱D-Phe-Lys(Boc)-LinkerAMResin在步驟(2)的Fmoc-D-Phe-Lys(Boc)-LinkerAMResin,加入脫帽試劑反應(yīng)5分鐘，抽干，重新加入脫帽劑反應(yīng)15分鐘，抽干，洗滌，，加入Fmoc-Trp(BOC)-OH、HOBt、分析級的DMF、DIC、Collidine反應(yīng)40分鐘(30°C~50°C),抽干，洗滌，，抽干，獲得Fmoc-Trp(BOC)-D-Phe-Lys(Boc)-LinkerAMResin;Fmoc-Trp(BOC)-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2-3倍;下同其余操縱以及工藝條件同上；(4)制備Fmoc-Ala-Trp(BOC)-D-Phe-Lys(Boc)-LinkerAMResin在步驟(3)的Fmoc-Trp(BOC)-D-Phe-Lys(Boc)-LinkerAMResin中，加入脫帽試劑反應(yīng)5分鐘，抽干，重新加入脫帽劑反應(yīng)15分鐘，抽干，洗滌，加入Fmoc-Ala-OH、HOBt、分析級的DMF、DIC、Collidine反應(yīng)40分鐘(30。C50。C),抽干，洗滌,抽干，獲得Fmoc-Ala-Trp(BOC)-D-Phe-Lys(Boc)-LinkerAMResin;Fmoc-Ala-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2-3倍;下同其余操縱以及工藝條件同上(5)制備Fmoc-D-2-Me-Trp-Ala-Trp(BOC)-D-Phe-Lys(Boc)-LinkerAMResin在步驟(4)的Fmoc-Ala-Trp(BOC)-D-Phe-Lys(Boc)-LinkerAMResin中，加入脫帽試劑反應(yīng)5分鐘，抽干，重新加入脫帽劑反應(yīng)15分鐘，抽干，洗滌，加入Fmoc-D-2-Me-Trp-OH、HOBt、分析級的DMF、DIC、Coilidine反應(yīng)40分鐘(30°C~50°C),抽干，洗滌,抽干，獲得Fmoc-D-2-Me-Trp-Ala-Trp(BOC)-D-Phe-Lys(Boc)-LinkerAMResin;Fmoc-D-2-Me-Trp-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2-3倍;下同其余操縱以及工藝條件同上(6)制備Fmoc-His(Trt)-D-2-Me-Trp-Ala-Trp(BOC)-D-Phe-Lys(Boc)-LinkerAMResin在步驟(5)的Fmoc-D隱2-Me-Trp-Ala-Trp(BOC)-D隱Phe-Lys(Boc)-LinkerAMResin中，加入脫帽試劑反應(yīng)5分鐘，抽干，重新加入脫帽劑反應(yīng)15分鐘，抽干，洗滌，加入Fmoc-His(Trt)-OH、HOBt、分析級的DMF、DIC、Collidine反應(yīng)40分鐘(30°C~50°C)，抽干，洗滌,抽干,獲得Fmoc-His(Trt)-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2-3倍;下同其余操縱以及工藝條件同上(7)在步驟(6)的Fmoc-His(Trt)-D-2-Me-Trp-Ala-Trp(BOC)-D-Phe陽Lys(Boc)-LinkerAMResin中，加入脫帽試劑反應(yīng)5分鐘，抽干，重新加入脫帽劑反應(yīng)15分鐘，抽干，用工業(yè)級的DMF洗滌3次，無水甲醇洗滌3次，重蒸過的DCM洗滌3次,用無水乙醚抽干(用真空泵一直抽約半小時),樹脂成很干的顆粒；(8)把抽干的Fmoc-His(Trt)-D-2-Me-Trp-Ala-Trp(BOC)-D-Phe-Lys(Boc)-LinkerAMResin倒入玻璃的茄型瓶，加入預(yù)冷-5t:-10'C的切肽試劑中(TFA/EDT/p-Cresol/DCN^80/2.5/2.5/15,體積比),20。C4(rC切肽反應(yīng)2~3小時，過濾除去樹脂，加乙醚沉淀，離心，用乙醚反復(fù)洗滌6次，在室溫，置干燥器中減壓抽干(一般為58小時)，獲得海沙瑞林粗品。切肽試劑中，樹脂的濃度為8~12ml/g;按照本發(fā)明，粗品經(jīng)C18柱分離純化的方法包括如下步驟將海沙瑞林粗品溶于25。/。ACN水溶液中，過濾，濾液經(jīng)C18色譜柱純化，流動相有兩種A:0.1%TFA+99.9%ACN;B:0.1%TFA+99.9%H2O;梯度22%~30%;流速為110ml/min;檢測波長為220nm;用液相色譜儀跟蹤所需要的流出液，樣品峰合并后濃縮去ACN，轉(zhuǎn)醋酸鹽，濃縮小體積凍干，獲得成品(MW:887.0)，總收率為46.73%(以樹脂的mmol計)。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明的海沙瑞林合成工藝路線有以下特點具備規(guī)?；a(chǎn)能力，工藝穩(wěn)定，原輔材料來源方便，生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)成本低，收率高，質(zhì)量穩(wěn)定，生產(chǎn)成本低，極具市場競爭力，每步接肽收率可以達到98%以上，降低了成本。本工藝采用溫和的Fmoc路線，每步脫Fmoc僅用20。/。的PIP，每步縮合反應(yīng)只要40分鐘，大大縮短了生產(chǎn)周期，切割采用TFA，避免使用氟化氫，大大減少了三廢，有利于工業(yè)化生產(chǎn)。前述過程中所釆用的原料中英文列表如下序號英文名中文名1PIP六氫吡啶2DICN，N-二異丙基碳化二亞胺3HOBt1-羥基-苯并-三氮唑<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實施例1(1)制備Fmoc-Lys(Boc)-LinkerAMResin稱取Fmoc-Linker-AMResinlg(Loadding:0.6mmol/g)倒入30ml接肽瓶，加入大約樹脂15mlDCM，浸泡10分鐘(常溫)后用真空泵抽千，加入脫帽試劑10ml放入恒溫振蕩器反應(yīng)5分鐘，用真空泵抽干，重新加入脫帽劑10ml反應(yīng)15分鐘(30。C40。C)，用真空泵抽干，用工業(yè)級的DMF洗滌3次，無水甲醇洗滌3次，重蒸過的DCM洗滌3次，加入Fmoc-Lys(BOC)-OH0.702g、HOBt0.337g、分析級的DMF8ml、DlC0.2ml、Comdine0.3ml反應(yīng)40分鐘(30°C~50°C),用真空泵抽干，用工業(yè)級的DMF洗滌3次，無水甲醇洗滌3次，重蒸過的DCM洗滌3次，抽干,獲得Fmoc-Lys(Boc)-LinkerAMResin;(2)制備Fmoc-D-Phe-Lys(Boc)-LinkerAMResin在步驟(l)的Fmoc-Lys(Boc)-LinkerAMResin中，加入脫帽試劑，3060。C反應(yīng)5分鐘，抽干，重新加入脫帽劑306(TC反應(yīng)15分鐘，抽干，洗滌，加入Fmoc-D-Phe-OH0.581g、HOBt0.337g、分析級的DMF8ml、DlC0.2ml、Collidine0.3ml反應(yīng)40分鐘(30。C50。C),抽干，洗滌,抽干,獲得Fmoc-D-Phe-Lys(Boc)-LinkerAMResin;其余操縱以及工藝條件同上；(3)制備Fmoc-Trp(BOC)-D-Phe-Lys(Boc)-LinkerAMResin在步驟(2)的Fmoc-D-Phe-Lys(Boc)-LinkerAMResin中，加入脫帽試劑反應(yīng)5分鐘，抽干，重新加入脫帽劑反應(yīng)15分鐘，抽干，洗滌，，加入Fmoc-Trp(BOC)-OH0.790g、HOBt0.337g、分析級的DMF8ml、DlC0.2ml、Collidine0.3ml反應(yīng)40分鐘G0。C50。C)，抽干，洗滌，，抽干,獲得Fmoc-Trp(BOC)-D-Phe-Lys(Boc)-LinkerAMResin;其余操縱以及工藝條件同上；(4)制備Fmoc-Ala-Tip(BOC)-D-Phe-Lys(Boc)-LinkerAMResin在步驟(3)的Fmoc-Trp(BOC)-D-Phe-Lys(Boc)-LinkerAMResin中，加入脫帽試劑反應(yīng)5分鐘，抽干，重新加入脫帽劑反應(yīng)15分鐘，抽干，洗滌,加入Fmoc-AIa-OH0.467g、HOBt0.337g、分析級的DMF8ml、DlC0.2ml、Collidine0.3ml反應(yīng)40分鐘G0。C50。C),抽干，洗滌,抽干,獲得Fmoc-Ala-Trp(BOC)-D-Phe-Lys(Boc)-LinkerAMResin;其余操縱以及工藝條件同上(5)制備Fmoc-D-2-Me-Trp-Ala隱Trp(BOC)-D-Phe-Lys(Boc)-LinkerAMResin在步驟(4)的Fmoc-Ala-Trp(BOC)-D-Phe-Lys(Boc)-LinkerAMResin中，加入脫帽試劑反應(yīng)5分鐘，抽干，重新加入脫帽劑反應(yīng)15分鐘，抽干，洗滌，加入Fmoc-D-2-Me陽Trp-OH0.635g、HOBt0.337g、分析級的DMF8ml、DlC0.2ml、Collidine0.3ml反應(yīng)40分鐘(3(TC5(TC)，抽干，洗滌，抽干，獲得Fmoc-D-2-Me-Trp-Ala-Trp(BOC)-D-Phe-Lys(Boc)-LinkerAMResin;其余操縱以及工藝條件同上。(6)制備Fmoc-His(Trt)-D-2-Me-Trp-Ala-Trp(BOC)-D-Phe-Lys(Boc)-LinkerAMResin在步驟(5)的Fmoc-D-2-Me-Trp-Ala-Trp(BOC)-D-Phe-Lys(Boc)-LinkerAMResin中，加入脫帽試劑反應(yīng)5分鐘，抽干，重新加入脫帽劑反應(yīng)15分鐘，抽干，洗滌，加入Fmoc-His(Trt)-OH0.929g、HOBt0.337g、分析級的DMF8ml、DlC0.2ml、Collidine0.3ml反應(yīng)40分鐘G(TC5(TC)，抽干，洗滌，抽干，獲得Fmoc-His(Trt)-D-2-Me-Trp-Ala-Trp(BOC)-D-Phe-Lys(Boc)-LinkerAMResin其余操縱以及工藝條件同上(7)在步驟(6)的Fmoc-His(Trt)-D-2-Me-Trp-Ala-Trp(BOC)-D-Phe-Lys(Boc)-LinkerAMResin中，加入脫帽試劑反應(yīng)5分鐘，抽干，重新加入脫帽劑反應(yīng)15分鐘，抽干，用工業(yè)級的DMF洗滌3次，無水甲醇洗滌3次，重蒸過的DCM洗滌3次，用無水乙醚抽干(用真空泵一直抽約半小時)，樹脂成很干的顆粒，所述的樹脂為Fmoc-His(Trt)-D-2-Me-Trp-Ala-Trp(BOC)-D-Phe-Lys(Boc)-LinkerAMResin(8)把抽干的Fmoc-His(Trt)-D-2-Me-Trp-Ala-Trp(BOC)-D-Phe-Lys(Boc)-LinkerAMResin倒入25ml玻璃的茄型瓶,加入8ml預(yù)冷-5'C~-10°C的切肽試劑(TFA/EDT/p-Cresol/DCM-80/2.5/2.5/15,體積比)，20。C40。C切肽反應(yīng)2~3小時，過濾除去樹脂，加乙醚沉淀，離心，用乙醚反復(fù)洗滌6次，在室溫，置干燥器中減壓抽干(一般為58小時)，獲得海沙瑞林粗品0.520g。按照本發(fā)明，粗品經(jīng)C18柱分離純化的方法包括如下步驟將海沙瑞林粗品溶于25y。ACN水溶液中，過濾，濾液經(jīng)C18色譜柱純化，流動相有兩種A:0.1%TFA+99.9%ACN;B:0.1%TFA+99.9%H2O;梯度22%~30%;流速為U0ml/min;檢測波長為220nm;用液相色譜儀跟蹤所需要的流出液，樣品峰合并后濃縮去ACN，轉(zhuǎn)醋酸鹽，濃縮小體積凍干，獲得成品0.243g(MW:887.0)，總收率為46.73%(以樹脂的mmol計)。實施例2采用與實施例l相同的方法和工藝條件，其中以Fmoc-Linker-MBHAResin作起始原料，加入脫帽試劑3050°C反應(yīng)5分鐘，抽干，重新加入脫帽劑反應(yīng)15分鐘，洗滌，加入Fmoc-氨基酸、分析級的DMF、Collidine、DIC/HOBt或DIC/HOAt或BOP/HOBt或BOP/HOAt或HBTU/HOBt或HBTU/HOAt或HATU/HOBt或HATU/HOAt或HCTU/HOBt或HUTC/HOAt或TBTU/HOBt，反應(yīng)40分鐘，同實施例l操作，直止六肽接完。再經(jīng)切割等反應(yīng)，得到0.540g白色粉末產(chǎn)品。實施例3稱取Fmoc-Linker-AMResin或Fmoc-Linker-MBHAResin50g(Loadding:0.7mmol/g)倒入600ml接肽瓶，加入脫帽試劑3050。C反應(yīng)5分鐘，抽干，重新加入脫帽劑反應(yīng)15分鐘，洗滌，加入Fmoc-氨基酸、分析級的DMF、Collidine、DIC/HOBt或DIC/HOAt或BOP/HOBt或BOP/HOAt或HBTU/HOBt或HBTU/HOAt或HATU/HOBt或HATU/HOAt或HCTU/HOBt或TBTU/HOBt，反應(yīng)40分鐘，同實施例1操作，直止六肽接完。再經(jīng)切割等反應(yīng)，得到33g白色粉末產(chǎn)品。用HBTU/HOBt反應(yīng)粗品純度會好點。權(quán)利要求1、一種固相多肽合成海沙瑞林的方法，其特征是包括如下步驟以芴甲氧羰?；?Linker-氨甲基樹脂或芴甲氧羰酰基-Linker-4-甲苯氫胺樹脂為起始原料，按照固相合成的方法依次連接具有芴甲氧羰酰基保護的氨基酸，獲的保護的六肽樹脂，其間依次脫去芴甲氧羰?；Ｗo基團，用N，N-二異丙基碳化二亞胺/1-羥基-苯并-三氮唑、N，N-二異丙基碳化二亞胺/N-羥基-7-偶氮苯并三氮唑、7-氮雜苯并唑-1-基-氧-(三-(二甲胺基)膦)六氟磷酸鹽/1-羥基-苯并-三氮唑、7-氮雜苯并唑-1-基-氧-(三-(二甲胺基)膦)六氟磷酸鹽/1-羥基-苯并-三氮唑/N-羥基-7-偶氮苯并三氮唑、苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯/1-羥基-苯并-三氮唑、苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯/N-羥基-7-偶氮苯并三氮唑、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯/1-羥基-苯并-三氮唑、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯/N-羥基-7-偶氮苯并三氮唑或6-氯苯并三氮唑-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯/1-羥基-苯并-三氮唑其中的一種為縮合劑進行接肽反應(yīng)，得保護的六肽樹脂后，同步進行脫側(cè)鏈保護基團及切肽，獲得海沙瑞林粗品，并經(jīng)C18色譜柱進行分離純化，獲得所說的海沙瑞林。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種固相多肽合成海沙瑞林的方法，其特征是獲得的海沙瑞林再經(jīng)過冷凍干燥，獲得海沙瑞林醋酸鹽或三氟乙酸鹽產(chǎn)品。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種固相多肽合成海沙瑞林的方法，其特征是依次連接具有保護基團的氨基酸，獲得保護六肽樹脂，其間依次脫去芴甲氧羰酰基保護基團，當所述的六肽樹脂為芴甲氧羰基-N-印silon-叔丁氧羰基-L-賴氨酸-Linker氨甲基樹脂，包括如下步驟選用芴甲氧羰酰基-Linker-氨甲基樹脂或芴甲氧羰?；?Linker-4-甲苯氫胺樹脂倒入接肽瓶，加入樹脂2.5倍體積的二氯甲烷，常溫浸泡10分鐘后用真空泵抽干，加入脫帽試劑放入恒溫振蕩器反應(yīng)5分鐘，用真空泵抽干，重新加入脫帽劑3(TC4(TC反應(yīng)15分鐘，用真空泵抽干，用工業(yè)級的二甲基甲酰胺洗滌3次，無水甲醇洗滌3次，重蒸過的二氯甲烷洗滌3次，加入芴甲氧羰基-N-epsilon-叔丁氧羰基-L-賴氨酸、1-羥基-苯并-三氮唑、分析級的二甲基甲酰胺、N，N-二異丙基碳化二亞胺、2,3,5-三甲基吡啶3(TC50'C反應(yīng)40分鐘，用真空泵抽干，用工業(yè)級的DMF洗滌3次，無水甲醇洗滌3次，重蒸過的二甲基甲酰胺洗滌3次,抽干,獲得芴甲氧羰基-N-epsilon-叔丁氧羰基-L-賴氨酸-Linker氨甲基樹脂。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種固相多肽合成海沙瑞林的方法，其特征是荷甲氧羰?；?Linker-氨甲基樹脂或芴甲氧羰?；?Linker-4-甲苯氫胺樹脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為8-12ml/g，芴甲氧羰基-N-epsilon-叔丁氧羰基-L-賴氨酸的摩爾數(shù)為樹脂的2-3倍，l-羥基-苯并-三氮唑的摩爾數(shù)為樹脂的2-3倍，N，N-二異丙基碳化二亞胺的摩爾數(shù)為樹脂的2-3倍;下同，芴甲氧羰?；?Linker-氨甲基樹脂或芴甲氧羰?；?Linker-4-甲苯氫胺樹脂的重量與分析級的二甲基甲酰胺的加入量的比例為8-10ml/g，芴甲氧羰?；?Linker-氨甲基樹脂或芴甲氧羰?；?Linker-4-甲苯氫胺樹脂的重量與用工業(yè)級的二甲基甲酰胺、無水甲醇洗滌、重蒸過的二氯甲烷的加入量的比例為8-10ml/g。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的一固種相多肽合成海沙瑞林的方法，其特征是當所述的六肽樹脂為芴甲氧羰基-D-苯氨酸-N-印silon-叔丁氧羰基-L-賴氨酸-Linker氨甲基樹脂，包括如下步驟在芴甲氧羰基-N-印silon-叔丁氧羰基-L-賴氨酸-Linker氨甲基樹脂中，加入脫帽試劑，306(TC反應(yīng)5分鐘，抽干，重新加入脫帽劑306(TC反應(yīng)15分鐘，抽干，洗滌，加入芴甲氧羰基-D-苯氨酸、1-羥基-苯并-三氮唑、分析級的二甲基甲酰胺、N，N-二異丙基碳化二亞胺、2,3,5-三甲基吡啶3(rC5(TC反應(yīng)40分鐘，抽干，洗滌,抽干,獲得芴甲氧羰基-D-苯氨酸-N-印silon-叔丁氧羰基-L-賴氨酸-Linker氨甲基樹脂，其中芴甲氧羰基-D-苯氨酸的摩爾數(shù)為樹脂的2-3倍。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種固相多肽合成海沙瑞林的方法，其特征是當所述的六肽樹脂為芴甲氧羰基-N-in-叔丁氧羰基-L-色氨酸-D-苯氨酸-N-印silon-叔丁氧羰基-L-賴氨酸-Linker氨甲基樹脂，包括如下步驟在芴甲氧羰基-D-苯氨酸-N-epsilon-叔丁氧羰基-L-賴氨酸-Linker氨甲基樹脂中，加入脫帽試劑反應(yīng)5分鐘，抽干，重新加入脫帽劑反應(yīng)15分鐘，抽干，洗滌，加入芴甲氧羰基-N-in-叔丁氧羰基-L-色氨酸、1-羥基-苯并-三氮唑、分析級的二甲基甲酰胺、N，N-二異丙基碳化二亞胺、2,3,5-三甲基吡啶30'C5(TC反應(yīng)40分鐘，抽干，洗滌，抽干，獲得芴甲氧羰基-N-in-叔丁氧羰基-L-色氨酸-D-苯氨酸-N-印silon-叔丁氧羰基-L-賴氨酸-Linker氨甲基樹脂，其中芴甲氧羰基-N-in-叔丁氧羰基-L-色氨酸的摩爾數(shù)為樹脂的2-3倍。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種固相多肽合成海沙瑞林的方法，其特征是當所述的六肽樹脂為芴甲氧羰基-L-丙氨酸-N-in-叔丁氧羰基-L-色氨酸-D-苯氨酸-N-印silon-叔丁氧羰基-L-賴氨酸-Linker氨甲基樹，包括如下步驟在芴甲氧羰基-N-in-叔丁氧幾基-L-色氨酸-D-苯氨酸-N-印silon-叔丁氧羰基-L-賴氨酸-Linker氨甲基樹脂中，加入脫帽試劑反應(yīng)5分鐘，抽干，重新加入脫帽劑反應(yīng)15分鐘，抽干，洗滌，加入芴甲氧羰基-L-丙氨酸、1-羥基-苯并-三氮唑、分析級的二甲基甲酰胺、N，N-二異丙基碳化二亞胺、2,3,5-三甲基吡啶30。C5(TC反應(yīng)40分鐘，抽干，洗滌，抽干，獲得芴甲氧羰基-L-丙氨酸-N-in-叔丁氧羰基-L-色氨酸-D-苯氨酸-N-印silon-叔丁氧羰基-L-賴氨酸-Linker氨甲基樹脂，其中芴甲氧羰基-L-丙氨酸的摩爾數(shù)為樹脂的2-3倍。8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種固相多肽合成海沙瑞林的方法，其特征是當所述的六肽樹脂為芴甲氧羰基-D-2-甲基-色氨酸-L-丙氨酸-N-in-叔丁氧羰基-L-色氨酸-D-苯氨酸-N-epsilon-叔丁氧羰基-L-賴氨酸-Linker氨甲基樹脂，包括如下步驟在芴甲氧羰基-L-丙氨酸-N-in-叔丁氧羰基-L-色氨酸-D-苯氨酸-N-印silon-叔丁氧羰基-L-賴氨酸-Linker氨甲基樹脂中，加入脫帽試劑反應(yīng)5分鐘，抽干，重新加入脫帽劑反應(yīng)15分鐘，抽干，洗滌，加入芴甲氧羰基-D-2-甲基-色氨酸、1-羥基-苯并-三氮唑、分析級的二甲基甲酰胺、N，N-二異丙基碳化二亞胺、2,3，5-三甲基吡啶3(TC5(TC反應(yīng)40分鐘，抽干，洗滌，抽干，獲得芴甲氧羰基-D-2-甲基-色氨酸-L-丙氨酸-N-in-叔丁氧羰基-L-色氨酸-D-苯氨酸-N-印silon-叔丁氧羰基-L-賴氨酸-Linker氨甲基樹脂，芴甲氧羰基-D-2-甲基-色氨酸的摩爾數(shù)為樹脂的2-3倍。9、根據(jù)權(quán)利要求8所述的一固種相多肽合成海沙瑞林的方法，其特征是當所述的六肽樹脂為芴甲氧羰基-L-組氨酸-D-2-甲基-色氨酸-L-丙氨酸-N-in-叔丁氧羰基-L-色氨酸-D-苯氨酸-N-epsilon-叔丁氧羰基-L-賴氨酸-Linker氨甲基樹脂，包括如下步驟在獲得芴甲氧羰基-0-2-甲基-色氨酸丄-丙氨酸-^^-叔丁氧羰基-1_-色氨酸-0-苯氨酸-N-epsilon-叔丁氧羰基-L-賴氨酸-Linker氨甲基樹脂中，加入脫帽試劑反應(yīng)5分鐘，抽干，重新加入脫帽劑反應(yīng)15分鐘，抽干，洗滌，加入芴甲氧羰基-L-組氨酸、l-羥基-苯并-三氮唑、分析級的二甲基甲酰胺、N，N-二異丙基碳化二亞胺、2,3,5-三甲基吡啶3(TC5(TC反應(yīng)40分鐘，抽干，洗滌，抽干，獲得芴甲氧羰基丄-組氨酸-0-2-甲基-色氨酸-1_-丙氨酸-N-in-叔丁氧羰基-L-色氨酸-D-苯氨酸-N-印silon-叔丁氧羰基-L-賴氨酸-Linker氨甲基樹脂，芴甲氧羰基-L-組氨酸的摩爾數(shù)為樹脂的2-3倍。10、根據(jù)權(quán)利要求9所述的一種固相多肽合成海沙瑞林的方法，其特征是當所述的六肽樹脂為芴甲氧羰基-L-組氨酸-D-2-甲基-色氨酸-L-丙氨酸-N-in-叔丁氧羰基-L-色氨酸-D-苯氨酸-N-印silon-叔丁氧羰基-L-賴氨酸-Linker氨甲基樹脂，包括如下步驟在芴甲氧羰基-L-組氨酸-D-2-甲基-色氨酸-L-丙氨酸-N-in-叔丁氧羰基-L-色氨酸-D-苯氨酸-N-印silon-叔丁氧羰基-L-賴氨酸-Linker氨甲基樹脂中，加入脫帽試劑反應(yīng)5分鐘,抽干，重新加入脫帽劑反應(yīng)15分鐘，抽干，用工業(yè)級的DMF洗漆3次，無水甲醇洗滌3次，重蒸過的DCM洗滌3次，用無水乙醚抽干樹脂成很干的顆粒，所得到的樹脂為L-組氨酸_0-2-甲基-色氨酸-1_-丙氨酸,-^-叔丁氧羰基丄-色氨酸-0-苯氨酸-N-印silon-叔丁氧羰基-L-賴氨酸-Linker氨甲基樹脂。11、根據(jù)權(quán)利要求3—10所述的一固種相多肽合成海沙瑞林的方法，其特征是所說的脫帽試劑的組分和體積比為六氫吡啶二甲基甲酰胺=1:4。12、根據(jù)權(quán)利要求10所述的一固種相多肽合成海沙瑞林的方法，其特征是把抽干的1_-組氨酸-0-2-甲基-色氨酸-1_-丙氨酸-1^0叔丁氧羰基丄-色氨酸-0-苯氨酸-N-印silon-叔丁氧羰基-L-賴氨酸-Linker氨甲基樹脂倒入玻璃的茄型瓶，加入預(yù)冷-5'C-l(TC的切肽試劑中，切肽試劑中，樹脂的濃度為8~12ml/g，切肽試劑其組分的體積比三氟乙酸/乙二硫醇/對甲苯酚/二氯甲烷=80/2.5/2.5/15，20。C40。C切肽反應(yīng)2~3小時，過濾除去樹脂，加乙醚沉淀，離心，用乙醚反復(fù)洗滌6次，在室溫，置干燥器中減壓抽干，獲得海沙瑞林粗品。13、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一固種相多肽合成海沙瑞林的方法，其特征是粗品經(jīng)C18柱分離純化的方法包括如下步驟:將海沙瑞林粗品溶于濃度為25。/。的乙腈水溶液中，過濾，濾液經(jīng)C18色譜柱純化，流動相有兩種A:0.1%三氟乙酸加99.9%乙腈；B:0.1%三氟乙酸加99.9%水；梯度22%到30%;流速為每分鐘110ml，檢測波長為220nm，用液相色譜儀跟蹤所需要的流出液，樣品峰合并后濃縮去乙腈，轉(zhuǎn)醋酸鹽，濃縮小體積凍干，獲得成品。全文摘要本發(fā)明涉及海沙瑞林的制備方法，主要解決現(xiàn)有合成方法存在的合成周期長、在合成中使用劇毒物的技術(shù)問題。一種相多肽合成海沙瑞林的方法，包括如下步驟以Fmoc-Linker-AM-Resin或Fmoc-Linker-MBHA-Resin為起始原料，按照固相合成的方法依次連接具有Fmoc保護的氨基酸，獲的保護的六肽樹脂，其間依次脫去Fmoc保護基團，用DIC/HOBt或DIC/HOAt或BOP/HOBt或BOP/HOAt或HBTU/HOBt或HBTU/HOAt或HATU/HOBt或HATU/HOAt或HCTU/HOBt其中的一種為縮合劑進行接肽反應(yīng)，得保護的六肽樹脂后，同步進行脫側(cè)鏈保護基團及切肽，獲得海沙瑞林粗品，并經(jīng)C18色譜柱進行分離純化，獲得所說的海沙瑞林，再經(jīng)過冷凍干燥，獲得海沙瑞林醋酸鹽或三氟乙酸鹽產(chǎn)品。本發(fā)明可規(guī)模化生產(chǎn)海沙瑞林。文檔編號C07K1/04GK101314612SQ20081004334公開日2008年12月3日申請日期2008年5月8日優(yōu)先權(quán)日2008年5月8日發(fā)明者姜培娟,徐紅巖,金健林申請人:吉爾生化(上海)有限公司