專(zhuān)利名稱(chēng)：：生物標(biāo)記物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及BNP4言號(hào)肽(BNP-SP)及其在預(yù)測(cè)、_珍斷和監(jiān)測(cè)受試者急性心臟病癥(包括急性冠狀動(dòng)脈綜合征)中的應(yīng)用，導(dǎo)致將生物標(biāo)記物釋》文進(jìn)入到循環(huán)中。更具體地，本發(fā)明涉及通過(guò)測(cè)量病癥發(fā)作或者臨床表現(xiàn)出病癥之后立刻從受試者獲得的樣品的BNP-SP的水平來(lái)預(yù)測(cè)、i貪斷或者監(jiān)測(cè)受試者的急性心臟病癥的方法。
背景技術(shù)：
：急性心臟病癥包纟舌急性冠^1犬動(dòng)^永綜合^正(ACS)，其包括^人不穩(wěn)、定絞痛到急性心月幾梗死(AMI)范圍內(nèi)的廣i普心臟在夬血事件。這些事件中AMI的表現(xiàn)最為嚴(yán)重，因此必須快速和準(zhǔn)確地診斷。表現(xiàn)有兩種或者多種所述特4i(在夾血性胸部不適的病史、連續(xù)心電圖(ECG)4九跡的漸進(jìn)變^:和血漿心臟生物標(biāo)記物的升高和降<氐)的患者被明確地確診為患有AMI1。但是，很大比例(40%-50%)表現(xiàn)有^:似AMI的患者不具有ECG的連續(xù)變化或者典型的癥狀，因此為了準(zhǔn)確-〖貪斷，就著重強(qiáng)調(diào)循環(huán)的生物標(biāo)記的濃度24。心肌梗塞的準(zhǔn)確早期診斷有利于再灌注治療的迅速引入，包括有效的經(jīng)皮或者溶栓血管重建以及附加的抗凝血?jiǎng)┖涂寡“逯委?。診斷和處理每延遲一'卜時(shí)，這樣的治療對(duì)于降低死亡率和發(fā)病率的有效性就逐漸降低2—4。鑒于在臨床環(huán)境下需要盡快作出決定，人們對(duì)提供急性心臟病癥，尤其是AMI的早期和特異性診斷的循3不生^7沖示i己物的確定沖目當(dāng)關(guān)注。出于這個(gè)目的，已經(jīng)^是出了多種生物標(biāo)記物，包括肌酸激酶-MB(CK-MB)、月幾釣蛋白T(TnT)、月幾4丐蛋白I(Tnl)和月幾紅蛋白，但是對(duì)它們的使用有限制。血漿心臟生物標(biāo)記物的可檢測(cè)到的或者異常的升高的時(shí)間可以為6小時(shí)(月幾紅蛋白、CK-MB)到12小時(shí)(TnT、Tnl),直到損傷發(fā)作后24-48小時(shí)才出現(xiàn)峰值水平，這給準(zhǔn)確的診斷和治療造成了延遲的空窗期"。而且，肌紅蛋白和CK-MB都是非特異性的，并且可以由心外源分泌，尤其是在損傷或者外科手術(shù)期間、可用于此目的的其4也生物標(biāo)記是BNP(preproBNP103-134)和N-BNP(preproBNP27-134),N-BNP還被稱(chēng)為NT-proBNP(見(jiàn)圖1)。這兩種肽都被分泌進(jìn)入到循環(huán)中。在AMI后的早期BNP和N-BNP的血漿;農(nóng)度的測(cè)量具有4艮有力的預(yù)測(cè)1"介值2'6'7，并且將這些肽的血漿濃度整合到治療體系中去可以顯著改善心力衰竭患者臨床結(jié)果8。對(duì)于具有大約比BNP長(zhǎng)約14倍的半衰期5,因此在AMI之后提供長(zhǎng)期心功效的其他重要信息的N-BNP尤其:^jj:匕。與上述心臟生物標(biāo)記物一樣，BNP和N-BNP在損傷發(fā)作后6到12小時(shí)可能達(dá)不到可一全測(cè)的或者異常水平，直到發(fā)作后24到48小時(shí)才出現(xiàn)峰值水平。因此BNP和N-BNP的長(zhǎng)期診斷/預(yù)測(cè)能力對(duì)于在臨床表現(xiàn)的最初幾個(gè)小時(shí)內(nèi)提供急性心臟病癥(如急性心臟損傷)的早期特異性診斷的特異性標(biāo)記物的隨附能力是不足的。最近，已經(jīng)提出BNP-SP在心臟疾病的i貪斷中可能是有用的(US2005/0244904、WO2005/052593)。心力衰竭的患者中BNP-SP的水平通常會(huì)顯示出高于正?；颊?。沒(méi)有任何關(guān)于何時(shí)測(cè)量BNP-SP7K平的時(shí)程(timecourse)信息。陳述了BNP-SP的水平升高與N-BNP有關(guān)。本發(fā)明的目的是對(duì)滿(mǎn)足對(duì)急性心臟病癥的早期標(biāo)記的需要起到一些作用，和/或至少為公眾提供一個(gè)有用的選擇。
發(fā)明內(nèi)容人B型鈉尿信號(hào)肽(BNP-SP)或者preproBNP(1-26)是從preproBNP(1-134)SEQIDNO:l分裂出的26個(gè)氨基酸的肽。BNP-SP單獨(dú)以SEQIDNO:21示出。申請(qǐng)人出人意料地發(fā)現(xiàn)BNP-SP的循環(huán)濃度在急性冠狀動(dòng)脈綜合征(ACS)發(fā)作或者臨床表現(xiàn)疑似的急性冠狀動(dòng)脈綜合征(ACS)之后的最初幾小時(shí)內(nèi)是最高的。在此最初的幾小時(shí)內(nèi)，峰^f直為正常只于照人群的4到10倍，通常為5到84咅。因此，在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了預(yù)測(cè)、診斷或者監(jiān)測(cè)受試者中急性心臟病癥(ACD)的方法，該方法包4舌測(cè)量在ACD發(fā)作的兩小時(shí)內(nèi)或表現(xiàn)出ACD的兩小時(shí)內(nèi)/人受試者獲得的生物樣品中的BNP-SP水平；并且將所述的BNP-SP水平與對(duì)照的BNP-SP水平進(jìn)行比較，其中所測(cè)量到的高于來(lái)自對(duì)照水平的BNP-SP水平是ACD的指4正。本發(fā)明還提供了監(jiān)測(cè)治療受試者對(duì)急性心臟病癥(ACD)的反應(yīng)的方法，該方法包4舌測(cè)量在ACD發(fā)作或者表J見(jiàn)ACD的兩個(gè)小時(shí)內(nèi)從受試者獲得的生物樣品中的BNP-SP水平；并且將所述BNP-SP水平與對(duì)照的BNP-SP的水平進(jìn)行比較，其中測(cè)量到的7jc平對(duì)于對(duì)照的BNP-SP水平發(fā)生變化是對(duì)治療的反應(yīng)的指征。另一方面，本發(fā)明還4是供了預(yù)測(cè)、i貪斷或者監(jiān)測(cè)受試者中的心臟移植排斥的方法，該方法包括測(cè)量在心臟移才直兩個(gè)小時(shí)內(nèi)的從受試者獲得的生物樣品中的BNP-SP水平，并且將所述的BNP-SP水平與對(duì)照的BNP-SP水平進(jìn)行比較，其中測(cè)量到的高于對(duì)照水平的BNP-SP水平是移檔:排斥的指4i。本發(fā)明還提供了將受試者中的肺病與急性心臟病癥(ACD)區(qū)別開(kāi)來(lái)的方法，該方法包括測(cè)量在表現(xiàn)該病癥的兩個(gè)小時(shí)內(nèi)從受試者獲得的生物樣品中的BNP-SP水平；并且將所述的BNP-SP水平與對(duì)照的BNP-SP水平進(jìn)行比較，其中測(cè)量到的BNP-SP7K平高于對(duì)照水平是ACD的指征。本發(fā)明還4是供了預(yù)測(cè)、it斷或者監(jiān)測(cè)受試者中的急性心臟病癥(ACD)、心臟移植排斥或者ACD/肺病的方法，該方法包括測(cè)量在ACD、心臟移植排斥或者ACD/肺病發(fā)作或者臨床表現(xiàn)ACD、心臟移植排斥或者ACD/肺病的最初的兩小時(shí)內(nèi)乂人受試者獲得的生物樣品中的BNP-SP7jc平。優(yōu)選地，將測(cè)量到的BNP-SP水平與對(duì)照的BNP-SP水平進(jìn)行比較，其中高于對(duì)照水平的測(cè)量到的BNP-SP水平是ACD或者心臟移植排斥的指征。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法是體外的方法。在一種實(shí)施方式中，BNP-SP水平的測(cè)量是在發(fā)作或者臨床表現(xiàn)的一個(gè)小時(shí)內(nèi)進(jìn)行的，優(yōu)選在30分鐘內(nèi)進(jìn)行。優(yōu)選地，生物才羊品是血液、唾液、間質(zhì)液、血漿、尿、血清或者心臟組織。在一種實(shí)施方式中，測(cè)量步驟包括檢測(cè)BNP-SP與選擇性結(jié)合BNP-SP的結(jié)合劑之間的結(jié)合。該結(jié)合劑優(yōu)選為抗體或者抗體片斷。最常見(jiàn)的是，該抗體為單克隆、多克隆或者人化(或人源化)抗體。優(yōu)選單克隆抗體。在一種替代的實(shí)施方式中，利用質(zhì)語(yǔ)法來(lái)測(cè)量BNP-SP水平。由抗體選擇性結(jié)合的BNP-SP是全長(zhǎng)人BNP-SP分子(SEQIDNO:21)或者抗原變異體或其片斷。優(yōu)選地，該片斷的長(zhǎng)度為至少5個(gè)氨基酸。理想的是，抗體結(jié)合BNP-SP的N末端或者C末端。結(jié)合劑選擇性結(jié)合的特異性抗原肽包括人BNP-SP(1-10)(SEQIDNO:13)、BNP-SP(1-17)(SEQIDNO:15)、BNP-SP(3-15)(SEQIDNO:23)、BNP-SP(17-26)(SEQIDNO:19)、BNP-SP(12-23)(SEQIDNO:17)和BNP-SP(1-26)(SEQIDNO:21)或者它們的變異體。優(yōu)選l吏用固定在固相上的抗體或者抗體片斷來(lái)測(cè)量BNP-SP的結(jié)合?？梢杂眠x自RIA、ELISA、熒光免疫分析、免疫熒光測(cè)量分析、質(zhì)譜法和免疫放射測(cè)定的分析法來(lái)有效地測(cè)量BNP-SP水平。因此，本發(fā)明還提供了在發(fā)作或者臨床表現(xiàn)ACD、心臟移植排斥、或ACD/肺病的兩小時(shí)內(nèi)乂人受試者獲得生物樣品中的BNP-SP測(cè)定，該測(cè)定包括利用已知的方法才全測(cè)和測(cè)量樣品中的BNP-SP水平。^f尤選i也，該測(cè)定是體外測(cè)定。本發(fā)明的方法還包括測(cè)量所述ACD、或心臟移植排斥、或ACD/肺病中的一種或者多種非-BNP-SP標(biāo)記物的水平，并且將該7K平與對(duì)照的標(biāo)記物水平進(jìn)行比較，其中測(cè)量到的水平與非-BNP-SP標(biāo)記的對(duì)照水平有偏差，以及測(cè)量到的高于對(duì)照BNP-SP水平的BNP-SP水平被用于ACD預(yù)測(cè)或者診斷，或者可以被用于監(jiān)測(cè)所述的ACD、心臟移植排斥或ACD/肺病。本文中的用于急性冠狀動(dòng)脈綜合征的標(biāo)記物包括肌鈣蛋白T、月幾4丐蛋白I、肌酸激酶MB、月幾紅蛋白、BNP、NT-BNP、LDH、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、和心臟特異性脂肪酸結(jié)合蛋白(H-FABP)。另一方面，本發(fā)明還提供了選擇性結(jié)合BNP-SP或者其抗原片斷或變異體的BNP-SP結(jié)合劑用于預(yù)測(cè)、i會(huì)斷或者監(jiān)測(cè)受試者的急性心臟病癥(ACD)、心臟移才直排斥或ACD/肺病的應(yīng)用，其中ACD、心臟移植排斥或ACD/肺病的特征為在發(fā)作或者臨床表現(xiàn)ACD、心臟移植排斥或ACD/肺病的兩個(gè)小時(shí)內(nèi)在從受試者獲得生物樣品中出現(xiàn)BNP隱SP。在一種實(shí)施方式中，結(jié)合劑優(yōu)選為抗體或其片斷。在另一種實(shí)施方式中，結(jié)合劑為能夠結(jié)合BNP-SP的任何固體或者非固體材料。本發(fā)明還提出了BNP-SP結(jié)合劑在制造用于判定受試者中的急性心臟病癥(ACD)、心臟移植排斥或者ACD/肺病的預(yù)測(cè)、診斷或者監(jiān)測(cè)器具中的應(yīng)用，其中在ACD、心臟移植排斥或ACD/肺病發(fā)作或臨床表現(xiàn)ACD、心臟移;法排斥或ACD/肺病的兩小時(shí)內(nèi)進(jìn)"f亍判定。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的應(yīng)用，其中將預(yù)測(cè)、i貪斷或者監(jiān)測(cè)器具才交〉隹k乂觀'J量在0.1至ij500pmol/L,優(yōu)選1至i』400pmoI/L,<尤選10至ij350pmol/L，1尤選20至'J300pmol/L,優(yōu)選25》J250pmol/L，4尤選30至!j180pmol/L,4尤選35至U150pmol/L和4尤選40至ij120pmol/L的范圍內(nèi)的BNP-SP水平。另一方面，本發(fā)明^是供了用于予貞測(cè)、i貪斷或監(jiān)測(cè)急性心臟病癥(ACD)、心臟移柏:排斥或者ACD/肺病的包括本發(fā)明的BNP-SP結(jié)合劑的試劑盒，其中該試劑盒用于與在ACD、心臟移植排斥或ACD/肺病發(fā)作或者臨床表現(xiàn)ACD、心臟移植排斥或ACD/肺病的兩小時(shí)內(nèi)從受試者獲得的生物樣品一起使用。本發(fā)明還提供了預(yù)測(cè)、診斷或者監(jiān)測(cè)急性心臟病癥(ACD)的包括本發(fā)明的結(jié)合劑的試劑盒，其中將該試劑盒校準(zhǔn)以測(cè)量在0.1至i』500pmol/L，^尤選1至)j400pmol/L,<尤選10至U350pmol/L,4尤選20至)J300pmol/L,優(yōu)選25pmol/L至)』250pmol/L，^尤選30180pmol/L,4尤選35至'J150pmol/L和伊C選40至)J120pmol/L的>范圍內(nèi)的BNP-SP水平。優(yōu)選地，該試劑盒還包括從發(fā)作或臨床表現(xiàn)兩小時(shí)內(nèi)獲得的生物樣品中測(cè)量得到的BNP-SP水平，在發(fā)作或者臨床表現(xiàn)的兩小時(shí)內(nèi)預(yù)測(cè)、i會(huì)斷或者監(jiān)測(cè)受試者的ACD的4吏用i兌明。另一方面，本發(fā)明涉及編碼本發(fā)明的BNP-SP的核酸分子，其中所述的核酸選自(a)SEQIDNO:14;(b)SEQIDNO:16;(c)SEQIDNO:18;(d)SEQIDNO:20;(e)(a)到(d)中任一者的補(bǔ)體；(f)能夠在嚴(yán)格條件下與(a)到(e)中任一者的序列雜交的序列，長(zhǎng)度為至少15個(gè)核苷酸，限制條件為該序列不是ccagtgcacaagctgcttggggaggcgaga或SEQIDNO:22。本發(fā)明還4是供了包括本發(fā)明的核酸分子的基因構(gòu)建體、包括該基因構(gòu)建體的載體、包括該基因構(gòu)建體或載體的宿主細(xì)胞、由本發(fā)明的核酸分子編碼的多肽、選擇性地結(jié)合本發(fā)明的多肽的抗體、以及重組產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法。因此，本發(fā)明的另一方面提供了選自以下的分離BNP-SP多肽(a)SEQIDNO:13;(b)SEQIDNO:15;(c)SEQIDNO:17;以及(d)SEQIDNO:19。附圖i兌明以下將參照附圖來(lái)描述本發(fā)明，其中圖1是描述導(dǎo)致產(chǎn)生自由信號(hào)肽、N-BNP肽和BNP肽的人preproBNP的過(guò)禾呈的示意圖；信號(hào)肽區(qū)是粗體并且具有下劃線；''^圖2B是preproBNP4言號(hào)肽序列的ClustalWversion1.83JALVIEW多重序列比對(duì)。在該比對(duì)中所使用的默認(rèn)ClustalW參數(shù)如下DNA空位開(kāi)》文罰分=15.0;DNA空位延伸罰分=6.66;DNA矩陣=Identity;蛋白質(zhì)空位開(kāi)放罰分=10.0;蛋白質(zhì)空位延伸罰分=0.2;蛋白質(zhì)矩陣二Gonnet;蛋白質(zhì)/DNAENDGAP=-1;蛋白質(zhì)/DNAGAPDIST=4。氨基酸以Pearson(fasta)才各式l是交9;圖3出示了與BNP-SP標(biāo)準(zhǔn)曲線(實(shí)心圓)平行的人血漿提取物(空心方形)的放射免疫分析的結(jié)果；圖4示出了證實(shí)健康人的BNP-SP的血漿濃度不表現(xiàn)出任何與年齡的相關(guān)性的放射免疫分析結(jié)果；圖5示出了i正實(shí)正常的健康人(n=13)的BNP和N-BNP血漿水平表王見(jiàn)出緊密相關(guān)性(左圖)，而B(niǎo)NP-SP濃度與N-BNP不相關(guān)(右圖)的放射免疫分析結(jié)果；圖6示出了人血漿中的BNP-SP的放射免疫分析SEHPLC(上圖)和RPHPLC(下圖)分析的結(jié)果，其表示BNP-SP洗脫物接近于合成的BNP-SP(向下的箭頭，下圖)；圖7:;改射免疫分析結(jié)果示于上圖在如所示入院時(shí)間從AMI患者(n=10)拍)耳又的血漿中的BNP-SP(空心六邊形)、BNP(實(shí)心圓形)和N-BNP(空心正方形)的濃度。與在入院后24小時(shí)達(dá)到峰值的BNP和N-BNP水平形成對(duì)比，觀察到BNP-SP的最高水平是在入院時(shí)，比正常健康個(gè)體中測(cè)量到的水平(空心圓形)平均高約7倍。下圖與上圖中的相同患者的CK-MB、肌紅蛋白和TnT的相匹配的時(shí)間過(guò)程濃度分布曲線。圖8示出了BNP-SP抗血清的交叉反應(yīng)性數(shù)據(jù)表；圖9是示出了患者中來(lái)自心源的循環(huán)BNP-SP濃度的柱狀圖。具體實(shí)施方式定義急性心臟病癥(ACD),包括〗旦不限于急性冠狀動(dòng)脈綜合征(AMI)(在ECG表現(xiàn)為ST段抬高)、不穩(wěn)定心絞痛、急性非ST段抬高M(jìn)I;心臟缺血；急性心臟損傷；由急性藥物毒性引起的急,f生心月幾損害、急4生心"幾疾病、和心臟移才直4非斥。這些病癥的定義和詳細(xì)描述可以在參考文獻(xiàn)l中4戈到。ACD/肺病是指具有未診斷、或疑似ACD或者肺病的受試者。急性冠狀動(dòng)脈綜合征(ACS)包括廣泛的心臟缺血事件，包括不穩(wěn)定心絞痛、心電圖(ECG)表現(xiàn)為ST段抬高的急性心肌梗死和ECG未表現(xiàn)ST段抬高的急性心肌梗死。術(shù)語(yǔ)"抗體"是指具有與包括用于合成該抗體的抗原的分子或與其密切相關(guān)的抗原特異性相互作用(結(jié)合)的特定結(jié)構(gòu)的免疫球蛋白分子。如果該抗體優(yōu)選地結(jié)合到BNP-SP，例如，具有小于25%,優(yōu)選小于10%,優(yōu)選小于1%的與非BNP-SP多肽的交叉反應(yīng)性，則抗體選擇性或者特異性地結(jié)合到本發(fā)明的BNP-SP多肽。通常，該抗體對(duì)抗原具有不超過(guò)10—7M,優(yōu)選小于約1(T8M,優(yōu)選小于約10"M的親和力(解離常數(shù)(Kd)值)?？梢岳帽砻娴入x子體共振(surfaceplasmaresonance)來(lái)評(píng)估該親和力。本文中所使用的生物樣品意指來(lái)自待篩選的受試者的任何樣品。該樣品可以為可檢測(cè)BNP-SP的領(lǐng)域中已知的任何樣品。任何體液，例如血漿、血液、唾液、間質(zhì)液、血清、尿、滑液、月囟脊液、'淋巴液、津奮液、羊水、心包液和腹水，以及組織(如心臟組織)均包4舌在內(nèi)，-f旦不限于此。還包^"來(lái)自不具有急性心臟病癥臨床病史的正常#:康受試者的才羊品。術(shù)語(yǔ)"BNP-SP"是指人preproBNP序列(SEQIDNO:1)的完整的26個(gè)氨基酸BNP信號(hào)肽。BNP-SP另外以SEQIDNO:21表示。術(shù)語(yǔ)BNP-SP還包括BNP-SP的變異體或者片斷。在本說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求中使用的術(shù)語(yǔ)"包括"表示"由至少部分……構(gòu)成"；也就是說(shuō)，當(dāng)解釋本說(shuō)明書(shū)或權(quán)利要求中包括"包括"的敘述時(shí)，每一敘述中以這個(gè)術(shù)語(yǔ)為開(kāi)始的特征都需要存在，但是其它特征也可以存在。相關(guān)的術(shù)語(yǔ)如"包含"也可以相似的方式解釋。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)"多核香酸"表示任意長(zhǎng)度的單鏈或雙鏈的脫氧核糖核酸或核糖核酸的聚合物，并且包括作為非限定性的實(shí)施例的基因的編碼和非編碼序列、有義序列和反義序列、外顯子、內(nèi)含子、基因組DNA、cDNA、前體mRNA、mRNA、rRNA、siRNA、miRNA、tRNA、核酶、重組多核普酸、分離并純化的天然存在的DNA或RNA序列、合成的DNA或RNA序列、核酸探針、前體、片段、基因構(gòu)建體、載體或者經(jīng)修飾的多核苷酸。提到核酸分子作相似、的理解。本文中所提供的多核苷酸序列的"片斷"是能夠與感興趣的靶標(biāo)特異性雜交的相鄰核苷酸的子序列，例如長(zhǎng)度少于10個(gè)核苷酸的序列。本發(fā)明的片斷包括SEQIDN0.22的多核苷酸的10個(gè)，優(yōu)選15個(gè)核苷酸，優(yōu)選16，優(yōu)選17，優(yōu)選18,優(yōu)選19,優(yōu)選21,優(yōu)選22，優(yōu)選23,優(yōu)選24,優(yōu)選25，優(yōu)選26,優(yōu)選27,優(yōu)選28,優(yōu)選29,優(yōu)選30,優(yōu)選31，優(yōu)選32，優(yōu)選33，優(yōu)選34,優(yōu)選35,優(yōu)選36，優(yōu)選37，優(yōu)選38，優(yōu)選39,優(yōu)選40，優(yōu)選41，優(yōu)選42，優(yōu)選43，優(yōu)選44,優(yōu)選45,優(yōu)選46，優(yōu)選47,優(yōu)選48,優(yōu)選49,優(yōu)選50，優(yōu)選51，優(yōu)選52，優(yōu)選53,優(yōu)選54,優(yōu)選55,優(yōu)選56，優(yōu)選57,優(yōu)選58,優(yōu)選59,優(yōu)選60,優(yōu)選61,優(yōu)選62,優(yōu)選63，優(yōu)選64，優(yōu)選65,優(yōu)選66,優(yōu)選67,優(yōu)選68,優(yōu)選69，優(yōu)選70,優(yōu)選71，優(yōu)選72,優(yōu)選73，優(yōu)選74,優(yōu)選75，優(yōu)選76，優(yōu)選77個(gè)相鄰核香酸。多核香酸序列的片斷可以3皮用作包括在微陣列(microarray)中的引物、探針，或者被用于本文中的基于多核苷酸的選擇方法。術(shù)語(yǔ)"引物"是指通常具有自由3'OH基團(tuán)的短的多核苷酸，其與模板雜交并且用于與靶標(biāo)互補(bǔ)的多核苷酸的起始聚合。術(shù)語(yǔ)"探針"是指在基于雜交的分析中用于檢測(cè)與該探針互補(bǔ)的多核苷酸序列的短多核苷酸。揮:針可以由本文中所限定的多核苷酸的"片斷"構(gòu)成。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)"多肽"包括任意長(zhǎng)度的氨基酸鏈，優(yōu)選至少5個(gè)氨基酸，優(yōu)選至少6個(gè)，優(yōu)選至少7個(gè)，優(yōu)選至少8個(gè)，優(yōu)選至少9個(gè)，優(yōu)選至少10個(gè)，優(yōu)選至少ll個(gè)，優(yōu)選至少12個(gè)，優(yōu)選至少13個(gè)，優(yōu)選至少14個(gè)，優(yōu)選至少15個(gè)，優(yōu)選至少16個(gè)，優(yōu)選至少17個(gè)，優(yōu)選至少18個(gè)，優(yōu)選至少19個(gè)，優(yōu)選至少20個(gè)，優(yōu)選至少21個(gè)，優(yōu)選至少22個(gè)，優(yōu)選至少23個(gè)，優(yōu)選至少24個(gè)，優(yōu)選至少25個(gè)，并且優(yōu)選BNP-SP(SEQIDNO:21)的全長(zhǎng)的全部26個(gè)氨基酸，其中氨基酸殘基通過(guò)共價(jià)肽鍵連接。用于本發(fā)明中的多肽可以為純4匕的天然產(chǎn)物，或者可以為部分或者完全利用重組或合成技術(shù)產(chǎn)生。該術(shù)語(yǔ)可以是指多肽，多肽聚合體(如二聚體或其它多聚體)、融合多肽、多肽片斷、多肽變異體或者它們的衍生物。多肽的"片斷"是起到所需生物活性或結(jié)合的功能和/或提供多肽的三維結(jié)構(gòu)的多肽的子序列。該術(shù)語(yǔ)可以是指多肽、多肽聚合體(如二聚體或其它多聚體)、融合多肽、多肽片斷、多肽變異體或者能夠起到上述信號(hào)肽作用的它們的衍生物。用于本文所7>開(kāi)的多核酸或多肽序列的術(shù)語(yǔ)"分離的"是指乂人它們的天然細(xì)月包環(huán)境取出的序列。分離的分子可以通過(guò)^壬《可方法或者包括生物化學(xué)、重組和合成纟支術(shù)的方法的組合來(lái)獲得?？梢酝ㄟ^(guò)至少一個(gè)純化步驟來(lái)制備多核苷酸或多肽序列。術(shù)語(yǔ)"重組"是指從其天然環(huán)境的序列中取得的多核苷酸序列和/或與其天然環(huán)境中不存在的序列重組的序列。"重組"多肽序列是通過(guò)翻譯"重組"多核苷酸序列來(lái)產(chǎn)生的。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)"變異體"是指與特異性同一序列不同的多核苷酸或多肽序列，其中刪除、置4奐或者添加了一個(gè)或多個(gè)核苦酸或氨基酸殘基。變異體可以是天然存在的等位基因變異體，或非天然存在的變異體。變異體可以來(lái)自相同物種或其它物種并且可以包4舌同源(homologue)、旁系同源(paralogue)和直系同源(orthologue)。在某些實(shí)施方式中，用于本發(fā)明中的多肽的變異體和生物活性與親本多肽或多核苷酸相同或相似。與多核苷酸和多肽相關(guān)的術(shù)語(yǔ)"變異體"包括本文中所限定的多核苷酸和多肽的所有形式。變異體多核普酸序列優(yōu)選表現(xiàn)的與本發(fā)明的序列至少50%，至少60%,優(yōu)選至少70%,優(yōu)選至少71%,優(yōu)選至少72%,優(yōu)選至少73%,優(yōu)選至少74%,優(yōu)選至少75%,優(yōu)選至少76%，優(yōu)選至少77%，優(yōu)選至少78%，優(yōu)選至少79%，優(yōu)選至少80%,優(yōu)選至少81%,優(yōu)選至少82%，優(yōu)選至少83%,優(yōu)選至少84%，優(yōu)選至少85%，優(yōu)選至少86%,優(yōu)選至少87%，優(yōu)選至少88%,優(yōu)選至少89%,優(yōu)選至少90%,優(yōu)選至少91°/。，優(yōu)選至少92°/。，優(yōu)選至少93%,優(yōu)選至少94%,優(yōu)選至少95%，優(yōu)選至少96%,優(yōu)選至少97%，優(yōu)選至少98%，以及優(yōu)選至少99%的同一性。在至少10個(gè)核普位置，優(yōu)選至少15個(gè)核普位置，優(yōu)選至少20個(gè)核普位置，優(yōu)選至少27個(gè)核苷位置，優(yōu)選至少40個(gè)核苷位置，優(yōu)選至少50個(gè)核苷位置的整個(gè)比較窗(comparisonwindow)上發(fā)現(xiàn)同一性，并且最優(yōu)選在本發(fā)明的多核苦酸的整個(gè)長(zhǎng)度上發(fā)現(xiàn)同一性?？梢詌吏用全局序列比只于禾呈序(例如，Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.(1970)J.Mol.Biol.48,443-453)在受試者多核苷酸序列和候選多核苷酸序列重疊的完整長(zhǎng)度上計(jì)算多核苷酸序列同一性。在EMBOSS壽欠件包中的指針(needle)程序中找到Needleman-Wunsch全局比對(duì)算法的完整實(shí)施(Rice，RLongden，I.和Bleasby,A.EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,TrendsinGeneticsJune2000，vol16,No6.pp.276-277),EMBOSS軟^f牛包可以/人http:〃www.hgmp.mrc.ac.uk/Software/EMBOSS/獲4f。歐洲生物4言息學(xué)研究所(EuropeanBioinformaticsInstitute)月艮務(wù)器也在http:〃www.ebi.ac.uk/emboss/align/在纟戔才是供方《更的兩個(gè)序列之間的EMBOSS-needle全局比》于。可替代地，可以4吏用GAP程序，其計(jì)算兩個(gè)序列的最佳全局比對(duì)而不對(duì)末端空位罰分。以下的論文中描述了GAP:Huang，X.(1994)OnGlobalSequenceAlignment.ComputerApplicationsintheBiosciences10，227-235。多核苷酸變異體還包括那些表現(xiàn)出與特異性同一序列中的一個(gè)或者多個(gè)的相似性，該特異性同一序列有可能保留了這些序列的功能相似部分，并且不能合理預(yù)期其是通過(guò)隨才幾產(chǎn)生的。這個(gè)程序發(fā)現(xiàn)了序列間的相似性，并且對(duì)于每個(gè)這樣的區(qū)域報(bào)告"E值"，"E值"是在含有隨機(jī)序列的固定參考大小的數(shù)據(jù)庫(kù)中的期望見(jiàn)到這樣的隨才幾配對(duì)的預(yù)期次H該凄t據(jù)庫(kù)的大小是通過(guò)bl2seq禾呈序中的默認(rèn)值來(lái)設(shè)定的。對(duì)于小的E值(遠(yuǎn)小于1)，該E值大約是這樣的卩il才幾匹配的相克率。當(dāng)與特異性同一序列中的任意一個(gè)進(jìn)行比較時(shí)，變異體多核苷酸序列的E值優(yōu)選為小于lxl(T5，更優(yōu)選小于lx10—6，更優(yōu)選小于lxl0力，更優(yōu)選小于lxl0",更優(yōu)選小于1><10"5，更優(yōu)選小于lxl(T18,并且最^尤選小于lxl(T21。優(yōu)選使用BLASTN以用于確定本發(fā)明的多核普酸變異體的序列同一性?？梢?lt;吏用以下的UNIX命令4亍參凌t來(lái)才企查多核苷酸序列的同一性bl2seq-inucleotideseql-jnucleotideseq2-FF-pblastn參數(shù)-FF關(guān)閉低復(fù)雜度部分的過(guò)濾。參數(shù)-p選擇用于序列配對(duì)的合適算法。bl2s叫程序在"Identities-，，行以相同的核苷酸數(shù)目和百分率來(lái)報(bào)告序列同一性。還可以以下的方式來(lái)確定多核香酸序列的同一性和相似性。利用序列比^"算法和序列相4以性:搜索工具(如Genbank、EMBL、Swiss-PROT和其它的數(shù)據(jù)庫(kù))將受試者多核普酸序列與候選多核普酸序列進(jìn)4亍比4交。NucleicAcidsRes29:1-10和11-16，2001才是供了在線資源的實(shí)例。7>眾可/人NCBI(ftp:〃ftp.ncbi.nih.gov/blast)或乂人位于美國(guó)馬里蘭州Bethesda的NCBI得到BLASTN(來(lái)自BLAST程序套裝，version2.2.13March2007inbl2s叫(TatianaA.等FEMSMicrobiolLett.174:247-250(1999)，Altschul等，Nuc.AcisRes25:3389-3402,(1997))。4吏用的bl2seq的默認(rèn)參數(shù)，除非應(yīng)該關(guān)閉4氐復(fù)雜度部分的過(guò)濾?？商娲?，在嚴(yán)格的條件下使變異體多核苷酸與特異性多核苷酸序列，或者其補(bǔ)體雜交。術(shù)語(yǔ)"在嚴(yán)格的條件下雜交"和其語(yǔ)法上的等同表達(dá)，是指在確定的溫度和鹽濃度條件下多核苷酸分子與目標(biāo)多核苷酸分子(如固定在DNA或者RNA印跡上的目標(biāo)核普酸分子，如DNA印跡或者RNA印跡)的雜交能力。在嚴(yán)格雜交條件下的雜交能力可以通過(guò)最初在嚴(yán)格性較d、的條件下進(jìn)行雜交，然后將嚴(yán)格性提高到期望的水平來(lái)確定。對(duì)于長(zhǎng)度大于約100個(gè)堿基的多核苷酸分子，的嚴(yán)格的雜交條件一般是不超過(guò)25到30。C(例如10°C)低于天然二倍體的解鏈溫度(Tm)(—般參見(jiàn)Sambrook等，Eds,1987,MolecularCloning,A26LaboratoryManual,第二版；ColdSpringHarborPress;Ausubel等,1987,CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishing,其結(jié)合于本文作為參考)?？梢酝ㄟ^(guò)7>式Tm=81.5+0.41%(G+C-log(Na+))(Sambrook等，Eds,1987，MolecularCloning,ALaboratoryManual,第二版,ColdSpringHarborPress;BoltonandMcCarthy,1962，PNAS84:1390)來(lái)計(jì)算大于100個(gè)石咸基的多核苷酸分子的Tm。x十于長(zhǎng)度大于100個(gè)石威基的多核苷酸的一力殳嚴(yán)才各條件可以為如下的雜交條件在6XSSC，0.2%SDS溶液中預(yù)洗滌；于65°C，6XSSC,0.2%SDS雜交過(guò)夜；隨后為分別于65°C,在lxSSC,0.1%SDS中洗滌兩次每次30分鐘，以及于65。C，在0.2xSSC，0.1%SDS中;先;條兩次，每次30分4中。在一種實(shí)施方式中，嚴(yán)格條件于42。C使用50。/。甲酰胺、5xSSC、50mM石粦酸鈉(pH6.8)、0.1%焦石粦酸鈉、5xDenhardt's〉容液、超聲處理的鮭魚(yú)精子DNA(50/^/ml)、0.1%SDS和10°/。硫酸葡聚糖，于42°C在0.2xSSC中洗滌并于55。C在50%曱酰胺中進(jìn)4亍洗滌，隨后于55°C用含有EDTA的O.lxSSC進(jìn)4亍洗滌。對(duì)于長(zhǎng)度小于100個(gè)堿基的多核苷酸分子，示例的嚴(yán)格雜交條件是比Tm低5到10°C。平均起來(lái)，長(zhǎng)度小于100bp的多核苦酸分子的Tm大約降低(500/寡核苦酸長(zhǎng)度)/°C。對(duì)于一皮稱(chēng)為肽核酸(PNA)的DNA模擬物(Nielsen等，Science.1991年12月6日；254(5037):1497-500),Tm值高于DNA-DNA或者DNA-RNA雜交體的Tm，并且可以利用在Giesen等，NucleicAcidsRes.1998年11月日；26(21):5004-6中描述的7>式來(lái)計(jì)算。長(zhǎng)度小于100個(gè)堿基的DNA-RNA雜交體的示例性嚴(yán)格雜交條件是4氐于Tm5到10°C。變異體多核香酸還包括與本發(fā)明的序列不同，但是其作為遺傳密碼簡(jiǎn)并的結(jié)果，編碼與本發(fā)明的多核苷酸編碼的多肽具有相似的活性的多肽的多核苦酸。不會(huì)改變多肽的氨基酸序列的序列改變是"沉默變異(silentvariation)"。除了ATG(甲石克氨酸)和TGG(色氨酸)以外，同一種氨基酸的其它密碼子可以通過(guò)本領(lǐng)域公知的技術(shù)來(lái)進(jìn)行改變，例如，從而優(yōu)化在特定的宿主生物中的密碼子表達(dá)。在本發(fā)明還包括導(dǎo)致一皮編碼的多肽序列中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸的〗呆守置換而不會(huì)顯著改變^皮編碼多肽序列的生物活性的多核苷酸序列的改變。一般的技術(shù)人員會(huì)知道實(shí)施表型沉默氨基酸取代的方法(參見(jiàn)例力口，Bowie等，1990，Science247,1306)?？梢岳胋l2seq程序經(jīng)由如上文所述的tblastx算法來(lái)確定在編碼的多肽序列中由沉默變異和保守置換產(chǎn)生的變異體多核苷酸。與多肽相關(guān)的術(shù)語(yǔ)"變異體"也包括天然存在的、重組的和合成產(chǎn)生的多肽。變異體多肽序列優(yōu)選表現(xiàn)與本發(fā)明的序列至少50%，優(yōu)選至少60%,優(yōu)選至少70%,優(yōu)選至少71%,優(yōu)選至少72%,優(yōu)選至少73%，優(yōu)選至少74%,優(yōu)選至少75%,優(yōu)選至少76%，優(yōu)選至少77%,優(yōu)選至少78%,優(yōu)選至少79%，優(yōu)選至少80%,優(yōu)選至少81%，優(yōu)選至少82%,優(yōu)選至少83%，優(yōu)選至少84%,優(yōu)選至少85%，優(yōu)選至少86%,優(yōu)選至少87%,優(yōu)選至少88%，優(yōu)選至少89%,優(yōu)選至少90%,優(yōu)選至少91%，優(yōu)選至少92%,優(yōu)選至少93%,優(yōu)選至少94%，優(yōu)選至少95%,優(yōu)選至少96%，優(yōu)選至少97%，優(yōu)選至少98%,以及優(yōu)選至少99%的同一性。在至少5個(gè)氨基酸位置，優(yōu)選至少7個(gè)氨基酸位置，優(yōu)選至少10個(gè)氨基酸位置，優(yōu)選至少15個(gè)氨基酸位置，優(yōu)選至少20個(gè)氨基酸的比較窗口上發(fā)現(xiàn)同一性，并且最優(yōu)選在本發(fā)明使用的多肽的整個(gè)長(zhǎng)度上發(fā)現(xiàn)同一性。多肽變異體還包括那些表現(xiàn)出與特異性同一序列中的一個(gè)或多個(gè)的相似性，該特異性同一序列有可能保留了這些序列的功能相似部分，并且不能合理預(yù)期其是通過(guò)隨機(jī)產(chǎn)生的?？梢酝ㄟ^(guò)以下的方式來(lái)確定多肽序列的同一性和相似性。利用W2s叫中的BLASTP(來(lái)自BLAST程序套裝，version2.2.14[2006年5月])將受試者的多肽序列與候選多肽序列進(jìn)行比較，公眾可以乂人NCBI獲得BLASTP(ftp:〃ft。.ncbi.nih.gov/blast/)。4吏用bl2seq的默^人參lt,除非應(yīng)該關(guān)閉低復(fù)雜度部分的過(guò)濾?？梢允褂靡韵碌腢NIX命令行參數(shù)來(lái)沖僉查多肽序列的相似性bl2seq-ipeptideseql-jpeptideseq2-FF-pblastp當(dāng)與特異性同一序列中的任意一個(gè)進(jìn)行比較時(shí)，變異體多肽序列的E值優(yōu)選為小于lxlO-s，更優(yōu)選小于1><10-6，更優(yōu)選小于lxl(T9,更優(yōu)選小于lxl(T12，更加優(yōu)選小于lxl(T15，更優(yōu)選小于lxl(T18，并且最優(yōu)選小于lxl(T21。參數(shù)-FF關(guān)閉低復(fù)雜度部分的過(guò)濾。參數(shù)-p選擇用于序列配對(duì)合適算法。該程序發(fā)現(xiàn)序列間的相似性，并且對(duì)于每個(gè)這樣的區(qū)域報(bào)告"E值"，該"E值"是在含有隨機(jī)序列的固定參考大小的數(shù)據(jù)庫(kù)中的期望見(jiàn)到這樣的隨機(jī)配對(duì)的預(yù)期次數(shù)。對(duì)于小的E值(遠(yuǎn)小于1),該E值大約是這才羊的隨才幾匹配的概率。還可以使用全局序列比對(duì)程序，在候選多肽序列和受試者多肽序列之間重疊的整個(gè)長(zhǎng)度上計(jì)算多肽序列同一性。以上所討論的EMBOSS-needle(可從http:/www.ebi.ac.uk/emboss/align/獲得)和GAP(Huang,X.(1994)OnGlobalSequenceAlignment.ComputerApplicationsintheBiosciences10，227-235)也是適合用于計(jì)算多月太序列同一性的全局序列比對(duì)程序。優(yōu)選使用上文所述的BLASTP用于確定本發(fā)明的多肽變異體。優(yōu)選的變異體包括其序列通過(guò)不影響該肽的生物活性的一個(gè)或者多個(gè)^f呆守氨基酸置換、刪除、添加或者插入而與本文中的人BNP-SP(l-26)不同的肽。保守置換一4殳包括用另外一個(gè)具有相似特性的氨基酸置換一個(gè)氨基酸，例如，在以下的組中進(jìn)行置換纈氨酸、甘氨酸；甘氨酸，丙氨酸；纈氨酸，異亮氨酸，亮氨酸；天冬氨酸，谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酸；絲氨酸，蘇氨酸；賴(lài)氨酸，精氨酸；以及苯基丙氨酸，酪氨酸。保守置換的實(shí)例還可以在圖2A和圖2B中的BNP-SP序列中，通過(guò)這所顯出的不同哺乳動(dòng)物種類(lèi)的置換與人類(lèi)序列的比較而發(fā)現(xiàn)。其它的保守置換可以來(lái)自下表1。<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>才艮據(jù)相同的側(cè)鏈特性將天然存在的殘基分成幾組(1)疏水氨基酸正亮氨酸、甲硫氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸；(2)中性親水氨基酸半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸；(3)酸性氨基酸天冬氨酸、谷氨酸；(4)石威性氨基酸天門(mén)冬酰胺、谷氨酰胺、組氨酸、賴(lài)氨酸、精氨酸；(5)影響鏈取向的殘基甘氨酸、脯氨酸；以及(6)芳香族氨基酸色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸。非保守置換會(huì)使這些類(lèi)別中的一類(lèi)的成員與另外一個(gè)類(lèi)別的成員進(jìn)行互換。參見(jiàn)例如在BNP-SP25中用H置換R。其它的變異體包括具有影響肽穩(wěn)定性的變性的肽。這樣的類(lèi)似物可以含有，例如，肽序列中的一個(gè)或多個(gè)非肽鍵(其代替了肽4建)。還包括這樣的類(lèi)似物，其該類(lèi)似物包括除天然存在的L-氨基酸之外的殘基，例如D-氨基酸或非天然存在的合成氨基酸，例如(3氨基酸或Y氨基酸以及環(huán)狀類(lèi)似物?？梢酝ㄟ^(guò)所屬領(lǐng)域中已知的突變形成方法來(lái)制造置換、刪除、添加或插入。一般技術(shù)人員會(huì)知道實(shí)施表型沉默的氨基酸置換的方法。例如參見(jiàn)Bowie等，1990,Science247，130610。本發(fā)明的多肽還包括那些已經(jīng)通過(guò)例如生物素化、千基化、糖基化、磷酸化、酰胺化、使用封端基團(tuán)/保護(hù)基等來(lái)衍生化而在合成過(guò)程中或者之后4皮改性的多肽。這樣的改性可以提高多肽的穩(wěn)定性或活性。術(shù)語(yǔ)"基因構(gòu)建體"是指多核苦酸分子，通常是雙鏈DNA，其可以-故插入到另外一個(gè)多核苷酸分子(插入多核苦酸分子)中，例如但不限于cDNA分子。基因構(gòu)建體可以含有使插入多核苦酸分子可以轉(zhuǎn)錄，并且可選地^f吏轉(zhuǎn)錄物凈皮翻i奪成多肽的必需元4牛。插入多核苷酸分子可以來(lái)自宿主細(xì)月包，或可以來(lái)自不同的細(xì)J包或生物體，和/或可以為重組多沖亥苷酸。一旦在宿主細(xì)力包中存在該基因構(gòu)建體，該基因構(gòu)建體就可以被整合到宿主染色體DNA中。該基因構(gòu)建體可以連4妄到載體。術(shù)語(yǔ)"載體"是指多核苷酸分子，通常為雙鏈DNA,其被用于將基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)運(yùn)至宿主細(xì)月包中。載體可以能夠在至少一個(gè)其4也宿主系統(tǒng)(如大腸桿菌)中復(fù)制。術(shù)語(yǔ)"表達(dá)構(gòu)建體"是指包括使得插入的多核苦酸分子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，并且可選地將轉(zhuǎn)錄本翻譯成多肽的必需元件的基因構(gòu)建體。表達(dá)構(gòu)建體在5'到3'的方向上通常包4舌a)啟動(dòng)子，在構(gòu)建體將被轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)的宿主細(xì)胞中起作用；b)待表達(dá)的多核苷酸，以及c)終止子，在構(gòu)建體將^皮轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)的宿主細(xì)胞中起^f乍用。術(shù)語(yǔ)"編碼區(qū)"或"開(kāi)放閱讀框"(ORF)是指在合適的調(diào)控序列的控制下能夠產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和/或多肽的基因組DNA序列或cDNA序列的有義鏈。編石馬序列由5'翻i奪起始密碼子和3'翻i奪纟冬止密石馬子的存在來(lái)確定。當(dāng)被插入了基因構(gòu)建體，當(dāng)"編碼序列",皮可操作地連接到啟動(dòng)子和中止子序列和/或其它調(diào)控元件時(shí)，"編碼序列"就能夠被表達(dá)。"可操作地連接(operably-linked)"意指待表達(dá)的序列被置于調(diào)控元件的控制之下，該調(diào)控元件包括啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄調(diào)一空序列、翻"i,調(diào)控序列、復(fù)制起點(diǎn)、組織特異性調(diào)控元件、臨時(shí)調(diào)控元件、增強(qiáng)子、多A，苷酸化信號(hào)、阻遏物和終止子。術(shù)語(yǔ)"非編碼區(qū)"是指不翻譯的序列，其是翻譯起始位點(diǎn)的上游和翻i爭(zhēng)終止位點(diǎn)的下游。這些序列也分別纟皮稱(chēng)為5'UTR和3'UTR。這些區(qū)域包括轉(zhuǎn)錄起始和終止以及調(diào)控翻譯效率所需要的元件。終止子是終止轉(zhuǎn)錄的序列，其被發(fā)現(xiàn)位于一皮翻譯序列的基因下游的3'不翻譯末端中。終止子是mRNA穩(wěn)定性的重要決定因素，并且在某些情況下發(fā)現(xiàn)其具有空間調(diào)控功能。術(shù)語(yǔ)"啟動(dòng)子"是指調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的編碼區(qū)上游的非轉(zhuǎn)錄順式調(diào)控元件。啟動(dòng)子包括順式起始元件，其特異于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和保守框(如TATA框)以及由轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的基因座(或基序，motif)。本發(fā)明的多核苷酸或多肽的術(shù)語(yǔ)"改變表達(dá)"或者"改變的表達(dá)"，意在包括相應(yīng)于本發(fā)明的多核苷酸的基因組DNA被修飾/人而導(dǎo)致本發(fā)明的多核苷酸或者多肽的表達(dá)被改變的情況。可以通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化或者i秀導(dǎo)突變領(lǐng)i或中已知的其它方法來(lái)《奮飾基因組DNA。"改變的表達(dá)"可以與所產(chǎn)生的信使RNA和/或多肽的量的增加或減少有關(guān)，并且還會(huì)由于所產(chǎn)生的多核苷酸和多肽序列中的改變而導(dǎo)致多肽的活性改變。本文中所使用的"受試者"優(yōu)選為哺乳動(dòng)物，且包括人類(lèi)和非人類(lèi)哺乳動(dòng)物，如貓、狗、馬、牛、羊、鹿、小鼠、大鼠、靈長(zhǎng)類(lèi)(包括大猩猩、獼猴和黑猩猩)、負(fù)鼠和其它飼養(yǎng)的農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物或動(dòng)物園動(dòng)物。4尤選i也，該哺乳動(dòng)物是人。本文中所使用的術(shù)語(yǔ)"表現(xiàn)"是指在醫(yī)療結(jié)構(gòu)，如門(mén)診部或者醫(yī)院的受試者的表現(xiàn)。術(shù)語(yǔ)"治療"和"預(yù)測(cè)"是指減輕、改善、維持、預(yù)測(cè)、抑制、停止或逆轉(zhuǎn)ACD或心臟移植排斥或其結(jié)果，尤其是ACS的發(fā)展的治療或預(yù)測(cè)措施。受試者會(huì)表現(xiàn)出Tnl、BNP、N-BNP和所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的其它常用臨床標(biāo)記物中的一種或多種的可見(jiàn)或可測(cè)的(統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的)降低，以指征改善。本文中所4皮露的涉及凄t字范圍(例如1到IO)還包括涉及該范圍內(nèi)所有相關(guān)凄t字(例如l、1.1、2、3、3.9、4、5、6、6.5、7、8、9和10)和該范圍內(nèi)的有理數(shù)的任何范圍(例如，2到8、1.5到5.5以及3.1到4.7)，并且因此，清楚的4皮露了本文中清楚4皮露的所有區(qū)間的所有子區(qū)間。這些4又是具體i兌明的實(shí)例，并且最小值和最大值之間的數(shù)值的所有可能組合都可以被認(rèn)為本申請(qǐng)中以相同的方式而^皮;青楚;t也i兌明。本發(fā)明的詳細(xì)描述人B型鈉尿肽(BNP)是心鈉肽家族的成員。如圖1中所示，preproBNP是134個(gè)氨基酸的分子。信號(hào)肽BNP-SP(l-26)被裂解乂人而產(chǎn)生preproBNP(27-134)。preproBNP(27-134)^皮進(jìn)一步處理/人而產(chǎn)生生物活性形式preproBNP(103-134)和preproBNP(27-102)。BNP-SP有可能被信號(hào)肽酶(SPP)降解成更小的片斷；通常4妄近BNP-SP(l-26)序列的號(hào)wK中心區(qū)。長(zhǎng)期以來(lái)，人們認(rèn)為BNP-SP的功能限于調(diào)控BNP在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的運(yùn)輸。運(yùn)輸完成后，信號(hào)肽隨后就會(huì)被降解成而細(xì)胞不會(huì)再分泌該信號(hào)肽。最近，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)BNP-SP出現(xiàn)在循環(huán)中(WO2005/052593;US2005/0244904)?；谶@個(gè)發(fā)現(xiàn)，已經(jīng)提出了利用BNP-SP作為心臟疾病的循環(huán)生物標(biāo)記物。本申請(qǐng)人已經(jīng)有了更進(jìn)一步的和非常意想不到的發(fā)現(xiàn)。在急性心肌梗塞(AMI)患者中，BNP-SP的循環(huán)濃度在患者癥狀發(fā)作(實(shí)際上，是在醫(yī)院或者門(mén)診部)的最初的幾個(gè)小時(shí)內(nèi)是最高的。這與BNP-SP水平會(huì)與N-BNP水平相聯(lián)系并且因此一皮認(rèn)為在從發(fā)作或臨床表現(xiàn)ACD、心臟移才直排斥、或者未確i貪或疑似ACD或肺病的12到24小時(shí)達(dá)到它們的峰值的預(yù)期相反。在最初的幾小時(shí)中觀察到的水平出人意料地高，通常達(dá)到高于正常對(duì)照群體大約4到104咅，通常為5到8倍的峰^f直。從首次臨床表現(xiàn)的測(cè)量開(kāi)始，將BNP-SP的水平維持在高于對(duì)照群體的BNP-SP水平的3倍至少6周。這些發(fā)現(xiàn)指出了BNP-SP是可用作心臟移植排斥、包括急性冠狀動(dòng)脈綜合征(ACS)的ACD(如AMI)、尤其是非ST段抬高M(jìn)I、急性心臟缺血的非常清楚的早期標(biāo)i己物，并且可以用于將ACD與肺病區(qū)別開(kāi)來(lái)?；谶@些出人意料的發(fā)現(xiàn)，本申請(qǐng)人已經(jīng)首次確定，在取自發(fā)作或臨床表5見(jiàn)該病癥2小時(shí)內(nèi)的受試者的生物才羊品中篩選循環(huán)、的BNP-SP或者其變異體或其片斷，以及編碼BNP-SP的核苷酸序列或其變異體或其片斷是有用的。長(zhǎng)度為至少5個(gè)氨基酸的BNP-SP的抗原片斷或變異體在本發(fā)明中是有用的。尤其有用的片斷是BNP-SP的N末端或C末端。特異性抗原肽的實(shí)例是BNP-SP(1-10)(SEQIDNO:13)、BNP-SP(1-17)(SEQIDNO.15)、BNP-SP(12-23)(SEQIDNO:17)和BNP-SP(17-26)(SEQIDNO:19)。相應(yīng)的核苷酸序列分別在SEQIDNO:14、16、18和20中給出。這些序列由本申請(qǐng)人首次提供。核酸分子和肽都形成本發(fā)明的方面。因此，在第一方面，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明的BNP-SP的核酸分子，選自(a)SEQIDNO:14;(b)SEQIDNO:16;(c)SEQIDNO:18;(d)SEQIDNO:20;(e)(a)到(d)中的任一者的補(bǔ)體；(f)能夠與(a)到(e)中的任一個(gè)序列在嚴(yán)格條件下雜交的序列，長(zhǎng)度至少為15個(gè)核苷酸，限制條件為該序列不是ccagtgcacaagctgcttggggaggcgaga或SEQIDNO:22。本發(fā)明還提供了由本發(fā)明的核酸分子編碼的分離的BNP-SP多肽。本發(fā)明的特異性多肽包括具有SEQIDNO:13、15、17和19(都如所附的序列表中列出的)的氨基酸序列的多肽。還可以考慮本文所限定的這些多肽的功能相等變異體和片斷。優(yōu)選分離本發(fā)明的核酸分子或者本文描述的其他物質(zhì)?？梢允褂盟鲱I(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的各種技術(shù)從生物樣品分離它們。例^口，可以通過(guò)利用Mullis等，Eds.1994ThePolymeraseChainReaction,Birkhauser中描述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)來(lái)分離這樣的多核苷酸。本發(fā)明的核酸分子可以4吏用源自本發(fā)明的多核苷酸序列的前體(如本文所限定的)來(lái)進(jìn)4于擴(kuò)增。多核普酸，尤其是具有SEQIDNO:19所列出的序列的多核香酸/f乍為雜交探針。將標(biāo)記的多核苷酸探針與固定在固體支持物(如硝化纖維素濾膜或者尼龍膜)上的多核苷酸進(jìn)行雜交的技術(shù)可以被用于篩選基因組或者cDNA文庫(kù)。類(lèi)似地，可將探針與珠狀物結(jié)合并與耙序列雜交。可以利用已知的實(shí)驗(yàn)方案，如^茲性分離來(lái)實(shí)現(xiàn)分離。示例性的嚴(yán)格雜交和洗滌條件如上文所給出的?？梢酝ㄟ^(guò)所屬領(lǐng)域中熟知的4支術(shù)(如限制內(nèi)切酶消化或^氐聚核苦酸合成)來(lái)產(chǎn)生多核苷酸片斷。部分的多核苷酸序列可以在所屬領(lǐng)i或中已知的方法中用fN罙針，從而鑒別樣品中對(duì)應(yīng)的全長(zhǎng)多核苷酸序列。這樣的方法包括基于PCR的方法、5'RACE(MethodsEnzymol.218:340-56(1993);Sambrook"a/.,Supra)和基于雜交的方法、基于計(jì)算機(jī)/數(shù)據(jù)庫(kù)的方法?？梢允褂弥T如》文射性同位素、熒光、化學(xué)發(fā)光和生物發(fā)光標(biāo)記物之類(lèi)的可4企測(cè)標(biāo)記物以有助于4企測(cè)。反向PCR也可以獲得本文所才皮露的多核普酸序列旁側(cè)的、開(kāi)始于基于已知區(qū)域的引物的未知序列(Triglia等，7Vwc/e/c^c/A16,8186,(1998))。該方法4吏用了幾種限制性?xún)?nèi)切酶從而產(chǎn)生基因的已知區(qū)域中的適合片斷。該片斷然后通過(guò)分子內(nèi)連接而被環(huán)化并被用作PCR的模板。從已知區(qū)域來(lái)i殳計(jì)趨異引物(divergentprimer)。為了物理裝配全長(zhǎng)克隆，可以4吏用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法(Sambrook""/.，Supra)?？梢?吏本發(fā)明的多核香酸擴(kuò)增的引物和引物對(duì)也形成了本發(fā)明的另一個(gè)方面。變異體(包括直系同源)可以通過(guò)下述方法進(jìn)行鑒別。變異體多核苷酸可以利用基于PCR的方法來(lái)進(jìn)行鑒別(Mullis等，Eds.1994ThePolymeraseChainReaction,Birkhauser)。通常，可用于通過(guò)PCR擴(kuò)增的多核普酸分子的變異的變異體的引物的多核苷酸序列可以基于編碼相應(yīng)的氨基酸序列的保守區(qū)域的序列。鑒別變異多核苷酸的其他方法包括使用所有的或者部分的特定多核苷酸作為雜交4果針乂人而篩選上述的基因組或者cDNA文庫(kù)。一般可以使用基于編碼相應(yīng)的氨基酸序列的保守區(qū)域的序列的探針。雜交條件的嚴(yán)格性也可以低于篩選與探針一致的序列時(shí)所用的條件。變異體序列，包括多核苷酸變異體和多肽變異體，也可以通過(guò)以上述的基于計(jì)算機(jī)的方法來(lái)進(jìn)行鑒別。一組相關(guān)序列的多序列比對(duì)可以用CLUSTALW(Thompson,等，NucleicAcidsResearch,22:4673-4680(1994),http:〃www-igbmc.u-strasbg.fr/BioInfo/ClustalW/Top.html)或T-COFFEE(CedricNotredame"J.Mol.Biol.302:205-217(2000))或者4吏用漸進(jìn)式、成對(duì)比對(duì)的PILEUP(Feng""/，J.Mol.Evol.25，351(1987))來(lái)進(jìn)行?？捎貌拍阶R(shí)別專(zhuān)欠件應(yīng)用來(lái)發(fā)現(xiàn)基因座或標(biāo)記序列。例如，MEME(MultipleEmforMotifElicitation)在一組序列中發(fā)現(xiàn)基因座禾口才示^己序列，并且MAST(MotifAlignmentandSearchTool)4吏用這些基因座來(lái)鑒別才企測(cè)序列(querys叫uence)中的相似或相同的基因座。提供的MAST的結(jié)果是具有適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)和所發(fā)現(xiàn)的基因座的一見(jiàn)覺(jué)總覽的一系列比只十。MEME和MAST是由圣;也亞哥的加利福尼亞大學(xué)開(kāi)發(fā)的。PROSITE(Bairoch等，NucleicAcidsRes.22，3583(1994);Hofmann""/.,NucleicAcidsRes.27，215(1999))是鑒定從基因組或cDNA序列翻譯的未表征蛋白質(zhì)的功能的方法。PROSITE數(shù)據(jù)庫(kù)(www.expasy.org/prosite)包含生物重要沖莫式和外形，并且4皮i殳"^十用于可以與合適的計(jì)算工具一起使用從而為已知的蛋白質(zhì)家族賦予新的序列，或確定存在于序列中的一個(gè)或多個(gè)已知結(jié)構(gòu)i或(FalquetWa/.,NucleicAcidsRes.30,235(2002))。Prosearch是肯巨句多搜索具有給定序列才莫式或標(biāo)記的SWISS-PROT和EMBL數(shù)據(jù)庫(kù)的工具。蛋白質(zhì)可以才艮據(jù)它們的序列與同一基因組(旁系同源)或不同基因組(直系同源)的其它蛋白質(zhì)的相關(guān)性進(jìn)行分類(lèi)。直系同源基因是由共同的祖先基因通過(guò)物種形成而發(fā)展進(jìn)化的基因，并且通常隨著它們發(fā)展進(jìn)化而保持相同的功能。旁系同源基因是在基因組中被復(fù)制的基因以及可能獲得了可能與原始基因相關(guān)的新的特異性或寸務(wù)飾的功能的基因。TatusovWa/.，Science278,631-637,1997中綜述了系統(tǒng)發(fā)育分析方法。除了以上所描述的計(jì)算才幾/凄t悟庫(kù)方法，可以通過(guò)物理方法來(lái)鑒別多肽變異體，例如以Sambrook等描述的重組DNA技術(shù)利用抗本發(fā)明的多肽的抗體來(lái)篩選表達(dá)文庫(kù)(Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,第二版，ColdSpringHarborPress,1987)，或者通過(guò)這樣的抗體的幫助乂人自然來(lái)源鑒別多肽?？梢允褂盟鶎兕I(lǐng)域中熟知的肽合成技術(shù)來(lái)制備多肽(包括變異體多肽)，如使用固相技術(shù)的直接肽合成(例如，Merrifield，1963,inJ.AmChem.Soc.85,2149;Stewart"fl/.，1969，inSolid-PhasePeptideSynthesis,WHFreemanCo,SanFranciscoCalifornia;Matteuccia/.J.Am.Chem.Soc.103:3185-3191,1981)或自動(dòng)合成，例如j吏用AppliedBiosystems(美國(guó)，力口利牙畐尼亞州)的合成4義(Synthesizer)。也可以使用如合成的方法來(lái)產(chǎn)生多肽的突變形式，如Adelmen等；DNA2,183(1983)所描述的編碼氨基酸序列的DNA的位點(diǎn)特異性突變。優(yōu)選將本文的多肽和變異體多肽分離?？梢赃m用本^頁(yè)i或中熟知的各種才支術(shù)/人自然來(lái)源分離或純化它們(例如，Deutscher,1990,Ed,MethodsinEnzymology，V61.182,Cw/defo尸n9fe/w尸i/〃yc"f/o")。i亥技術(shù)包括HPLC、離子交換色譜法和免疫色譜法，但不限于這些?？商娲兀嚯暮妥儺愺w多肽可以在合適的宿主細(xì)胞中#皮重組表達(dá)并且如以下所討論的被從該細(xì)胞分離。除了其他用處之外，該多肽和變異體還用于產(chǎn)生抗體，以及產(chǎn)生配體。本文所描述的基因構(gòu)建體可以包括本發(fā)明所披露的多核苷酸序列和/或編碼所4皮露的多肽的多核苷酸序列中的一個(gè)或多個(gè)，并且可以用于轉(zhuǎn)化例如細(xì)菌、真菌、昆蟲(chóng)、哺乳動(dòng)物或才直物。本發(fā)明的基因構(gòu)建體傾向于包括本文所限定的表達(dá)構(gòu)建體。包括載體(如pBR322、pUC18、pU19、Mpl8、Mpl9、ColEI、PCR1和pKRC)、p藍(lán)菌體(^口Xgt10)、禾口M13質(zhì)并立(^口pBR322、pACYC184、pT127、RP4、plJ101、SV40和BPV)、凌占灃立、YACS,BACs穿才發(fā)載體(^口pSA3)、PAT28轉(zhuǎn)位子(如US5,792,294中所描述的)等。該構(gòu)建體可以方便地包括選擇基因或者可選的標(biāo)記物。一般使用抗生素抗性標(biāo)記物，如氨千西林、曱氨蝶呤或四環(huán)素。構(gòu)建體中有用的啟動(dòng)子包括本領(lǐng)域中熟知的p-內(nèi)酰胺酶、堿性磷酸酶、色氨酸和tac啟動(dòng)子系統(tǒng)。酵母啟動(dòng)子包括3-磷酸甘油酸激酶、烯醇酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、葡萄糖激酶和甘油醛-3-磷酸脫氬酶，^旦不限于此。也可以使用增強(qiáng)子作用于啟動(dòng)子上從而提高轉(zhuǎn)錄。合適在此處使用的增強(qiáng)子包括SV40增強(qiáng)子、巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子增強(qiáng)子、球蛋白、白蛋白、胰島素等。產(chǎn)生和使用基因構(gòu)建體和載體的方法在所屬領(lǐng)域中是熟知的，并且在Sambrookef"/，(supra)，以、及Ausubelefa/"CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishing,1987中進(jìn)行了筒要地描述。用載體轉(zhuǎn)化所選擇的宿主細(xì)胞也是已知的，例如，Cohen，SN;PNAS69,2110,1972所描述的IU匕4丐處理。包括所描述的基因構(gòu)建體和載體的宿主細(xì)胞可以來(lái)自于原核或者真核來(lái)源，例如酵母、細(xì)菌、真菌、昆蟲(chóng)(例如，桿狀病毒)、動(dòng)物、哺乳動(dòng)物或才直物。在一種實(shí)施方式中，宿主細(xì)月包是分離的宿主細(xì)胞。最常4吏用的估文為宿主細(xì)胞的原核生物是大腸桿菌(￡.co//)。其4也的原核宿主包4舌4叚單月包菌()、才干菌(5"c/〃m)、沙雷氏菌(5^m3"a)、克氏軒菌(^7eZwW/a)、鏈霉菌(/S^epfom^ces)、李斯特菌(L/他Wa)、酵母菌(6"acc/zara，ces1)、沙門(mén)氏菌(^"/譜we〃")和分4支^f菌(M少coZ^"en'a)，4旦不限于它們。用于表達(dá)重組蛋白質(zhì)的真核細(xì)胞包括，但不限于Vero纟田月包、HeLa、CHO(中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞)、293、BHK細(xì)胞、MDCK細(xì)胞和COS細(xì)月包，以及前列&泉癌細(xì)月包系，如PrEC、LNCaP、Du145和RWPE-2。可以從美國(guó)弗吉尼亞州的ATCC獲得這些細(xì)胞。建的啟動(dòng)子(如噬菌體X的int啟動(dòng)子、和pBR322的(3-內(nèi)酰胺酶基因序列的bla啟動(dòng)子)和可調(diào)控啟動(dòng)子(如lacZ、recA和gal)。編碼序列的核糖體結(jié)合位點(diǎn)上游也可能是表達(dá)所需要的。包含基因構(gòu)建體(如表達(dá)構(gòu)建體)的宿主細(xì)胞在重組產(chǎn)生多肽的方法中是有用的。這4f的方法在所屬領(lǐng)i^中是熟知的(例如見(jiàn)Sambrook等，supra)。該方法通常涉及宿主細(xì)力包在適合于或者有利于本發(fā)明的多肽的表達(dá)或選擇的適合培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。具有選擇標(biāo)記的細(xì)胞也可以在適合于選擇表達(dá)本發(fā)明多肽的宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。表達(dá)本發(fā)明多肽的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞被選擇出來(lái)，并在適合于多肽表達(dá)的條件下對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)?？梢允褂盟鶎兕I(lǐng)域中公知的方法來(lái)從培養(yǎng)基分離和純化表達(dá)的重組多肽，包括硫酸銨沉淀、離子交才奐層才斤、凝月交過(guò)濾、親和層才斤、電泳等(例如，Deutscher，Ed，1990，MethodsinEnzymology,Vol182,GuidetoProteinPurification)。宿主細(xì)胞在由本發(fā)明的表達(dá)多肽產(chǎn)生的產(chǎn)品的生產(chǎn)方法中也是有用的。另一方面，本發(fā)明^是供了預(yù)測(cè)、診斷、或監(jiān)測(cè)受試者的急性心臟病癥(ACD)的方法，該方法包括測(cè)量在ACD發(fā)作或者臨床表現(xiàn)出ACD的兩小時(shí)內(nèi)從受試者獲得的生物樣品中的BNP-SP水平；并且將所述的BNP-SP水平與對(duì)照的BNP-SP水平進(jìn)行比較，其中測(cè)量到的高于對(duì)照水平的BNP-SP水平是ACD的指4i。另一方面，本發(fā)明提供了監(jiān)測(cè)對(duì)受試者的急性心臟病癥(ACD)的治療的反應(yīng)的方法，該方法包括測(cè)量在ACD發(fā)作或臨床表現(xiàn)出ACD的兩小時(shí)內(nèi)從受試者獲得的生物樣品中的BNP-SP水平；并且將所述的BNP-SP水平與對(duì)照的BNP-SP水平進(jìn)4亍比較，其中測(cè)量到的BNP水平對(duì)于對(duì)照水平的變化是治療反應(yīng)的指征。本4頁(yè)i或中已^口，BNP前體(^口proBNP27-102、proBNP27-47)可以;故用于預(yù)測(cè)或"^斷心臟移柏:4非斥事件并將呼吸困難(呼吸短促)的肺部原因和心血管原因相區(qū)別。參見(jiàn)US2005/0244902。因此，其同樣可認(rèn)為BNP-SP可用作基于心臟組織分析的心臟移植排斥的早期標(biāo)記，并且可以將肺病與急性心臟病癥區(qū)別開(kāi)來(lái)。因此，本發(fā)明還4是供了預(yù)測(cè)、-珍斷或監(jiān)測(cè)受試者的心臟移才直排斥事件的方法，該方法包括測(cè)量心臟移才直的兩個(gè)小時(shí)內(nèi)乂人受試者獲得的生物樣品的BNP-SP水平，并且將所述的BNP-SP7jc平與對(duì)照的BNP-SP水平進(jìn)行比較，其中測(cè)量到的高于對(duì)照水平的BNP-SP水平是移植排斥的指征。本發(fā)明還提供了區(qū)別受試者的肺病和急性心臟病癥(ACD)的方法，該方法包4舌測(cè)量在表玉見(jiàn)出病癥的兩小時(shí)內(nèi)乂人受試者獲4尋的生物才羊品中的BNP-SP水平；并將所述的BNP-SP水平與對(duì)照的BNP-SP水平進(jìn)行比較，其中測(cè)量到的高于對(duì)照7jc平的BNP-SP水平是ACD的指征。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明l是供了預(yù)測(cè)、-診斷或者監(jiān)測(cè)受試者的急性心臟病癥(ACD)、心臟移植排斥或ACD/肺病的方法，該方法包括測(cè)量在ACD、移植排斥或ACD/肺病發(fā)作或者臨床表現(xiàn)出ACD、移植排斥或ACD/肺病的最初的兩小時(shí)內(nèi)從受試者獲得生物才羊品中的BNP-SP7jC平。優(yōu)選地，將測(cè)量到的BNP-SP水平與對(duì)照的BNP-SP水平進(jìn)行比較，其中高于對(duì)照水平的BNP-SP水平是ACD或者移植排斥的指征。普通^支術(shù)人員讀者會(huì)理解，基于評(píng)1"介的目的，標(biāo)記物必須與參考值或?qū)φ罩稻哂邢嚓P(guān)性。本文中所使用的對(duì)照可以為個(gè)體或群體，從其中獲得BNP-SP樣品并且確定平均BNP-SP水平。通常，該個(gè)體或群體會(huì)包括普通的健康個(gè)體或者已知未患有ACD、心臟移植排斥或者ACD/肺病的個(gè)體的群體。在多數(shù)個(gè)體中BNP-SP水平在0-15pmol/L之間，平均的乂于照水平是大約10pmol/L?？商?也，可以基于之前測(cè)量的個(gè)體或群體的多個(gè)讀凄t來(lái)評(píng)定對(duì)照水平。對(duì)照水平的另一個(gè)實(shí)例是心臟組織中的BNP-SP和BNP水平之間的比例式測(cè)量。可將受試者的BNP-SP水平與對(duì)照群體的平均BNP-SP水平進(jìn)行比較。心臟對(duì)照群體中的BNP-SP水平可以比正常對(duì)照群體的BNP-SP水平高1.5到34咅，通常為2到34咅或2.5到3倍?？蒦^4戈i也，對(duì)照可以是更早期的來(lái)自同一受試者的讀數(shù)或這樣的讀數(shù)的平均值。對(duì)于特定方法確定合適的對(duì)照和對(duì)照水平在所屬領(lǐng)i或中是熟知的。術(shù)語(yǔ)"在發(fā)作或臨床表現(xiàn)的兩小時(shí)內(nèi)，，的表述包括從在醫(yī)療機(jī)構(gòu)ACD、心臟移賴(lài)j非斥或者未it確或l^f以的ACD/肺病發(fā)作或者臨床表現(xiàn)出ACD、心臟移植排斥或者未診確或疑似的ACD/肺病起1分鐘到120分鐘并包括120分鐘。優(yōu)選地，在從發(fā)作或表現(xiàn)出的一小時(shí)(從1分鐘到60分鐘并包括60分鐘)內(nèi)進(jìn)行測(cè)量，優(yōu)選在發(fā)4乍或者表玉見(jiàn)出的5到45分4中內(nèi)，伊乙選15到40分4中，伊C選20》J35分鐘，或者最優(yōu)地是在25到30分鐘內(nèi)。"高于"對(duì)照或者，對(duì)于對(duì)照的改變或偏離的水平優(yōu)選是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的。如果與對(duì)照水平相比，該水平與對(duì)照水平的差別達(dá)5%或者更多，達(dá)10%或更多，優(yōu)選達(dá)20%或更多，更加優(yōu)選達(dá)50%或更多，則可以認(rèn)為存在相對(duì)于對(duì)照水平或平均對(duì)照水平的更高水平、偏離或改變?；蛘呖梢杂?jì)算統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性為PS0.05。在另外一種替代方式中，可以借助于分析參考限或參考區(qū)間來(lái)確定更高的水平、偏離和改變。這些可以從直覺(jué)評(píng)價(jià)或非參數(shù)方法來(lái)進(jìn)行計(jì)算?？傊?，這些方法a尋0.025和0.975分4立凄t計(jì)算為0.025x(n+l)和0.975(n+l)。這樣的方法在所屬領(lǐng)域中是熟知的23'24。存在對(duì)照中沒(méi)有的標(biāo)記也一皮i人為是更高的水平、偏離或改變。應(yīng)該理解測(cè)量才羊品中的BNP-SP水平的步驟是單個(gè)樣品上的單次測(cè)量，或在多個(gè)樣品上的重復(fù)測(cè)量。因此，在發(fā)作或者臨床表現(xiàn)的最初兩小時(shí)內(nèi)，優(yōu)選在一'J、時(shí)內(nèi)的不同時(shí)間點(diǎn)^f又得的樣品中，測(cè)量可以包4舌BNP-SP的1到20次測(cè)量，4尤選1到10次，4尤選1到5次，4尤選1到3次，4尤選1次或，4尤選2次或3次測(cè)量。在這兩小時(shí)之外，也可以進(jìn)行單一或重復(fù)測(cè)量從而確定BNP-SP水平是否已經(jīng)降<氐到正常對(duì)照水平或心臟對(duì)照水平。在一種伊二選的實(shí)施方式中，該方法包纟舌測(cè)量在發(fā)作或表J見(jiàn)的一小時(shí)內(nèi)所耳又的1個(gè)或2個(gè)沖羊品中的BNP-SP水平，然后為在發(fā)作或表現(xiàn)出或初次測(cè)量BNP-SP水平的2到4小時(shí)內(nèi)，優(yōu)選2到3小時(shí)內(nèi)，測(cè)量1個(gè)或2個(gè)樣品中的BNP-SP水平。如上所述，在發(fā)作或表現(xiàn)出的最初2小時(shí)內(nèi)測(cè)量到的BNP-SP水平通常比正常對(duì)照中測(cè)量到的BNP-SP水平高4到l(H咅，一l殳高5到8倍。如上所述，凈爭(zhēng)定范圍4到9倍、4到84咅、4到74告、4到64咅、4到54咅、5到1(M咅、5到9倍、5到8倍、5到74咅、5至ij64咅、6至'J10倍、6至)J9倍、6至'j8倍.6至'j74咅、7至)』10倍、7至'j9<咅、7至'」8倍、8至i」10倍、8至ij94咅、^乂^9至'j10倍也包4舌在這個(gè)范圍內(nèi)。在另一種實(shí)施方式中，樣品BNP-SP水平在20到300pmol/L>范圍內(nèi)，<尤選25至'J250pmol/L,<尤選30至U180pmol/L,4尤選35至U150pmol/L，^尤選40至'J120pmol/L,優(yōu)選40至'J90pmol/L,^C及優(yōu)選45到80pmol/L是ACD、心臟移植排斥的指征，或者將ACD與月申病區(qū)別開(kāi)來(lái)。^口上所述，該范圍還包4舌在例如20到180pmol/L、50到200pmol/L、40至'J130pmol/L、50至)J100pmol/L、45至U160pmol/L等范圍內(nèi)的任意值。生物才羊品可以為BNP-SP可以存在或分泌BNP-SP的任意生物材泮牛。其包括^f壬4可的組織或體液，例如血液、p垂液、間質(zhì)液、血清、血漿、尿、心包液和腦脊液，^旦不限于此。優(yōu)選地，該生物樣品是循環(huán)生物才羊品，例如血液、血清或血漿。在一種實(shí)施方式中，該生物才羊品是心臟纟且織。樣品中標(biāo)記物的存在和它們的表達(dá)水平可以基于本文所纟是供的標(biāo)記物序列，才艮據(jù)本領(lǐng)域中已知的方法來(lái)確定，如DNA印跡法、RNA印記法、FISH或定量mRNA轉(zhuǎn)錄的定量PCR[(Thomas,Pro.NAH，Acad.Sci.USA77:5201-52051980),(JainKK，MedDeviceTechnol.2004年五月；15(4):14-7)]、斑點(diǎn)印跡法、(DNA分析)或使用合適的標(biāo)記探針的原位雜交。因此，本發(fā)明還提供了檢測(cè)樣品中的本發(fā)明的核酸分子的存在的分才斤方法，該方法包i舌(a)使樣品與在嚴(yán)格雜交條件下與該核酸序列雜交的多核苷酸探針接觸；以及(b)4企測(cè)樣品中雜交復(fù)合物的存在。優(yōu)選該雜交探針是標(biāo)記的探針。標(biāo)記(label)的實(shí)例包括熒光、化學(xué)發(fā)光、放射酶和生物素-親和素標(biāo)記。通過(guò)如上文所述那些本領(lǐng)域已知的方法來(lái)標(biāo)記該標(biāo)記的揮:針和并<吏其可—見(jiàn)化。為了方便，可將核酸探針固定在固體支持物上，該固體支持物包括樹(shù)脂(例如聚丙烯酰胺)、碳水化合物(例如瓊脂糖)、塑料(例如聚-灰酸酯)和乳力交孩U求。如上文所討論的，核酸分子探針可以?xún)?yōu)選為RNA、cDNA或DNA分子。優(yōu)選的探針包括SEQIDNO:14、16、18、20和22。嚴(yán)才各雜交條件是如上文所討論的。核酸標(biāo)記物的表達(dá)水平可以利用本領(lǐng)域已知的技術(shù)來(lái)確定，如RT-PCR和包括SDS-PAGE的電泳^支術(shù)。利用這些技術(shù)來(lái)擴(kuò)增受試者樣品中的本發(fā)明核酸分子的DNA或cDNA序列，并且測(cè)量DNA或cDNA或RNAK平。在一種可^,^的方法中，可以直^妻測(cè)量沖羊品中的DNA或cDNA或RNA7K平而不進(jìn)^亍擴(kuò)增。目前優(yōu)選的方法是RNA印記雜交分析。RNA印記雜交分析中使用的探針可以基于本文所確定的標(biāo)記物序列來(lái)制備。探針優(yōu)選包4舌至少12、至少15、至少18、至少24、至少30、至少36,伊C選至少42,優(yōu)選至少51,優(yōu)選至少60,優(yōu)選至少70或更多的參考序列的相鄰沖亥苷酸?？商娲兀梢岳梅崔D(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)分析使用特異于該核酸序列的引物來(lái)測(cè)量表達(dá)水平。如果需要的話(huà)，可以參照對(duì)照核酸分子來(lái)進(jìn)行樣品中標(biāo)記物水平的比舉支，對(duì)照核酸分子的表達(dá)與被測(cè)量的參數(shù)和條件無(wú)關(guān)。對(duì)照核酸分子是指在紊亂或移植排斥狀態(tài)和健康狀態(tài)下，其水平?jīng)]有差異的分子。對(duì)照分子水平可以被用估文比較群體中的標(biāo)準(zhǔn)化水平。這樣的對(duì)照分子的一個(gè)實(shí)例是GAP-DH。本發(fā)明的標(biāo)記物的7K平會(huì)隨著病癥改變而改變。在一種實(shí)施方式中，測(cè)量的步驟包括檢測(cè)BNP-SP與選4奪性結(jié)合BNP-SP的結(jié)合劑或其片斷或變異體之間的結(jié)合。優(yōu)選地，該結(jié)合劑與生物事件的其他標(biāo)記物(更具體地是BNP和NT-BNP)之間的交叉反應(yīng)性較低。結(jié)合劑優(yōu)選為抗體或其片斷。本發(fā)明還涉及這樣的抗體，或抗體的片斷。結(jié)合BNP-SP的抗體或其片斷或變異體可以是任何形式，包括所有類(lèi)型的多克隆抗體、單克隆抗體、單《連抗體、人類(lèi)抗體、人化抗體和由基因重組產(chǎn)生的嵌合抗體。還包4舌通過(guò)用BNP-SP或其片斷或變異體免疫動(dòng)物(如小鼠、大鼠或家兔)而獲得的抗血清。這里也可以使用抗體片斷或經(jīng)l多飾的抗體，只要其結(jié)合BNP-SP或其片斷或變異體即可?？贵w片斷可以為Fab、F(ab')、F(ab'),以及Fc或Fv片斷或單鏈Fv(scFv)，其中通過(guò)合適的連4妄子將H和L鏈的Fv片斷連4妄起來(lái)(Hustonetal.Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-83(1988))?？贵w的"Fc"部分表示免疫球蛋白重鏈的部分，其包括一個(gè)或多個(gè)重鏈恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域；CH1、CH2和CH3，但是不包括重鏈可變區(qū)。制備抗體的方法是本領(lǐng)i或中/^知的(參見(jiàn)例如Harlow和Lane(1998)。11最常^f吏用的抗體是通過(guò)免疫合適的宿主哺乳動(dòng)物來(lái)產(chǎn)生的。包括BNP-SP的融合蛋白質(zhì)可以被用作免疫原?？梢酝ㄟ^(guò)與多種分子結(jié)合來(lái)^f奮飾抗體，如聚乙二醇(PEG)。經(jīng)》務(wù)飾的抗體可以通過(guò)化學(xué){多飾抗體來(lái)獲得。這些^f奮飾方法在本領(lǐng)J:或中是常規(guī)使用的?？商娲兀贵w可以作為來(lái)自非人抗體的可變區(qū)和來(lái)自人類(lèi)抗體的恒定區(qū)之間的嵌合抗體，或者作為包括來(lái)自非人抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)、來(lái)自人類(lèi)抗體的骨架區(qū)(FR)和恒定區(qū)的人^f匕抗體來(lái)獲得。這樣的抗體可以利用本4頁(yè)i或已知的方法來(lái)制備。簡(jiǎn)言之，制備多克隆抗體的方法對(duì)于普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是公知的。多克隆抗體可以通過(guò)，例如一次或多次注射免疫劑和佐劑(如果需要)而在哺乳動(dòng)物中獲得。通常，該免疫劑和/或佐劑通過(guò)多次皮下注射或腹月莫內(nèi)注射而注入到哺乳動(dòng)物體內(nèi)。免疫劑可以包括「BNP-SP或其片斷或變異體或它們的融合蛋白。將該免疫劑結(jié)合到已知對(duì)要被免疫的哺乳動(dòng)物的免疫原性蛋白上可能是有用的。這樣的免疫原性蛋白包括，但不限于鑰孔戚血藍(lán)素(keyholelimpethemocyanin，KLH)、牛血清白蛋白、牛曱狀^J求蛋白和大豆月夷蛋白酶抑制劑?？梢允褂玫淖魟┑膶?shí)例包括弗氏完全佐劑(Freund'scompleteadjuvant,FCA)和MPLTDM佐劑(單石粦酸類(lèi)脂質(zhì)A、合成的海藻糖二霉菌酸酯)。免疫試-驗(yàn)方案可以由所屬領(lǐng)域的普通才支術(shù)人員來(lái)選擇而不需要過(guò)度實(shí)驗(yàn)?？梢岳盟鶎兕I(lǐng)域中熟知的雜交瘤方法來(lái)制備單克隆抗體。參見(jiàn)例如Kohler和Milstein,197512以及US4,196,265。雜交瘤細(xì)月包可以在合適的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，可替代地，該雜交瘤細(xì)胞可以在體內(nèi)(如哺乳動(dòng)物的腹水中)生長(zhǎng)。優(yōu)選的永生化細(xì)胞系是鼠骨髓瘤細(xì)胞系，其可以從例如美國(guó)弗吉尼亞州的美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心(ATCC)獲得。免疫測(cè)定可以被用于篩選分泌感興趣的抗體的永生4匕細(xì)月包系。BNP-SP或其片斷或變異的序列可以用于篩選。因此，本文中還關(guān)注能夠分泌BNP-SP特異性單克隆抗體的永生4匕細(xì)月包系的雜交瘤細(xì)月包。確定由雜交瘤細(xì)力包產(chǎn)生的單克隆抗體的結(jié)合特異性的7>知方法包纟舌免疫沉淀反應(yīng)、》丈射免疫分一斤法(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)和蛋白質(zhì)印跡法(Westernblot)(Lutzetal.,Exp.Cell.Res.175:109-124(1988))?？梢灶?lèi)似地從被免疫動(dòng)物的樣品篩選多克隆4元體的存在。為了方侵j全測(cè)，在這里可以用可4企測(cè)到的標(biāo)i己物來(lái)標(biāo)記抗體和片斷，如熒光、生物發(fā)光、和化學(xué)》文光的化合物，以及》文射性同位素、》茲J朱和親和性才示i己(例如，生物素和親和素)?？梢赃M(jìn)4亍結(jié)合的間接測(cè)量的標(biāo)記的實(shí)例包括其底物可4是供有色熒光產(chǎn)物的酶，合適的酶包括辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶、乙碌^磷脫氫酶等。熒光染料(例如，德克薩斯紅、熒光素、藻膽蛋白和藻紅蛋白)可以與熒光激活細(xì)胞分類(lèi)器一起使用。標(biāo)記技術(shù)在所屬領(lǐng)域中是熟知的?？梢酝ㄟ^(guò)常^L的免疫5求蛋白純化程序來(lái)/人培養(yǎng)基或腹水分離或純化細(xì)胞分泌的單克隆抗體，如蛋白A瓊脂糖凝膠法、羥磷灰石色i普法、凝月交電>承》去、透沖斤法或親和色^普法。可以通過(guò)重組DNA法(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利第4，816，567號(hào))來(lái)產(chǎn)生單克隆4元體或片斷。DNA^f"飾，例如用人重鏈和輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域的編碼序列代替同源鼠序列(上述美國(guó)專(zhuān)利第4,816,567號(hào))也是可能的。該抗體可以是單價(jià)抗體。制備單價(jià)抗體的方法在所屬的領(lǐng)域中是熟知的。在本文中也可以考慮產(chǎn)生嵌合二^介抗體。本發(fā)明的抗體還可以包括人化抗體或人類(lèi)抗體。人化抗體包括人免疫球蛋白，其中來(lái)自受體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的殘基4皮來(lái)自非人類(lèi)的CDR所替代。來(lái)自非人類(lèi)源(如兔、大鼠和小鼠)的人化抗體的產(chǎn)生是熟知的。13'14'15還可以利用各種本領(lǐng)^或中已知的方法來(lái)產(chǎn)生人類(lèi)抗體，包括噬菌體展示文庫(kù)16;和砵爭(zhēng)基因法，參見(jiàn)例如Neuberger199617和Vaughan等，199818。雙特異性抗體也是有用的。這些抗體是對(duì)至少兩種不同的抗原具有結(jié)合特異性的單克隆抗體，優(yōu)選是人類(lèi)抗體或者人化抗體。例如，BNP-SP或其變異體或片斷，以及選自preproBNP、BNP、CK-MB、TnT、Tnl和肌紅蛋白的抗原。本文也考慮具有多于兩種特異性的抗體，例如三特異性抗體。制造雙特異性抗體的方法是所屬領(lǐng)i或/厶知的。參見(jiàn)例如Milstein和Cudlo198319、Suresh等，198620和Brennan等，198521。被抗體選擇性結(jié)合的BNP-SP是上文所討論的BNP-SP或其抗原變異體或片斷。理想的是，抗體結(jié)合BNP-SP的N末端或C末端。結(jié)合劑選擇性結(jié)合特異性抗原多肽的實(shí)例包括BNP-SP(l-lO)SEQIDNO:13、BNP-SP(1-17)SEQIDNO:15、BNP-SP(12-23)(SEQIDNO,17)、BNP-SP(17-26)SEQIDNO:19和BNP-SP(l-26)SEQIDNO.21?？梢酝ㄟ^(guò)所屬領(lǐng)域中已知的方法來(lái)檢測(cè)BNP-SP的結(jié)合，包括特異性的(基于抗體)和非特異性的(如HPLC固相)。最常用的是，使用如上文所^提到的如ELISA或RIA的分析方法來(lái)檢測(cè)本文的抗體。單獨(dú)4吏用竟?fàn)幮越Y(jié)合測(cè)定、夾心測(cè)定法、非竟?fàn)幮詼y(cè)定、熒光免疫測(cè)定、免疫熒光測(cè)量測(cè)定法、或免疫》文射測(cè)定、發(fā)光測(cè)定、化學(xué)發(fā)光測(cè)定和質(zhì)譜分析這樣的表面增強(qiáng)的激光解吸離子化(SELDI)、電噴射離子化(ESI)、基質(zhì)輔助的激光解吸離子化(MALDI)、傅里葉變換離子回旋加速器共振質(zhì)i普分析(FTICR),或與非特異性結(jié)合劑(例如層析試劑)組合使用也是可行的。方便地，可將抗體固定于固體基底以便于清洗和分離BNP-SP/抗體復(fù)絡(luò)合物。可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的纟支術(shù)將抗體結(jié)合于固體支持4勿。參見(jiàn)侈寸^口《HandbookofExperimentalImmunology》，第4版，BlackwellScientificPublications,Oxford(1986)?？梢杂糜赹元體的固體基底包括玻璃、尼龍、紙和塑料。類(lèi)似地，可將BNP-SP吸附于固體基底上，該固體基底例如是可選地被離子交換材料、反相材料(例如C18涂層)或其他材料涂覆的或由它們衍生的吸附劑硅石、或樹(shù)脂顆粒、或二氧化硅片。該基底可以是珠狀、片狀、管狀、條狀或生物芯片的形式?？稍O(shè)定位置和精確微量滴定度的生物芯片或片材尤其有用。還優(yōu)選使用多重系統(tǒng)，其中，含有指向多重分析物的抗體的珠狀物被用于測(cè)量單個(gè)樣品中分析物的水平。待測(cè)量的分才斤物可以包括心臟標(biāo)i己物(cardiacmarker)以及BNP-SP或其變異體和片段。本文中所使用的適合的多重微珠系統(tǒng)(multiplexbeadsystem)是LuminexFlurokineMultianalyteProfiling系統(tǒng)?？贵w分析方法是本領(lǐng)域公知的，參見(jiàn)例如，US5,221,685、US5,310,687、US5,480,792、US5，525，524、US5，679，526、US5,824,799、US5,851,776、US5,885,527、US5,922,615、US5,939,272、US5,647,124、US5，985，579、US6，019，944、US6113,855、US6，143，576,以及對(duì)于未標(biāo)記分析的US5,955,377，以及US5，631,171還參見(jiàn)Zola，MonoclonalAntibodies:AManualofTechniquesppl47-158(CRCPress,Inc1987)、Harlow和Lane(1998)Antibodies,ALaboratoryManual,ColdSpringHarbourPublications,NewYork,以及對(duì)于分析形式和條件參見(jiàn)US2005/0064511，所有上述參考文獻(xiàn)的全文以引用方式結(jié)合于本文作為參考。免疫分析的分析物也是7>知的，除了其他的之外，包括已經(jīng)相吸描述的BeckmanAcess、AbbottAxSym，RocheElecSys和DadeBehringStatus系統(tǒng)。能夠直接或間接檢測(cè)BNP-SP與抗體形成復(fù)合物的結(jié)合。直接檢測(cè)是利用標(biāo)記進(jìn)行的，例如熒光、發(fā)光、放射性核素、金屬、染料等。間接^r測(cè)包括結(jié)合可4企測(cè)的標(biāo)記，例如地高辛或酶(例如辣才艮過(guò)氧化物酶和石咸性A粦酸酶)，以形成標(biāo)記的BNP-SP抗體，然后通過(guò)加入4全測(cè)試劑來(lái)實(shí)施4企測(cè)標(biāo)記的步驟。-束才艮過(guò)氧化物酶例如可以與諸如鄰苯二胺二鹽酸鹽(o-PhenylenediamineDihyhydrochloride(OPD))和過(guò)氧訐匕凈勿的底4勿一起溫育，以產(chǎn)生可測(cè)量吸光度的有色的產(chǎn)物，或與發(fā)光氨和過(guò)氧化物一起鄉(xiāng)合出能夠在發(fā)光計(jì)中測(cè)量的化學(xué)發(fā)光，這是本領(lǐng)i或z厶知的。生物素和地高辛能夠與結(jié)合劑反應(yīng)，該結(jié)合劑與它們強(qiáng)力結(jié)合。例如，蛋白質(zhì)親和素和抗生物素蛋白鏈菌素會(huì)與生物素強(qiáng)力結(jié)合。然后，通過(guò)與蛋白質(zhì)直接反應(yīng)，或通過(guò)利用通?？捎玫慕宦?lián)劑(例如MCS和石灰二亞胺)，或通過(guò)加入螯合劑而將其他可測(cè)量的標(biāo)記共價(jià)結(jié)合或連接于蛋白質(zhì)。通常，通過(guò)例如離心將復(fù)合物乂人未復(fù)合(uncomplexed)的試劑中分離。如果抗體是經(jīng)標(biāo)記的，則復(fù)合物的量會(huì)由4企測(cè)到的標(biāo)記的量得到反映?？商娲?，當(dāng)抗體標(biāo)記的BNP-SP與含未經(jīng)標(biāo)記的BNP-SP生物才羊品一起溫育時(shí)，可以通過(guò)結(jié)合于抗體而標(biāo)i己BNP-SP,并通過(guò)測(cè)量結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記的BNP-SP的減少而在竟?fàn)幮苑治鲋衈r測(cè)BNP-SP。其他的免疫分析法可以用于夾心分析法的樣品。在一個(gè)實(shí)例中，在與抗體4妻觸后，通常在4。C,持續(xù)18至25小時(shí)過(guò)夜，或在25。C,持續(xù)l至2至4小時(shí)，將結(jié)合于結(jié)合劑的經(jīng)標(biāo)記的BNP-SP/人未結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記的BNP-SP中分離。在溶液相測(cè)試中，該分離可以隨著結(jié)合于固相顆粒(例如纖維素或》茲性材料)的抗y球蛋白抗體(二抗)的加入而進(jìn)行。從不同物種中獲得該二抗以用于一抗并結(jié)合該一抗。乂人而所有的一抗經(jīng)由二抗^皮結(jié)合于固相。通過(guò)離心或磁吸《I將這種復(fù)合物從溶液中除去并利用與其結(jié)合的標(biāo)記來(lái)測(cè)量結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記的肽。從游離指示物分離結(jié)合物的其他選擇包4舌形成免疫復(fù)合物，其/人溶液沉淀出來(lái)，通過(guò)聚乙烯二醇或?qū)⒂坞x的經(jīng)標(biāo)記的肽結(jié)合于木炭并通過(guò)離心或過(guò)濾將其從溶液中除去來(lái)實(shí)現(xiàn)抗體的沉淀。分離的結(jié)合物或游離相中的指示物是通過(guò)_渚如上述的方法來(lái)測(cè)量的。竟?fàn)幮越Y(jié)合分析還可以被設(shè)置為固相分析，其早已實(shí)施并且相對(duì)于上述方法而言是優(yōu)選的。這種分析利用具有孔的板(通常稱(chēng)為ELISA或免疫測(cè)定板)、固體微珠或管的表面。一抗吸附或共價(jià)結(jié)合于該板、樣o朱或管的表面，或通過(guò)吸附于或共價(jià)結(jié)合于第二抗y球蛋白或抗Fc區(qū)抗體而間接結(jié)合。將樣品和經(jīng)標(biāo)記的肽(如上所述)一起加入或順序加入到板中并在^f吏抗體與樣品中的BNP-SP和經(jīng)標(biāo)記的肽竟?fàn)幮越Y(jié)合的條件下進(jìn)行溫育。隨后，可抽除未結(jié)合的標(biāo)記的肽并清洗板以除去附著在板上的抗體結(jié)合的標(biāo)記的肽。然后，利用上述4支術(shù)測(cè)量該標(biāo)記的肽。由于特異性、速度以及測(cè)量較大范圍的原因，更加優(yōu)選夾心分析。在這種類(lèi)型的測(cè)定中，對(duì)于BNP-SP過(guò)量的一抗通過(guò)吸附、共價(jià)結(jié)合、或抗Fc或y球蛋白抗體而附著在ELISA板、纟鼓珠或管的壁上，如上文所述用于固相竟?fàn)幮越Y(jié)合分析。使樣品液或提取物與附著于該固相的抗體接觸。由于該抗體過(guò)量，結(jié)合反應(yīng)通常很迅速。BNP-SP的二抗也與一抗同時(shí)或順序溫育。選擇該二抗以結(jié)合于BNP-SP的位點(diǎn)，該位點(diǎn)不同于一抗的結(jié)合位點(diǎn)。這兩種抗體反應(yīng)導(dǎo)致產(chǎn)生BNP-SP的夾心，樣品的BNP-SP^皮兩種抗體加在中間。二抗通常由如上所述用于竟?fàn)幮越Y(jié)合分析的容易測(cè)量的化合物標(biāo)記?？商娲?，可使特異性結(jié)合于該二抗的標(biāo)記的三抗與樣品接觸。在洗4卓未標(biāo)記的材泮牛之后，可以測(cè)量結(jié)合物標(biāo)記的抗體，并通過(guò)竟?fàn)幮越Y(jié)合分析指出的方法進(jìn)行定量化。也可以4吏用浸染測(cè)試法(dipstickassay)。這些測(cè)試是本領(lǐng)i或7^知的。例如可以釆用特異性抗體吸附的諸如金或有色的乳"交顆粒之類(lèi)的小顆粒?？蓪⒋郎y(cè)量的液態(tài)樣品加入到預(yù)先載有顆粒的膜或紙條的一端，并^f吏其沿著膜或紙條遷移。結(jié)合于顆粒的樣品中的抗原改變了顆粒與捕獲位點(diǎn)的結(jié)合能力，其含有諸如抗原或抗體的顆粒的結(jié)合劑，進(jìn)一步沿著膜或紙條遷移。著色顆粒在這些位點(diǎn)的蓄積導(dǎo)致顏色的顯現(xiàn)取決于樣品中竟?fàn)幮钥乖臐舛?。其他的浸染方法也采用使抗體共價(jià)結(jié)合于試紙條或膜條，從而捕獲樣品中的抗原。隨后的反應(yīng)采用結(jié)合于酶(例如辣根過(guò)氧化物酶)的二抗并與底物一起溫育以產(chǎn)生能夠定量樣品中抗原的顏色、熒光或化學(xué)光輸出。正如在以下的實(shí)施例中所探討的，放射免疫分析法(RIA)是一種目前優(yōu)選的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)。在一次RIA中，使》文射標(biāo)記的抗原和未標(biāo)記的抗原與抗體竟?fàn)幮越Y(jié)合。常用的;故射性標(biāo)記物包括125I、1311、3H和"C。方文射免疫分析法涉及BNP-SP與結(jié)合蛋白的特異性抗體和力文射才示記的抗體的沉淀作用，其能夠測(cè)量沉淀物中的經(jīng)標(biāo)i己的抗體的量，該量與才羊品中的BNP-SP的量成比例。可^+fU也，^吏用產(chǎn)生經(jīng)標(biāo)記的BNP-SP和結(jié)合蛋白的未標(biāo)記的抗體。經(jīng)標(biāo)記的BNP-SP的減少與才羊品中的BNP-SP的量成比例。在RIA中，從游離的BNP-SP中分離結(jié)合BNP-SP也是可行的。這會(huì)涉及使BNP-SP/抗體復(fù)合物與二抗一起沉淀。例如，如果BNP-SP抗體復(fù)合物含有兔抗體，則可以使用驢抗兔抗體來(lái)沉淀復(fù)合物并計(jì)算標(biāo)記的量。例如，在LKB中，Gammamaster計(jì)數(shù)器。參見(jiàn)Hunt"a/.，。12本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括測(cè)量ACD、心臟移植排斥、或ACD/肺病的一種或多種非-BNP-SP標(biāo)記物水平?？蓪⑵渌囊环N或多種標(biāo)記物水平與來(lái)自對(duì)照群體的平均對(duì)照水平進(jìn)行比較。測(cè)量水平與平均對(duì)照水平的偏差是ACD或心臟移植排斥的前兆或i貪斷特4i。盡管已經(jīng)描述了本發(fā)明的方法與指征ACD或心臟移植排斥的BNP-SP的高水平或7jc平增加有關(guān)，^f旦在一些事4?；虿“Y中BNP-SP的水平下降也是有可能的。本發(fā)明還測(cè)量低于對(duì)照水平的偏差。這里特別地使用的其他標(biāo)記物包括肌4丐蛋白T、肌4丐蛋白I、肌酸激酶MB、月幾紅蛋白、BNP、NT-BNP、LDH、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、H-FABP、內(nèi)皮縮血管肽、腎上腺髓質(zhì)素、凝乳酶和血管緊張素II1。這些標(biāo)記物在心臟機(jī)能障礙在均有涉及。使BNP-SP水平與其他標(biāo)記物相關(guān)聯(lián)能夠增加對(duì)BNP-SP值的預(yù)測(cè)、i貪斷或監(jiān)測(cè)。在ACD、心臟移植排斥或ACD/肺病的情況下，將BNP-SP標(biāo)記物水平與已知的心臟標(biāo)記物相結(jié)合能夠增加患者輸出的預(yù)測(cè)或診斷值。利用單獨(dú)的測(cè)試樣品可將肽標(biāo)記物的數(shù)目分析能夠同時(shí)進(jìn)行或分開(kāi)進(jìn)行。優(yōu)選同時(shí)進(jìn)行兩個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)形式的測(cè)試。尤其采用多重孩O朱、孩i量測(cè)定或生物芯片系統(tǒng)。孩O朱、測(cè)定或芯片具有"i午多精確(discreet)、經(jīng)常是可定位的位置，包括針對(duì)一種或多種標(biāo)記物(例如BNP-SP)的才元體。該一種或多種才示i己物包4舌一種以上的BNP-SP標(biāo)記物。例如，進(jìn)行N-末端和C-末端的BNP-SP片段的測(cè)試并簡(jiǎn)單測(cè)試結(jié)果組合是有用的。許多其他的這種標(biāo)記物組合也是可行的。US2005/0064511描述了用于本發(fā)明的芯片和技術(shù)。Luminex提供了用于本發(fā)明的多重微珠系統(tǒng)。當(dāng)監(jiān)測(cè)受試者時(shí)，可以隨時(shí)間來(lái)采集生物學(xué)樣品。系列采樣使得標(biāo)記物水平發(fā)生改變，尤其是隨之間而測(cè)量的BNP-SP水平。采樣可以4是供接近于事件開(kāi)始時(shí)間、事件嚴(yán)重程度的信息，相應(yīng)于所采用的治療方案和長(zhǎng)期的預(yù)測(cè)，其治療方案可以〗吏適合的。分析可以在諸如救護(hù)車(chē)、醫(yī)生辦公室、診所、住院期間、門(mén)診、或定期健康檢查過(guò)程中進(jìn)行。本發(fā)明的方法還可以與一種或多種風(fēng)險(xiǎn)因素的分析組合實(shí)施，該風(fēng)險(xiǎn)因素包括，但不限于，年齡、體重、性別和家族病史(例如心臟病)。測(cè)試結(jié)果也可以用于與本發(fā)明的方法相結(jié)合。例如，ECG結(jié)果和臨床檢查。BNP-SP循環(huán)水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著增加、與一種或多種其他的風(fēng)險(xiǎn)因素或測(cè)試結(jié)果可以被用于更精確地診斷或預(yù)測(cè)受試著的病情。本文的方法還可以用于指導(dǎo)治療。例如，以什么沖羊的治療開(kāi)始以及4可時(shí)進(jìn)行治療監(jiān)測(cè)、陽(yáng)性;險(xiǎn)測(cè)或治療不良反應(yīng)(例如抗有絲分裂藥物的心臟毒性)的檢測(cè)，以及如果需要或當(dāng)需要時(shí)根據(jù)結(jié)果調(diào)整治療方案。這可以改善患者的短期、中期和長(zhǎng)期效果。對(duì)于指導(dǎo)治療，參見(jiàn)Troughton""/8。急性心臟病癥申請(qǐng)人已經(jīng)示出了全長(zhǎng)BNP-SP分子(1-26)的濃縮物及其各種片段與急性心臟病癥的關(guān)聯(lián)。此外，在患者疑似為急性心肌梗塞(AMI)的情況下在臨床表現(xiàn)后BNP-SP水平達(dá)到最高?；颊弑憩F(xiàn)急性心臟病癥，并且尤其〗吏進(jìn)^于心臟缺血可能會(huì)經(jīng)歷或不經(jīng)歷隨后的心肌梗塞(MI)。不表現(xiàn)MI的組不能利用目前的臨床技術(shù)和標(biāo)記物進(jìn)行簡(jiǎn)單診斷。因此，申請(qǐng)人第一次提出有用的早期和特異性標(biāo)i己物，以用于與MI有關(guān)的心月幾損傷。這可以允"i午進(jìn)^f亍由于不良事件(AE)導(dǎo)致的心肌損傷的早期診斷并允許醫(yī)生將這樣的情況與其他急性冠狀動(dòng)脈綜合征以及導(dǎo)致胸痛的其他原因區(qū)分開(kāi)。例如心絞痛、胃腸疾病、肺部/胸膜病癥等。這顯著縮短了目前需經(jīng)歷的6小時(shí)到12小時(shí)窗口期，以等待目前的心臟生物標(biāo)記物(包括^幾紅蛋白、CK-MB、TnT和TnI)水平評(píng)價(jià)。因此，可以盡早地實(shí)施更為精確的診斷和治療，以減少發(fā)病率和死亡率并得到更好的預(yù)后效果。本發(fā)明尤其用于監(jiān)測(cè)對(duì)于心臟患者的再灌注治療。再灌注治療通常包括經(jīng)皮冠狀介入(例如血管成形術(shù))和/或藥理學(xué)的治療。藥理學(xué)治療中通常采用用于血管成形術(shù)中的溶栓藥。輔助療法包括抗凝血和抗血小板的治療。在診斷后盡快使用再灌注治療是最有效的。加速i貪斷的BNP-SP測(cè)試允許迅速引入再灌注治療。也可以通過(guò)重復(fù)測(cè)試來(lái)監(jiān)測(cè)治療的有歲文性并適當(dāng)調(diào)整治療。乂于于再灌注治療的綜述'性^H侖參見(jiàn)Braunwald"。1心臟病本發(fā)明的方法還可以用于診斷或預(yù)測(cè)受試者的心臟病。申i青人已經(jīng)示出了患有進(jìn)4亍心臟病的患者體內(nèi)的BNP-SP水平在心臟事件之后的6周仍然在升高。類(lèi)似地，可預(yù)測(cè)患有心臟病或具有同樣風(fēng)險(xiǎn)的患者會(huì)表現(xiàn)出高于對(duì)照群體中的平均對(duì)照水平的BNP-SP水平。除了BNP之外，申請(qǐng)人還示出了BNP-SP水平不受群體年齡的影響。這表明BNP-SP作為一種心臟病的標(biāo)記物具有廣泛的應(yīng)用。心婦植排斥本發(fā)明還可用于通過(guò)在利用BNP-SP測(cè)量的移植過(guò)程中或移植后實(shí)施常失見(jiàn)的活組織#企查來(lái)監(jiān)測(cè)心臟移植(通常是心臟的同種異體移植)的排異反應(yīng)。在心臟移植的兩小時(shí)內(nèi)測(cè)量BNP-SP水平相對(duì)于對(duì)照水平的增加可以預(yù)測(cè)或診斷排異反應(yīng)的發(fā)生。本發(fā)明還提供了獲得自在ACD、心臟移植排斥、或ACD/肺病發(fā)作或臨床表現(xiàn)出ACD、心臟移植排斥、或ACD/肺病的兩小時(shí)內(nèi)從受試者獲得的生物樣品中的BNP-SP測(cè)試，該測(cè)試包括利用已知方法檢測(cè)和測(cè)量樣品中的BNP-SP水平。優(yōu)選地，該測(cè)試是體外測(cè)試。這樣的方法包括上述的所有已知分析技術(shù)和凝膠電泳技術(shù)、蛋白質(zhì)印跡法、氣相色語(yǔ)法、原子力顯微鏡、表面等離子體共振、質(zhì)i普法，^f旦不限于此。在測(cè)試的一種實(shí)施方式中，包括一種或多種結(jié)合于一種或多種本發(fā)明的BNP-SP核酸序列的核酸序列?？梢杂赡郯l(fā)明的序列來(lái)設(shè)計(jì)較大范圍的有義和反義探針和引物。利用上述的本領(lǐng)域中已知的技術(shù)來(lái)確定BNP-SP序列的表達(dá)水平。該測(cè)試可以采用固相基底(例如，美國(guó)專(zhuān)利第5,744,305所描述的"芯片")或硝化纖維素膜。由本文的BNP-SP標(biāo)記物所表達(dá)的蛋白質(zhì)也可用于測(cè)試，并且將其結(jié)果與在正常對(duì)照樣品中表達(dá)的相同蛋白質(zhì)的表達(dá)水平相比較。利用本領(lǐng)域中已知和本文中所討論的技術(shù)來(lái)評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)的存在和量。優(yōu)選利用BNP-SP與結(jié)合劑(例如本發(fā)明的抗體)的結(jié)合來(lái)枱r測(cè)樣品中BNP-SP的存在并測(cè)量所存在的結(jié)合BNP-SP的量。如上所述，選擇用于BNP-SP(包括變異及其片段)的抗體形成了本發(fā)明的另一方面，并且可以通過(guò)上文所討i侖的4支術(shù)來(lái)制備該抗體。該抗體可用于本發(fā)明的方法和測(cè)試中。在另一方面，本發(fā)明4是供了用于預(yù)測(cè)、it斷或監(jiān)測(cè)急性心臟病癥(ACD)、心臟移植排斥或者ACD/肺病的包括本發(fā)明的BNP-SP結(jié)合劑的試劑盒，其中該試劑盒用于與在ACD、心臟移植排斥或ACD/肺病發(fā)作或者臨床表現(xiàn)出ACD、心臟移才直排斥或ACD/肺病的兩小時(shí)內(nèi)/人受試者獲得的生物樣品一起使用。本發(fā)明還提供了預(yù)測(cè)、i貪斷或者監(jiān)測(cè)急性心臟病癥(ACD)的包4舌本發(fā)明的結(jié)合劑的試劑盒，其中將該試劑盒4交準(zhǔn)以測(cè)量在0.1pmol/L至)j500pmol/L，<尤選1pmol/L亞)J400pmol/L,<尤選10pmol/L到350pmol/L,4尤選20pmol/L到300pmol/L，優(yōu)選25pmol/L至'J250pmol/L,優(yōu)選30pmol/L到180pmol/L,優(yōu)選35pmol/L到150pmol/L、優(yōu)選40pmol/L到120pmol/L的范圍內(nèi)的BNP-SP水平。可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的技術(shù)來(lái)進(jìn)行測(cè)試的校準(zhǔn)，例如利用具有已知BNP-SP水平的血液樣品，或在測(cè)量過(guò)程中進(jìn)行常規(guī)校準(zhǔn)的一系列才交準(zhǔn)。參見(jiàn)例^口US6,780,645。該試劑盒對(duì)于測(cè)量生物才羊品中的BNP-SP水平是有用的。檢測(cè)的試劑可以是互補(bǔ)于BNP-SP的寡核苷酸序列或BNP-SP標(biāo)記物的片段，或結(jié)合于由該標(biāo)記物編碼的的試劑所包封。該固態(tài)基質(zhì)或基底可以是上文所述的孩i珠、一反、管、浸染條、試紙或生物芯片。檢測(cè)試劑包括清洗試劑和能夠檢測(cè)結(jié)合抗體(例如二抗)的試劑，或能夠與標(biāo)^己的抗體反應(yīng)的試劑。該試劑盒還方^f更地包括對(duì)照試劑(陽(yáng)性和/或陰性試劑)和/或用于檢測(cè)和核酸或抗體的手段。試劑盒中還可以包括使用說(shuō)明，例如急性心臟病癥(ACD)、心臟移植排斥或者ACD/肺病發(fā)作后或表3見(jiàn)出急4生心臟病癥(ACD)、心臟移才直4非斥或者ACD/肺病的兩小時(shí)內(nèi)乂人受^式者體內(nèi)獲耳又生物才羊品，測(cè)量該樣品中的BNP-SP水平，與對(duì)照水平進(jìn)行比較并將結(jié)果于心臟狀態(tài)相聯(lián)系。通常，來(lái)自對(duì)照的BNP-SP標(biāo)記物水平的增加是ACD或心臟移植排斥、或ACD/肺病的指征。更通常地，如本領(lǐng)域/>知的，將該試劑盒安排為用于本領(lǐng)域中7>知的測(cè)試，并且更通常地，用于PCR、RNA印跡雜交或DNA印跡ELISA分析。該試劑盒也可以包4舌一種或多種用于其j也ACD或心臟移植j非斥、或ACD/肺病的標(biāo)"i己物。在ACS的情況下，該其^^示記物可以包括肌4丐蛋白T、肌釣蛋白I、肌酸激酶MB、肌紅蛋白、BNP、NT-BNP、LDH、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、H-FABP、內(nèi)皮縮血管肽、腎上腺髓質(zhì)素、凝乳酶和血管緊張素II中的一種或多種。在一種實(shí)施方式中，所有這些標(biāo)記物都包括在試劑盒中。該試劑盒可由一種或多種內(nèi)含物組成，且還可以包4舌收集裝置，例如瓶、袋(例如靜脈輸液袋)、管形瓶、注射器和試管。至少一個(gè)容器用來(lái)盛裝對(duì)于預(yù)測(cè)、-珍斷或監(jiān)測(cè)ACD(尤其是ACS)、移才直排斥、或ACD/肺病有效的產(chǎn)物。該產(chǎn)物通常是本發(fā)明的核酸分子、多肽或結(jié)合劑、或包括它們的組合物。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，說(shuō)明書(shū)或標(biāo)簽、或與容器聯(lián)合而指示了該組合物被用于預(yù)觀'j、診斷或監(jiān)測(cè)ACD(尤其是ACS)、移植排斥、或ACD/肺病。其他組件可以包括針頭、稀釋劑和緩沖液。通常，該試劑盒可以包4舌至少一個(gè)包含藥用緩沖液(例如磷酸鹽緩沖鹽水、林格式溶液和葡萄糖溶液)的容器。試劑盒中期望包括選擇性結(jié)合BNP-SP的結(jié)合劑。優(yōu)選地，該結(jié)合劑是抗體。在分析和試劑盒中使用的該抗體可以是單克隆抗體或多克隆抗體，并且可由上述4壬4可哺乳動(dòng)物來(lái)制備。該4元體4尤選4十對(duì)編碼的天然肽來(lái)制備或由本發(fā)明的BNP-SP核酸序列、BNP-SP(1-26)、或基于其合成的肽來(lái)指征，或可以針對(duì)融合至編碼本發(fā)明的BNP-SP肽的4亥酸序列的外源性序列來(lái)產(chǎn)生。在一種試劑盒的實(shí)施方式中，將BNP-SP沖企測(cè)試劑固定于固體基質(zhì)(例如多孔條)上，以形成至少一個(gè)BNP-SP檢測(cè)位點(diǎn)。多孔條的測(cè)量或檢測(cè)區(qū)域可以包括多個(gè)檢測(cè)位點(diǎn)，這樣的檢測(cè)文典含有BNP-SP4企測(cè)_逸劑。該4立點(diǎn)可以呈條^1犬、交叉或點(diǎn)狀或其他安4非。測(cè)試條還可以含有用于陰性和/陽(yáng)性對(duì)照的位點(diǎn)?？商鎊;也，該乂于照位點(diǎn)可以在不同的條上。不同的沖企測(cè)位點(diǎn)可以含有不同量的固定的核酸或抗體，例如，在第一檢測(cè)位點(diǎn)的量較大而在隨后的檢測(cè)位點(diǎn)的量4交小。加入測(cè)試生物樣品后，顯示了可4企測(cè)信號(hào)的位點(diǎn)凄t目揭二供了樣品中存在的BNP-SP的量的定量指征。該試劑盒還可以包括用于樣品分析的裝置，包括裝有適當(dāng)組分(標(biāo)記物、抗體和試劑)以實(shí)施樣品測(cè)試的一次性測(cè)試藥液筒。該裝置方便地包括測(cè)試區(qū)和測(cè)試結(jié)果窗口。免疫色譜法藥筒是這樣的裝置的實(shí)例。參見(jiàn)例如US6,399,398、US6,235,241和US5,504,013?？商娲兀撗b置可以是電子裝置，允許輸入、儲(chǔ)存并針對(duì)對(duì)照水平和其他標(biāo)記物水平來(lái)評(píng)價(jià)測(cè)量到的標(biāo)記物的7K平。US2006/02343154是供了這樣的裝置的實(shí)例。在本i兌明書(shū)，參考文獻(xiàn)4皮制成專(zhuān)利i兌明書(shū)、其4也外部文件、或其他信息資源，這通常是出于提供討論本發(fā)明的特征的目的。除非特別指出，所參考的這些外部文件不能被解釋為接受這些文件；或這樣的信息資源，在任何管轄權(quán)區(qū)域內(nèi)是現(xiàn)有4支術(shù)，或形成本領(lǐng)域普通知識(shí)的一部分?，F(xiàn)在將參考以下實(shí)施例以非限制性的方式舉例i兌明本發(fā)明。實(shí)施例1方法(UpperSouthRegionalEthicsCommittee)的糸匕準(zhǔn)，并且才艮才居《赫爾辛基宣言》實(shí)施。化學(xué)合成的人BNP信號(hào)肽BNP-SP(l-lO)、BNP-SP(17-26)和BNP-SP(l-26)(SEQIDNO:l)是由Mimotopes(澳大利亞)來(lái)合成的。所有的多爰沖^式劑購(gòu)自BDH和/或Sigma。BNP-SP(17-26)由C-末端用半胱氨酸延伸而合成以用于方向性載體(directionalcarrier)結(jié)合。BNP-SP(17-26)也可以用酪氨酰殘基延伸而合成以用于在同樣的肽上進(jìn)行示蹤劑制備。人類(lèi)研究對(duì)健康志愿者進(jìn)行參考范圍研究，在前晚禁食后乂人13位Dfc康志愿者(6位女性，平均年齡43士12歲(年齡范圍為22-60歲)，BMI24.4±3.9kg/m2)體內(nèi)獲得血液樣品。為了分析進(jìn)^f亍性心臟損傷中的BNP-SP濃度，我們研究了10^f立在Christchurch醫(yī)院的冠心病監(jiān)護(hù)室(CoronaryCareUnit)<主院的連續(xù)患者(4位女性，平均年齡70士8歲(年齡59-79歲))在胸痛發(fā)作或有明顯的ST-升高的急性MI癥狀的6小時(shí)內(nèi)，BNP-SP濃度隨血漿肌鈣蛋白T(TnT)升高之后又下降。不包括患有心源性《木克的患者。五〗立患者之前就患有高血脂癥，四位患有高血壓、一位患有早期MI，一位正在接受心肌衰竭治療，以及兩位患有糖尿病。入院時(shí)的治療方法是給予利尿劑(兩位患者)、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(兩位患者)、阿司匹林(兩位患者)、p-阻滯劑(兩位患者)。一位患者已經(jīng)接受經(jīng)皮穿刺冠狀動(dòng)脈成形術(shù)(對(duì)于前壁MI的PTCA)，九位患者4妄受;;容纟全治療。七位患者在《主院期間具有ECG。對(duì)于所有的患者，平均射血分?jǐn)?shù)為54%(范圍為24-75%)。平均住院期為6.6天(范圍為3-15天)。胸痛發(fā)作和靜脈樣品基線圖(時(shí)間0)之間的時(shí)間間隔為3.9±0.3h。將18-口徑(gauge)的靜脈套管插入到前臂靜3永中以用于血液采樣。在入院時(shí)抽耳又靜3永樣品(10ml)到冠心病監(jiān)護(hù)室(時(shí)間0)并隨后對(duì)于^f主院患者在0.5、1、4、8、12、24和72h,對(duì)于門(mén)診患者在l、6和12周抽取靜脈樣品。將樣品置于管中置于水上并在2700g下于+4。C冷藏5分鐘，在用于分析之前將血漿儲(chǔ)存于-80°C。血漿提取在SepPak凈水器(SepPakmanufacturerwaters,前述的美國(guó)藥筒22)上提取所有的血漿樣品，干燥并在RIA和HPLC之前存于-20。C。激素濃度分析才艮據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的制造商試-驗(yàn)方案(RocheDiagnostics)，利用異相免疫測(cè)定在Elecsys2010上利用釕標(biāo)記的生物素基化抗體7于血漿才羊品進(jìn)行TnT、CK-MB和月幾紅蛋白測(cè)試。18利用我們前文所述的測(cè)定方法來(lái)測(cè)量免疫反應(yīng)(IR)的BNP和N-BNP濃度。"利用以下的特異性RIA來(lái)測(cè)量BNP-SP:對(duì)于推定的人BNP-SPIR肽的測(cè)量，我們提出了一種針對(duì)preproBNP(l-26)信號(hào)序列(SEQIDNO:l)的氨基酸17-26的新型的且特異性的RIA。fAntibodygeneration)通過(guò)一般的在室溫下混合將preproBNPQy/5(17-26)結(jié)合于馬來(lái)酰亞胺(malemide)處理的N-e-馬來(lái)酰己酰氧基琥珀酰亞胺酯(N畫(huà)e-maleimidocaproyloxysuccinimideester,EMCS)書(shū)亍生4b6々PBS(pH7.0)中的BSA。用弗氏佐劑將結(jié)合的肽乳化并每隔一個(gè)月皮下注射到2只新西蘭白兔身體的4-5處。在注射12天后將兔》文血以評(píng)價(jià)抗體滴度，直至達(dá)到足夠的水平。對(duì)于RIA，利用抗血清在最終稀釋1:6,000時(shí)確定BNP-SPIR。這種抗血清不具有可用人proBNP(l-13)、proBNP(l-76)、proANP(l-30)、ANP、BNP、內(nèi)皮縮血管肽l、血管緊張素II、尾加壓素II、CNP、proCNP(l-15)、腎上腺髓質(zhì)素、Y尤洛可定I和優(yōu)洛可定II(全部<0.01%)來(lái)4全測(cè)的交叉反應(yīng)'性。嫂/鍵尉4;t才法通過(guò)氯胺T方法將preproBNP2>r25(17-26)石典化并如上文所述在反相HPLC上進(jìn)行純化。所有的樣品、標(biāo)準(zhǔn)樣品、放射性示蹤劑和抗血清溶液在基于鉀的測(cè)試緩沖液中進(jìn)行稀釋。22測(cè)試溫育由100(iL樣品或標(biāo)準(zhǔn)樣品(0-640pmol)人preproBNP(17-26)與100(iL經(jīng)渦流(vortex)并在4。C溫育24小時(shí)的抗血清混合而構(gòu)成。然后加入100(iL示蹤劑(4000-5000cpm)并繼續(xù)在4°C溫育24小時(shí)。最后通過(guò)固相二抗方法(驢抗兔Sac-Cel)來(lái)分離游離的和結(jié)合的免疫反應(yīng)性，并在Gammamaster計(jì)凄史器(LKB，Uppsala，瑞典)上計(jì)數(shù)。高效:^目色i普(HPLC)利用同樣的條件(60%乙腈/0.1三氟乙酸的(TFA)，流速為0.25/ml/分鐘)^f吏血漿4是耳又物在室溫下在TSK-GeIG2000SW肽柱(Toyosoda，東京，日本)上經(jīng)受尺寸排阻HPLC(SE-HPLC)。每隔一分鐘收集流分并使其經(jīng)受BNP-SPRIA。用葡聚糖藍(lán)(Vo)、細(xì)月包色素C(Mr12,400)、大鼠BNP45(Mr5,000)、血管緊《長(zhǎng)素II(Mr1,045)和甘氨酸(Vt)來(lái)校準(zhǔn)SE-HPLC柱，然后在Brownleeds反相HPLC(RP-HPLC)片主(AppliedBiosystems,CA)上用線性洗脫梯度從120/o-48。/。乙腈/0.1o/。TFA,以1ml/分鐘的流速在40分鐘內(nèi)進(jìn)一步表征由SE-HPLC/RIA確定的BNP-SPRIA。每一分鐘收集流分，在空氣流下干燥并使其經(jīng)受關(guān)于SE-HPLC特異性的RIA。利用合成的preproBNP(17-26)來(lái)4交準(zhǔn)RP-HPLC。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表示為平均士SEM。利用？又向ANOVA來(lái)分片斤時(shí)禾呈(time-course)1史據(jù)來(lái)進(jìn)4亍測(cè)試，該雙向ANOVA用于在最小顯著差數(shù)后重復(fù)進(jìn)行測(cè)量。利用一般線性回歸模型來(lái)實(shí)施血漿激素濃度的相關(guān)分析。在所有的分析中，P-值〈0.05被認(rèn)為是顯著的。結(jié)果為了確定人類(lèi)循環(huán)中是否存在衍生自BNP的SP的26個(gè)氨基酸或片,殳，我們開(kāi)發(fā)了一種針對(duì)preproBNP(l-26)(BNP-SP，圖2)的殘基17-26的特異性的放射免疫分析法(RIA)。血漿提取物的稀釋表明與標(biāo)準(zhǔn)曲線的平行性(圖3)以及健康人體內(nèi)的BNP-SP濃度為9.6±2.2pmol/L(n=13)。在健康人體內(nèi)，血液中的BNP-SPIR濃度未表現(xiàn)出與年齡的顯著相關(guān)性(圖4)。然而，當(dāng)血漿BNP-SP水平與其同胞肽BNP和N-BNP相類(lèi)似時(shí)，它們與其他的肽沒(méi)有相關(guān)性(圖5)。通過(guò)反相(RP)和尺寸排阻(SE)高效液相色語(yǔ)(HPLC)進(jìn)行IR血漿BNP-SP的生物化學(xué)檢查表明我們的特異性RIA檢測(cè)一個(gè)或多個(gè)用大約Mr1,000-2,000在SE-HPLC上洗脫的BNP-SP片段，并4妄近于合成Mr1,000-2,000在SE-HPLC在RP-HPLC上的洗脫時(shí)間(圖6)。已經(jīng)確定，IRBNP-SP肽存在于人類(lèi)血漿中，我們測(cè)量了患有AMI(n=10，圖7)的患者體內(nèi)的系列IRBNP-SP濃度。在入院時(shí)觀察到IRBNP-SP的最高濃度并在6周內(nèi)緩慢下降至穩(wěn)定水平。重要的是，平均峰值水平比正常健康志愿者高7倍(范圍為4-12倍)，并在6周內(nèi)保持高3倍。這種圖形的位置與直到入院后24小時(shí)才出現(xiàn)峰值水平的BNP和N-BNP相對(duì)(圖7)。肌紅蛋白的峰值濃度出現(xiàn)在入院后1-2小時(shí)，而在入院后8-12小時(shí)后也不會(huì)出現(xiàn)TnT和CK-MB峰〗直水平。實(shí)施例2為32位臨床上穩(wěn)定的疑似ACS患者插入導(dǎo)管并從多個(gè)器官處獲取血液才羊品這些器官為股動(dòng)脈(FA)、肝靜力永(HV),下腔靜脈(IVC)、心臟冠狀竇靜脈(CS)和肺動(dòng)脈(PA)。將血液收集于冰凍的EDTA管中，通過(guò)離心由血漿制備并將該血漿加入至BNP-SPRJA。圖9清楚地示出了BNP-SP濃度的最高處為CS、靜脈引流心臟，尤其是心室。這有力地證明了心臟是BNP-SP分泌的主要部位，并且與已知的BNP基因表達(dá)圖語(yǔ)一致，在心臟中是最高的。結(jié)論臨床穩(wěn)定的患者體內(nèi)的循環(huán)BNP-SP濃度是心源性的。顯著的心臟分泌與作為心臟激素的BNP-SP相一致。討論這個(gè)證據(jù)首次證明了在患者表現(xiàn)ACD的兩小時(shí)內(nèi)或ACD發(fā)作兩小時(shí)內(nèi)在循環(huán)和胞外空間中存在preproBNP信號(hào)肽。我們示出了第一種實(shí)例，即血液中的BNP-SP測(cè)量可能是急性心肌缺血和/或隨后的損傷的快速生物標(biāo)記物，以及第二種實(shí)例，即在具備作為長(zhǎng)期預(yù)測(cè)和結(jié)果的標(biāo)記物可能優(yōu)點(diǎn)的事件之后進(jìn)行BNP-SP測(cè)量。本領(lǐng)域技術(shù)人員當(dāng)然可以理解，上文的描述是以舉例的方式提供的且本發(fā)明不限于此。64參考文獻(xiàn)1,BraunwaME，ZipesDP,LibbyP,AcutemyocardialinfarctionCfip,35He時(shí)disease:atextbookofcardiovascularmedicine,6*ed.2001,pgs.11144231.2,Richards嵐，NichollsMG,YandleTG，F(xiàn)鵬pt加C，EspinerEA,T咖o:JG，BttttimoreRC,LalnchbaryJG，E招ottIM，IkramH，Cr股ierK3，S邊ytbDW.PlasmaN-term!nalpro-biMnnateiureticpeptideandadrenomedullin:newneuroho加onalpredictorsofleftventricularfonctkmandprognosisaftermyocardialInfarction.CircuM啦l鄉(xiāng)97:1921-1929.'3,JembergT，StridsfeergMVengeP，JLkriahlB.N-temii加IproBrainNatriureticPeptideonadmissionforearlyriskstotificatioaofpatientswithchestpainandnoST-segraeiitelevation,J.Am,Coll.Cardiology20j@240:437~445,4,OmlandT,PerssonA，NgL,OBrienR，KarissonT，HerlitzJ,HartfordM,CaidahlN-tetminalpro-B4ypenatriureticpeptideandlong-termmortalityinacutecoronarysyndromes,Circufation.2002106:2913-2918.5,P咖bertonCJ,JohnsonML,YandteTG,EspliierEA,Dec加volutionAnalysisoftheSecretionandEliminationofCardiacNatriureticPeptidesDuringAcuteVolumeOwrioad,Hypertekm2000;36:355-359,6,RichardsAM,Nic涵sMG，T,ghtonRW,LainchkayJG,ElliottJ,FramptonC,Espi加rEA,Crozier1G，Y旭dteTGTurnerLAntecedenthypertensionandheartfailureaftermyocardialinfercti加.J,Am.CoU.Cardiology,200239:1182-腦.7,TroughtonRW，Prioi*DL，PereiraJJ,MartinM，F(xiàn)ogarty人MoreheadA，YandleTG，RichardsAM，StaritogRC，YoungJB,Tho廳JD，KleinAL,PlasmaB-typenatriureticpeptidelevelsinsystolicheartfailure:importanceofleftventricdardiastolicfimcticmandrightventriodarsystolicfonetion.JAmCollCardioL200443:416-422,8.Troughtcm證，F(xiàn),ptonCMYan迅eTG，^pinerEA,NfcholbMG，RkhapdaAM,Tteatmentofheartfail鵬piidabyplasmaaBMJaO"tenBinalbrainmtri鵬ticpeptide(M-BNP)咖centrati纖Lancet雄355:1126,1130,9.MultipleSequenceAlignmentwiththeQustalseriesofprogramsNucleicAcidsRes(20(B)M(13):3497-500.10.B(rwie，J.U"1,(1990).Deeipeingttiemessageiaft"oteinSequences:ToterancetoAminoAcidSabstituMous,Science247,1306-1310,11,HarbourandLane柳8,Anti)odks:ALaboratoryManual,ColdSpringHarbourPressNewYork.2712,ICohlerandMilsteta1975,continuousCulturesofFusedCdlsSeeredngAntibodyofPredefinedSpecficity,Nature,256,495497.13.VedioeycnM.CMibteio^andGWinterReshapingh,aaantibodies:grafting加actilysozymeactivity.Science1988Mar25;239(4847):1534-6.14,J咖s，P.T.，Dear,P.H,，F(xiàn)oote,J.,Neuberger，M.S.andWinter,G."5—匈co附j(luò)pfewentori0^ie/er柳/旭'wgfeg《'o加Mafowwntw/訪o命wi故f/wwe#0挑a附owe,'，Nature(里986)321:522-525,15,RiechmannL，ClarkM，WaldmannH,WinterG,Resliapingh鵬anantibodiesfortherapy.Nature.1紹8Mar24;332(6162):323-7.16.HoogeoboomHR^WinterG(1992)Humanantibodiesft,synttieticrepertoiresofgermlineVHgenesegmentsreairangedJnvitro,JMoiBiol.1992Sep20;227(2):381-g.17,jVfichaelNeub四'ger(1996)GeneratingWgh-avidityhumanMabsinmice她艦e胸tec/舶fogy14,82618.TristanJ.Vaughan，JaneOsboum&PMlipR-T咖pest(1998)Humanantibodiesbydesign,NatureBkrtechnoto歐16,535-53919.MilsteinandCuelfo983)Theco~ejcpressionoftwoimmimoglotralinheavy-chai函ght"CMnpairs,wherethetwoheavychainsbavfedifferentspecificities,Nature,305:537-539.20.Sirosli，M,R"CueUo,A,C.andMilstein,C.(1986)K-spec迅cmcraocionalantibodiesfromhybridhybrM鵬as.MethodsittEnzymology，121:210-228..21.Breananetal.5"Preparationofbispec迅cantibodiesbychemicalrecombinationofmo加donalimmimoglobulinGlfragments"Sd6nce229:81-8322.HuntPJ,RichardsAM,MchottsMG,YaiidleTG,DoughtyRN,EspinerEA.Immimoreactiveaminotenninalprobrainnatriureticpeptide(NT-proBNP):a加wmarkerofcardiacimpairment.Clin.Endocrinol.199747:287-296.23.TheImraimo鵬ayHandbook.3rtedition,ed.DavidWild,ElsevierLtd,2005.24-SolberH.Approvedrecommendation(1987)onthetheoryofreferencevalues.PartS.StatisticaltreatoentofcoHectedreferencevalues.DeterminaticMiofreferencelimits.JournalofclinicalChemistiyandCi!inicalffioctiemistry198725:645~656.25,BraudVM，AManDSO'Callagh肌CA，SoderstromD'AndreaA，OggGS,LazetfcS,YoungNT,BeUJI,PhillipsJH，LanierLL，McMidiadAJ.HLA-EMudstonaturalkiltercellreceptorsCD斜狐G2A,BandC,Nature1998391:795*799.以上列出的所有參考文獻(xiàn)和引用以及包括專(zhuān)利申請(qǐng)文件全文的說(shuō)明書(shū)以其全文結(jié)合于本文。權(quán)利要求1.一種用于預(yù)測(cè)、診斷或監(jiān)測(cè)受試者體內(nèi)急性心臟病癥(ACD)的方法，所述方法包括測(cè)量獲自所述受試者ACD發(fā)作兩小時(shí)內(nèi)或表現(xiàn)出ACD兩小時(shí)內(nèi)的生物樣品中的BNP-SP水平；以及將所述BNP-SP水平與來(lái)自對(duì)照的BNP-SP水平進(jìn)行比較，其中所測(cè)量到的所述BNP-SP水平高于所述對(duì)照水平是ACD的指征。2.—種用于監(jiān)測(cè)受試者體內(nèi)對(duì)于急性心臟病癥(ACD)治療反應(yīng)的方法，所述方法包括測(cè)量獲自所述受試者ACD發(fā)作兩小時(shí)內(nèi)，或表現(xiàn)出ACD兩小時(shí)內(nèi)的生物樣本中的BNP-SP水平；以及將所述BNP-SP水平與來(lái)自對(duì)照的BNP-SP水平進(jìn)4亍比較，其中所測(cè)量到的BNP-SP7K平相對(duì)于所述對(duì)照水平的改變是對(duì)治療反應(yīng)的指征。3.—種用于預(yù)測(cè)、-珍斷或監(jiān)測(cè)受試者體內(nèi)心臟移植排斥的方法，所述方法包括測(cè)量在心臟移才直兩小時(shí)內(nèi)乂人受試者獲得的生物樣品中的BNP-SP水平，并且將所述BNP-SP水平與來(lái)自對(duì)照的BNP-SP水平進(jìn)行比較，其中測(cè)量到的BNP-SP水平高于所述對(duì)照水平是移植排斥的指征。4.一種區(qū)分受i式者體內(nèi)肺病與急性心臟病癥(ACD)的方法，所述方法包括測(cè)量在表現(xiàn)出所述病癥的兩小時(shí)內(nèi)從受試者獲;彈的生物沖羊品中的BNP-SP水平；并且將所述BNP-SP水平與來(lái)自對(duì)照的BNP-SP水平進(jìn)4亍比4交，其中測(cè)量到的BNP-SP水平高于所述對(duì)照水平是ACD的指征。5.—種用于預(yù)測(cè)、診斷或監(jiān)測(cè)受試者體內(nèi)急性心臟病癥(ACD)、心臟移植排斥、或ACD/肺病的方法，所述方法包括測(cè)量在ACD、心臟移植排斥或ACD/肺病發(fā)作或者臨床表現(xiàn)出ACD、心臟移植排斥或ACD/肺病的最初的兩小時(shí)內(nèi)/人所述受試者獲S尋的生物才羊品中的BNP-SP水平。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，將所述測(cè)量到的BNP-SP7jc平與來(lái)自只f照的BNP-SP7jc平相比4交，其中測(cè)量到的所述BNP-SP水平高于所述對(duì)照水平是ACD或移一直排斥的指征。7.根據(jù)權(quán)利要求l、3、4和6中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述較高的BNP-SP水平表示統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性增加超過(guò)所述對(duì)照水平。8.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述方法是體外方法。9.沖艮據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述BNP-SP水平是在ACD發(fā)作，或臨床表現(xiàn)出ACD、心臟移植排斥或ACD/肺病的最初一'J、時(shí)內(nèi)測(cè)量的。10.才艮據(jù)片又利要求9所述的方法，其中，所述BNP-SP水平是在ACD、心臟移植排斥或ACD/肺病發(fā)作或臨床表現(xiàn)出ACD、心臟移植排斥或ACD/肺病的最初30分鐘內(nèi)測(cè)量的。11.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述BNP-SP水平測(cè)量是重復(fù)進(jìn)行的，優(yōu)選進(jìn)行二至四次測(cè)量。12.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的方法，其中，重復(fù)測(cè)量是在發(fā)作或臨床表現(xiàn)或初次測(cè)量的二到三小時(shí)內(nèi)進(jìn)行的。13.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述樣品中的BNP-SP水平為20到300pmol/L，優(yōu)選25到250pmol/L，優(yōu)選30至)」180pmol/L，4尤選35至)j150pmol/L，4尤選40至'J120pmol/L，優(yōu)選40至'J90,^iL選45至'J80是ACD、或心臟移才ii非斥的指4正，或者爿夸ACD與力申病區(qū)別開(kāi)。14.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述樣品中的BNP-SP水平高于所述對(duì)照水平大約4到10倍是ACD、或心臟移植排斥的指征，或者將ACD與肺病區(qū)別開(kāi)。15.沖艮據(jù)4又利要求14所述的方法，其中，所述樣品中的BNP-SP水平高于所述對(duì)照水平5到8倍是ACD、或心臟移植排斥的指征，或者將ACD與肺病區(qū)別開(kāi)。16.根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述ACD選自由以下急性冠狀動(dòng)脈綜合^正組成的組在ECG上表現(xiàn)出ST段抬高的AMI、不穩(wěn)定心絞痛、以及非ST段抬高M(jìn)I;心臟缺血、急性心臟損傷、由急性藥物中毒引起的急性心肌損害、急性心月幾疾病、以及心臟移才直排斥。17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中，所述ACD是非ST段抬高M(jìn)I。18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中，所述ACD是急性心臟擊夬血。19.根據(jù)權(quán)利要求1至18中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述生物才羊品是血液、血漿、血清、唾液、間質(zhì)液、尿、或心臟組織才羊印o20.根據(jù)權(quán)利要求1至19中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述測(cè)量步驟包括檢測(cè)BNP-SP與選擇性結(jié)合BNP-SP的結(jié)合劑之間的結(jié)合。21.根據(jù)權(quán)利要求1至20中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述結(jié)合劑是抗體或抗體片段。22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中，所述抗體是單克隆抗體、多克隆抗體、或人<匕抗體。23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中，所述結(jié)合劑是單克隆抗體或單克隆抗體片段。24.根據(jù)權(quán)利要求20至23中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述抗體選擇性結(jié)合的所述BNP-SP是BNP-SP或任何抗原片段或它們的變異體。25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中，所述片段的長(zhǎng)度為至少5個(gè)氨基酸。26.根據(jù)權(quán)利要求24或權(quán)利要求25所述的方法，其中，所述抗體結(jié)合BNP-SP的N-末端或C-末端。27.根據(jù)權(quán)利要求24或25所述的方法，其中，所述結(jié)合劑選擇性結(jié)合的所述BNP-SP包4舌選自由BNP-SP(l-lO)(SEQIDNO:13)、BNP-SP(1-17)(SEQIDNO:15)、BNP-SP(3-15)(SEQIDNO:23)、BNP-SP(12-23)(SEQIDNO.17)、BNP-SP(17-26)(SEQIDNO:19)和BNP-SP(1-26)(SEQIDNO.21)組成的組中的4元原月太。28.根據(jù)權(quán)利要求20至27中任一項(xiàng)所述的方法，其中，BNP-SP29.根據(jù)權(quán)利要求1至28中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述BNP-SP水平是利用選自RIA、ELISA、質(zhì)i普法、熒光免疫測(cè)定、免疫萸光測(cè)量法、以及免疫》文射測(cè)定法的測(cè)定方法來(lái)測(cè)量的。30.根據(jù)權(quán)利要求1至19中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述BNP-SP水平是利用質(zhì)譜法來(lái)測(cè)量的。31.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中，所述質(zhì)譜法是SELDI、ESI、MALDI或FTICR。32.根據(jù)權(quán)利要求1至31中任一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括測(cè)量所述ACD、或心臟移植排斥、或ACD/肺病的一種或多種非BNP-SP標(biāo)記物的水平，并將所述水平與來(lái)自對(duì)照的標(biāo)記物水平比較，其中所測(cè)量的水平與來(lái)自所述對(duì)照的水平的偏離與所測(cè)量到的高于BNP-SP的所述對(duì)照水平的BNP-SP水平一起用于所述ACD的預(yù)測(cè)或it斷、或可用于監(jiān)測(cè)所述ACD、心臟移植排斥、或ACD/肺病。33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中，所述非BNP-SP標(biāo)記物選自由肌4丐蛋白T、肌4丐蛋白I、肌酸激酶MB、肌紅蛋白、BNP、NT-BNP、LDH、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、和H-FABP組成的組。34.4艮據(jù)一又利要求32或33所述的方法，其中，所述所測(cè)量的水平與所述對(duì)照水平的偏離包括4交高的測(cè)量到的非BNP-SP標(biāo)記物水平。35.—種用于測(cè)試獲得自受試者的生物樣品中BNP-SP的測(cè)定方法，所述生物樣品獲得自受試者在ACD、心臟移一直排斥、或ACD/肺病發(fā)作的兩小時(shí)內(nèi)，或臨床表現(xiàn)出ACD、心臟移植排斥、或ACD/肺病的兩小時(shí)內(nèi)，所述測(cè)定方法包4舌利用4壬4可已知方法檢測(cè)和測(cè)量所述樣品中的BNP-SP水平。36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的測(cè)定方法，其中，所述測(cè)定方法為體外測(cè)-武。37.才艮據(jù)4又利要求35或斥又利要求36所述的測(cè)定方法，其中，所述樣品中所述BNP-SP的存在是通過(guò)將BNP-SP結(jié)合于選擇性結(jié)合BNP-SP的結(jié)合劑來(lái)4企測(cè)的。38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的測(cè)定方法，其中，所述BNP-SP水平是利用質(zhì)i普法測(cè)量的。39.才艮據(jù)片又利要求38所述的測(cè)定方法，其中，所述質(zhì)i普法是SELDI、ESI、MALDI或FTICR。40.根據(jù)權(quán)利要求37所述的測(cè)定方法，其中，所述BNP-SP水平是利用選自RIA、ELISA、免疫熒光測(cè)定和免疫方文射測(cè)定中的測(cè)定方法來(lái)測(cè)量的。41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的測(cè)定方法，其中，所述測(cè)量包括提供SELDI探針，所述SELDI探針包括附著于基底的BNP-SP抗體；使所述抗體與所述生物樣品接觸；以及利用SELDI測(cè)量結(jié)合的BNP-SP水平。42.—種BNP-SP結(jié)合劑，其選擇性結(jié)合BNP-SP或抗原片段或它們的變異體，以用于預(yù)測(cè)、i貪斷或監(jiān)測(cè)受試者體內(nèi)的急性心臟病癥(ACD)、心臟移植排斥、或ACD/肺病，其中所述ACD、心臟移植排斥、或ACD/肺病的特征在于在獲得自ACD、或心臟移植排斥、或ACD/肺病發(fā)作的兩小時(shí)內(nèi)或臨床表現(xiàn)出ACD、或心臟移植排斥、或ACD/肺病的兩小時(shí)內(nèi)的所述受試者的生物才羊品中出玉見(jiàn)BNP-SP。43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的BNP-SP結(jié)合劑，其中，所述樣品中存在的BNP-SP范圍是20到300pmol/L，^尤選25到250pmoI/L,<尤選30至'J180pmol/L,Y尤選35至U150pmol/L并且優(yōu)選40到120pmol/L。44.根據(jù)權(quán)利要求42所述的BNP-SP結(jié)合劑，其中，所述樣品中存在的BNP-SP的水平比BNP-SP的平均對(duì)照水平高4至10倍。45.—種BNP-SP結(jié)合劑，所述BNP-SP結(jié)合劑選擇性結(jié)合BNP-SP(1-10)(SEQIDNO.13)、BNP-SP(1-17)(SEQIDNO:15)、BNP-SP(12-23)(SEQIDNO.17)或BNP(17-26)(SEQIDNO,19)。46.才艮據(jù)^又利要求42至45中4壬一項(xiàng)所述的BNP-SP結(jié)合劑，其中，所述結(jié)合劑是抗體或抗體片段。47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的BNP-SP結(jié)合劑，其中，所述結(jié)合劑是單克隆抗體、多克隆抗體或人化抗體。48.BNP-SP結(jié)合劑在制造用于評(píng)價(jià)受試者體內(nèi)的急性心臟病癥(ACD)、心臟移植排斥、或ACD/肺病的預(yù)測(cè)、i貪斷或監(jiān)測(cè)的器具中的應(yīng)用，其中所述評(píng)價(jià)是在ACD、心臟移植排斥、或ACD/肺病發(fā)作的兩小時(shí)內(nèi)或臨床表現(xiàn)出ACD、心臟移植排斥、或ACD/月申病的兩小時(shí)內(nèi)實(shí)施的。49.根據(jù)權(quán)利要求48所述的應(yīng)用，其中，所述預(yù)測(cè)、診斷或監(jiān)測(cè)器具詳皮才交〉偉k乂觀'量0.1至'』500pmol/L,4尤選1至i」400pmol/L，^尤選10至)j350pmol/L,4尤選20至ij300pmol/L,<尤選25至)j250pmol/L,^尤選30至'j180pmol/L,<尤選35至'J150pmol/L^乂及優(yōu)選40到120pmol/L范圍內(nèi)的BNP-SP水平。50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的應(yīng)用，其中，所述預(yù)測(cè)、診斷或監(jiān)測(cè)器具凈皮4交準(zhǔn)以測(cè)量比BNP-SP只于照水平高4至10倍的范圍內(nèi)的BNP-SP水平。51.BNP-SP結(jié)合劑在用于預(yù)測(cè)、診斷或監(jiān)測(cè)受試者體內(nèi)的急性心臟病癥(ACD)、心臟移才i^非斥、或ACD/肺病的應(yīng)用，其中，所述預(yù)測(cè)、i貪斷或監(jiān)測(cè)是在ACD、心臟移植排斥、或ACD/肺病發(fā)作的兩小時(shí)內(nèi)或臨床表現(xiàn)出ACD、心臟移植排斥、或ACD/肺病的兩小時(shí)內(nèi)實(shí)施的。52.才艮據(jù)片又利要求51所述的應(yīng)用，其中，所述預(yù)測(cè)、i貪斷或監(jiān)測(cè)是利用如權(quán)利要求1至32中任一項(xiàng)所述的方法來(lái)進(jìn)行的。53.根據(jù)權(quán)利要求48至52中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中，所述結(jié)合劑是如^又利要求42至47中任一項(xiàng)所述的結(jié)合劑。54.—種用于預(yù)測(cè)、診斷或監(jiān)測(cè)急性心臟病癥(ACD)、心臟移植排斥、或ACD/肺病的試劑盒，所述試劑盒包括如權(quán)利要求42至47中任一項(xiàng)所述的結(jié)合劑，其中所述試劑盒用于與獲得自ACD、心臟移植排斥、或ACD/肺病發(fā)作的兩小時(shí)內(nèi)或臨床表現(xiàn)出ACD、心臟移植排斥、或ACD/肺病的兩小時(shí)內(nèi)的受試者的生物樣品一起使用。55.—種用于預(yù)測(cè)、i貪斷或監(jiān)測(cè)急性心臟病癥(ACD)的試劑盒，包括如權(quán)利要求42至47中任一項(xiàng)所述的結(jié)合劑，其中，所述試劑盒^皮才交準(zhǔn)以測(cè)量0.1到500pmol/L,優(yōu)選1到400pmol/L,<尤選105'J350pmol/L,^尤選20$』300pmol/L，4尤選25至)J250pmol/L,4尤選30至'』180pmol/L,優(yōu)選35至)」150pmol/L^乂及優(yōu)選40到120pmol/L范圍內(nèi)的BNP-SP水平。56.根據(jù)權(quán)利要求55所述的試劑盒，進(jìn)一步包括所述結(jié)合劑固定于其上的固相。57.根據(jù)權(quán)利要求54至56中任一項(xiàng)所述的試劑盒，進(jìn)一步包括由獲得自發(fā)作或臨床表現(xiàn)的兩小時(shí)內(nèi)的生物樣品中測(cè)量到的BNP-SP水平用于預(yù)測(cè)、診斷或監(jiān)測(cè)受試者體內(nèi)的ACD、心臟移植排斥、或ACD/肺病發(fā)作或臨床表現(xiàn)ACD、心臟移植排斥、或ACD/月申病的兩小時(shí)內(nèi)的il明。58.—種編碼如權(quán)利要求27所限定的BNP-SP的核酸分子，其中，所述核酸選自U)SEQIDNO:14;(b)SEQIDNO:16;(c)SEQIDNO:18;(d)SEQIDNO:20;(e)(a)到(d)中任一者的補(bǔ)體；(f)能夠在嚴(yán)格條件下與(a)到(e)中任一者的序列雜交的序列，長(zhǎng)度為至少15個(gè)核苷酸，限制條件為所述序歹'J不是ccagtgcacaagctgcttggggaggcgaga或SEQIDNO:22。59.—種基因構(gòu)建體，其包括4又利要求58所述的核酸分子。60.根據(jù)權(quán)利要求59所述的基因構(gòu)建體，其中，所述基因構(gòu)建體是表達(dá)構(gòu)建體。61.—種載體，其包括權(quán)利要求59或權(quán)利要求60所述的基因構(gòu)建體。62.—種宿主細(xì)胞，其包括權(quán)利要求58至61中任一項(xiàng)所述的基因構(gòu)建體或載體。63.—種由^K利要求58的核酸分子編碼的BNP-SP多肽。64.—種BNP-SP多肽，選自(a)SEQIDNO:13;(b)SEQIDNO:15;(c)SEQIDNO:17;以及(d)SEQIDNO:19。65.—種選擇性結(jié)合于權(quán)利要求64的多肽的抗體。66.根據(jù)權(quán)利要求65所述的抗體，其被可4企測(cè)的標(biāo)記物所標(biāo)記。67.—種用于重纟且產(chǎn)生如4又利要求64所述的多肽的方法，所述方法包括以下步驟(a)培養(yǎng)宿主細(xì)胞，其包括能夠表達(dá)權(quán)利要求61的多肽的權(quán)利要求59或權(quán)利要求60的基因構(gòu)建體；以及(b)選4奪表達(dá)本發(fā)明的所述多肽的細(xì)胞；(c)從所述細(xì)胞中分離所述表達(dá)的多肽；以及可選地(d)純化所述表達(dá)的多肽。68.根據(jù)權(quán)利要求67所述的方法，其中，所述方法包括用所述構(gòu)建體轉(zhuǎn)染所述宿主細(xì)胞的預(yù)先步驟。全文摘要本發(fā)明提供了通過(guò)在病癥或者移植排斥發(fā)作或者表現(xiàn)出病癥或者移植排斥之后立刻從受試者獲得的樣品中測(cè)量BNP信號(hào)肽的水平來(lái)預(yù)測(cè)、診斷或監(jiān)測(cè)急性心臟病癥、心臟移植排斥，或?qū)⒓毙孕呐K病癥與肺病區(qū)分開(kāi)的方法。文檔編號(hào)C07K14/705GK101611318SQ200780041474公開(kāi)日2009年12月23日申請(qǐng)日期2007年9月7日優(yōu)先權(quán)日2006年9月7日發(fā)明者克里斯托弗·約瑟夫·彭伯頓,蒂莫西·格蘭特·揚(yáng)德?tīng)?邁克爾·加里·尼科爾斯,阿瑟·馬克·理查茲申請(qǐng)人:奧塔哥創(chuàng)新有限公司