專利名稱：：能中和流感病毒h5n1的人結(jié)合分子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)。特別地，本發(fā)明涉及流感病毒H5N1感染的診斷、預(yù)防和/或治療。
背景技術(shù)：
：流感病毒由三個(gè)類型組成A、B和C。流感病毒A感染多種鳥類和哺乳動(dòng)物，包括人、馬、海洋哺乳動(dòng)物、豬、雪貂和雞。在動(dòng)物中，大多數(shù)流感病毒A導(dǎo)致呼吸道和腸道的輕微局部感染。然而，高致病性流感A毒株如H5N1導(dǎo)致家禽全身性感染，死亡率可達(dá)到100%。感染了流感病毒A的動(dòng)物通常作為流感病毒庫(reservoir)并且一些亞型已經(jīng)示出越過物種屏障而感染人。流感病毒A基于編碼表面糖蛋白的兩個(gè)基因的抗原性區(qū)域中的等位基因變異而可以分成亞型，所述表面糖蛋白即血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)，其為病毒附著和細(xì)胞釋放所必需。其它主要的病毒蛋白包括核蛋白、核殼結(jié)構(gòu)蛋白、膜蛋白(M1和M2)、聚合酶(PA、PB和PB2)以及非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1和NS2)。目前已知流感病毒A的16個(gè)HA亞型(H1-H16)和9個(gè)NA(N1-N9)抗原性變體。先前已知僅三個(gè)亞型在人體內(nèi)循環(huán)(H1N1、H1N2和H3N2)。然而，近年來己經(jīng)報(bào)道了禽流感病毒A的致病性H5N1亞型越過物種屏障并且感染人，導(dǎo)致一些患者的死亡，如1997和2003年在香港的文獻(xiàn)記錄。在人體內(nèi)，禽流感病毒感染呼吸道以及腸道、肝、脾、腎及其它器官的細(xì)胞。禽流感的癥狀包括發(fā)熱、呼吸困難(包括氣短和咳嗽)、淋巴細(xì)胞減少、腹瀉以及血糖水平調(diào)節(jié)困難。與季節(jié)性流感相反，最處于風(fēng)險(xiǎn)中的人群是構(gòu)成人群主體的健康成人。由于某些禽流感病毒A亞型特別是H5N1的高致病性以及經(jīng)證實(shí)的其越過物種屏障感染人體的能力，因此存在與這些病毒株相關(guān)的重大經(jīng)濟(jì)和公眾健康風(fēng)險(xiǎn)，包括嚴(yán)重的流行性和爆發(fā)性威脅。這種威脅的規(guī)模如1918年的流感大爆發(fā)，導(dǎo)致超過五千萬人死亡。目前還沒有H5N1感染的有效疫苗，因此用免疫球蛋白進(jìn)行的被動(dòng)免疫治療可能是一種替代策略。據(jù)報(bào)道在1918年期間被動(dòng)免疫的應(yīng)用使得死亡率減半。鑒于它們對(duì)于人體的治療益處，因此需要能中和H5N1的結(jié)合分子優(yōu)選人結(jié)合分子。本發(fā)明提供了這些結(jié)合分子并且揭示了它們可用于醫(yī)學(xué)中，特別是用于診斷、預(yù)防和/或治療H5Nl感染中。附圖描述圖1示出了使用抗體CR6307(左側(cè)部分)、CR6323(中間部分)和CR5111(右側(cè)部分)對(duì)不同的血凝素(HA)進(jìn)行的免疫印跡分析。將重組HA進(jìn)行還原性SDS-PAGE分析和免疫印跡分析。泳道1示出H5NlTV的sHA，泳道2示出重組HA、亞型H5(A/Vietnam/1203/2004(H5N1))，泳道3示出重組HA、亞型H3(A/Wyoming/3/2003(H3N2》，泳道4示出重組HA、亞型Hl(A/NewCaledonia/20/99(HINI))。圖中還標(biāo)出了可以發(fā)現(xiàn)HA0、HA1和HA2的位置。圖2示出一項(xiàng)研究中(實(shí)施例12)每組小鼠的平均臨床評(píng)分，其中在用流感病毒H5N1感染前一天，用三種人H5N1單克隆抗體CR6261，CR6323，和CR6325以不同劑量預(yù)防性治療小鼠。圖3示出在感染后21天期間用抗H5N1抗體預(yù)防性治療小鼠期間的體重變化(實(shí)施例12)。圖4示出在圖2和3的研究(實(shí)施例12)中不同組中存活小鼠的數(shù)目。圖5示出在圖2-4的研究(實(shí)施例12)中死亡率與給予的抗-H5Nl抗體劑量之間的關(guān)系。圖6示出在一項(xiàng)研究中(實(shí)施例13)每組小鼠的平均臨床評(píng)分，其中用致死劑量的流感病毒H5N1感染小鼠并且在感染后的不同時(shí)間點(diǎn)(4小時(shí)、1天、2天和3天)用CR6261抗-H5Nl單克隆抗體或者不相關(guān)的抗體CR2006(在感染后第1天給予)治療。圖7示出圖6所述研究中每組小鼠的存活數(shù)目。第1-4組的所有動(dòng)物(除了第1組中的1只動(dòng)物之外)在整個(gè)研究期間均存活直至感染后第21天。第5組的所有動(dòng)物在第9天全部死亡。圖8示出圖6所述的研究期間每組小鼠的平均體重。在第9天停止測(cè)量第5組小鼠體重，因?yàn)樵摻M的所有小鼠此時(shí)已經(jīng)死亡。盡管每組動(dòng)物康復(fù)的快慢依賴于治療時(shí)間，但是第1-4組中存活的小鼠在感染后第21天均達(dá)到正常體重水平。圖9示出一項(xiàng)研究的每組動(dòng)物中存活動(dòng)物的百分比，其中用致死劑量的H1N1流感病毒感染小鼠并且在不同時(shí)間點(diǎn)(感染前1天，感染后1、2和3天)用CR6261抗-H5Nl單克隆抗體或者不相關(guān)的抗體CR57(在感染后第1天給予)治療。圖10示出圖9所述研究期間每組小鼠的平均體重。在第9天停止測(cè)量第5組小鼠體重，因?yàn)樵摻M的所有小鼠此時(shí)已經(jīng)死亡。盡管每組動(dòng)物康復(fù)的快慢依賴于治療時(shí)間，但是第1-4組中存活的小鼠在感染后第21天均達(dá)到正常體重水平。發(fā)明描述下文闡述了本發(fā)明使用的一些術(shù)語的定義。如本文所用，術(shù)語"結(jié)合分子"是指完整的免疫球蛋白，包括單克隆抗體，如嵌合抗體、人源化抗體或人單克隆抗體，或者是指抗原結(jié)合和/或可變結(jié)構(gòu)域，其包含與所述完整的免疫球蛋白競(jìng)爭(zhēng)特異性結(jié)合所述免疫球蛋白的結(jié)合配偶體例如H5N1的免疫球蛋白片段。無論結(jié)構(gòu)如何，所述抗原結(jié)合片段結(jié)合由所述完整的免疫球蛋白識(shí)別的相同抗原?？乖Y(jié)合片段可包含具有這樣的氨基酸序列的肽或多肽，所述氨基酸序列為所述結(jié)合分子的氨基酸序列的至少2、5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200或者250個(gè)連續(xù)氨基酸殘基。如本文所用，術(shù)語"結(jié)合分子"包括本領(lǐng)域已知的所有免疫球蛋白類別和亞類。根據(jù)其重鏈恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，結(jié)合分子可以被分為五種主要類別的完整抗體IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且其中一些類別可進(jìn)一步分成亞類(同種型)，例如IgAl、IgA2、IgGl、IgG2、IgG3和IgG4?？乖Y(jié)合片段包括Fab、F(ab')、F(ab')2、Fv、dAb、Fd、互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)片段、單鏈抗體(scFv)、二價(jià)單鏈抗體、單鏈?zhǔn)删w抗體、雙特異雙鏈抗體(diabody)、三鏈抗體(triabody)、四鏈抗體(tetrabody)、含有至少足以賦予與(多)肽特異性抗原結(jié)合的免疫球蛋白片段的(多)肽等。上述片段可以合成產(chǎn)生或者通過酶或化學(xué)裂解完整的免疫球蛋白而產(chǎn)生或者可以通過重組DNA技術(shù)遺傳工程化。所述產(chǎn)生方法為本領(lǐng)域所熟知，例如并入本文作參考的由E.HarlowandD，Lane(1988)編輯的Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLabotatoiy，ColdSpringHarbor,NewYork。結(jié)合分子或者其抗原結(jié)合片段可以具有一或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。如果存在一個(gè)以上的結(jié)合位點(diǎn)，則所述結(jié)合位點(diǎn)可以彼此相同或不同。結(jié)合分子可以是裸的或者未綴合的結(jié)合分子，但是也可以是免疫綴合物的一部分。裸的或者未綴合的結(jié)合分子是指這樣的結(jié)合分子，其未與效應(yīng)部分或標(biāo)記綴合、可操縱地連接或者另外物理或功能性關(guān)聯(lián)，所述效應(yīng)部分或者標(biāo)記例如是毒性物質(zhì)、放射性物質(zhì)、脂質(zhì)體、酶。裸的或者未綴合的結(jié)合分子不排除已經(jīng)穩(wěn)定化的、多聚體化的、人源化或者以任何其它方式操作的(除了效應(yīng)成分或者標(biāo)記的附著之外)結(jié)合分子。因此，所有翻譯后修飾的裸的和未綴合的結(jié)合分子均包含在其中，包括其中是在產(chǎn)生天然結(jié)合分子的細(xì)胞環(huán)境中通過產(chǎn)生重組結(jié)合分子的細(xì)胞而產(chǎn)生修飾以及在最初的結(jié)合分子制備后通過人工導(dǎo)入修飾。當(dāng)然，術(shù)語裸的或者未綴合的結(jié)合分子不排除在給予機(jī)體后所述結(jié)合分子與效應(yīng)細(xì)胞和/或分子形成功能聯(lián)系的能力，因?yàn)橐恍┻@樣的相互作用是發(fā)揮生物學(xué)作用所必需的。相關(guān)聯(lián)的效應(yīng)基團(tuán)或者標(biāo)記的缺少因此用于定義在體外而不是在體內(nèi)的裸的或者未綴合的結(jié)合分子。如本文所用，術(shù)語"生物學(xué)樣品"涵蓋了多種樣品類型，包括生物學(xué)來源的血液及其它體液樣品，實(shí)體組織樣品如活檢組織樣品或者組織培養(yǎng)物，或者衍生自其中的細(xì)胞或者其后代。該術(shù)語還包括在獲得后己經(jīng)通過任何方式處理的樣品，例如用試劑處理、溶解、或者富集某些成分如蛋白質(zhì)或者多核苷酸。該術(shù)語涵蓋了得自任何物種的各種臨床樣品，也包括培養(yǎng)的細(xì)胞、細(xì)胞上清和細(xì)胞溶解產(chǎn)物。如本文所用，術(shù)語"互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)"是指結(jié)合分子如免疫球蛋白的可變區(qū)中的序列，其通常很大程度上構(gòu)成抗原結(jié)合位點(diǎn)，在形態(tài)和電荷分布方面與在抗原上識(shí)別的表位互補(bǔ)。CDR區(qū)可以特異于蛋白質(zhì)或者蛋白質(zhì)片段的線性表位、不連續(xù)表位或者構(gòu)象表位，這些表位以其天然構(gòu)象存在于蛋白質(zhì)上，或者在一些情況中以變性形式(例如通過在SDS中溶解)存在于蛋白質(zhì)上。表位也可以由蛋白質(zhì)的翻譯后修飾物組成。如本文所用，術(shù)語"缺失"是指與通常是天然發(fā)生的親代分子相比，氨基酸序列或者核苷酸序列中分別缺少一或多個(gè)氨基酸或者核苷酸殘基的改變。如本文所用，術(shù)語"調(diào)節(jié)表達(dá)的核酸序列"是指可操縱地連接的編碼序列在特定宿主生物體中表達(dá)所必需的和/或影響所述編碼序列表達(dá)的多核苷酸序列。調(diào)節(jié)表達(dá)的核酸序列可以是在選擇的宿主生物體中具有活性的任何核酸序列且可以衍生自編碼與宿主生物體同源或異源的蛋白質(zhì)的基因，所述序列例如是合適的轉(zhuǎn)錄起始序列、終止序列、啟動(dòng)子序列、增強(qiáng)子序列；阻抑物或者激活物序列；有效的RNA加工信號(hào)如剪接和聚腺苷酸化信號(hào)；穩(wěn)定細(xì)胞質(zhì)mRNA的序列；增強(qiáng)翻譯效率的序列(例如核糖體結(jié)合位點(diǎn))；增強(qiáng)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的序列；以及當(dāng)需要時(shí)增強(qiáng)蛋白質(zhì)分泌的序列。調(diào)節(jié)表達(dá)的序列的鑒別與應(yīng)用為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。如本文所用，術(shù)語"功能變體"是指這樣的結(jié)合分子，其與親代結(jié)合分子的核苷酸序列和/或氨基酸序列相比包含一或多個(gè)核苷酸和/或氨基酸被改變的核苷酸和/或氨基酸序列，而與親代結(jié)合分子相比仍能競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合所述結(jié)合配偶體例如H5N1。換句話說，親代結(jié)合分子的氨基酸和/或核苷酸序列中的修飾不顯著影響或改變由所述核苷酸序列編碼的或者含有所述氨基酸序列的所述結(jié)合分子的結(jié)合特性，即所述結(jié)合分子仍能識(shí)別并結(jié)合其靶位。所述功能變體可以具有保守序列修飾，包括核苷酸和氨基酸取代、添加和缺失。這些修飾可以通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)導(dǎo)入，例如定向誘變和隨機(jī)PCR介導(dǎo)的誘變，并且可包含天然以及非天然核苷酸和氨基酸。保守氨基酸取代包括其中氨基酸殘基由具有相似結(jié)構(gòu)或者化學(xué)性質(zhì)的另一氨基酸殘基置換的取代。具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族己經(jīng)在本領(lǐng)域中限定。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、無電荷極性側(cè)鏈氨基酸(例如天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非極性側(cè)鏈氨基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、J3-分支側(cè)鏈氨基酸(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)以及芳香側(cè)鏈氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)。本領(lǐng)域技術(shù)人員明白也可以使用除了上述家族之外的其它氨基酸殘基家族分類方式。另外，變體可具有非保守的氨基酸取代，例如氨基酸由具有不同結(jié)構(gòu)或者化學(xué)性質(zhì)的另一氨基酸殘基置換。相似的小變異也可包括氨基酸缺失或者插入，或者這二者。使用本領(lǐng)域熟知的計(jì)算機(jī)程序可以發(fā)現(xiàn)確定哪些氨基酸殘基可以被取代、插入或者缺失而不消除免疫學(xué)活性的指導(dǎo)。核苷酸序列中的突變可以是在一個(gè)基因座的單一改變(點(diǎn)突變)，例如轉(zhuǎn)換或顛換突變，或者可以在一個(gè)基因座插入、缺失或者改變多個(gè)核苷酸。另外，可以在核苷酸序列中的任何數(shù)目的基因座中產(chǎn)生一或多個(gè)改變。所述突變可以通過本領(lǐng)域己知的任何合適方法進(jìn)行。如本文所用，術(shù)語"宿主"是指其中已經(jīng)導(dǎo)入載體的生物體或者細(xì)胞，所述載體例如是克隆載體或者表達(dá)載體。所述生物體或者細(xì)胞可以是原核或真核生物體或細(xì)胞。應(yīng)理解該術(shù)語不僅是指特定對(duì)象生物體或細(xì)胞，而且可以是這種生物體或細(xì)胞的后代。由于突變或者環(huán)境影響而導(dǎo)致某些修飾可以在隨后的世代中出現(xiàn)，因此事實(shí)上這種后代也許與所述親代生物體或細(xì)胞不相同，但是其仍包含在如本文所用術(shù)語"宿主"的范圍內(nèi)。術(shù)語"人"當(dāng)用于描述本文所述結(jié)合分子時(shí)是指直接衍生自人或者基于人序列的分子。當(dāng)結(jié)合分子衍生自或者基于人序列以及隨后被修飾時(shí)，在本說明書中仍認(rèn)為其是人分子。換句話說，術(shù)語"人"當(dāng)用于描述結(jié)合分子時(shí)包括具有這樣的可變區(qū)和恒定區(qū)的結(jié)合分子，所述可變區(qū)和恒定區(qū)衍生自人種系免疫球蛋白序列或者基于在人或人淋巴細(xì)胞中出現(xiàn)的且以一些形式修飾的可變區(qū)或恒定區(qū)。因此，人結(jié)合分子可包括不是由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基，包含取代和/或缺失(例如通過體外隨機(jī)或位點(diǎn)特異性誘變方法或者通過體內(nèi)體細(xì)胞突變方法導(dǎo)入的突變)。如本文所用，"基于"是指這樣的情形，即核酸序列可以精確地從模板中拷貝，或者例如通過易錯(cuò)PCR方法而具有小突變，或者經(jīng)合成制備而與所述模板精確匹配或者具有小修飾。基于人序列的半合成分子在本文中也被認(rèn)為是人分子。術(shù)語"插入"也被稱作"添加"，是指與親代序列相比分別導(dǎo)致添加一或多個(gè)氨基酸或者核苷酸殘基的氨基酸或核苷酸序列中的變化。術(shù)語"分離的"當(dāng)用于描述本文所述結(jié)合分子時(shí)是指這樣的結(jié)合分子，其基本上不含其它蛋白質(zhì)或多肽、特別是不含具有不同抗原特異性的其它結(jié)合分子，而且也基本上不含其它細(xì)胞材料和/或化學(xué)物。例如，當(dāng)所述結(jié)合分子是重組產(chǎn)生的時(shí)，其優(yōu)選基本上不含培養(yǎng)基；當(dāng)所述結(jié)合分子是通過化學(xué)合成方法產(chǎn)生的時(shí)，其優(yōu)選基本上不含化學(xué)物前體或者其它化學(xué)物，即其與參與蛋白質(zhì)合成的化學(xué)物前體或者其它化學(xué)物是分開的。術(shù)語"分離的"當(dāng)用于描述編碼本文所述結(jié)合分子的核酸分子時(shí)是指其中編碼所述結(jié)合分子的核苷酸序列不含其它核苷酸序列、特別是編碼結(jié)合除了H5N1之外的結(jié)合配偶體的結(jié)合分子的核苷酸序列的核酸分子。此外，術(shù)語"分離的"是指與其它細(xì)胞成分基本上分開的核酸分子，所述其它細(xì)胞成分是與天然核酸分子在其天然宿主中天然相伴隨的細(xì)胞成分，例如核糖體、聚合酶或者與其天然相關(guān)聯(lián)的基因組序列。此外，"分離的"核酸分子如cDNA分子當(dāng)通過重組技術(shù)產(chǎn)生時(shí)可以基本上不含其它細(xì)胞材料或者培養(yǎng)基，當(dāng)通過化學(xué)合成時(shí)基本上不含化學(xué)物前體或者其它化學(xué)物。如本文所用，術(shù)語"單克隆抗體"是指單一分子組成的抗體分子的制備物。單克隆抗體對(duì)于特定表位展示單一的結(jié)合特異性和親和性。因此，術(shù)語"人單克隆抗體"是指展示單一結(jié)合特異性的抗體，其具有衍生自或者基于人種系免疫球蛋白序列或者衍生自完全合成的序列的可變區(qū)和恒定區(qū)。制備單克隆抗體的方法是無關(guān)的。如本文所用，術(shù)語"天然發(fā)生的"用于描述一個(gè)對(duì)象時(shí)，是指可以在自然界中發(fā)現(xiàn)該對(duì)象的事實(shí)。例如，存在于可分離自自然屆來源且未經(jīng)在實(shí)驗(yàn)室中人工有意修飾的生物體中的多肽或者多核苷酸序列是天然發(fā)生的。如本發(fā)明所用，術(shù)語"核酸分子"是指核苷酸的聚合形式，包括RNA、cDNA、基因組DNA的有義和反義鏈以及上述分子的合成形式和混合的聚合物。核苷酸是指核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸或者任一類型核苷酸的修飾形式。該術(shù)語還包括單鏈和雙鏈形式的DNA。另外，多核苷酸可包括通過天然發(fā)生的和/或非天然發(fā)生的核苷酸鍵連接在一起的天然發(fā)生的核苷酸和修飾的核苷酸任一或這二者。所述核酸分子可以經(jīng)化學(xué)或者生物化學(xué)方法修飾或者可含有非天然的或者衍生的核苷酸堿基，這一點(diǎn)本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易意識(shí)到。這種修飾包括例如標(biāo)記，甲基化，一或多個(gè)天然發(fā)生的核苷酸由類似物取代，核苷酸間修飾如無電荷鍵(例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)、帶電荷鍵(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)，懸垂部分(pendentmoiety)(例如多肽)，嵌入劑(例如吖啶、補(bǔ)骨脂素等)，螯合劑，垸化劑，以及修飾的鍵(例如a異頭核酸等)。該術(shù)語還包括任何拓?fù)錁?gòu)象，包括單鏈、雙鏈、部分雙螺旋、三螺旋、發(fā)夾、環(huán)形和扣鎖構(gòu)象。該術(shù)語也包括合成的分子，其模擬多核苷酸通過氫鍵及其它化學(xué)相互作用而結(jié)合指定序列的能力。這種分子為本領(lǐng)域所已知，包括例如其中用肽鍵取代分子主鏈中的磷酸鍵的那些分子。除非特別指出，提及核酸序列時(shí)包含其互補(bǔ)體。因此，具有特定序列的核酸分子應(yīng)理解為包含其互補(bǔ)鏈以及其互補(bǔ)序列。所述互補(bǔ)鏈也可用于例如反義治療、雜交探針和PCR引物。術(shù)語"可操縱地連接"是指兩或多個(gè)核酸序列元件通常是物理連接的，而且彼此功能相關(guān)聯(lián)。例如，如果啟動(dòng)子能起始或者調(diào)節(jié)編碼序列的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)，則該啟動(dòng)子與所述編碼序列是可操縱地連接的，在這種情況中應(yīng)理解所述編碼序列是在所述啟動(dòng)子的"控制下"。"藥物可接受的賦形劑"是指任何惰性物質(zhì)，其與活性分子如藥物、藥劑或者結(jié)合分子組合以制備合適或常規(guī)的劑型。"藥物可接受的賦形劑"是在所用劑量和濃度對(duì)于受體無毒性的賦形劑，而且與包含所述藥物、藥劑或結(jié)合分子的配制品的其它成分相容。藥物可接受的賦形劑在本領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用。如本文所用，術(shù)語"特異性結(jié)合"當(dāng)用于描述結(jié)合分子例如抗體與其結(jié)合配偶體例如抗原之間的相互作用時(shí)意味著該相互作用依賴于所述結(jié)合配偶體上特定結(jié)構(gòu)例如抗原決定簇或者表位的存在。換句話說，抗體優(yōu)先結(jié)合或者識(shí)別結(jié)合配偶體，即使當(dāng)所述結(jié)合配偶體存在于其它分子或生物體的混合物中時(shí)也如此。結(jié)合可以由共價(jià)或非共價(jià)相互作用或者這二者的組合介導(dǎo)。再換句話說，術(shù)語"特異性結(jié)合"是指與抗原或其片段的免疫特異性結(jié)合，而與其它抗原不是免疫特異性結(jié)合。與抗原免疫特異性結(jié)合的結(jié)合分子與其它肽或多肽可以較低親和性結(jié)合，例如通過放射性免疫測(cè)定(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、BIACORE、或者本領(lǐng)域己知的其它測(cè)定方法確定。與抗原免疫特異性結(jié)合的結(jié)合分子或其片段可以與相關(guān)抗原交叉反應(yīng)。優(yōu)選地，與抗原免疫特異性結(jié)合的結(jié)合分子或其片段與其它抗原不交叉反應(yīng)。如本文所用，"取代"是指一或多個(gè)氨基酸或核苷酸分別由不同的氨基酸或核苷酸置換。術(shù)語"治療有效量"是指本文所述結(jié)合分子有效預(yù)防、改善和/或治療得自H5N1感染的病癥的量。術(shù)語"治療"是指治療性治療以及預(yù)防(prophylactic)或保護(hù)(preventative)措施以治愈疾病或者使疾病停止進(jìn)展或者至少延遲疾病進(jìn)展。需要治療的那些對(duì)象包括已經(jīng)患有H5N1感染所致病癥的對(duì)象以及其中H5N1感染待被預(yù)防的那些對(duì)象。部分或者完全自H5N1感染中復(fù)原的對(duì)象或許也需要治療。預(yù)防包含抑制或降低的H5N1傳播或者抑制或降低與H5N1感染相關(guān)的一或多種癥狀的發(fā)生、發(fā)展或進(jìn)展。術(shù)語"載體"是指這樣的核酸分子，向其中可以插入另一種核酸分子以導(dǎo)入宿主中，在宿主中其將被復(fù)制，以及在一些情況中被表達(dá)。換句話說，載休能轉(zhuǎn)運(yùn)與其連接的核酸分子?？寺≥d體以及表達(dá)載體包含在本文所用術(shù)語"載體"范圍中。載體包括但不限于質(zhì)粒、粘粒、細(xì)菌人工染色體(BAC)和酵母人工染色體(YAC)以及衍生自噬菌體或者植物或動(dòng)物(包括人)病毒的載體。載體包含由提議的宿主識(shí)別的復(fù)制起點(diǎn)，在表達(dá)載體的情況中還包含啟動(dòng)子及由所述宿主識(shí)別的其它調(diào)節(jié)區(qū)。含有另一個(gè)核酸分子的載體通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或者通過使用病毒進(jìn)入機(jī)制被導(dǎo)入細(xì)胞中。某些載體能在其被導(dǎo)入的宿主中自主復(fù)制(例如具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的載體可以在細(xì)菌中復(fù)制)。其它載體在導(dǎo)入宿主中時(shí)可以被整合進(jìn)宿主基因組中，從而與宿主基因組一起復(fù)制。發(fā)明概述本發(fā)明提供了能特異性結(jié)合流感病毒H5N1并且呈現(xiàn)針對(duì)H5N1中和活性的人結(jié)合分子。本發(fā)明還提供了結(jié)合流感病毒亞型之間共有的血凝素蛋白中的表位的結(jié)合分子，并因此涉及在基于H5-、Hl-、H2-、H6-和H9-流感病毒的亞型如H5N1、H1N1和含有具有這些特定表位的HA蛋白的其它流感病毒毒株之間交叉反應(yīng)的結(jié)合分子。本發(fā)明還涉及編碼至少所述人結(jié)合分子的結(jié)合區(qū)的核酸分子。本發(fā)明進(jìn)一步提供了本發(fā)明的人結(jié)合分子在預(yù)防和/或治療患有H5N1感染或者處于H5N1感染風(fēng)險(xiǎn)的對(duì)象中的應(yīng)用。除此之外，本發(fā)明還涉及本發(fā)明的人結(jié)合分子在診斷/檢測(cè)H5Nl中的應(yīng)用。詳細(xì)描述第一方面，本發(fā)明涉及能特異性結(jié)合流感病毒A、特別是流感病毒A亞型H5N1的結(jié)合分子。優(yōu)選地，所述結(jié)合分子是人結(jié)合分子。優(yōu)選地，本發(fā)明的結(jié)合分子呈現(xiàn)對(duì)于流感病毒A亞型H5N1的中和活性。另一方面，本發(fā)明的結(jié)合分子能特異性結(jié)合不同的流感病毒H5N1毒株和/或?qū)ζ渚哂兄泻突钚?。這些毒株可以是流感病毒H5N1毒株的進(jìn)化枝1、進(jìn)化枝2或者進(jìn)化枝3的成員。對(duì)來自2004年和2005年爆發(fā)的H5N1的HA基因進(jìn)行的系統(tǒng)發(fā)生學(xué)分析揭示了HA基因的兩個(gè)不同譜系(lineage),稱作進(jìn)化枝1和進(jìn)化枝2。這些進(jìn)化枝的每一個(gè)中的病毒分布于亞洲的不相重疊的地理區(qū)域。來自印度支那半島的H5N1病毒在進(jìn)化枝1中緊密群集，而來自一些周圍國(guó)家的H5N1分離株與進(jìn)化枝1分離物不同，屬于更發(fā)散的進(jìn)化枝2。進(jìn)化枝1H5N1病毒分離自越南、泰國(guó)和柬埔寨的人和禽類，但是在老撾和馬來西亞僅分離自禽類。進(jìn)化枝2病毒在只是從中國(guó)、印度尼西亞、日本和韓國(guó)的禽類中分離的病毒中發(fā)現(xiàn)。2003年和1997年在香港從禽類和人中分離的病毒分別組成進(jìn)化枝l'(也被分類為進(jìn)化枝1中)和進(jìn)化枝3(見WHOGlobalInfluenzaProgramSurveillanceNetwork,2005)。所述進(jìn)化枝的血凝素的氨基酸序列不同。進(jìn)化枝1毒株的例子包括但不限于A/HongKong/213/03，A/Vietnam/1194/04,A/Vietnam/1203/04和A/Thailand/1(KAN-1)/2004。進(jìn)化枝2毒株的例子包括但不限于A/Indonesia/5/05，A/barheadedgoose/Qinghai/lA/05，A/turkey/Turkey/1/05和A/Anhui/l/05。進(jìn)化枝3毒株的例子包括但不限于A/HongKong/156/97和A/goose/Guangdong/l/96。其它毒株可見于例如WHOGlobalInfluenzaProgramSurveillanceNetwork,2005以及http:〃www.who.int/csr/disease/avian_influenza/guidelines/recommendation鶴i腳df。優(yōu)選地，本發(fā)明的結(jié)合分子能特異性結(jié)合進(jìn)化枝1、進(jìn)化枝2和進(jìn)化枝3毒株并且對(duì)其具有中和活性。本發(fā)明的結(jié)合分子能特異性結(jié)合存活的、活的和/或感染性或者失活/減毒形式的流感病毒H5Nl。使流感病毒H5N1失活/減毒的方法為本領(lǐng)域所熟知，包括但不限于用甲醛、J3-丙酸內(nèi)酯(BPL)、硫柳汞和/或紫外線處理。本發(fā)明的結(jié)合分子也可以特異性結(jié)合流感病毒H5N1的一或多個(gè)片段，如衍生自亞型H5N1的一或多種蛋白質(zhì)和/或(多)肽或者一或多種重組產(chǎn)生的H5N1蛋白質(zhì)和域多肽的制備物。對(duì)于治療和域預(yù)防H5N1感染的方法而言，所述結(jié)合分子優(yōu)選能特異性結(jié)合H5N1的表面可及蛋白質(zhì)如為病毒附著和細(xì)胞釋放所必需的表面糖蛋白血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)或者膜蛋白(M1和M2)。在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子能特異性結(jié)合H5N1毒株的HA分子。它們也許能特異性結(jié)合HA分子的HA1和/或HA2亞基。它們也許能特異性結(jié)合HA分子的HA1和域HA2亞基上的線性或結(jié)構(gòu)和/或構(gòu)象表位。所述HA分子可以在使用之前純化自病毒或者重組產(chǎn)生以及任選地分離。或者，HA可以在細(xì)胞的表面上表達(dá)。為了診斷目的，結(jié)合分子也能特異性結(jié)合H5N1表面上不存在的蛋白質(zhì)，包括核蛋白、核殼結(jié)構(gòu)蛋白、聚合酶(PA、PB和PB2)以及非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1和NS2)。各種H5N1毒株的核苷酸序列和域蛋白質(zhì)的氨基酸序列可見于GenBank-數(shù)據(jù)庫、NCBI流感病毒序列數(shù)據(jù)庫、流感病毒序列數(shù)據(jù)庫(ISD)、EMBL-數(shù)據(jù)庫和/或其它數(shù)據(jù)庫。本領(lǐng)域技術(shù)人員易于在各自的數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)這種序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子能特異性結(jié)合上述蛋白質(zhì)和/或多肽的片段，其中所述片段至少包含由本發(fā)明的結(jié)合分子識(shí)別的抗原決定簇。如本文所用，"抗原決定簇"是能以足夠高的親和性結(jié)合本發(fā)明的結(jié)合分子以形成可檢測(cè)的抗原-結(jié)合分子復(fù)合物的部分。本發(fā)明的結(jié)合分子可以或者不能特異性結(jié)合HA的胞外部分(在本文也稱作可溶HA(sHA))。本發(fā)明的結(jié)合分子可以是完整的免疫球蛋白分子例如多克隆或單克隆抗體或者所述結(jié)合分子可以是抗原結(jié)合片段，包括但不限于Fab、F(ab')、F(ab')2、Fv、dAb、Fd、互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)片段、單鏈抗體(scFv)、二價(jià)單鏈抗體、單鏈?zhǔn)删w抗體、雙特異雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體以及至少含有足以賦予與流感病毒H5N1毒株的特異性抗原結(jié)合的免疫球蛋白的片段的(多)肽或其片段。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子是人單克隆抗體。本發(fā)明的結(jié)合分子可以以未分離的或者分離的形式使用。此外，本發(fā)明的結(jié)合分子可以單獨(dú)應(yīng)用或者于包含至少一種本發(fā)明的結(jié)合分子(或其變體或片段)的混合物中應(yīng)用。換句話說，所述結(jié)合分子可以組合應(yīng)用，例如作為包含兩或更多種本發(fā)明的結(jié)合分子、其變體或片段的藥物組合物。例如，具有不同但互補(bǔ)活性的結(jié)合分子可以組合在一個(gè)治療方案中以達(dá)到希望的預(yù)防、治療或診斷作用，但是或者也可以將具有相同活性的結(jié)合分子組合在一個(gè)治療方案中以達(dá)到希望的預(yù)防、治療或診斷作用。任選地，所述混合物進(jìn)一步包含至少一種其它治療劑。優(yōu)選地，所述治療劑如M2抑制劑(例如amantidine、金剛乙胺(rimantadine))和/或神經(jīng)氨酸酶抑制劑(例如扎那米韋(zanamivir)、奧司他韋(oseltamivir))可用于預(yù)防和/或治療流感病毒H5N1感染。典型地，本發(fā)明的結(jié)合分子可結(jié)合其結(jié)合配偶體，即流感病毒H5N1或其片段，親和常數(shù)(Kd值)低于0.2xl0-4M、1.0xl(r5M、1.0xl()-6M、l.Oxl(T7M，優(yōu)選地低于1.0xl(T8M，更優(yōu)選低于1.0xl(T9M，更優(yōu)選低于1.0xlO'1QM，甚至更優(yōu)選低于l.OxlO'11M，特別優(yōu)選低于l.Oxl(T12M。所述親和常數(shù)根據(jù)抗體類型而可以有所不同。例如，IgM同種型的親和性結(jié)合是指至少大約1.0xl(^M的結(jié)合親和性。親和性常數(shù)可例如通過使用表面等離子共振技術(shù)測(cè)量，例如使用BIACORE系統(tǒng)(PharmaciaBiosensorAB,Uppsala,Sweden)。本發(fā)明的結(jié)合分子可以結(jié)合可溶形式例如于樣品中或懸浮液中的流感病毒H5N1或其片段或者可以結(jié)合與載體或基材結(jié)合或附著例如與微滴定平板、膜和珠結(jié)合或附著的流感病毒H5N1或其片段。載體或基材可以由玻璃、塑料(例如聚苯乙烯)、多糖、尼龍、硝化纖維素或Teflon等制成。這種支持物的表面可以是固相或者多孔的以及可以是任何便利的形狀。此外，所述結(jié)合分子可以結(jié)合純化/分離或者非純化/非分離形式的流感病毒H5N1。本發(fā)明的結(jié)合分子呈現(xiàn)中和活性。中和活性可例如如本文所述測(cè)量。另一種測(cè)量中和活性的測(cè)定方法例如在WHOManualonAnimalInfluenzaDiagnosisandSurveillance,Geneva:WorldHealthOrganisation,2005,version2002.5中描述。本發(fā)明涉及分離的人結(jié)合分子，其能識(shí)別并結(jié)合流感血凝素蛋白(HA)的HA2亞基中的表位，特征在于所述結(jié)合分子具有針對(duì)包含H5亞型的HA的流感病毒的中和活性。含有這種H5亞型的HA且是具有流行性威脅的重要毒株的流感病毒毒株的例子是H5N1、H5N2、H5N8和H5N9。特別優(yōu)選的是至少中和H5N1流感病毒毒株的結(jié)合分子。優(yōu)選地，本發(fā)明的所述結(jié)合分子與所述HA蛋白的結(jié)合不依賴于HA蛋白的HA1亞基中的表位?，F(xiàn)有
技術(shù)領(lǐng)域：
中描述的也結(jié)合HA2結(jié)構(gòu)域中相同表位的已知鼠抗體(C179)也依賴于與HA蛋白的HA1結(jié)構(gòu)域中表位的結(jié)合。這是不利的，因?yàn)槠湓黾恿瞬辉儆伤隹贵w識(shí)別的逃逸突變體(escapemutant)的可能性。此外，許多本發(fā)明抗體(如CR6307和CR6323)不依賴于構(gòu)象表位，甚至可識(shí)別還原形式的HA2表位(當(dāng)用于蛋白質(zhì)印跡中時(shí))。這優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)的抗體，因?yàn)楫?dāng)由于在蛋白質(zhì)的另一部分中無論何樣的突變而在HA蛋白中導(dǎo)入構(gòu)象改變時(shí)，這種構(gòu)象改變不太可能阻礙本發(fā)明的抗體與HA2表位的結(jié)合；而當(dāng)這種突變發(fā)生時(shí)，依賴于構(gòu)象的抗體非?？赡懿荒芙Y(jié)合。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子對(duì)于包含Hl亞型的HA的流感病毒也具有中和活性，優(yōu)選其中所述結(jié)合分子對(duì)于包含H2、H6和/或H9亞型的HA的流感病毒也具有中和活性。本文揭示了本發(fā)明的結(jié)合分子與H5、Hl、H2、H6和H9亞型中存在的HA2表位中存在的一個(gè)表位相互作用，并且揭示了本發(fā)明的結(jié)合分子由于這種表位共享而在流感病毒亞型之間具有交叉中和性。推斷依賴于與HA2結(jié)構(gòu)域中的特定部分結(jié)合(且不與HA1中具有突變傾向的另一表位結(jié)合)的本發(fā)明的結(jié)合分子在流感病毒亞型之間具有交叉中和性，因?yàn)榭雌饋砥洳灰蕾囉谂cHA1中的由于抗原性漂移而被明顯改變的結(jié)構(gòu)域的結(jié)合。本領(lǐng)域技術(shù)人員基于本文所描述內(nèi)容可以確定抗體與不同亞型的HA蛋白是否確實(shí)交叉反應(yīng)，且也可以確定它們是否能在體內(nèi)中和不同亞型的流感病毒。在本發(fā)明的另一優(yōu)選方面，本發(fā)明的結(jié)合分子結(jié)合HA2亞基中的表位，所述表位選自如下氨基酸序列組成的一組中GVTNKVNSIIDKCSEQIDNO:368)、GVTNKVNSIINK(SEQIDNO:369)、GVTNKENSIIDK(SEQIDNO:370)、GVTNKVNRIIDK(SEQIDNO:371)、GITNKVNSV正K(SEQIDNO:372)、GITNKENSV正K(SEQIDNO:373)、GITNKVNSHDK(SEQIDNO:374)和KITSKVNMVDK(SEQIDNO:375)。從表13中示出的數(shù)據(jù)中可以推斷本發(fā)明的某些結(jié)合分子CR6261、CR6325和CR6329與H5N1中存在的GVTNKVNSIIDK(SEQIDNO:368)表位相互作用，且不受HA1中的TGLRN表位中突變的妨礙，該突變影響C179的結(jié)合。此外，一些結(jié)合分子如CR6307和CR6323甚至不受逃逸突變體的妨礙，如Okunoetal.(1993)所述在第6位纈氨酸突變?yōu)楣劝彼?GVTNKENSIIDK(SEQIDNO:370))。這個(gè)表位是HA2區(qū)中延伸的oc螺旋的一部分。預(yù)測(cè)這個(gè)推定表位中最暴露于溶劑的殘基是粗體下劃線處的殘基GVJNKE^SIIDK(SEQIDNO:370)。這些氨基酸最易接近結(jié)合分子，并因此形成表位最重要的區(qū)域。與這個(gè)觀點(diǎn)一致，高亮的氨基酸在所有呈現(xiàn)的序列中在相同性和位置方面是絕對(duì)保守的。這方面的知識(shí)可用于預(yù)測(cè)流感病毒亞型中不具有上述相同序列的結(jié)合表位(即H3、H7和B毒株)。優(yōu)選本發(fā)明的結(jié)合分子選自如下一組a)包含SEQIDNO:l所示重鏈CDR1區(qū)、SEQIDNO:2所示重鏈CDR2區(qū)和SEQIDNO:3所示重鏈CDR3區(qū)的結(jié)合分子，b)包含SEQIDNO:16所示重鏈CDR1區(qū)、SEQIDNO:17所示重鏈CDR2區(qū)和SEQIDNO:18所示重鏈CDR3區(qū)的結(jié)合分子，c)包含SEQIDNO:1所示重鏈CDR1區(qū)、SEQIDNO:22所示重鏈CDR2區(qū)和SEQIDNO:23所示重鏈CDR3區(qū)的結(jié)合分子，d)包含SEQIDNO:27所示重鏈CDR1區(qū)、SEQIDNO:28所示重鏈CDR2區(qū)和SEQIDNO:29所示重鏈CDR3區(qū)的結(jié)合分子，e)包含SEQIDNO:39所示重鏈CDR1區(qū)、SEQIDNO:40所示重鏈CDR2區(qū)和SEQIDNO:41所示重鏈CDR3區(qū)的結(jié)合分子，f)包含SEQIDNO:45所示重鏈CDR1區(qū)、SEQIDNO:46所示重鏈CDR2區(qū)和SEQIDNO:47所示重鏈CDR3區(qū)的結(jié)合分子，g)包含SEQIDNO:1所示重鏈CDR1區(qū)、SEQIDNO:49所示重鏈CDR2區(qū)和SEQIDNO:50所示重鏈CDR3區(qū)的結(jié)合分子，h)包含SEQIDNO:52所示重鏈CDR1區(qū)、SEQIDNO:53所示重鏈CDR2區(qū)和SEQIDNO:54所示重鏈CDR3區(qū)的結(jié)合分子，i)包含SEQIDNO:262所示重鏈CDR1區(qū)、SEQIDNO:263所示重鏈CDR2區(qū)和SEQIDNO:264所示重鏈CDR3區(qū)的結(jié)合分子，j)包含SEQIDNO:268所示重鏈CDR1區(qū)、SEQIDNO:2所示重鏈CDR269區(qū)和SEQIDNO:270所示重鏈CDR3區(qū)的結(jié)合分子，k)包含SEQIDNO:274所示重鏈CDR1區(qū)、SEQIDNO:275所示重鏈CDR2區(qū)和SEQIDNO:276所示重鏈CDR3區(qū)的結(jié)合分子，l)包含SEQIDNO:280所示重鏈CDR1區(qū)、SEQIDNO:281所示重鏈CDR2區(qū)和SEQIDNO:282所示重鏈CDR3區(qū)的結(jié)合分子，m)包含SEQIDNO:286所示重鏈CDR1區(qū)、SEQIDNO:287所示重鏈CDR2區(qū)和SEQIDNO:288所示重鏈CDR3區(qū)的結(jié)合分子，n)包含SEQIDNO:292所示重鏈CDR1區(qū)、SEQIDNO:293所示重鏈CDR2區(qū)和SEQIDNO:294所示重鏈CDR3區(qū)的結(jié)合分子，o)包含SEQIDNO:304所示重鏈CDR1區(qū)、SEQIDNO:305所示重鏈CDR2區(qū)和SEQIDNO:306所示重鏈CDR3區(qū)的結(jié)合分子，及p)包含SEQIDNO:310所示重鏈CDR1區(qū)、SEQIDNO:311所示重鏈CDR2區(qū)和SEQIDNO:312所示重鏈CDR3區(qū)的結(jié)合分子。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子用作藥物，優(yōu)選用于診斷、治療和/或預(yù)防流感病毒感染。在這種應(yīng)用的一個(gè)方面中，所述流感病毒感染是由于與流行性爆發(fā)相關(guān)的或者具有與流行性爆發(fā)相關(guān)的潛力的流感病毒所致(見WO2007/045674及其中的表)。優(yōu)選地，與流行性爆發(fā)相關(guān)的、且由這些毒株導(dǎo)致的疾病可以由本發(fā)明的結(jié)合分子治療的所述流感病毒毒株選自由H1N1、H5N1、H5N2、H5N8、H5N9、基于H2的病毒和H9N2組成的一組。本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的結(jié)合分子以及藥物可接受的賦形劑的藥物組合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的結(jié)合分子在制備診斷、預(yù)防和/或治療流感病毒感染的藥物中的應(yīng)用。這種感染可以在小群體中發(fā)生，但是也可以以季節(jié)流行病方式在世界范圍傳播，或者更嚴(yán)重地在全球蔓延，數(shù)百萬個(gè)體處于危險(xiǎn)之中。本發(fā)明提供了可以中和導(dǎo)致這種季節(jié)流行病以及潛在的全球性流行病的流感病毒毒株的感染的結(jié)合分子。重要的是，目前可以預(yù)期利用本發(fā)明的結(jié)合分子對(duì)于多種流感病毒毒株起到防護(hù)和治療作用，因?yàn)橐呀?jīng)揭示了由于與在不同流感病毒毒株的HA蛋白之間共享的表位的結(jié)合，因此目前可以使用本發(fā)明的結(jié)合分子在這些毒株之間進(jìn)行交叉中和作用。這是特別有利的，因?yàn)樵诟腥局盎蛘咧蠼o予所述結(jié)合分子可以保護(hù)哺乳動(dòng)物(如實(shí)施例揭示)，因此在還不清楚所述感染是否由基于Hl、H2、H5、H6或H9的毒株的引起時(shí)(在發(fā)病的早期階段)也起到如此作用?？梢允褂帽景l(fā)明的結(jié)合分子預(yù)防性治療或者感染時(shí)治療健康工人、軍人以及普通人群。潛在地，本發(fā)明的結(jié)合分子可以大量庫存形式制備和貯存，因?yàn)槠涮峁┝酸槍?duì)不同的流行性毒株的保護(hù)作用，且對(duì)于為將來可能發(fā)生的流感爆發(fā)做準(zhǔn)備是有利的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的人結(jié)合分子特征在于所述人結(jié)合分子選自如下一組a)包含具有SEQIDNO"所示氨基酸序列的重鏈CDRl區(qū)、具有SEQIDNO:2所示氨基酸序列的重鏈CDR2區(qū)、具有SEQIDNO:3所示氨基酸序列的重鏈CDR3區(qū)、具有SEQIDNO:4所示氨基酸序列的輕鏈CDRl區(qū)、具有SEQIDNO:5所示氨基酸序列的輕鏈CDR2區(qū)以及具有SEQIDNO:6所示氨基酸序列的輕鏈CDR3區(qū)的人結(jié)合分子，b)包含具有SEQIDNO.'l所示氨基酸序列的重鏈CDRl區(qū)、具有SEQIDNO:2所示氨基酸序列的重鏈CDR2區(qū)、具有SEQIDNO:3所示氨基酸序列的重鏈CDR3區(qū)、具有SEQIDNO:7所示氨基酸序列的輕鏈CDRl區(qū)、具有SEQIDNO:8所示氨基酸序列的輕鏈CDR2區(qū)以及具有SEQIDNO:9所示氨基酸序列的輕鏈CDR3區(qū)的人結(jié)合分子，c)包含具有SEQIDNO:l所示氨基酸序列的重鏈CDRl區(qū)、具有SEQIDNO:2所示氨基酸序列的重鏈CDR2區(qū)、具有SEQIDNO:3所示氨基酸序列的重鏈CDR3區(qū)、具有SEQIDNO:IO所示氨基酸序列的輕鏈CDRl區(qū)、具有SEQIDNO:11所示氨基酸序列的輕鏈CDR2區(qū)以及具有SEQIDNO:12所示氨基酸序列的輕鏈CDR3區(qū)的人結(jié)合分子，d)包含具有SEQIDNO:l所示氨基酸序列的重鏈CDRl區(qū)、具有SEQIDNO:2所示氨基酸序列的重鏈CDR2區(qū)、具有SEQIDNO.3所示氨基酸序列的重鏈CDR3區(qū)、具有SEQIDNO:13所示氨基酸序列的輕鏈CDRl區(qū)、具有SEQIDNO:14所示氨基酸序列的輕鏈CDR2區(qū)以及具有SEQIDNO:15所示氨基酸序列的輕鏈CDR3區(qū)的人結(jié)合分子，e)包含具有SEQIDNO:16所示氨基酸序列的重鏈CDRl區(qū)、具有SEQIDNO:17所示氨基酸序列的重鏈CDR2區(qū)、具有SEQIDNO:18所示氨基酸序列的重鏈CDR3區(qū)、具有SEQIDNO:19所示氨基酸序列的輕鏈CDRl區(qū)、具有SEQIDNO:20所示氨基酸序列的輕鏈CDR2區(qū)以及具有SEQIDNO:21所示氨基酸序列的輕鏈CDR3區(qū)的人結(jié)合分子，f)包含具有SEQIDNO:l所示氨基酸序列的重鏈CDRl區(qū)、具有SEQIDNO:22所示氨基酸序列的重鏈CDR2區(qū)、具有SEQIDNO:23所示氨基酸序列的重鏈CDR3區(qū)、具有SEQIDNO:24所示氨基酸序列的輕鏈CDRl區(qū)、具有SEQIDNO:25所示氨基酸序列的輕鏈CDR2區(qū)以及具有SEQIDNO:26所示氨基酸序列的輕鏈CDR3區(qū)的人結(jié)合分子，g)包含具有SEQIDNO:27所示氨基酸序列的重鏈CDRl區(qū)、具有SEQIDNO:28所示氨基酸序列的重鏈CDR2區(qū)、具有SEQIDNO:29所示氨基酸序列的重鏈CDR3區(qū)、具有SEQIDNO:30所示氨基酸序列的輕鏈CDRl區(qū)、具有SEQIDNO:31所示氨基酸序列的輕鏈CDR2區(qū)以及具有SEQIDNO:32所示氨基酸序列的輕鏈CDR3區(qū)的人結(jié)合分子，h)包含具有SEQIDNO:l所示氨基酸序列的重鏈CDR1區(qū)、具有SEQIDNO:2所示氨基酸序列的重鏈CDR2區(qū)、具有SEQIDNO:3所示氨基酸序列的重鏈CDR3區(qū)、具有SEQIDNO:33所示氨基酸序列的輕鏈CDRl區(qū)、具有SEQIDNO:34所示氨基酸序列的輕鏈CDR2區(qū)以及具有SEQIDNO:35所示氨基酸序列的輕鏈CDR3區(qū)的人結(jié)合分子，i)包含具有SEQIDNO:l所示氨基酸序列的重鏈CDRl區(qū)、具有SEQIDNO:2所示氨基酸序列的重鏈CDR2區(qū)、具有SEQIDNO:3所示氨基酸序列的重鏈CDR3區(qū)、具有SEQIDNO:36所示氨基酸序列的輕鏈CDRl區(qū)、具有SEQIDNO:37所示氨基酸序列的輕鏈CDR2區(qū)以及具有SEQIDNO:38所示氨基酸序列的輕鏈CDR3區(qū)的人結(jié)合分子，j)包含具有SEQIDNO:39所示氨基酸序列的重鏈CDRl區(qū)、具有SEQIDNO:40所示氨基酸序列的重鏈CDR2區(qū)、具有SEQIDNO:41所示氨基酸序列的重鏈CDR3區(qū)、具有SEQIDNO:42所示氨基酸序列的輕鏈CDRl區(qū)、具有SEQIDNO:43所示氨基酸序列的輕鏈CDR2區(qū)以及具有SEQIDNO:44所示氨基酸序列的輕鏈CDR3區(qū)的人結(jié)合分子，k)包含具有SEQIDNO:45所示氨基酸序列的重鏈CDR1區(qū)、具有SEQIDNO:46所示氨基酸序列的重鏈CDR2區(qū)、具有SEQIDNO:47所示氨基酸序列的重鏈CDR3區(qū)、具有SEQIDNO:7所示氨基酸序列的輕鏈CDR1區(qū)、具有SEQIDNO:8所示氨基酸序列的輕鏈CDR2區(qū)以及具有SEQIDNO:48所示氨基酸序列的輕鏈CDR3區(qū)的人結(jié)合分子，l)包含具有SEQIDNO:l所示氨基酸序列的重鏈CDR1區(qū)、具有SEQIDNO:49所示氨基酸序列的重鏈CDR2區(qū)、具有SEQIDNO:50所示氨基酸序列的重鏈CDR3區(qū)、具有SEQIDNO:33所示氨基酸序列的輕鏈CDR1區(qū)、具有SEQIDNO:34所示氨基酸序列的輕鏈CDR2區(qū)以及具有SEQIDNO:51所示氨基酸序列的輕鏈CDR3區(qū)的人結(jié)合分子，m)包含具有SEQIDNO:52所示氨基酸序列的重鏈CDR1區(qū)、具有SEQIDNO:53所示氨基酸序列的重鏈CDR2區(qū)、具有SEQIDNO:54所示氨基酸序列的重鏈CDR3區(qū)、具有SEQIDNO:55所示氨基酸序列的輕鏈CDR1區(qū)、具有SEQIDNO:56所示氨基酸序列的輕鏈CDR2區(qū)以及具有SEQIDNO:57所示氨基酸序列的輕鏈CDR3區(qū)的人結(jié)合分子，n)包含具有SEQIDNO:262所示氨基酸序列的重鏈CDR1區(qū)、具有SEQIDNO:263所示氨基酸序列的重鏈CDR2區(qū)、具有SEQIDNO:264所示氨基酸序列的重鏈CDR3區(qū)、具有SEQIDNO:265所示氨基酸序列的輕鏈CDR1區(qū)、具有SEQIDNO:266所示氨基酸序列的輕鏈CDR2區(qū)以及具有SEQIDNO:267所示氨基酸序列的輕鏈CDR3區(qū)的人結(jié)合分子，o)包含具有SEQIDNO:268所示氨基酸序列的重鏈CDR1區(qū)、具有SEQIDNO:269所示氨基酸序列的重鏈CDR2區(qū)、具有SEQIDNO:270所示氨基酸序列的重鏈CDR3區(qū)、具有SEQIDNO:271所示氨基酸序列的輕鏈CDR1區(qū)、具有SEQIDNO:272所示氨基酸序列的輕鏈CDR2區(qū)以及具有SEQIDNO:273所示氨基酸序列的輕鏈CDR3區(qū)的人結(jié)合分子，p)包含具有SEQIDNO:274所示氨基酸序列的重鏈CDR1區(qū)、具有SEQIDNO:275所示氨基酸序列的重鏈CDR2區(qū)、具有SEQIDNO:276所示氨基酸序列的重鏈CDR3區(qū)、具有SEQIDNO:277所示氨基酸序列的輕鏈CDR1區(qū)、具有SEQIDNO:278所示氨基酸序列的輕鏈CDR2區(qū)以及具有SEQIDNO:279所示氨基酸序列的輕鏈CDR3區(qū)的人結(jié)合分子，q)包含具有SEQIDNO:280所示氨基酸序列的重鏈CDR1區(qū)、具有SEQIDNO:281所示氨基酸序列的重鏈CDR2區(qū)、具有SEQIDNO:282所示氨基酸序列的重鏈CDR3區(qū)、具有SEQIDNO:283所示氨基酸序列的輕鏈CDR1區(qū)、具有SEQIDNO:284所示氨基酸序列的輕鏈CDR2區(qū)以及具有SEQIDNO:285所示氨基酸序列的輕鏈CDR3區(qū)的人結(jié)合分子，r)包含具有SEQIDNO:286所示氨基酸序列的重鏈CDR1區(qū)、具有SEQIDNO:287所示氨基酸序列的重鏈CDR2區(qū)、具有SEQIDNO:288所示氨基酸序列的重鏈CDR3區(qū)、具有SEQIDNO:289所示氨基酸序列的輕鏈CDR1區(qū)、具有SEQIDNO:290所示氨基酸序列的輕鏈CDR2區(qū)以及具有SEQIDNO:291所示氨基酸序列的輕鏈CDR3區(qū)的人結(jié)合分子，s)包含具有SEQIDNO:292所示氨基酸序列的重鏈CDR1區(qū)、具有SEQIDNO:293所示氨基酸序列的重鏈CDR2區(qū)、具有SEQIDNO:294所示氨基酸序列的重鏈CDR3區(qū)、具有SEQIDNO:295所示氨基酸序列的輕鏈CDRl區(qū)、具有SEQIDNO:296所示氨基酸序列的輕鏈CDR2區(qū)以及具有SEQIDNO:297所示氮基酸序列的輕鏈CDR3區(qū)的人結(jié)合分子，t)包含具有SEQIDNO:304所示氨基酸序列的重鏈CDR1區(qū)、具有SEQIDNO:305所示氨基酸序列的重鏈CDR2區(qū)、具有SEQIDNO:306所示氨基酸序列的重鏈CDR3區(qū)、具有SEQIDNO:307所示氨基酸序列的輕鏈CDR1區(qū)、具有SEQIDNO:308所示氨基酸序列的輕鏈CDR2區(qū)以及具有SEQIDNO:309所示氨基酸序列的輕鏈CDR3區(qū)的人結(jié)合分子，u)包含具有SEQIDNO:310所示氨基酸序列的重鏈CDR1區(qū)、具有SEQIDNO:311所示氨基酸序列的重鏈CDR2區(qū)、具有SEQIDNO:312所示氨基酸序列的重鏈CDR3區(qū)、具有SEQIDNO:313所示氨基酸序列的輕鏈CDR1區(qū)、具有SEQIDNO:314所示氨基酸序列的輕鏈CDR2區(qū)以及具有SEQIDNO:315所示氨基酸序列的輕鏈CDR3區(qū)的人結(jié)合分子，v)包含具有SEQIDNO:238所示氨基酸序列的重鏈CDRl區(qū)、具有SEQIDNO:239所示氨基酸序列的重鏈CDR2區(qū)、具有SEQIDNO:240所示氨基酸序列的重鏈CDR3區(qū)、具有SEQIDNO:241所示氨基酸序列的輕鏈CDR1區(qū)、具有SEQIDNO:242所示氨基酸序列的輕鏈CDR2區(qū)以及具有SEQIDNO:243所示氨基酸序列的輕鏈CDR3區(qū)的人結(jié)合分子，w)包含具有SEQIDNO:244所示氨基酸序列的重鏈CDR1區(qū)、具有SEQIDNO:245所示氨基酸序列的重鏈CDR2區(qū)、具有SEQIDNO:246所示氨基酸序列的重鏈CDR3區(qū)、具有SEQIDNO:247所示氨基酸序列的輕鏈CDR1區(qū)、具有SEQIDNO:248所示氨基酸序列的輕鏈CDR2區(qū)以及具有SEQIDNO:249所示氨基酸序列的輕鏈CDR3區(qū)的人結(jié)合分子，x)包含具有SEQIDNO:250所示氨基酸序列的重鏈CDR1區(qū)、具有SEQIDNO:251所示氨基酸序列的重鏈CDR2區(qū)、具有SEQIDNO.252所示氨基酸序列的重鏈CDR3區(qū)、具有SEQIDN0:253所示氨基酸序列的輕鏈CDR1區(qū)、具有SEQIDNO:254所示氨基酸序列的輕鏈CDR2區(qū)以及具有SEQIDNO:255所示氨基酸序列的輕鏈CDR3區(qū)的人結(jié)合分子，y)包含具有SEQIDNO:256所示氨基酸序列的重鏈CDR1區(qū)、具有SEQIDNO:257所示氨基酸序列的重鏈CDR2區(qū)、具有SEQIDNO:258所示氨基酸序列的重鏈CDR3區(qū)、具有SEQIDNO:259所示氨基酸序列的輕鏈CDR1區(qū)、具有SEQIDNO:260所示氨基酸序列的輕鏈CDR2區(qū)以及具有SEQIDNO:261所示氨基酸序列的輕鏈CDR3區(qū)的人結(jié)合分子，以及z)包含具有SEQIDNO:298所示氨基酸序列的重鏈CDR1區(qū)、具有SEQIDNO:299所示氨基酸序列的重鏈CDR2區(qū)、具有SEQIDNO:300所示氨基酸序列的重鏈CDR3區(qū)、具有SEQIDNO:301所示氨基酸序列的輕鏈CDR1區(qū)、具有SEQIDNO:302所示氨基酸序列的輕鏈CDR2區(qū)以及具有SEQIDNO:303所示氨基酸序列的輕鏈CDR3區(qū)的人結(jié)合分子。在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子包含具有SEQIDNO:l所示氨基酸序列的重鏈CDR1區(qū)、具有SEQIDNO:2所示氨基酸序列的重鏈CDR2區(qū)及具有SEQIDNO:3所示氨基酸序列的重鏈CDR3區(qū)。本發(fā)明的結(jié)合分子的CDR區(qū)在表7中示出。根據(jù)Kabat"a/.(1991)所述，CDR區(qū)是免疫學(xué)感興趣的蛋白質(zhì)的序列。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，結(jié)合分子可包含本文揭示的二、三、四、五或者所有六個(gè)CDR區(qū)。優(yōu)選地，本發(fā)明的結(jié)合分子包含本文揭示的至少兩個(gè)CDR。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子包含VH種系VH1-69(見TomlinsonIM,WilliamsSC，IgnatovitchO,CorbettSJ，WinterG.V隱BASESequenceDirectory.CambridgeUnitedKingdom:MRCCentreforProteinEngineering(1997))。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子包含重鏈，所述重鏈包含具有選自如下一組中的氨基酸序列的可變重鏈SEQIDNO:59、SEQIDNO:61、SEQIDNO:63、SEQIDNO:65、SEQIDNO:67、SEQIDNO:69、SEQIDNO:71、SEQIDNO:73、SEQIDNO:75、SEQIDNO:77、SEQIDNO:79、SEQIDNO:81、SEQIDNO:83、SEQIDNO:317、SEQIDNO:321、SEQIDNO:325、SEQIDNO:329、SEQIDNO:333、SEQIDNO:337、SEQIDNO:341、SEQIDNO:345、SEQIDNO:349、SEQIDNO:353、SEQIDNO:357、SEQIDNO:361和SEQIDNO:365。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子包含輕鏈，所述輕鏈包含具有選自如下一組中的氨基酸序列的可變輕鏈SEQIDNO:85、SEQIDNO:87、SEQIDNO:89、SEQIDNO:91、SEQIDNO:93、SEQIDNO:95、SEQIDNO:97、SEQIDNO:99、SEQIDNO:101、SEQIDNO:103、SEQIDNO:105、SEQIDNO:107、SEQIDNO:109、SEQIDNO:319、SEQIDNO:323、SEQIDNO:327、SEQIDNO:331、SEQIDNO:335、SEQIDNO:339、SEQIDNO:343、SEQIDNO:347、SEQIDNO:351、SEQIDNO:355、SEQIDNO:359、SEQIDNO:363和SEQIDNO:367。表8列出了本發(fā)明結(jié)合分子的重鏈和輕鏈可變區(qū)。本發(fā)明的另一方面包括本文所述結(jié)合分子的功能變體。如果變體能與親代結(jié)合分子競(jìng)爭(zhēng)特異性結(jié)合流感病毒H5N1或其片段，則認(rèn)為該變體分子是本發(fā)明結(jié)合分子的功能變體。換句話說，所述功能變體仍能結(jié)合流感病毒H5N1或其片段。優(yōu)選地，所述功能變體能競(jìng)爭(zhēng)性特異性結(jié)合由親代結(jié)合分子特異性結(jié)合的至少兩(或更多個(gè))不同的流感病毒H5N1毒株或其片段。此外，如果某分子對(duì)于親代結(jié)合分子對(duì)其具有中和活性的流感病毒H5N1、優(yōu)選對(duì)于至少兩(或多個(gè))流感病毒H5N1毒株具有中和活性，則認(rèn)為該分子是本發(fā)明結(jié)合分子的功能變體。功能變體包括但不限于一級(jí)結(jié)構(gòu)序列基本相似、但是含有例如在親代結(jié)合分子中未發(fā)現(xiàn)的體外或體內(nèi)化學(xué)和/或生物化學(xué)修飾的衍生物。這種修飾包括乙?；?、?；⒑塑账峄蛘吆塑账嵫苌锏墓矁r(jià)附著、脂質(zhì)或者脂質(zhì)衍生物的共價(jià)附著、交聯(lián)、二硫鍵形成、糖基化、羥基化、甲基化、氧化、聚乙二醇化、蛋白酶解加工、磷酸化等?；蛘?，功能變體可以是本發(fā)明所述的結(jié)合分子，其包含這樣的氨基酸序列，所述氨基酸序列與親代結(jié)合分子的氨基酸序列相比含有一或多個(gè)氨基酸的取代、插入、缺失或者這種修飾的組合。此外，功能變體可包含氨基酸序列在氨基末端或者羧基末端或者這兩端的截短。本發(fā)明的功能變體與親代結(jié)合分子相比可具有相同或不同的、更高或更低的結(jié)合親和性，但是仍能結(jié)合流感病毒H5N1或其片段。例如，本發(fā)明的功能變體與親代結(jié)合分子相比對(duì)于流感病毒H5N1或其片段可具有增加或降低的結(jié)合親和性。優(yōu)選地，可變區(qū)包括但不限于構(gòu)架區(qū)、高變區(qū)、特別是CDR3區(qū)的氨基酸序列被修飾。通常，輕鏈和重鏈可變區(qū)包含三個(gè)高變區(qū)，包括三個(gè)CDR，以及更保守的區(qū)域，即所謂的構(gòu)架區(qū)(FR)。高變區(qū)包含來自CDR的氨基酸殘基和來自高變環(huán)的氨基酸殘基。在本發(fā)明范圍內(nèi)的功能變體與本文所述親代結(jié)合分子具有至少大約50%至大約99%、優(yōu)選至少大約60°/。至大約99%、更優(yōu)選至少大約70%至大約99%、甚至更優(yōu)選至少大約80%至大約99°/。、最優(yōu)選至少大約卯°/。至大約99%、特別是至少大約95%至大約99%，以及特別是至少大約97%至大約99%的氨基酸序列同源性。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的計(jì)算機(jī)算法如Gap或者Bestfit可用于最佳地排列氨基酸序列以進(jìn)行對(duì)比以及明確相似或相同的氨基酸殘基。功能變體可以通過使用本領(lǐng)域已知的普通分子生物學(xué)方法改變親代結(jié)合分子或其一部分而獲得，所述方法包括但不限于易錯(cuò)PCR、寡核苷酸指導(dǎo)的誘變、定點(diǎn)誘變以及重鏈和/或輕鏈改組法。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的功能變體對(duì)于流感病毒H5N1具有中和活性。所述中和活性與親代結(jié)合分子相比可以相同或者更高或更低。此后，當(dāng)使用術(shù)語(人)結(jié)合分子時(shí)，其也涵蓋所述(人)結(jié)合分子的功能變體。另一方面，本發(fā)明包括免疫綴合物，即包含本文所述至少一個(gè)結(jié)合分子以及進(jìn)一步包含至少一個(gè)標(biāo)記如可檢測(cè)的部分/物質(zhì)的分子。本發(fā)明還涉及本發(fā)明免疫綴合物的混合物或者至少一種本發(fā)明免疫綴合物與另一分子的混合物，所述另一分子如治療劑或者另一結(jié)合分子或免疫綴合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫綴合物可包含一個(gè)以上的標(biāo)記。這些標(biāo)記可以彼此相同或不同，并且可以與結(jié)合分子非共價(jià)地結(jié)合/綴合。所述標(biāo)記也可以通過共價(jià)鍵與人結(jié)合分子直接結(jié)合/綴合。或者，所述標(biāo)記可以通過一或多種連接化合物與所述結(jié)合分子結(jié)合/綴合。標(biāo)記與結(jié)合分子的綴合技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。本發(fā)明的免疫綴合物的標(biāo)記可以是治療劑，但是它們也可以是可檢測(cè)的部分/物質(zhì)。適于治療和/或預(yù)防的標(biāo)記可以是毒素或者其功能部分、抗生素、酶、增強(qiáng)吞噬作用或者免疫刺激作用的其它結(jié)合分子。包含可檢測(cè)物質(zhì)的免疫綴合物可診斷性地用于例如評(píng)定對(duì)象是否已經(jīng)感染流感病毒H5N1毒株或者作為臨床實(shí)驗(yàn)程序的一部分監(jiān)測(cè)流感病毒H5N1感染的發(fā)生或進(jìn)展以例如確定指定治療方案的功效。然而，它們也可以用于其它檢測(cè)和域分析和減診斷目的。可檢測(cè)的部分/物質(zhì)包括但不限于酶、輔基、熒光材料、發(fā)光材料，生物發(fā)光材料、放射性材料、正電子發(fā)射金屬以及非放射性順磁性金屬離子。為了檢測(cè)和/或分析和/或診斷目的用于標(biāo)記結(jié)合分子的標(biāo)記依賴于使用的特定檢測(cè)/分析/診斷技術(shù)和/或方法例如免疫組織化學(xué)染色(組織)樣品、流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)、激光掃描細(xì)胞計(jì)量術(shù)檢測(cè)、熒光免疫測(cè)定、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、放射免疫測(cè)定(RIA)、生物測(cè)定(例如吞噬作用測(cè)定)、蛋白質(zhì)印跡應(yīng)用等。對(duì)于本領(lǐng)域已知的檢測(cè)/分析/診斷技術(shù)和/或方法合適的標(biāo)記為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。此外，本發(fā)明的人結(jié)合分子或者免疫綴合物也可以附著于固體支持物上，其特別用于流感病毒H5N1或其片段的體外免疫測(cè)定或者純化。這種固體支持物可以是多孔或者無孔的、平面或非平面的。本發(fā)明的結(jié)合分子可以與標(biāo)記序列如肽融合以便于純化。所述標(biāo)記序列的例子包括但不限于六組氨酸標(biāo)記、血凝素(HA)標(biāo)記、myc標(biāo)記或者flag標(biāo)記?；蛘?，一種抗體可以與另一種抗體綴合形成抗體異源綴合物(heteroconjugate)。另一方面，本發(fā)明的結(jié)合分子可以與一或多個(gè)抗原綴合/附著。優(yōu)選地，這些抗原是由給予了結(jié)合分子-抗原綴合物的對(duì)象的免疫系統(tǒng)識(shí)別的抗原。所述抗原可以彼此相同，但也可以是不同的。使附著抗原和結(jié)合分子的綴合方法為本領(lǐng)域所熟知，包括但不限于使用交聯(lián)劑。本發(fā)明的結(jié)合分子結(jié)合流感病毒H5N1并且附著于結(jié)合分子的抗原將引發(fā)對(duì)于所述綴合物的有力T細(xì)胞攻擊，最終導(dǎo)致流感病毒H5N1的破壞。除了通過直接或間接(例如通過接頭)綴合而化學(xué)產(chǎn)生免疫綴合物之外，所述免疫綴合物可以作為融合蛋白而產(chǎn)生，所述融合蛋白包含本發(fā)明的結(jié)合分子及合適的標(biāo)記。融合蛋白可以通過本領(lǐng)域已知方法產(chǎn)生，例如通過構(gòu)建核酸分子以及隨后表達(dá)所述核酸分子而重組產(chǎn)生，所述核酸分子包含符合讀框的編碼結(jié)合分子的核苷酸序列以及編碼合適標(biāo)記的核苷酸序列。本發(fā)明另一方面提供了編碼本發(fā)明的至少一種結(jié)合分子、其功能變體或者免疫綴合物的核酸分子。這種核酸分子可以用作中間物以進(jìn)行克隆，例如用于如上述的親和力成熟方法中。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸分子是分離或純化的。技術(shù)人員將意識(shí)到這些核酸分子的功能變體也是本發(fā)明的一部分。功能變體是這樣的核酸序列，通過使用標(biāo)準(zhǔn)遺傳密碼可以將其直接翻譯以提供與從親代核酸分子中翻譯的序列相同的氨基酸序列。優(yōu)選地，所述核酸分子編碼包含上述CDR區(qū)的結(jié)合分子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸分子編碼包含本發(fā)明的結(jié)合分子的2、3、4、5或者甚至所有6個(gè)CDR區(qū)的結(jié)合分子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸分子編碼包含重鏈的結(jié)合分子，所述重鏈包含上述可變重鏈序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸分子編碼包含輕鏈的結(jié)合分子，所述輕鏈包含上述可變輕鏈序列。本發(fā)明的結(jié)合分子的核苷酸序列在實(shí)施例章節(jié)中提供(見例如表6和表8)。本發(fā)明另一方面提供了載體，即核酸構(gòu)建體，其包含一或多個(gè)本發(fā)明的核酸分子。載體可以衍生自質(zhì)粒如F、Rl、RP1、Col、pBR322、TOL、Ti等；粘粒；噬菌體如X噬菌體、X形噬菌體、M13、Mu、Pl、P22、QP、T-even、T-odd、T2、T4、T7等；植物病毒。載體可用于克隆和/或表達(dá)本發(fā)明的結(jié)合分子，甚至可用于基因治療目的。本發(fā)明也包含與一或多個(gè)表達(dá)調(diào)節(jié)核酸分子可操縱地連接的包含本發(fā)明的一或多個(gè)核酸分子的載體。載體的選擇依賴于隨后的重組程序以及使用的宿主。將載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中可以通過如下方法實(shí)現(xiàn)磷酸鈣轉(zhuǎn)染、病毒感染、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、lipofectamin轉(zhuǎn)染或者電穿孔。載體可以自主復(fù)制或者可以與其整合進(jìn)入其中的染色體一起復(fù)制。優(yōu)選地，所述載體含有一或多個(gè)選擇標(biāo)記。標(biāo)記的選擇依賴于選擇的宿主細(xì)胞，盡管如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知-這對(duì)于本發(fā)明不是至關(guān)重要的。所述標(biāo)記包括但不限于卡那霉素、新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、zeodn、單純皰疹病毒的胸苷激酶基因(HSV-TK)、小鼠的二氫葉酸還原酶基因(dhfr)。本發(fā)明也包括這樣的載體，其包含與編碼可用于分離人結(jié)合分子的蛋白質(zhì)或肽的一或多個(gè)核酸分子可操縱地連接的編碼人結(jié)合分子的一或多個(gè)核酸分子。這些蛋白質(zhì)或肽包括但不限于谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、麥芽糖結(jié)合蛋白、結(jié)合金屬的多組氨酸、綠色熒光蛋白、熒光素酶以及p-半乳糖苷酶。含有上述載體的一或多個(gè)拷貝的載體的宿主是本發(fā)明的另一方面。優(yōu)選地，所述宿主是宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞包括但不限于源于哺乳動(dòng)物、植物、昆蟲、真菌或者細(xì)菌的細(xì)胞。細(xì)菌細(xì)胞包括但不限于革蘭氏陽性菌或者革蘭氏陰性菌的細(xì)胞，例如腸桿菌屬的一些菌種如大腸桿菌(￡.CO//)以及假單胞菌屬。在真菌細(xì)胞中，優(yōu)選使用酵母細(xì)胞。在酵母中的表達(dá)可以通過使用酵母菌株而實(shí)現(xiàn)，所述酵母菌株如巴斯德畢赤酵母(i^/n'apwto^)、釀酒酵母(S"cc/wrcw拜jcerev/w'ae)和多形漢遜酵母(J7flw鄉(xiāng)w/a;o—o一a)。此外，昆蟲細(xì)胞如果蠅和Sf9細(xì)胞可以用作宿主細(xì)胞。除此之外，宿主細(xì)胞可以是植物細(xì)胞，例如農(nóng)作物如森林植物的細(xì)胞，或者提供食品和原材料的植物細(xì)胞，如谷類植物或者藥用植物，或者觀賞植物的細(xì)胞，或者花球根農(nóng)作物(flowerbulbcrop)的細(xì)胞。轉(zhuǎn)化的(轉(zhuǎn)基因)植物或植物細(xì)胞通過已知方法產(chǎn)生，例如農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移、葉盤轉(zhuǎn)化、通過聚乙二醇誘導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移進(jìn)行的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、電穿孔、超聲、顯微注射或者bolistic基因轉(zhuǎn)移法。另外，合適的表達(dá)系統(tǒng)可以是桿狀病毒系統(tǒng)。本發(fā)明優(yōu)選使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)，例如中國(guó)倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、COS細(xì)胞、BHK細(xì)胞、NSO細(xì)胞或者Bowes黑素瘤細(xì)胞。哺乳動(dòng)物細(xì)胞提供具有翻譯后修飾的表達(dá)的蛋白質(zhì)，與哺乳動(dòng)物來源的天然分子最相似。由于本發(fā)明涉及給予人的分子，因此特別優(yōu)選完全人表達(dá)系統(tǒng)。因此，更優(yōu)選的宿主細(xì)胞是人細(xì)胞。人細(xì)胞的例子是HeLa、911、AT1080、A549、293和HEK293T細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，人生產(chǎn)細(xì)胞包含可表達(dá)形式的編碼腺病毒El區(qū)的核酸序列的至少功能部分。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞衍生自人視網(wǎng)膜并且用包含腺病毒E1序列的核酸永生化，例如911細(xì)胞或者于1996年2月29日保藏在位于CAMR，Salisbury,WiltshireSP4OJG，GreatBritain的歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物中心(EuropeanCollectionofCellCultures(ECACC》中的細(xì)胞系，保藏號(hào)為96022940，以PER.C6(PER.C6是CrucdlHollandB.V.的注冊(cè)商標(biāo))商標(biāo)銷售。為本申請(qǐng)的目的，"PER.C6細(xì)胞"是指以保藏號(hào)96022940保藏的細(xì)胞或者祖細(xì)胞，保藏細(xì)胞的祖細(xì)胞的上游或下游傳代和后代以及子代，以及任何前述細(xì)胞的衍生物。在宿主細(xì)胞中重組蛋白的產(chǎn)生可以根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法進(jìn)行。以PERX:6^商標(biāo)銷售的細(xì)胞作為感興趣的蛋白質(zhì)的生產(chǎn)平臺(tái)的應(yīng)用在WO00/63403中描述，所述文獻(xiàn)以其全部?jī)?nèi)容并入本文作參考。產(chǎn)生本發(fā)明的結(jié)合分子的方法是本發(fā)明的另一部分。所述方法包括如下步驟a)在有益于結(jié)合分子表達(dá)的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的宿主，b)任選地回收表達(dá)的結(jié)合分子。表達(dá)的結(jié)合分子可以從無細(xì)胞提取物中回收，但是優(yōu)選從培養(yǎng)基中回收。上述產(chǎn)生方法也可用于產(chǎn)生本發(fā)明的結(jié)合分子和/或免疫綴合物的功能變體。從無細(xì)胞提取物或者培養(yǎng)基中回收蛋白質(zhì)如結(jié)合分子的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。通過上述方法可獲得的結(jié)合分子、其功能變體和/或免疫綴合物也是本發(fā)明的一部分。或者，在宿主如宿主細(xì)胞中表達(dá)之后，本發(fā)明的結(jié)合分子和免疫綴合物可以通過常規(guī)的肽合成儀合成產(chǎn)生或者在無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)中使用衍生自本發(fā)明的DNA分子的RNA核酸合成產(chǎn)生。通過上述合成產(chǎn)生方法或者無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)可獲得的結(jié)合分子和免疫綴合物也是本發(fā)明的一部分。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子也可以在轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物如兔、山羊或者牛中產(chǎn)生，并且分泌進(jìn)例如其乳中。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子、優(yōu)選特異性結(jié)合流感病毒H5N1或其片段的人結(jié)合分子可以由表達(dá)人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物如轉(zhuǎn)基因小鼠或兔產(chǎn)生。優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物具有這樣的基因組，其包含如上述編碼所有或部分人結(jié)合分子的人重鏈轉(zhuǎn)基因和人輕鏈轉(zhuǎn)基因。所述轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物可以用純化的或者富集的流感病毒H5N1或其片段的制備物免疫接種。免疫接種非人哺乳動(dòng)物的方案在本令員域己纟圣充分建立。見UsingAntibodies:ALaboratoryManual,Editedby:E.Harlow,D.Lane(1998),ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NewYork禾口CurrentProtocolsinImmunology,Editedby:丄E.Coligan,A.M.Kruisbeek，D.H.Margulies,E.M.Shevach，W.Strober(2001)，JohnWiley&SonsInc.,NewYork,所述文獻(xiàn)均并入本文作參考。免疫接種方案通常包括有或無佐劑的多次免疫接種，所述佐劑如弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑，也可以包括裸DNA免疫接種方法。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述人結(jié)合分子由衍生自所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的B細(xì)胞、漿細(xì)胞和/或記憶細(xì)胞產(chǎn)生。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述人結(jié)合分子由雜交瘤產(chǎn)生，所述雜交瘤是通過得自上述轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物的B細(xì)胞與永生化細(xì)胞融合而制備的。可得自上述轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物的B細(xì)胞、漿細(xì)胞和雜交瘤以及可得自上述轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物、B細(xì)胞、漿細(xì)胞和/或記憶細(xì)胞和雜交瘤的人結(jié)合分子也是本發(fā)明的一部分。另一方面，本發(fā)明提供了鑒別特異性結(jié)合流感病毒H5N1的結(jié)合分子或者編碼這種結(jié)合分子的核酸分子的方法，所述結(jié)合分子例如是人結(jié)合分子如人單克隆抗體或其片段，所述方法包括如下步驟(a)在有益于結(jié)合的條^f牛下將可復(fù)制遺傳包裝(geneticpackage)表面上的結(jié)合分子集合與流感病毒H5N1或其片段接觸，(b)至少選擇一次與流感病毒H5N1或其片段結(jié)合的可復(fù)制遺傳包裝，(c)從與流感病毒H5N1或其片段不結(jié)合的可復(fù)制遺傳包裝中分離并回收與流感病毒H5N1或其片段結(jié)合的可復(fù)制遺傳包裝。如本文所用，可復(fù)制遺傳包裝可以是原核或者真核生物，包括細(xì)胞、孢子、酵母、細(xì)菌、病毒、(細(xì)菌)噬菌體、核糖體和多核糖體。優(yōu)選的可復(fù)制遺傳包裝是噬菌體。所述結(jié)合分子例如單鏈Fv展示在可復(fù)制遺傳包裝上，即它們附著于位于可復(fù)制遺傳包裝外表面的基團(tuán)或分子。所述可復(fù)制遺傳包裝是可篩選的單位，其包含與編碼結(jié)合分子的核酸分子連接的待被篩選的結(jié)合分子。所述核酸分子應(yīng)可以在體內(nèi)(例如作為載體)或者體外(例如通過PCR、轉(zhuǎn)錄和翻譯)復(fù)制。體內(nèi)復(fù)制可以是自主復(fù)制(就細(xì)胞而言)，借助于宿主因子復(fù)制(就病毒而言)或者借助于宿主和輔助病毒二者復(fù)制(就噬菌粒而言)。展示結(jié)合分子集合的可復(fù)制遺傳包裝是這樣形成的，即將編碼待被展示的外源結(jié)合分子的核酸分子導(dǎo)入可復(fù)制遺傳包裝的基因組中以與從可復(fù)制遺傳包裝的外表面正常表達(dá)的內(nèi)源蛋白形成融合蛋白。所述融合蛋白的表達(dá)、轉(zhuǎn)運(yùn)至外表面及組裝導(dǎo)致外源結(jié)合分子從可復(fù)制遺傳包裝的外表面展示。本發(fā)明方法中的選擇步驟可以用流感病毒H5N1進(jìn)行，所述病毒是活的且仍具有感染性或者是失活的。流感病毒H5N1的失活可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的病毒失活方法進(jìn)行，例如用甲醛、P-丙酸內(nèi)酯(BPL)、硫柳汞和/或紫外線處理。檢測(cè)流感病毒H5N1是否仍是活的、感染性的和/或可存活或者部分或完全失活的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。上述方法中使用的流感病毒H5N1可以是未分離的，例如存在于被感染的個(gè)體的血清和/或血液中。使用的流感病毒H5N1也可以分離自于合適培養(yǎng)基中的細(xì)胞培養(yǎng)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，流感病毒H5N1當(dāng)與可復(fù)制遺傳包裝接觸時(shí)是在懸浮液中?；蛘撸?dāng)發(fā)生接觸時(shí)，它們也可以與載體偶聯(lián)。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一次和進(jìn)一步的選擇可以針對(duì)同一進(jìn)化枝的流感病毒H5N1毒株進(jìn)行?；蛘?，第一次和進(jìn)一步的選擇可以針對(duì)不同進(jìn)化枝的流感病毒H5N1毒株進(jìn)行(例如第一次選擇針對(duì)進(jìn)化枝1毒株進(jìn)行，第二次選擇針對(duì)進(jìn)化枝2或3毒株進(jìn)行)。或者，選擇步驟可以在存在流感病毒H5N1的片段例如細(xì)胞膜制備物、重組H5N1蛋白或多肽、包含H5N1蛋白或多肽的融合蛋白、表達(dá)重組H5N1的蛋白質(zhì)或多肽的細(xì)胞等的條件下進(jìn)行。這些蛋白質(zhì)或多肽的胞外暴露部分也可以用作選擇材料。流感病毒H5N1的片段在使用之前可以被固定在合適的材料上或者可以懸浮液使用。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述選擇可以針對(duì)流感病毒H5N1的不同片段或者不同流感病毒H5N1毒株的片段進(jìn)行。發(fā)現(xiàn)合適的選擇組合為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知?？梢酝ㄟ^ELISA或FACS進(jìn)行選擇。再一方面，本發(fā)明提供了獲得特異性結(jié)合流感病毒H5N1毒株或其片段的結(jié)合分子或者編碼這種結(jié)合分子的核酸分子的方法，其中所述方法包括如下步驟a)進(jìn)行上述鑒別結(jié)合分子的方法，b)從回收的可復(fù)制遺傳包裝中分離所述結(jié)合分子和/或編碼所述結(jié)合分子的核酸分子?？蓮?fù)制遺傳包裝表面上的結(jié)合分子的集合可以是scFv或Fab的集合。一旦用上述鑒別結(jié)合分子或者編碼所述結(jié)合分子的核酸分子的方法確定或鑒別了新的scFv或Fab，則可以從細(xì)菌或噬菌體中分離編碼所述scFv或Fab的DNA并與標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)組合產(chǎn)生編碼希望特異性的scFv、二價(jià)scFv、Fab或者完全人免疫球蛋白(例如IgG、IgA或IgM)的構(gòu)建體?？梢詫⑦@些構(gòu)建體轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞系中，最終可以產(chǎn)生完全人單克隆抗體(見HulsWa/.，1999;Boel2000)。如前所述，優(yōu)選的可復(fù)制遺傳包裝是噬菌體。鑒別并獲得(人)結(jié)合分子例如(人)單克隆抗體的噬菌體展示方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。所述方法例如在美國(guó)專利No.5,696，108;BurtonandBarbas，1994;deKruif"a/.，1995b;和PhageDisplay:ALaboratoryManual.Editedby:CFBarbas，DRBurton,JKScottandGJSilverman(2001)，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork中描述。所有這些參考文獻(xiàn)均以其全部?jī)?nèi)容并入本文作參考。為了構(gòu)建噬菌體展示文庫，使人單克隆抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)基因的集合在噬菌體優(yōu)選絲狀噬菌體、顆粒的表面上以例如單鏈Fv(scFv)或者Fab形式表達(dá)(見deKruif1995b)。表達(dá)抗體片段的噬菌體的大文庫典型含有超過1.0X109種抗體特異性，且可以從在免疫或未免疫的個(gè)體的B淋巴細(xì)胞中表達(dá)的免疫球蛋白V區(qū)組裝。在本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施方案中，結(jié)合分子的噬菌體文庫、優(yōu)選scFv噬菌體文庫是從分離自細(xì)胞的RNA中制備，所述細(xì)胞得自已經(jīng)接種流感病毒(例如H5N1)、最近接種不相關(guān)的病原體、最近經(jīng)歷流感病毒H5N1感染的對(duì)象的細(xì)胞或者得自健康個(gè)體的細(xì)胞。RNA可以分離自骨髓或者外周血，優(yōu)選分離自外周血淋巴細(xì)胞或者分離的B細(xì)胞或者甚至B細(xì)胞的亞群如記憶B細(xì)胞。所述對(duì)象可以是動(dòng)物，優(yōu)選人。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述文庫可以從由IgM記憶B細(xì)胞表達(dá)的免疫球蛋白V區(qū)組裝?；蛘?，噬菌體展示文庫可以從己經(jīng)在體外部分組裝的免疫球蛋白可變區(qū)中構(gòu)建以在文庫(半合成文庫)中導(dǎo)入另外的抗體多樣性。例如，在體外組裝的可變區(qū)在對(duì)于抗體特異性重要的那些分子區(qū)域(例如CDR區(qū))中含有合成產(chǎn)生的、隨機(jī)化或部分隨機(jī)化的DNA序列。特異于流感病毒H5N1的噬菌體抗體可以選自文庫，通過將病毒或其片段暴露于噬菌體文庫以使得結(jié)合表達(dá)特異于所述病毒或其片段的抗體片段的噬菌體。未結(jié)合的噬菌體通過洗滌除去，洗脫結(jié)合的噬菌體以感染大腸桿菌并隨后增殖。通常需要多次選擇和增殖循環(huán)以足以富集特異性結(jié)合所述病毒或其片段的噬菌體。如果需要，在噬菌體文庫暴露于所述病毒或其片段之前，可以首先通過將噬菌體文庫暴露于非靶材料如不同毒株的病毒或其片段(即非H5N1流感病毒)而消減所述噬菌體文庫。這些消減(siibtmctor)病毒或其片段可以與固相結(jié)合或者可以是在懸浮液中。也可以針對(duì)與復(fù)合抗原的結(jié)合選擇噬菌體，所述復(fù)合抗原例如是任選補(bǔ)加了其它材料的H5N1蛋白或(多)肽的復(fù)合混合物。表達(dá)流感病毒H5N1的一或多種蛋白質(zhì)或(多)肽的宿主細(xì)胞也可以用于選擇目的。使用這些宿主細(xì)胞的噬菌體展示方法可以通過如下方式得以擴(kuò)展和改良，所述方式是在篩選期間通過加入過量的不包含靶分子的宿主細(xì)胞或者包含與靶分子相似但不同的非靶分子的宿主細(xì)胞而消減不相關(guān)的結(jié)合物，從而強(qiáng)力地增加發(fā)現(xiàn)相關(guān)結(jié)合分子的機(jī)會(huì)。當(dāng)然，所述消減可以在用病毒或其片段篩選之前、期間或之后進(jìn)行。所述方法稱作MABSTRACT方法(MABSTRAC^是CrucellHollandB.V.的注冊(cè)商標(biāo)，也見于并入本文作參考的美國(guó)專利6,265,150)。再一方面，本發(fā)明提供了獲得潛在具有對(duì)于流感病毒H5N1、優(yōu)選至少進(jìn)化枝1、2和3的流感病毒H5N1毒株的中和活性的結(jié)合分子的方法，所述方法包括如下步驟(a)進(jìn)行如上述獲得特異性結(jié)合流感病毒H5N1或其片段的結(jié)合分子或者編碼這種結(jié)合分子的核酸分子的方法，(b)檢驗(yàn)分離的結(jié)合分子對(duì)于所述病毒、優(yōu)選對(duì)于至少進(jìn)化枝1和2的流感病毒H5N1毒株是否具有中和活性。檢驗(yàn)結(jié)合分子是否具有中和活性的測(cè)定方法為本領(lǐng)域所熟知(見WHOManualonAnimalInfluenzaDiagnosisandSurveillance,Geneva:WorldHealthOrganisation,2005version2002.5)。另一方面，本發(fā)明涉及通過上述方法可獲得的具有中和活性的結(jié)合分子。再一方面，本發(fā)明提供了包含至少本發(fā)明的結(jié)合分子優(yōu)選人單克隆抗體、至少其功能變體、至少本發(fā)明的免疫綴合物或者其組合的組合物。除此之外，所述組合物可包含穩(wěn)定分子如白蛋白或者聚乙二醇或者鹽。優(yōu)選地，所用的鹽是保留結(jié)合分子的希望的生物學(xué)活性且不導(dǎo)致任何不希望的毒性作用的鹽。如果需要，本發(fā)明的人結(jié)合分子可以包被于一種材料之中或之上以保護(hù)其免于酸的作用或可以使所述結(jié)合分子失活的其它天然或非天然條件的影響。再一方面，本發(fā)明提供了包含至少一種本發(fā)明核酸分子的組合物。所述組合物可包含水溶液如含有鹽(例如NaCl或者如上述鹽)、去污劑(例如SDS)和域其它合適成分的水溶液。此外，本發(fā)明涉及藥物組合物，其包含至少一種結(jié)合分子如本發(fā)明的人單克隆抗體(或其功能片段或變體)、至少一種本發(fā)明的免疫綴合物、至少一種本發(fā)明的組合物或其組合。本發(fā)明的藥物組合物進(jìn)一步包含至少一種藥物可接受的賦形劑。藥物可接受的賦形劑為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。本發(fā)明的藥物組合物可進(jìn)一步包含至少一種其它治療劑。合適的藥劑也為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物組合物可包含兩或多個(gè)對(duì)于流感病毒H5N1具有中和活性的結(jié)合分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)組合應(yīng)用時(shí)，所述結(jié)合分子呈現(xiàn)協(xié)同中和活性。換句話說，所述組合物包含至少兩種具有中和活性的結(jié)合分子，特征在于所述結(jié)合分子在中和流感病毒H5N1中起協(xié)同作用。如本文所用，術(shù)語"協(xié)同"是指當(dāng)組合應(yīng)用時(shí)，結(jié)合分子的組合作用高于單獨(dú)應(yīng)用時(shí)的加合作用。所述協(xié)同作用的結(jié)合分子可以結(jié)合流感病毒H5N1的相同或不同片段上的不同結(jié)構(gòu)。計(jì)算協(xié)同作用的方式是通過組合指數(shù)計(jì)算。組合指數(shù)(CI)的概念已經(jīng)由ChouandTalalay(1984)描述。所述組合物也可包含具有中和活性的一種結(jié)合分子以及一種非中和性H5N1特異性結(jié)合分子。所述非中和性及中和性H5N1特異性結(jié)合分子在中和流感病毒H5N1中也可以協(xié)同作用。本發(fā)明的藥物組合物可進(jìn)一步包含至少一種其它治療劑、預(yù)防劑和/或診斷劑。優(yōu)選地，所述藥物組合物包含至少一種其它預(yù)防劑和/或治療劑。優(yōu)選地，所述進(jìn)一步的治療劑和/或預(yù)防劑是能預(yù)防和/或治療流感病毒H5N1感染和/或得自這種感染的病癥的藥劑。所述治療劑和/或預(yù)防劑包括但不限于抗病毒劑。這種藥劑可以是結(jié)合分子、小分子、有機(jī)或無機(jī)化合物、酶、多核苷酸序列、抗病毒肽等。目前用于治療感染流感病毒H5N1患者的其它藥劑是M2抑制劑(例如amantidine、金剛乙胺)和/或神經(jīng)氨酸酶抑制劑(例如扎那米韋、奧司他韋)。這些藥劑可以與本發(fā)明的結(jié)合分子組合應(yīng)用。在實(shí)驗(yàn)階段的能預(yù)防和域治療流感病毒H5N1感染和/或得自這種感染的病癥的藥劑也可以用作可用于本發(fā)明的其它治療劑和/或預(yù)防劑。本發(fā)明的結(jié)合分子或藥物組合在用于人體之前可以在合適的動(dòng)物模型系統(tǒng)中檢測(cè)。這種動(dòng)物模型系統(tǒng)包括但不限于小鼠、雪貂(ferret)和猴。典型地，藥物組合物在生產(chǎn)和貯存條件下必須是無菌且穩(wěn)定的。本發(fā)明的結(jié)合分子、免疫綴合物、核酸分子或組合物可以是粉末形式，在輸送之前或者在輸送時(shí)在合適的藥物可接受的賦形劑中重建(reconstitution)。在用于制備無菌可注射溶液的無菌粉末的情況中，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥(凍干)，產(chǎn)生活性成分粉末加上來自先前過濾滅菌溶液的任何其它希望成分?；蛘撸景l(fā)明的結(jié)合分子、免疫綴合物、核酸分子或者組合物可以在溶液中并且在輸送之前或者輸送時(shí)可以加入或者與合適的藥物可接受的賦形劑混合以提供可注射形式的單位劑量。優(yōu)選地，本發(fā)明中使用的藥物可接受的賦形劑適于高藥物濃度，可以保持適當(dāng)流動(dòng)性，且如果需要時(shí)可以延遲吸收。藥物組合物的最佳給予途徑的選擇受到一些因素的影響，所述因素包括組合物中活性分子的物理-化學(xué)性質(zhì)、臨床狀況的緊急性以及活性分子的血漿濃度與希望的治療作用的關(guān)系。例如，如果需要，本發(fā)明的結(jié)合分子可以與載體一起制備，以保護(hù)其免于快速釋放，例如控制釋放配制品，包括植入體、經(jīng)皮貼劑以及微膠囊化輸送系統(tǒng)?？梢允褂每缮锝到獾摹⑸锵嗳莸木酆衔?，例如乙烯-醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、多正酯類以及聚乳酸。此外，也許必需用防止所述人結(jié)合分子失活的材料或化合物包被所述結(jié)合分子或者與這些材料或化合物一起給予所述結(jié)合分子。例如，所述結(jié)合分子可以在合適的載體中給予對(duì)象，所述載體例如是脂質(zhì)體或者稀釋劑。給予途徑可以分為兩種主要類型口服和胃腸外給予。優(yōu)選的給予途徑是靜脈內(nèi)給藥或者通過吸入?？诜┬涂梢耘渲茷槠瑒?tablets)、片劑(troches)、錠劑(lozenges)、水溶液懸浮液或者油懸浮液、可分散的粉末或顆粒、乳狀液、硬膠囊、軟明膠膠囊、糖漿或酏劑、丸劑、糖衣丸劑、液體、凝膠或者漿劑(slurries)。這些配方可含有藥物賦形劑，包括但不限于惰性稀釋劑、粒化劑和分解劑、結(jié)合劑、潤(rùn)滑劑、防腐劑、色素、調(diào)味劑或者甜味劑、植物油或礦物質(zhì)油、增濕劑以及增稠劑。本發(fā)明的藥物組合物也可以配制為用于胃腸外給藥。胃腸外給藥的制劑可以是水溶液或者非水溶液等滲無菌無毒注射或者灌注溶液或者懸浮液形式。所述溶液或懸浮液可包含在所用劑量和濃度對(duì)于受體無毒的物質(zhì)，例如l，3-丁二醇、Ringer's溶液、Hank's溶液、等滲氯化鈉溶液、油、脂肪酸、局部麻醉劑、防腐劑、緩沖液、增稠劑或增溶劑、水溶性抗氧化劑、油溶性抗氧化劑以及金屬螯合劑。另一方面，本發(fā)明的結(jié)合分子如人單克隆抗體(其功能片段和變體)、免疫綴合物、組合物或者藥物組合物可以用作藥物。因此，使用本發(fā)明的結(jié)合分子、免疫綴合物、組合物或者藥物組合物治療和/或預(yù)防流感病毒H5N1感染的方法是本發(fā)明的另一部分。上述分子可用于流感病毒H5N1感染的診斷、預(yù)防、治療或其組合中。它們適合治療經(jīng)歷流感病毒H5N1感染但仍未治療的患者以及已經(jīng)治療或者治療了流感病毒H5N1感染的患者。它們可用于這樣的患者，例如衛(wèi)生保健從業(yè)者、感染對(duì)象的親屬、(禽類)詞養(yǎng)者等。上述分子或組合物可以與可用于診斷、預(yù)防和/或治療的其它分子聯(lián)合應(yīng)用。它們可以在體外、離體(e;cwV^或在體內(nèi)使用。例如，本發(fā)明的結(jié)合分子如人單克隆抗體(或其功能變體)、免疫綴合物、組合物或者藥物組合物可以與流感病毒H5N1的疫苗(如果可獲得)共同給予?；蛘撸呙缫部梢栽诮o予本發(fā)明的分子之前或之后給予。代替疫苗，抗病毒劑也可以與本發(fā)明的結(jié)合分子聯(lián)合應(yīng)用。合適的抗病毒劑是上述那些。所述分子典型以治療或診斷有效量配制在本發(fā)明的組合物和藥物組合物中?；蛘?，它們可以單獨(dú)配制和給予。例如，其它分子如抗病毒劑可以全身性應(yīng)用，而本發(fā)明的結(jié)合分子可以靜脈內(nèi)給予?？梢哉{(diào)整給藥方案以提供最佳的所需應(yīng)答(例如治療應(yīng)答)。合適的劑量范圍可例如是0.1-100mg/kg體重，優(yōu)選0.5-15mg/kg體重。此外，例如可以給予一次推注、隨時(shí)間給予多次分開劑量或者根據(jù)治療情況的緊急性而可以按比例降低或增加劑量。本發(fā)明的分子和組合物優(yōu)選是無菌的。使得這些分子和組合物無菌的方法為本領(lǐng)域所熟知。用于診斷、預(yù)防和/或治療的其它分子可以以與本發(fā)明的結(jié)合分子相似的給藥方案給予。如果單獨(dú)給予其它分子，則可以在給予本發(fā)明的一或多種人結(jié)合分子或藥物組合物之前(例如2分鐘、5分鐘、10分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、60分鐘、2小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)、8小時(shí)、IO小時(shí)、12小時(shí)、14小時(shí)、16小時(shí)、18小時(shí)、20小時(shí)、22小時(shí)、24小時(shí)、2天、3天、4天、5天、7天、2周、4周或6周之前)、同時(shí)或者之后(例如2分鐘、5分鐘、IO分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、60分鐘、2小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)、8小時(shí)、10小時(shí)、12小時(shí)、14小時(shí)、16小時(shí)、18小時(shí)、20小時(shí)、22小時(shí)、24小時(shí)、2天、3天、4天、5天、7天、2周、4周或者6周之后)給予患者。對(duì)于人患者的精確給藥方案通常在臨床實(shí)驗(yàn)期間挑選出。當(dāng)作為體內(nèi)治療劑給予人時(shí)，人結(jié)合分子和包含所述人結(jié)合分子的藥物組合物是特別有益且通常是優(yōu)選的，因?yàn)槭荏w對(duì)于給予的抗體的免疫應(yīng)答通?；旧系陀诮o予單克隆鼠的、嵌合或人源化結(jié)合分子的應(yīng)答。另一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的結(jié)合分子如中和性人單克隆抗體(其功能片段和變體)、免疫綴合物、核酸分子、組合物或者藥物組合物在制備用于診斷、預(yù)防、治療流感病毒H5N1感染或其組合的藥物中的應(yīng)用。接下來，試劑盒也是本發(fā)明的一部分，所述試劑盒包含本發(fā)明的至少一種結(jié)合分子如中和性人單克隆抗體(其功能片段和變體)、至少一種免疫綴合物、至少一種核酸分子、至少一種組合物、至少一種藥物組合物、至少一種載體、至少一種宿主或其組合。任選地，本發(fā)明試劑盒的上述成分包裝在合適的容器中，并標(biāo)示出診斷、預(yù)防和/或治療指定病癥。上述成分可以貯存在單位劑量或者多劑量容器中，以水溶液優(yōu)選無菌水溶液形式或者作為待重建的凍干優(yōu)選無菌凍干制劑形式貯存。所述容器可以由各種材料制成，例如玻璃或者塑料，并且可具有無菌進(jìn)入孔(例如容器可以是靜脈內(nèi)注射溶液袋或者可由皮下注射針頭刺穿的塞子的小瓶)。所述試劑盒可進(jìn)一步包含多個(gè)容器，其中包含藥物可接受的緩沖液。所述試劑盒可進(jìn)一步包括為商業(yè)和使用者所需的其它材料，包括其它緩沖液、稀釋劑、過濾器、針頭、注射器、一或多種合適宿主的培養(yǎng)基，甚至可能包含至少一種其它治療劑、預(yù)防劑或診斷劑。該試劑盒附帶通常在治療、預(yù)防或診斷產(chǎn)品的商業(yè)包裝中包含的說明書，該說明書含有關(guān)于例如這種治療、預(yù)防或診斷產(chǎn)品的應(yīng)用的指征、使用方法、劑量、生產(chǎn)、給藥、禁忌癥和/或注意事項(xiàng)的信息。本發(fā)明進(jìn)一步涉及檢測(cè)樣品中流感病毒H5N1的方法，其中所述方法包括如下步驟(a)將樣品與診斷有效量的本發(fā)明的結(jié)合分子(其功能片段和變體)或者免疫綴合物接觸，(b)確定所述結(jié)合分子或者免疫綴合物是否特異性結(jié)合樣品的分子。所述樣品可以是來自(潛在)感染對(duì)象的生物學(xué)樣品，包括但不限于血液、血清、大便、唾液、鼻咽部吸出物(nasophargyalaspirates)、支氣管灌洗物(bronchiallavages)、尿液、組織或者其它生物學(xué)材料，或者非生物學(xué)樣品如水、飲料等。所述(潛在)感染對(duì)象可以是人，但是也可以對(duì)懷疑攜帶流感病毒H5N1的動(dòng)物進(jìn)行檢測(cè)所述病毒的存在情況，使用本發(fā)明的人結(jié)合分子或者免疫綴-合物進(jìn)行。首先可以對(duì)樣品進(jìn)行處理以使其更適于檢測(cè)方法。處理意味著對(duì)懷疑含有和/或含有所述病毒的樣品進(jìn)行處理，由此該病毒分解成抗原性成分如蛋白質(zhì)、(多)肽或者其它抗原性片段。優(yōu)選地，將本發(fā)明的人結(jié)合分子或者免疫綴合物與樣品在使得人結(jié)合分子與樣品中也許存在的病毒或其抗原性成分之間形成免疫復(fù)合物的條件下接觸。然后通過合適方式檢測(cè)和測(cè)量所述免疫復(fù)合物的形成，所述免疫復(fù)合物的形成表示樣品中存在所述病毒。這種方法包括均質(zhì)和異質(zhì)結(jié)合免疫測(cè)定，例如放射性免疫測(cè)定(RIA)、ELISA、免疫熒光方法、免疫組織化學(xué)方法、FACS、BIACORE和蛋白質(zhì)印跡分析。優(yōu)選的測(cè)定技術(shù)、尤其是大規(guī)模臨床篩選患者血清和血液以及血液衍生制品的測(cè)定技術(shù)是ELISA和蛋白質(zhì)印跡技術(shù)。特別優(yōu)選ELISA測(cè)試。為了在這些測(cè)定方法用作試劑，將本發(fā)明的結(jié)合分子或者免疫綴合物便利地結(jié)合在微滴定孔的內(nèi)表面上。本發(fā)明的結(jié)合分子或者免疫綴合物可以被直接結(jié)合在微滴定孔上。然而，本發(fā)明的結(jié)合分子或者免疫綴合物與孔的最大結(jié)合可以通過用多賴氨酸預(yù)處理孔之后加入本發(fā)明的結(jié)合分子或者免疫綴合物而實(shí)現(xiàn)。此外，本發(fā)明的結(jié)合分子或者免疫綴合物可以通過已知方式與孔共價(jià)附著。通常，使用0.01-100昭/ml的結(jié)合分子或者免疫綴合物用于包被，但是也可以使用更高濃度以及更低的量。然后將樣品加入用本發(fā)明的結(jié)合分子或者免疫綴合物包被的孔中。此外，本發(fā)明的結(jié)合分子可用于鑒別流感病毒H5N1的特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)。所述結(jié)合結(jié)構(gòu)可以是蛋白質(zhì)和/或多肽上的表位。它們可以是線性的，但是也可以是結(jié)構(gòu)和/或構(gòu)象的。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述結(jié)合結(jié)構(gòu)可以通過PEPSCAN分析方法(見WO84/03564，WO93/09872，Slootstra"1996)分析。或者，可以針對(duì)能結(jié)合本發(fā)明的結(jié)合分子的肽篩選包含來自流感病毒H5N1蛋白質(zhì)的肽的隨機(jī)肽文庫。發(fā)現(xiàn)的結(jié)合結(jié)構(gòu)/肽/表位可以用作疫苗以及用于診斷流感病毒H5N1感染。在除了蛋白質(zhì)和/或多肽之外的片段由所述結(jié)合分子結(jié)合的情況中，結(jié)合結(jié)構(gòu)可以通過質(zhì)譜法、高效液相層析以及核磁共振方法鑒別。另一方面，本發(fā)明提供了篩選特異性結(jié)合與由本發(fā)明的人結(jié)合分子結(jié)合的表位相同的流感病毒H5N1的表位的結(jié)合分子(或其功能片段或變體)的方法，其中所述方法包括如下步驟(a)將待被篩選的結(jié)合分子、本發(fā)明的結(jié)合分子與流感病毒H5N1或其片段接觸，(b)測(cè)量待被篩選的結(jié)合分子是否能與本發(fā)明的結(jié)合分子競(jìng)爭(zhēng)特異性結(jié)合流感病毒H5N1或其片段。在進(jìn)一步的步驟中，可以確定能競(jìng)爭(zhēng)特異性結(jié)合流感病毒H5N1或其片段的被篩選的結(jié)合分子是否具有中和活性。能與本發(fā)明的結(jié)合分子競(jìng)爭(zhēng)特異性結(jié)合流感病毒H5N1或其片段的結(jié)合分子是本發(fā)明的另一部分。在上述篩選方法中，"特異性結(jié)合相同表位"還包含特異性結(jié)合與本發(fā)明的結(jié)合分子結(jié)合的表位基本(substantially)或者基本(essentially)相同的表位。阻斷或者競(jìng)爭(zhēng)本發(fā)明的結(jié)合分子與流感病毒H5N1結(jié)合的能力典型是指待被篩選的結(jié)合分子結(jié)合與本發(fā)明的結(jié)合分子免疫特異性識(shí)別的流感病毒H5N1上的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)構(gòu)重疊的流感病毒H5N1上的表位或結(jié)合位點(diǎn)?；蛘撸@是指待被篩選的結(jié)合分子結(jié)合與由本發(fā)明的結(jié)合分子免疫特異性識(shí)別的結(jié)合位點(diǎn)在空間排列上十分接近的表位或結(jié)合位點(diǎn)或者抑制本發(fā)明的結(jié)合分子與流感病毒H5N1的結(jié)合。通常，競(jìng)爭(zhēng)性抑制通過這樣的測(cè)定方法測(cè)量，其中將抗原組合物即包含流感病毒H5N1或其片段的組合物與參考結(jié)合分子即本發(fā)明的結(jié)合分子以及待被篩選的結(jié)合分子混合。通常，待被篩選的結(jié)合分子過量存在?；贓LISA和蛋白質(zhì)印跡的方案適用于這種簡(jiǎn)便的競(jìng)爭(zhēng)性研究中。通過使用物種或同種型二級(jí)抗體，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以僅檢測(cè)到結(jié)合的參考結(jié)合分子，其結(jié)合由于基本上識(shí)別相同表位的待被篩選的結(jié)合分子的存在而降低。在進(jìn)行參考結(jié)合分子與待被篩選的任何結(jié)合分子(不管物種或者同種型)之間進(jìn)行的結(jié)合分子競(jìng)爭(zhēng)性研究中，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以首先用可檢測(cè)的標(biāo)記對(duì)參考結(jié)合分子加以標(biāo)記以進(jìn)行隨后的鑒別，所述標(biāo)記例如是生物素、酶標(biāo)記、放射性標(biāo)記或者其它標(biāo)記，通過這些競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定方法鑒別的結(jié)合分子(競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合分子或者交叉反應(yīng)性結(jié)合分子)包括但不限于結(jié)合由參考結(jié)合分子即本發(fā)明的結(jié)合分子結(jié)合的表位或者結(jié)合位點(diǎn)的抗體、抗體片段及其他結(jié)合劑，以及結(jié)合與所述參考結(jié)合分子結(jié)合的表位十分接近的表位或結(jié)合位點(diǎn)的抗體、抗體片段及其他結(jié)合劑，在所述待被篩選的結(jié)合分子與參考結(jié)合分子之間發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合。優(yōu)選地，當(dāng)本發(fā)明的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合分子過量存在時(shí)，將抑制參考結(jié)合分子與選擇的耙的特異性結(jié)合，抑制程度為至少10%、優(yōu)選至少25。/。、更優(yōu)選至少50%、更優(yōu)選至少75%-90%或者更高。結(jié)合與本發(fā)明的結(jié)合分子結(jié)合的表位大約、基本(substantially).基本(essentially)或者相同的表位的一或多種競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合分子的鑒別是一種簡(jiǎn)明的技術(shù)方法。由于競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合分子的鑒別是與參考結(jié)合分子即本發(fā)明的結(jié)合分子進(jìn)行對(duì)比而確定的，因此應(yīng)理解實(shí)際上不需要以任何方式確定所述參考結(jié)合分子和競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合分子結(jié)合的表位以鑒別結(jié)合與參考結(jié)合分子結(jié)合的表位相同或基本相同的表位的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合分子。實(shí)施例為了例證本發(fā)明，提供了如下實(shí)施例。所述實(shí)施例不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1使^^記憶5,智應(yīng)^遠(yuǎn)欲游/A^稱建5ci^V廬蘑沐展示文,通過靜脈穿刺從正常健康供體收集外周血置于EDTA抗凝樣品管中。將血樣(45ml)用PBS稀釋兩次，取30ml等分置于10mlFicoll-Hypaque(Pharmacia)上，在900Xg在室溫不間斷離心20分鐘。小心取出在含有淋巴細(xì)胞和血小板級(jí)分的白色層上面的上清。接著，將該層小心取出(10ml)，移至新的50ml試管中，用40mlPBS洗滌3次，并且在室溫在400xg離心10分鐘以除去血小板。將獲得的含有淋巴細(xì)胞的沉淀重懸于含有2%FBS的RPM培養(yǎng)基中，通過細(xì)胞計(jì)數(shù)方法確定細(xì)胞數(shù)。使用CD24、CD27和表面IgM作為標(biāo)記對(duì)大約1X108個(gè)淋巴細(xì)胞進(jìn)行染色以進(jìn)行熒光細(xì)胞分選以分離IgM記憶B細(xì)胞。使用設(shè)置為YieldMode的BectonDickinsonDigitalVantage裝置進(jìn)行物理記憶B細(xì)胞分選和分離。淋巴細(xì)胞從FSC/SSC窗門控(gated)為小的致密群。記憶B細(xì)胞(0024+/0)27+)隨后與幼稚(加^6)8細(xì)胞(0024+/0027-)和記憶1細(xì)胞(€024-027+)分開。接著，使用IgM表達(dá)從開關(guān)記憶B細(xì)胞(IgM-)中分離IgM記憶B細(xì)胞(IgM+)。在這個(gè)步驟中，IgM記憶B細(xì)胞在單獨(dú)的樣品管中分選。將1乂105個(gè)細(xì)胞收集在DMEM/50°/。FBS中，在分選完成后將其在400xg離心10分鐘，并在50(HilTRIZOL總RNA提取溶液中裂解。使用200pl氯仿和異丙醇沉淀方法從裂解溶液中提取RNA，如TRIZOL溶液方案詳細(xì)描述。接著，應(yīng)用lplPelletPaint(Novogen)增強(qiáng)和顯現(xiàn)沉淀過程。將全部RNA制備物溶于23plDEPC處理的超純水(Invitrogen)中，并用SuperscriptIII逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)進(jìn)行cDNA轉(zhuǎn)化。將1^1RandomHexamers(500ng/nl)(Promega)加入RNA樣品中，混合，并在熱蓋PCR儀中在65'C解鏈5分鐘。將樣品在濕冰(wet-ice)上速冷，加入如下成分8pd5XRT緩沖液(250mMTris-HClpH8.3，375mMKCl，15mMMgCl2)，2jx1dNTP(每種10mM)(Invitrogen)，2^1DTT(100mM)，2fxlRNAse抑制劑(40U爾l)(Promega),2^1SuperscriptIII(200U/pl)(Invitrogen)。首先將獲得的混合物在室溫保溫5分鐘，然后移至熱蓋PCR儀中在5(TC運(yùn)行1小時(shí)。通過加熱直至75'C進(jìn)行15分鐘而終止反應(yīng)。獲得的cDNA用超純水稀釋至200^1，在-2(TC貯存直至進(jìn)一步使用。應(yīng)用兩輪PCR擴(kuò)增方法，使用如表1和表2所示引物組以從各自的供體庫(repertoire)中分離免疫球蛋白VH和VL區(qū)。PCR擴(kuò)增程序中使用的擴(kuò)增成分如下5plcDNA模板，32.75jil超純水，2.5^1每種引物(10pM)，5pl10XPCR緩沖液(200mMTris畫HClpH8.4，500mMKC1),1.5plMgCl2(50mM)，0.5^1dNTP(每種25mM)，0.25|^1Taq聚合酶(5U/iJ)(Invitrogen)。使用表1示出的引物組對(duì)各自cDNA進(jìn)行的第一輪擴(kuò)增對(duì)于VH、Vk和V入?yún)^(qū)分別產(chǎn)生大約650堿基對(duì)的7、6和9個(gè)產(chǎn)物。對(duì)于IgM記憶B細(xì)胞VH區(qū)擴(kuò)增，使用OCM恒定引物組合OHl-OH7。第一輪擴(kuò)增的熱循環(huán)程序是2分鐘96。C(變性步驟)，30次循環(huán)如下30秒96X:/30秒55。C/60秒72X:，10分鐘72'C最終延伸，以及在4'C冷卻。將產(chǎn)物加樣于1%瓊脂糖凝膠上并使用凝膠-提取柱(Qiagen)從中分離，洗脫在50^1lmMTris-HClpH8.0中。將10%的第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物(5^11)進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，使用表2示出的引物。這些引物用限制位點(diǎn)延伸，使得各自的VL和VH區(qū)定向克隆進(jìn)噬菌體展示載體PDV-C06中。第二輪PCR擴(kuò)增程序如下2分鐘96'C(變性步驟)，30次如下循環(huán)30秒96'C/30秒6(TC/60秒72'C，10分鐘72'C最終延伸，以及在4°C冷卻。根據(jù)在免疫球蛋白基因產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的J節(jié)段的天然出現(xiàn)首先集合第二輪擴(kuò)增產(chǎn)物(350堿基對(duì))，對(duì)于VH、Vk和VX可變區(qū)分別產(chǎn)生7、6和9個(gè)集合(見表3和表4)。為了獲得免疫文庫中免疫球蛋白序列的標(biāo)準(zhǔn)化分布，根據(jù)表3提及的百分比混合6個(gè)Vk和9個(gè)VX輕鏈集合。將這個(gè)單一的最終VL集合(3叱)用Sail和Notl限制酶消化過夜，加樣于1.5%瓊月旨糖凝膠(~350堿基對(duì))中并使用Qiagen凝膠提取柱從中分離，如下連接在Sall-Notl切割的PDV-C06載體(~5000堿基對(duì))中l(wèi)OplPDV-C06載體(50ng/|il)，7nlVL插入體(10ng/^1)，5^110X連接緩沖液(NEB)，2.5T4DNA連接酶(400U/ixl)(NEB),25.5nl超純水(載體與插入體比率為1:2)。在16°C水浴中連接過夜。接著，用水使樣品體積加倍，用等體積的苯酚-氯仿-異戊醇(75:24:l)(Invitrogen)提取，隨后用氯仿(Merck)提取，并且用1piPelletPaint(Novogen)、10^1乙酸鈉(3MpH5.0)和lOOjil異丙醇在-20。C沉淀2小時(shí)。隨后將獲得的樣品在20，000xg在4°C離心30分鐘。獲得的沉淀用70%乙醇洗滌，在20.000xg在室溫離心10分鐘。通過真空抽吸除去乙醇，將沉淀在空氣中干燥幾分鐘，然后溶解于含有10mMTris-HCl(pH8.0)的50^1緩沖液中。連接混合物用于在冷卻的O.lcm電穿孔管(Biomd)中使用設(shè)定為1.7kV、200Ohm，25|iiF(時(shí)間常數(shù)4，5msec)的GenepulserII設(shè)備(Biorad)轉(zhuǎn)化40^1TG-1電感受態(tài)細(xì)胞(Stratagene)。在脈沖后，立即用37。C的lOOOpl含有5n/。(w/v)葡萄糖(Sigma)的SOC培養(yǎng)基(Invitrogen)從電穿孔管中沖洗細(xì)菌，轉(zhuǎn)移至15ml圓底培養(yǎng)試管中。另外的500nlSOC/葡萄糖用于從電穿孔管中沖洗剩余的細(xì)菌，并將其加入培養(yǎng)試管中。通過在37'C在搖床孵箱中在220rpm培養(yǎng)正好1小時(shí)而回收細(xì)菌。將轉(zhuǎn)化的細(xì)菌鋪板于大的240mm方形培養(yǎng)皿(NUNC)中，所述培養(yǎng)皿中含有200ml2TY瓊脂(16g/1細(xì)菌用胰蛋白胨，10g/l細(xì)菌用酵母抽提物，5g/lNaCl，15g/l瓊脂，pH7.0)補(bǔ)加有50ng/ml氨芐青霉素和5。/。(w/v)葡萄糖(Sigma)。將1-1000倍稀釋液鋪板于含有相同培養(yǎng)基的15cm培養(yǎng)皿上以進(jìn)行計(jì)數(shù)。繼續(xù)重復(fù)20次這個(gè)轉(zhuǎn)化程序，將全部文庫鋪板于共30個(gè)大方形培養(yǎng)皿上，在37'C培養(yǎng)室(culturestove)中生長(zhǎng)過夜。典型地，使用上述方案獲得大約lX10、fii。通過輕輕刮取每個(gè)平板細(xì)菌置于10ml2TY培養(yǎng)基中從平板中收獲中間體VL輕鏈文庫。細(xì)胞質(zhì)量通過OD600測(cè)量確定，2倍500OD的細(xì)菌用于質(zhì)粒DNA大量制備，使用兩個(gè)P500maxiprep柱(Qiagen)根據(jù)廠商指導(dǎo)進(jìn)行。與VL可變區(qū)類似，首先將第二輪VH-JH產(chǎn)物混合在一起以獲得正常的J節(jié)段使用分布(見表4)，產(chǎn)生稱作PHI-PH7的7個(gè)VH亞集合。使用表4所示百分比混合該集合以獲得標(biāo)準(zhǔn)化的序列分布，獲得一個(gè)VH級(jí)分，將其用Sfil和Xhol限制酶消化并且連接在如上述獲得的Sfil-Xhol切割的PDV-VL中間體文庫中。連接的設(shè)置、純化方法、隨后的TG1轉(zhuǎn)化以及細(xì)菌的收獲與針對(duì)VL中間體文庫所述一致(見上文)。使用位于插入的VH-VL區(qū)兩側(cè)的引物組通過菌落PCR檢測(cè)最終文庫(大約5X1()Scfo)的插入頻率。超過95%的菌落示出正確長(zhǎng)度插入體(見表5)。菌落PCR產(chǎn)物用于隨后的DNA序列分析以檢測(cè)序列變化以及評(píng)定示出完全ORF的菌落百分比。這個(gè)百分比典型超過70%(見表5)。也分析了V基因中的突變頻率。在50個(gè)序列中，有47個(gè)序列(94%)不是種系構(gòu)型，表示成熟過程并與用作文庫的RNA來源的B細(xì)胞的記憶表型一致。最后，使用CT輔助噬菌體(見WO02/103012)拯救并擴(kuò)增所述文庫并用于通過下文所述淘選方法進(jìn)行噬菌體抗體選擇。實(shí)施例2據(jù)帝^^歷iWA皮游像蘑沐游透雍使用基本如上述構(gòu)建的抗體噬菌體展示文庫以及通常的噬菌體展示技術(shù)和基本如美國(guó)專利6,265,150和WO98/15833(這兩篇文獻(xiàn)均并入本文作參考)所述的MABSTRAC^技術(shù)選擇抗體片段。此外，WO02/103012(并入本文作參考)所述的方法和輔助噬菌體用于本發(fā)明中。針對(duì)在昆蟲細(xì)胞中使用桿狀病毒載體產(chǎn)生的重組血凝素(HA)亞型H5(A/Vietnam/1203/2004;見SEQIDNO:l10)進(jìn)行選擇(ProteinSciences,CT,USA)。來自分離株A/Vietnam/I194/2004(H5N1TV)的HA的氨基酸序列以及來自在印尼和中國(guó)分離的毒株(H5N1IC)的代表性HA的共有氨基酸序列分別示于SEQIDNO:lll和SEQIDNO:112。也針對(duì)來自H5N1的可溶重組HA(sHA)進(jìn)行了選擇。使用標(biāo)準(zhǔn)DNA克隆技術(shù)在含有myc-和his-標(biāo)記的表達(dá)載體中克隆如下序列編碼來自分離株A/Vietnam/1194/2004(H5Nl)的HA胞外(可溶)部分(sHA)的序列，該序列代表2004年在泰國(guó)和越南分離的流感病毒毒株(進(jìn)化枝1)中鑒別的HA(H5N1TV的sHA，SEQIDNO:113)，以及代表2003/2004年在印尼和中國(guó)分離的H5N1毒株(進(jìn)化枝2)的HA可溶部分的共有序列(H5N1IC的sHA，SEQIDNO:114)。H5N1TV與H5N1IC的HA在9個(gè)氨基酸位置不同，均位于所述分子的HA1亞基中。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)在？￡1^6細(xì)胞中進(jìn)行DNA轉(zhuǎn)染以瞬時(shí)和/或穩(wěn)定表達(dá)。使用HisTrapFF柱(AmershamBiosciences)根據(jù)廠商指導(dǎo)通過金屬螯合親和層析從培養(yǎng)上清中純化sHA。將HA抗原(H5N1TV的重組HA和sHA)在PBS中稀釋(5.0pg/ml)，力口入MaxiSorpTMNunc-ImmunoTubes(Nunc)中，在轉(zhuǎn)輪上在4'C保溫過夜。倒空這些免疫試管(immunotubes)并用封閉緩沖液(于PBS中2%脫脂奶粉(ELK))洗滌3次。隨后將免疫試管用封閉緩沖液填滿，在室溫保溫1-2小時(shí)。另外，將免疫試管用抗-myc抗體包被過夜并且與含有5pg/mlmyc-標(biāo)記的H5N1TV的sHA的封閉緩沖液保溫。將集合的噬菌體展示文庫的等份(500-1000nl，0.5x1013—lx1013cfb，使用CT輔助噬菌體擴(kuò)增(見WO02/103012))在補(bǔ)加了10%非加熱失活的胎牛血清和2%小鼠血清的封閉緩沖液中在室溫封閉l-2小時(shí)。將封閉的噬菌體文庫加入免疫試管中，在室溫保溫2小時(shí)，用洗滌緩沖液(0.05%(v/v)于PBS中的Tween-20)洗滌以除去未結(jié)合的噬菌體。結(jié)合的噬菌體通過在室溫與lml的100mM三乙胺(TEA)保溫10分鐘而從各自抗原中洗脫。隨后，將洗脫的噬菌體與0.5ml的1MTris-HCl(pH7.5)混合以中和pH。這個(gè)混合物用于感染已經(jīng)在37"C生長(zhǎng)至OD600nm為大約0.3的5ml的XL1-Blue大腸桿菌培養(yǎng)物。使噬菌體在37'C感染XL1-Blue細(xì)菌30分鐘。然后將該混合物在室溫以3000xg離心10分鐘，將細(xì)菌沉淀重懸于0.5ml2-胰蛋白胨酵母提取物(2TY)培養(yǎng)基中。將獲得的細(xì)菌懸浮液分到補(bǔ)加四環(huán)素、氨芐青霉素和葡萄糖的兩個(gè)2TY瓊脂平板中。將平板在37"C保溫過夜后，從平板刮取菌落用于制備富集的噬菌體文庫，基本如DeKruif"a/.(1995a)和WO02/103012所述進(jìn)行。簡(jiǎn)而言之，將刮取的細(xì)菌用于接種含有氨芐青霉素、四環(huán)素和葡萄糖的2TY培養(yǎng)基，在37。C生長(zhǎng)至OD600nm為0.3。加入CT輔助噬菌體，使其感染細(xì)菌，之后將培養(yǎng)基更換為含有氨芐青霉素、四環(huán)素和卡那霉素的2TY。在3(TC繼續(xù)保溫過夜。第二天，通過離心從2TY培養(yǎng)基中除去細(xì)菌，之后使用聚乙二醇(PEG)6000/NaCl沉淀培養(yǎng)基中的噬菌體。最后，將噬菌體溶于具有1°/。牛血清白蛋白(BSA)的2mlPBS中，過濾滅菌并用于下一輪選擇中。或者使用全長(zhǎng)HA表達(dá)細(xì)胞系進(jìn)行噬菌體選擇。為此，使用含有來自分離株A/Vietnam/1194/2004(H5N1TV)的全長(zhǎng)HA的完整編碼序列以及代表在印尼和中國(guó)分離的H5N1毒株(H5N1IC)的全長(zhǎng)HA的共有序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染PER.C6細(xì)胞。使用抗HA抗體與每次噬菌體選擇并行進(jìn)行流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)以保證H5NlTV-和H5NlIC-轉(zhuǎn)染的PER.C6細(xì)胞的HA表達(dá)(數(shù)據(jù)未示出)。將10乂106個(gè)未轉(zhuǎn)染的？￡11.06細(xì)胞重懸于0.5ml集合的噬菌體文庫和補(bǔ)加4%ELK的0.5mlPER.C6培養(yǎng)基中，在翻滾式轉(zhuǎn)子(end-over-endrotor)中以5rpm在4'C保溫1小時(shí)。對(duì)噬菌體文庫/未轉(zhuǎn)染的PER.C6細(xì)胞混合物在4'C以300xg離心5分鐘之后，含有噬菌體的上清用10xl(^未轉(zhuǎn)染的PER，C6細(xì)胞進(jìn)行第二次消減。隨后將消減的噬菌體制備物與lxl()S個(gè)表達(dá)HA的PER.C6細(xì)胞混合，在翻滾式轉(zhuǎn)子中以5rpm在4'C保溫2小時(shí)。隨后將細(xì)胞在3000xg旋轉(zhuǎn)2分鐘，將細(xì)胞沉淀重懸于lmlPBS/0.05%Tween-20中以洗去未結(jié)合的噬菌體。將細(xì)胞在3000xg離心2分鐘，再重復(fù)洗滌5次。在每次洗滌之后，將細(xì)胞移至新的試管中。結(jié)合的噬菌體通過與lml的lOOmMTEA在翻滾式轉(zhuǎn)子中以5rpm在室溫保溫10分鐘而從抗原洗脫。將細(xì)胞以3000xg旋轉(zhuǎn)2分鐘，將洗脫的噬菌體轉(zhuǎn)移至含有0.5ml1MTris-HCl(pH7.5)的50ml試管中。如上述對(duì)洗脫的噬菌體進(jìn)行拯救和增殖。在分離各個(gè)單鏈?zhǔn)删w抗體之前進(jìn)行兩輪選擇。在第二輪選擇之后，各個(gè)大腸桿菌菌落用于制備單克隆噬菌體抗體?；旧鲜垢鱾€(gè)菌落在96孔平板中生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期，并且用VCS-M13輔助噬菌體感染，之后使得噬菌體抗體產(chǎn)生進(jìn)行過夜。含有噬菌體抗體的上清直接用于ELISA中以結(jié)合HA抗原?；蛘邔?duì)噬菌體抗體進(jìn)行PEG/NaCl-沉淀以及過濾滅菌以進(jìn)行流式細(xì)胞計(jì)量分析。實(shí)施例3股辦絲卓鏈麟沐拔鄉(xiāng)線"在ELISA中確認(rèn)在上述篩選方法中獲得的選擇的單鏈?zhǔn)删w抗體的特異性，即與HA抗原的結(jié)合。為此，將桿狀病毒表達(dá)的重組HA(ProteinSciences,CT,USA)以及H5N1TV和H5N1IC的純化的sHA包被MaxisorpELISA平板。將抗-mycmA9E10(Roche)固定在MaxisorpELISA平板上作為陰性對(duì)照抗原。在包被之后將平板在含有0.1%v/vTween-20的PBS中洗滌3次并且在含有3%BSA或2%ELK的PBS中在室溫封閉1小時(shí)。選擇的單鏈?zhǔn)删w抗體在含有4%ELK的等體積PBS中保溫1小時(shí)以獲得封閉的噬菌體抗體。倒空平板，用PBS/0.1%Tween-20洗滌3次，將封閉的單鏈?zhǔn)删w抗體加入孔中。保溫1小時(shí)，用PBS/0.1%Tween-20洗滌平板，使用與過氧化物酶綴合的抗-M13抗體檢測(cè)結(jié)合的噬菌體抗體(使用OD492nm測(cè)量)。作為對(duì)照，同時(shí)進(jìn)行不使用單鏈?zhǔn)删w抗體和使用陰性對(duì)照單鏈?zhǔn)删w抗體的相應(yīng)程序。從用IgM記憶B細(xì)胞文庫在不同HA抗原上進(jìn)行的選擇中獲得特異于重組HA或者sHA的92個(gè)獨(dú)特的單鏈?zhǔn)删w抗體?；蛘撸褂昧魇郊?xì)胞計(jì)量分析檢測(cè)針對(duì)與表達(dá)HA的PER.C6細(xì)胞的結(jié)合而選擇的單鏈抗體的反應(yīng)性。將PEG/NaCl沉淀的噬菌體與等體積的PBS/2%ELK混合，在冰上封閉30分鐘。將封閉的噬菌體加入沉淀的細(xì)胞中(未轉(zhuǎn)染的PER.C6細(xì)胞和表達(dá)HA的PER.C6細(xì)胞)，在冰上保溫1小時(shí)。將細(xì)胞用PBS/1%BSA洗滌3次，隨后在300xg離心1分鐘，使用生物素?；目?M13抗體(Fitzgemld)及隨后使用鏈霉抗生物素-藻紅蛋白綴合物(Caltag)觀測(cè)所述單鏈?zhǔn)删w抗體與細(xì)胞的結(jié)合。使用表達(dá)HA的PER.C6細(xì)胞進(jìn)行的選擇提供了24個(gè)獨(dú)特的單鏈?zhǔn)删w抗體，在使用不同的重組HA蛋白選擇期間未鑒別出這些抗體。實(shí)施例4股辦性"尸v縱定從選擇的特異性單鏈?zhǔn)删w抗體(scFv)克隆中獲得質(zhì)粒DNA，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)確定核苷酸和氨基酸序列。所述scFv的核苷酸序列和氨基酸序列以及VH和VL基因相同性(見TomlinsonIMetal.V-BASESequenceDirectory.CambridgeUnitedKingdom:MRCCentreforProteinEngineering(1997))示于表6。所述HA特異性免疫球蛋白的CDR區(qū)示于表7。實(shí)施例5A透雍游卓鏈^V中稱達(dá)完全乂克疫球歪A分開乂卓克廣貧鄰?fù)ㄟ^限制消化直接克隆所述scFv的重鏈和輕鏈可變區(qū)以在IgG表達(dá)載體pIg畫C911畫HCyl(見SEQIDNo:141)、pIG-C909-Oc(見SEQIDNO:142)或者pIg-C910-C入(見SEQIDNo:143)中表達(dá)。根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)確認(rèn)所有構(gòu)建體的核苷酸序列。將編碼人IgGl重鏈和輕鏈的所得表達(dá)構(gòu)建體在293T細(xì)胞中組合瞬時(shí)表達(dá)，使用標(biāo)準(zhǔn)純化方法獲得和生產(chǎn)含有人IgGl抗體的上清。將所述人IgGl抗體在10-0.003pg/ml濃度范圍針對(duì)H5滴定(數(shù)據(jù)未示出)。SARS-CoV特異性抗體作為對(duì)照抗體。IgGl分子示出與單鏈?zhǔn)删w抗體相同的反應(yīng)性模式。表8中示出了如下名稱的抗體的重鏈和輕鏈的核苷酸與氨基酸序列以及其重鏈和輕鏈可變區(qū)CR6141、CR6255、CR6257、CR6260、CR6261、CR6262、CR6268、CR6272、CR6296、CR6301、CR6307、CR6310、CR6314、CR6323、CR6325、CR6327、CR6328、CR6329、CR6331、CR6332、CR6334、CR6336、CR6339、CR6342、CR6343和CR6344。隨后通過流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)分析抗-HAIgG與表達(dá)HA的PER.C6細(xì)胞的結(jié)合。分析抗體與HA結(jié)合的流式細(xì)胞術(shù)表明抗體CR6255、CR6257、CR6260、CR6261、CR6262、CR6268、CR6307、CR6310、CR6314、CR6323、CR6325、CR6331和CR6344結(jié)合表達(dá)HA(H5NlTV)-的PER.C6細(xì)胞(見表9)?？贵wCR6261和CR6344也顯示出與未轉(zhuǎn)染的對(duì)照細(xì)胞結(jié)合，但是獲得的信號(hào)比與表達(dá)HA(H5N1TV)的PER.C6細(xì)胞的結(jié)合獲得的信號(hào)低大約10倍(見表9)。未觀測(cè)到對(duì)照抗體CR3014與表達(dá)HA的細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染對(duì)照細(xì)胞的結(jié)合。實(shí)施例6獰弄絲/gG對(duì)f//5iW流滅錄毒游沐A中浙/^^^毒^浙/^WM^)為了確定選擇的IgG是否能阻斷H5N1感染，進(jìn)行體外病毒中和作用測(cè)定(VNA)。對(duì)MDCK細(xì)胞(ATCCCCL-34)進(jìn)行VNA。將MDCK細(xì)胞在MDCK細(xì)胞培養(yǎng)基(MEM培養(yǎng)基，補(bǔ)加了抗生素、20mMHepes和0.15%(w/v)碳酸氫鈉(完全MEM培養(yǎng)基)，補(bǔ)加10%(v/v)胎牛血清)中培養(yǎng)。將該測(cè)定中使用的H5N1重排列毒株NIBRG-14稀釋為4X103TCID50/ml(50%組織培養(yǎng)物感染劑量每ml)的效價(jià)，根據(jù)Spearman和Karber的方法計(jì)算效價(jià)。將IgG制備物(200pg/ml)在一式兩份的孔中在完全MEM培養(yǎng)基中系列稀釋2倍(1:2-1:16)。將25pl各自的IgG稀釋液與25^1病毒懸浮液(IOOTCID50/25^il)混合，在37'C保溫1小時(shí)。然后將該懸浮液一式兩份移至含有匯合的MDCK培養(yǎng)物的96孔平板的50pl完全MEM培養(yǎng)基中。在使用之前，將MDCK細(xì)胞接種在MDCK細(xì)胞培養(yǎng)基中，密度為3乂104個(gè)細(xì)胞每孔，生長(zhǎng)直至細(xì)胞達(dá)到匯合，用300-350plPBS(pH7.4)洗滌，并且最后向每個(gè)孔中加入5(^1完全MEM培養(yǎng)基。接種的細(xì)胞在33'C培養(yǎng)3-4天，每天觀測(cè)致細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)的發(fā)生情況。將該CPE與陽性對(duì)照(NIBRG-14-接種的細(xì)胞)和陰性對(duì)照(模擬接種的細(xì)胞)進(jìn)行比較。各個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)物中完全不存在CPF被限定為保護(hù)作用。綿羊抗-A/Vietnam/1194/04H5N1流感病毒HA(04/214，NIBSC)在該測(cè)定中用作陽性對(duì)照。另外，使用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)培養(yǎng)物中病毒的存在情況。為此，棄去培養(yǎng)上清，將細(xì)胞用40。/。(v/v)丙酮和60。/。(v/v)甲醇固定15分鐘。固定的細(xì)胞在補(bǔ)加2%(w/v)BSA和5。/。(v/v)山羊血清的封閉緩沖液(200mMNaCl，0.2。/。(w/v)牛血清白蛋白(BSA)，0.01%硫柳滎，0.2%(v/v)Tween-20，20mMTris-HCl，pH7.45)中在37"C封閉30分鐘。隨后，將細(xì)胞與在洗滌緩沖液中1:1000稀釋的50pl小鼠抗流感病毒A單克隆抗體混合物(Chemicon)在37。C保溫1小時(shí)。在用洗滌緩沖液洗滌3次后，加入在洗滌緩沖液中1:1000稀釋的50^il生物素綴合的山羊抗小鼠IgG(Jackson)，在37"C保溫1小時(shí)。在用洗滌緩沖液洗滌3次后，加入在洗滌緩沖液中1:3000稀釋的5(^1鏈霉抗生物素-過氧化物酶綴合物(Calbiochem)，在37。C保溫30分鐘。在用洗漆緩沖液洗滌3次后，使用含有1^1H202/lmlAEC溶液的AEC溶液(0.12%(w/v)3-氨基-9-乙基咔唑，30%(v/v)N-N-二甲基甲酰胺和70%(v/v)乙酸鹽緩沖液)觀測(cè)染色情況。再用洗滌緩沖液洗滌3次后，在顯微鏡下分析染色情況。對(duì)稱作CR6255、CR6257、CR6260、CR6261、CR6262、CR6268、CR6307、CR6310、CR6314、CR6323、CR6325、CR6331和CR6344的人抗HA抗體進(jìn)行上述VNA。所有抗體均中和H5N1重排列毒株NIBRG-14。這些抗體保護(hù)MDCK培養(yǎng)物對(duì)抗CPE的濃度Gig/ml)在表10中示出。在觀測(cè)到CPE的孔中，通過免疫組織化學(xué)染色方法證實(shí)病毒的存在(數(shù)據(jù)未示出)。為了更精確地確定H5N1特異性IgG的中和效力，重復(fù)用NIBRG-14進(jìn)行的體外病毒中和作用測(cè)定，但這次對(duì)IgG制備物進(jìn)一步稀釋。將IgG制備物(200^ig/ml)在完全MEM培養(yǎng)基中系列稀釋2倍(1:1-1:512)，在一式四份的孔中在如上述VNA中進(jìn)行檢測(cè)。在VNA中確定如下名稱的人抗-H5N1抗體的中和效力CR6255、CR6257、CR6260、CR6261、CR6262、CR6268、CR6272、CR6307、CR6310、CR6314、CR6323、CR6325、CR6327、CR6328、CR6329、CR6331、CR6332、CR6334、CR6336、CR6339、CR6342、CR6343和CR6344。除了CR6272和CR6339之外，所有抗體均中和H5N1重排列毒株NBRG-14。這些抗體保護(hù)MDCK培養(yǎng)物對(duì)抗CPE的濃度Oig/ml，在存在100TCID50病毒的條件下)在表11中示出。在觀測(cè)到CPE的孔中，通過免疫組織化學(xué)染色方法證實(shí)病毒的存在(數(shù)據(jù)未示出)。實(shí)施例7奶7W錄雜/gG戯鄉(xiāng)教折為了進(jìn)一步研究抗HA抗體的特異性，對(duì)不同的重組血凝素流感病毒A抗原在還原條件下進(jìn)行SDS-PAGE，隨后進(jìn)行抗HA免疫印跡分析。HAO多肽由HA1和HA2亞基組成。抗體CR5111,—種H5Nl-特異性對(duì)照抗體，識(shí)別H5N1TV的sHA的HA1亞基和完整的(未裂解的)HAO多肽(見圖1，右側(cè)，泳道1)。另外，CR5111識(shí)別重組HA的HA1亞基，所述重組HA是使用桿狀病毒載體在昆蟲細(xì)胞中產(chǎn)生的亞型H5(A/Vietnam/1203/2004(H5N1),見SEQIDNO:l10)(ProteinSciences,CT,USA)(圖1，右側(cè)，泳道2)。未裂解的HAO多肽在這個(gè)HA制備物中未檢測(cè)到。泳道1與泳道2中HA亞基之間大小的差異可以由昆蟲細(xì)胞與PER.C6細(xì)胞中表達(dá)的HA的不同糖基化作用加以解釋。CR5111不識(shí)別為亞型Hl(A/NewCaledonia/20/99(H1N1))(見圖1，右側(cè)，泳道4)或者亞型H3(A/Wyoming/3/2003(H3N2》(圖1，右側(cè)，泳道3)的重組HA的HA1和/或HA0多肽。抗體CR6307和CR6323識(shí)別H5N1TV的sHA(見圖1，左側(cè)和中間部分，泳道l)以及亞型H5的重組HA(A/Vietnam/1203/2004(H5N1)(見圖1，左側(cè)和中間部分，泳道2)的HA2亞基。令人感興趣地，當(dāng)HA2亞基完整存在時(shí)，未裂解的HA0多肽不被識(shí)別。顯然由CR6307和CR6323識(shí)別的表位在HA0裂解時(shí)變得可接近。另外，抗體CR6307和CR6323識(shí)別亞型H1(A/NewCaledonia/20/99(H1N1))的重組HA的HA2亞基(見圖1，左側(cè)和中間部分，泳道4)，但是不識(shí)別亞型H3(A/Wyoming/3/2003(H3N2))的重組HA的HA2亞基(見圖1，左側(cè)和中間部分，泳道3)，這兩個(gè)重組HA均是在昆蟲細(xì)胞中使用桿狀病毒載體產(chǎn)生的(ProteinSciences,CT,USA)。由于中和抗體CR6307和CR6323的結(jié)合位點(diǎn)在亞型HI和H5的流感病毒A毒株中是保守的，因此包含所述結(jié)合位點(diǎn)的分子可以被認(rèn)為是能誘導(dǎo)廣泛交叉反應(yīng)性抗流感病毒抗體應(yīng)答的疫苗(的一部分)。在抗體CR6307和CR6323之后，稱作CR6141、CR6296和CR6301的抗體用于免疫印跡分析中。這三個(gè)抗體中的每一個(gè)抗體均能結(jié)合H5N1TV的sHA以及亞型H5(A/Vietnam/1203/2004;H5Nl)的重組HA的HA2亞基(數(shù)據(jù)未示出)。實(shí)施例8線定層J特雜/gG艦基錄將胸GS分橋?yàn)榱嗽u(píng)估HA1亞基對(duì)于抗-H5Nl抗體結(jié)合的貢獻(xiàn)，進(jìn)行測(cè)定，其中HA1亞基從表達(dá)HA的PER.C6細(xì)胞釋放。將表達(dá)HA的PER.C6細(xì)胞用PBS(pH7.4)洗滌3次，并且在酸化PBS(pH4.9)中保溫10分鐘。隨后，將細(xì)胞用PBS(pH7.4)洗滌，用在PBS(pH7.4)中的10pg/ml胰蛋白酶處理10分鐘以使得HAO分子裂解為二硫鍵連接的HA1和HA2亞基。最后，將細(xì)胞在于PBS(pH7.4)中的20mMDTT中保溫20分鐘以從膜錨定的HA2亞基中釋放HA1亞基。未處理的以及酸/胰蛋白酶/DTT處理的細(xì)胞用含有1%w/vBSA的PBS洗滌兩次。為了進(jìn)行流式細(xì)胞計(jì)量分析，每次染色使用2.5X105個(gè)細(xì)胞。觀測(cè)到用陰性對(duì)照抗體CR3014處理和未處理的細(xì)胞無染色?？贵wCR5111在免疫印跡分析中結(jié)合HA1亞基，其使得未處理的表達(dá)HA的PER.C6細(xì)胞染色，而處理的細(xì)胞未被識(shí)別(數(shù)據(jù)未示出)。這個(gè)結(jié)果提供了CR5111識(shí)別HA1亞基的進(jìn)一步證據(jù)。處理和未處理的細(xì)胞被抗體CR6307和CR6323相似程度染色(數(shù)據(jù)未示出)。HA1亞基的釋放顯然不影響這些抗體的結(jié)合，進(jìn)一步證實(shí)得自所述抗體結(jié)合HA2亞基的免疫印跡分析的結(jié)果。抗體CR6325和CR6331結(jié)合未處理的細(xì)胞，而與結(jié)合未處理的細(xì)胞相比與處理的細(xì)胞的結(jié)合明顯降低(數(shù)據(jù)未示出)。這個(gè)結(jié)果提示抗體對(duì)于其表位的親和性由于構(gòu)象改變而明顯降低，所述構(gòu)象改變是通過酸處理或者通過還原連接HA1與HA2亞基的二硫鍵而誘導(dǎo)的。實(shí)施例9^^廬蘼沐拔沐浙/gG遂/f羞^^1^,^5//^^為了鑒別結(jié)合非重疊非競(jìng)爭(zhēng)性表位的抗體，進(jìn)行血凝素競(jìng)爭(zhēng)性ELISA。將Nunc-ImmunoMaxisorpF96平板用在PBS中的0.5pig/ml亞型H5(A/Vietnam/1203/2004(H5N1)(ProteinSciences)的重組HA在4。C包被過夜。洗去未包被的蛋白質(zhì)，之后將孔用含有2%w/v脫脂奶粉的30(^1PBS(封閉溶液)在室溫封閉1小時(shí)。棄去封閉溶液，在每個(gè)孔中加入于封閉溶液中的50^1的10pg/ml抗-H5NlIgG，在室溫保溫1小時(shí)。隨后向每個(gè)孔中加入于封閉溶液中的5(^1噬菌體抗體，濃度為導(dǎo)致50%最大結(jié)合的濃度(在先前測(cè)定中確定)的兩倍，在室溫再保溫1小時(shí)。用含有0.1%v/vTween-20的PBS洗滌孔3次。使用過氧化物酶綴合的抗-M13抗體檢測(cè)結(jié)合的噬菌體抗體。如上述再次洗滌孔并且通過加入100^1的OPD試劑(Sigma)進(jìn)一步顯色ELISA。反應(yīng)通過加入50nl1MH2S04而終止，然后測(cè)量在492nm的OD。在存在IgG的條件下，噬菌體抗體的結(jié)合以與在不存在IgG的條件下的結(jié)合的百分比表示，在不存在IgG條件下的結(jié)合設(shè)定為100°/。。識(shí)別H5血凝素的HA1亞基中表位的噬菌體抗體SC05-111及相應(yīng)的IgGCR5111用作對(duì)照。結(jié)果表明大多數(shù)噬菌體抗體和IgG結(jié)合亞型H5(A/Vietnam/1203/2004(H5N1))的重組HA上的重疊表位(數(shù)據(jù)未示出)。SC05-111噬菌體抗體的結(jié)合由CR5111IgG阻斷，但是不由任何其它IgG阻斷，提示其它IgG識(shí)別與CR5111的結(jié)合區(qū)不同的表位。5個(gè)IgGCR6262、CR6272、CR6307、CR6339和CR6343與剩余的IgG較低程度地競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合(25%以上的剩余結(jié)合)。對(duì)于IgGCR6262、CR6272、CR6339和CR6343，這可以由對(duì)于HA的較低親和性解釋。這由這樣的觀測(cè)結(jié)果支持，即相應(yīng)于這些抗體的噬菌體抗體被其它IgG更有效地競(jìng)爭(zhēng)。噬菌體抗體SC06-307的結(jié)合被IgGCR6307阻斷，但是其它IgG對(duì)其影響較低。這提示SC06-307和CR6307識(shí)別與其它IgG識(shí)別的表位不同的獨(dú)特表位。實(shí)施例10鄉(xiāng)恭艦〃gG艦義鵬絲五環(huán)為了檢測(cè)抗-H5Nl抗體的表位在除了亞型H5之外的HA中是否是保守的，進(jìn)行血凝素交叉反應(yīng)性ELISA。將Nunc-ImmunoMaxisorpF96平板(Nunc)用如下材料在4。C包被過夜在PBS中的0.5ng/ml亞型H1(A/NewCaledonia/20/99(HINI))、亞型H3(A/Wyoming/3/03(H3N2))、亞型H5(A/Vietnam/1203/04(H5N1))、亞型H7(A/Netherlands/219/03(H7N7))以及亞型H9(A/HongKong/1073/99(H9N2))(ProteinSciencesCorp.)的重組HA。另外，將含有0.5ng/ml的A/NewCaledonia/20/99(H1N1)和重排列毒株NIBRG-14(A/Vietnam/1194/04(H5N1))的HA的BPL-失活的病毒制備物于PBS中在平板上包被過夜。用含有0.1%v/vTween-20的PBS洗滌孔3次以除去未包被的蛋白質(zhì)，隨后用含有2。/。w/v脫脂奶粉的30(^lPBS(封閉溶液)在室溫封閉1小時(shí)。棄去封閉溶液，每孔加入于封閉溶液中的100nl的5pg/ml抗-H5Nl抗體，在室溫保溫1小時(shí)。用含有0.1%v/vTween-20的PBS洗滌孔3次，使用過氧化物酶綴合的小鼠抗人IgG抗體(Jackson)檢測(cè)結(jié)合的抗體。如前述進(jìn)行顯色和測(cè)量。表12示出所有抗-H5NlIgG均結(jié)合亞型H5(A/Vietnam/1203/2004(H5N1))和BPL-失活的NIBRG-14病毒制備物的重組HA，后者含有毒株A/Vietnam/1194/2004(H5N1)的HA。亞型H3和H7的重組HA不被任何檢測(cè)的抗-H5N1IgG識(shí)別。令人感興趣地，除了CR5111和CR6307之外所有抗-H5NlIgG均結(jié)合亞型Hl和H9以及BPL-失活的毒株A/NewCaledonia/20/99(H1N1)的病毒制備物的重組HA。這表明大多數(shù)抗-H5NlIgG的表位在不同亞型的HA分子中是保守的。實(shí)施例11界腳//gG條位微Okunoetal.(1993)和Smimovetal.(1999)證實(shí)流感病毒A亞型HI、H2和H5的HA共享的一個(gè)共有表位的存在以及針對(duì)這個(gè)表位的鼠單克隆抗體C179對(duì)這些亞型的中和作用。這個(gè)構(gòu)象表位由位于HA1和HA2亞基中的兩個(gè)不同位點(diǎn)組成。這兩個(gè)位點(diǎn)在HA分子的干區(qū)中間緊密相鄰。為了評(píng)估前述抗HA抗體是否識(shí)別這個(gè)表位，產(chǎn)生在這個(gè)區(qū)域中含有氨基酸取代的HA分子。由抗體C179(TakaraBioInc.)識(shí)別的表位已經(jīng)被歸屬為包含HA1亞基的第318-322位殘基和HA2亞基的第47-58殘基的區(qū)域(氨基酸編號(hào)如Okunoeta1.1999所述)。含有這樣的HA的逃逸病毒不再由C179識(shí)別和中和，所述HA在HA1亞基第318位具有Thr至Lys的取代或者在HA2亞基第52位具有Val至Glu的取代。這些突變(第318位Thr至Lys，突變體I;第52位Val至Glu，突變體11)、HA1亞基第320位的Leu至Met取代(突變體m,Met320存在于亞型H3和H7的HA1的第318-322位區(qū)域中)、HA2亞基第54位的Ser至Arg取代(突變體IV，Arg54存在于亞型H3和H7的HA2的第47-58位區(qū)域中)以及HA2亞基第57位的Asp至Asn取代(突變體V，Asn57存在于毒株A/HongKong/156/97(H5Nl)的HA2的第47-58位區(qū)域中)導(dǎo)入分離株A/Vietnam/I194/2004(H5N1TV)的全長(zhǎng)HA中，并且在PER.C6細(xì)胞中轉(zhuǎn)染。如前述C179和人抗HA抗體與表達(dá)這些突變體的PER.C6細(xì)胞的結(jié)合通過FACA分析評(píng)估?？笻A1亞基中表位的抗體CR5111以及多克隆抗H5綿羊血清證實(shí)轉(zhuǎn)染的PER.C6細(xì)胞表達(dá)H5N1TV和HA突變體(數(shù)據(jù)未示出)。觀測(cè)到用陰性對(duì)照抗體CR3014或者在不存在抗體的條件下無染色(數(shù)據(jù)未示出)。正如所預(yù)期的，抗體C179不識(shí)別突變體I和n，其具有與C179逃逸病毒中HA相同的氨基酸取代(見Okuno"a/.，1993)。此外，C179不結(jié)合突變體IV，而C179與突變體III和V的結(jié)合不受影響。針對(duì)抗體CR6342觀測(cè)到相似的反應(yīng)性模式，這提示抗體C179和CR6342識(shí)別相似的表位?？贵wCR6261、CR6325和CR6329識(shí)別除了突變體II之外的所有突變體。這提示抗體CR6261、CR6325和CR6329的表位與C179的表位不同。由于HA1亞基中的取代不消除這些抗體的結(jié)合，因此其表位很可能位于HA2亞基中。抗體CR6307和CR6323識(shí)別所有突變體，提示這些抗體的表位也與C179的表位不同。關(guān)于突變體的序列和抗體結(jié)合的概況在表13中示出?？傊?，結(jié)果表明抗體CR6261、CR6325、CR6329、CR6307和CR6323是結(jié)合并中和流感病毒的理想候選物，其在由鼠單克隆抗體C179識(shí)別的表位中具有突變并因此不再由這個(gè)抗體中和。實(shí)施例12乂姊卓避拔做謬艦艦層7攻擊微賭絲給予小鼠致死劑量的流感病毒H5N1毒株A/HongKong/156/97以研究人單克隆IgG抗體CR6261、CR6323和CR6325的預(yù)防作用。在感染每組10只小鼠的8組動(dòng)物的前一天為每只小鼠經(jīng)腹膜內(nèi)注射不同劑量的抗體。作為陰性對(duì)照，一組小鼠注射不相關(guān)的對(duì)照抗體(CR3014)。監(jiān)測(cè)臨床癥狀、體重喪失以及死亡率直至感染后21天。進(jìn)行這項(xiàng)研究是為了評(píng)定所述單克隆人抗H5N1IgG抗體在體內(nèi)的預(yù)防作用。H5N1毒株最初得自患有呼吸系統(tǒng)疾病的3歲兒童。將該病毒在MDCK細(xì)胞上傳代兩次。用于感染小鼠的批次[效價(jià)8.1logTCID5。/ml]在雞胚中增殖一次。將80只雌性7周齡Balb/c小鼠分成8組，每組10只，在用H5N1病毒攻擊之前為每只小鼠進(jìn)行如下注射1.15mg/kgCR6261,2.5mg/kgCR6261.3.2mg/kgCR6261.4.0.7mg/kgCR6261.5.15mg/kgCR6323.6.15mg/kgCR63257.500^1兔抗-H5N3免疫血清(100X稀釋)8.15mg/kgCR3014.使所有動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境并飼養(yǎng)6天，之后開始研究。在用H5N1病毒感染前一天，通過腹膜內(nèi)注射給予50(^1抗體。在第0天用25LDso病毒(大約50(!l)經(jīng)鼻內(nèi)接種動(dòng)物，并繼續(xù)進(jìn)行21天。給予的病毒的實(shí)際劑量通過滴定得自完成動(dòng)物接種后剩余的接種物的幾個(gè)同樣樣品而估定。接種物的病毒效價(jià)(TCID50/mL)在MDCK細(xì)胞上確定。結(jié)果示出在制備或給予所述接種物期間未無意發(fā)生病毒的失活。第8組作為陰性對(duì)照。在第0天為這組動(dòng)物注射不相關(guān)的單克隆抗體(CR3014)。第7組假定作為陽性對(duì)照。為這組小鼠注射抗H5N3流感病毒產(chǎn)生的兔多克隆血清抗體。從接種病毒后第-1天直至第21天每天監(jiān)測(cè)臨床癥狀和體重。臨床癥狀用評(píng)分系統(tǒng)評(píng)分并記錄(0=無臨床癥狀；1=被毛粗糙(roughcoat);2=被毛粗糙，反應(yīng)性降低，操作期間順從；3=被毛粗糙，巻起，用力呼吸，操作期間順從；4=被毛粗糙，巻起，用力呼吸，當(dāng)背向下放置時(shí)不退回至胃向下狀態(tài))。存活的動(dòng)物在第21天安樂死并取血。為了分析血清IgG抗體水平，在第0天收集每只小鼠的血樣。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序制備血清。為了產(chǎn)生感染后血清，第21天從存活的動(dòng)物中收集血液。將血清貯存在-20。Ci2'C直至進(jìn)行分析病毒特異性抗體的存在。使用4HAU的H5N1HK/97底物一式兩份檢測(cè)血清。效價(jià)以示出HI的最高血清稀釋度的倒數(shù)表示，在1/10稀釋度開始。在適應(yīng)環(huán)境期間，所有小鼠均是活躍的而且看起來是健康的，未示出疾病跡象。每天計(jì)算平均臨床得分(總臨床得分除以每組存活動(dòng)物數(shù))，結(jié)果示于圖2(每組平均臨床得分)、表14(臨床得分)和表15(呼吸窘迫)。在感染后第3天，在用陰性對(duì)照AbCR3014接種的組(第8組)中觀測(cè)到陰性臨床癥狀發(fā)生。呼吸窘迫在第6天首次記錄，持續(xù)1-4天。在用15mg/kg的CR6325處理的小鼠(第6組)中未觀測(cè)到臨床癥狀。在第5組(CR6323)中，一只小鼠在第5-8天示出輕微的臨床癥狀(得分l)并且在次日死亡。在第1組中，一只小鼠在第13天死亡，但是先前未示出任何臨床癥狀。較高的CR6261的Ab劑量與較晚發(fā)生臨床癥狀以及較低的平均臨床得分相關(guān)。在最低劑量(0.7mg/kg)組中觀測(cè)到呼吸窘迫，但是在較高劑量(2、5和15mg/kg)組中未觀測(cè)到。所有小鼠均示出在第9-13天(第2、3和5組)或者從第17天開始(第4組)其臨床狀況得以改善。注射兔多克隆抗體的小鼠(第7組)在3天內(nèi)發(fā)生嚴(yán)重疾病且隨后死亡，表明兔抗體在體內(nèi)不能發(fā)揮抗感染的保護(hù)作用。在第10天對(duì)兩只動(dòng)物安樂死(第4組一只及第8組一只)并且不再用于研究中，因?yàn)樵搫?dòng)物被認(rèn)為患有嚴(yán)重疾病(得分4)。H5N1感染的動(dòng)物示出不同程度的體重喪失(圖3)。成比例的體重喪失和發(fā)作時(shí)刻與抗體劑量相關(guān)。在用最高劑量抗體處理的組中，隨著時(shí)間的推移體重穩(wěn)定增加，與年齡相關(guān)的體重增加一致。接種最低劑量CR6261的動(dòng)物組比接受較高劑量抗體的動(dòng)物組體重更快速降低。在較低劑量組中，體重喪失的總量較大，在接種2和0.7mg/kgCR6261的組中平均體重與起始體重相比分別降低大約15%和40%。在較低劑量組中，在動(dòng)物示出一些臨床癥狀改善的同時(shí)表現(xiàn)出平均體重增加。圖4示出每天每組存活的小鼠數(shù)。存在給予的抗體量與平均存活時(shí)間之間清晰的劑量應(yīng)答關(guān)系。圖5示出劑量應(yīng)答方式的死亡率。在最低劑量組(0.7mg/kg)和接受陰性對(duì)照抗體CR3014的小鼠組中，在接種7天后第一只小鼠死亡。當(dāng)給予0.7mg/kg的CR6261抗體時(shí)，低于50%的動(dòng)物得以保護(hù)免于死亡。然而當(dāng)給予最高劑量的抗體時(shí)，9-10只小鼠存活。陰性對(duì)照組(CR3014)中無小鼠存活，表明這項(xiàng)研究中使用的確實(shí)是100%致死攻擊劑量o為了評(píng)定IgG抗體是否能呈現(xiàn)對(duì)抗感染的完全保護(hù)作用，進(jìn)行HI測(cè)定，使用在第21天從接受15mg/kg的CR6261(第1組)的小鼠收集的血清進(jìn)行測(cè)定。這個(gè)數(shù)據(jù)應(yīng)表明雖然小鼠無臨床表現(xiàn)，但是經(jīng)歷了H5N1感染。這些結(jié)果示出如本文所述鑒別和開發(fā)的至少三種人抗-H5Nl抗體(CR6261、CR6323和CR6325)均能獨(dú)立地提供在體內(nèi)對(duì)抗致死劑量流感病毒H5N1的保護(hù)作用。觀測(cè)到在給予的CR6261抗體量與平均存活時(shí)間之間的清晰劑量應(yīng)答關(guān)系。結(jié)果表明當(dāng)在感染前一天給予小鼠15mg/kg劑量的檢測(cè)的每種單克隆抗-H5NlIgG抗體時(shí)，所述抗體在小鼠中均能預(yù)防H5N1感染的臨床表現(xiàn)。實(shí)施例13玄效^W量游魔感諒毒奶W^;^^^fyl^^^i^-//5iV/拔沐游沐力疾柳浙微在感染后模型中進(jìn)行研究以檢測(cè)本文所述的單克隆抗體例如CR6261對(duì)抗致死H5N1A/HK/97流感病毒攻擊的體內(nèi)治療作用。所述病毒批次和類型以及小鼠年齡與實(shí)施例12所用相同。作為陰性對(duì)照，一組小鼠注射不相關(guān)的對(duì)照抗體(CR2006)。監(jiān)測(cè)臨床癥狀、體重喪失情況以及死亡率直至感染后第21天。將58只雌性7周齡Balb/c小鼠分成5組，如下所述在感染后不同階段接受抗體1.IO只小鼠，在感染后4小時(shí)給予15mg/kgCR62612.14只小鼠，在感染后1天給予15mg/kgCR62613.IO只小鼠，在感染后2天給予15mg/kgCR62614.IO只小鼠，在感染后3天給予15mg/kgCR62615.14只小鼠，在感染后1天給予15mg/kgCR2006。使所有動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境并飼養(yǎng)6天，之后開始研究。在第0天為動(dòng)物經(jīng)鼻內(nèi)接種25LDso的H5N1流感病毒(大約50pl)并監(jiān)測(cè)21天。給予的病毒的實(shí)際劑量通過滴定得自接種動(dòng)物完成后剩余的接種物的幾個(gè)同樣樣品而估定。接種物的病毒效價(jià)(TCID50/mL)在MDCK細(xì)胞上確定。結(jié)果表明在制備或給予接種物期間未無意發(fā)生病毒失活。在接種后的特定時(shí)間點(diǎn)通過腹膜內(nèi)注射給予500W抗體。第5組作為陰性對(duì)照。這個(gè)組中動(dòng)物在感染后第1天注射不相關(guān)的單克隆抗體(CR2006)。從第-1天直至第21天每天評(píng)定臨床癥狀和體重。臨床癥狀如實(shí)施例12所述評(píng)分，得分范圍是0-4。存活的動(dòng)物在第21天被行安樂死并取血。為了評(píng)定病理學(xué)改變，在攻擊后第6天處死第2組和第5組的4只動(dòng)物。這些動(dòng)物在第0天已經(jīng)進(jìn)行預(yù)選擇，并且與其它動(dòng)物分別安置。為此，第2組和第5組在開始時(shí)有14只動(dòng)物，在選擇后剩余10只動(dòng)物。在病毒接種后第-1天直至第21天每天評(píng)定臨床癥狀和體重。在適應(yīng)環(huán)境期間所有動(dòng)物均是活躍的且看起來是健康的，無疾病跡象。每天計(jì)算平均臨床得分(總臨床得分除以每組存活動(dòng)物數(shù))，結(jié)果示于圖6(每組平均臨床得分)、表16(臨床得分)和表17(呼吸窘迫)。顯然，所有組均包含在感染后第1天示出臨床癥狀的小鼠。根據(jù)給予抗體的時(shí)間，所述臨床癥狀消除，且在第15天所有組中臨床癥狀均再不存在。在對(duì)照組5中，在第9天所有動(dòng)物均出現(xiàn)嚴(yán)重臨床癥狀且所有動(dòng)物均死亡或者被行安樂死，因?yàn)檫@些動(dòng)物達(dá)到臨床得分4。這表明給予動(dòng)物的是致死劑量的流感病毒。在第1組中，動(dòng)物在感染后4小時(shí)接受抗體，一些動(dòng)物不出現(xiàn)臨床癥狀，而其它動(dòng)物出現(xiàn)臨床癥狀。表16中提供了出現(xiàn)可以評(píng)分的臨床癥狀的動(dòng)物的數(shù)目。由于流感病毒對(duì)于呼吸器官可具有顯著作用，因此也測(cè)量呼吸窘迫情況并在表17中提供。圖7和表18分別示出所有組的存活動(dòng)物數(shù)目和死亡率。由于未知原因，在感染后4小時(shí)接受抗體的第1組中一只動(dòng)物在第10天死亡。在流感病毒感染后接受抗體的動(dòng)物組中所有剩余動(dòng)物在第21天均存活且健康。這在從所有小鼠獲得的體重?cái)?shù)據(jù)中清晰可見。圖8示出在研究的21天期間每組小鼠的平均體重。盡管所有小鼠的體重在感染時(shí)均降低，但是在給予抗體之后小鼠的體重恢復(fù)至正常水平。顯然，恢復(fù)至正常體重水平依賴于抗體治療的時(shí)間選擇，在暴露后4小時(shí)治療的動(dòng)物迅速康復(fù)且在第7天達(dá)到正常水平；在感染后3天治療的動(dòng)物在第17天達(dá)到其正常體重。所有動(dòng)物在研究結(jié)束即第21天時(shí)均達(dá)到相似且健康的體重。顯然，接受陰性對(duì)照抗體的動(dòng)物未恢復(fù)體重，在第9天死亡則終止測(cè)量。這些結(jié)果表明在用致死劑量H5N1流感病毒攻擊后，在感染后用本發(fā)明揭示的抗H5N1流感病毒的單克隆抗體例如CR6261進(jìn)行治療可以拯救哺乳動(dòng)物對(duì)象，如本文在小鼠中所示。甚至在晚期階段，感染后3天，所述抗體仍能使臨床癥狀倒退至臨床癥狀不再可監(jiān)測(cè)到的水平。令人吃驚的是在感染后第21天，所有經(jīng)抗體治療的動(dòng)物均達(dá)到正常體重水平且未示出任何殘存的臨床癥狀。實(shí)施例14伊微淑5A7游沿游卓克麟沐貧鵬薪魔赫毒週艦攻擊離/^如前所述(實(shí)施例11)，本發(fā)明的一些抗體顯然識(shí)別H5血凝素蛋白的HA2結(jié)構(gòu)域中的單一表位。實(shí)施例7示出本發(fā)明的某些結(jié)合分子可以非構(gòu)象方式與HA2表位相互作用，換句話說，血凝素蛋白的折疊形式似乎不妨礙本發(fā)明揭示的這些抗體的中和活性和保護(hù)作用。本領(lǐng)域己知流感病毒血凝素蛋白的無抗原性漂移傾向的那部分的序列(抗原性漂移二所述蛋白質(zhì)的HA1區(qū)域中免疫決定區(qū)的改變，導(dǎo)致需要每年更新流感病毒疫苗)。由CR6261、CR6325和CR6329識(shí)別的HA2中的表位包含于氨基酸序列GVTNKVNSIIDK(SEQIDNO:368，見表13)中，也存在于H1和H9亞型的血凝素蛋白中，見表22。實(shí)施例IO示出本發(fā)明的結(jié)合分子與表位的相互作用非限于H5的HA，也可以識(shí)別Hl和H9的HA(見表12)。因此，本發(fā)明的結(jié)合分子識(shí)別存在于不同流感病毒血清型的多個(gè)HA蛋白中的表位。為了研究這些抗體用于體內(nèi)治療的交叉應(yīng)用性，在小鼠中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，與實(shí)施例13中描述的實(shí)驗(yàn)的給藥方案一致。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，給予小鼠極高致死劑量的另一種流感病毒H1N1，該病毒與1918年流行性爆發(fā)、目前在季節(jié)性感染人體相關(guān)。隨后，用本發(fā)明的抗體例如CR6261治療小鼠，在感染后監(jiān)測(cè)小鼠的臨床癥狀、呼吸窘迫和體重共3周。如下文所述，這些結(jié)合分子可以拯救H5N1感染的小鼠，也能拯救H1N1感染的哺乳動(dòng)物對(duì)象。在感染后模型中進(jìn)行研究以檢測(cè)單克隆抗體例如CR6261對(duì)抗致死H1N1A/WSN/33流感病毒攻擊的體內(nèi)治療作用。該病毒批次得自ATCC(VR-219)并且在雞胚中增殖一次。效價(jià)為8.5logTCID50/ml。作為陰性對(duì)照，一組小鼠注射不相關(guān)的單克隆抗體(IgGl,X，稱作CR57，同種型匹配的陰性對(duì)照抗體)。監(jiān)測(cè)臨床癥狀、體重喪失以及死亡率直至感染后21天。將50只雌性6-8周齡的Balb/c小鼠分為5組，如下所述在感染相關(guān)的不同階段接受抗體1.IO只小鼠，在感染前l(fā)天給予15mg/kgCR62612.10只小鼠，在感染后1天給予15mg/kgCR62613.IO只小鼠，在感染后2天給予15mg/kgCR62614.IO只小鼠，在感染后3天給予15mg/kgCR62615.10只小鼠，在感染后1天給予15mg/kg陰性對(duì)照CR57使所有動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境并飼養(yǎng)至少4天，之后開始研究。在第0天為動(dòng)物接種大約50^1的致死劑量H1N1病毒(6.6logTCIDso;25XLDso等價(jià)物)并監(jiān)測(cè)。在接種之前/之后的指定時(shí)間點(diǎn)通過腹膜內(nèi)注射給予50(HU抗體。在研究期間監(jiān)測(cè)小鼠的一般健康情況。從第-1天直至第21天每天評(píng)定臨床癥狀和體重。利用實(shí)施例12和13所述的評(píng)分等級(jí)對(duì)臨床癥狀評(píng)分，得分范圍是0-4。存活的動(dòng)物在第21天被行安樂死并取血。表19提供了每組的死亡率，示出在研究期間每個(gè)研究組中活小鼠數(shù)目。兩只小鼠在接種后不久死亡(在第1天，第2組一只，第3組一只)，如研究計(jì)劃中預(yù)先指定將其從分析中排除。對(duì)照組5中的所有小鼠在第9天全部死亡，與先前用H5N1進(jìn)行的研究一樣(見表18)。這個(gè)致死攻擊劑量H1N1下存活的動(dòng)物的百分比在圖9中繪出。每組中示出相關(guān)臨床癥狀的小鼠的數(shù)目在表20中提供。在第1組中未觀測(cè)到臨床癥狀，而在第2、3和4組中一些小鼠出現(xiàn)臨床癥狀，這些癥狀在接種后第14天完全消失。第5組的所有小鼠在第2天開始出現(xiàn)臨床癥狀。這個(gè)組無小鼠康復(fù)。出現(xiàn)得分2或3的呼吸窘迫癥狀的小鼠的數(shù)目在表21中提供。在第l-4組中，在第13天后未觀測(cè)到臨床癥狀，而對(duì)照組5中所有剩余的小鼠均出現(xiàn)嚴(yán)重的呼吸窘迫。圖IO示出每個(gè)研究組中小鼠的平均體重。顯然，在第5組中在第8天后無測(cè)量數(shù)據(jù)可提供。從這個(gè)圖可以看出，接受抗-H5Nl抗體且均從臨床癥狀中康復(fù)的所有小鼠在第21天均達(dá)到其預(yù)期體重水平。在感染之前或之后給予所述抗體可以保護(hù)這些小鼠。顯然，感染劑量相當(dāng)高25XLDso劑量，表明當(dāng)所述抗體在肺中高效價(jià)存在時(shí)，提供非常強(qiáng)的抗病毒保護(hù)作用。這是臨床相關(guān)的，因?yàn)楦咧虏⌒圆《救鏗5N1在感染后復(fù)制為高效價(jià)且這些高病毒荷載與感染的人體中頻繁出現(xiàn)的嚴(yán)重后果相關(guān)。此外，所有被保護(hù)的小鼠隨著時(shí)間均從這個(gè)致死感染中完全康復(fù)。因此推斷結(jié)合不具有抗原性漂移傾向的HA2區(qū)中的(單一)表位的本發(fā)明的抗-H5Nl抗體(如CR6261、CR6325和CR6329)提供了對(duì)抗多種流感病毒血清型的體內(nèi)交叉保護(hù)作用，不再需要針對(duì)高突變敏感性HA1區(qū)的抗體。應(yīng)理解不受僅存在于H5流感病毒血清型的HA中的表位限制，本發(fā)明的結(jié)合分子也可以用于預(yù)防或者治療在HA2的穩(wěn)定區(qū)中含有相同表位的所有流感病毒血清型如H1N1以及包含H2、H6和H9血凝素蛋白的流感病毒。實(shí)施例15'菜微賄使用表面等離子共振分析進(jìn)行親和性研究，使用BIAcore3000分析系統(tǒng)在25'C和37。C使用HBS-EP(BiacoreAB,Sweden)作為運(yùn)行緩沖液以75pl/分鐘流速進(jìn)行。使用胺偶聯(lián)方法將IgG固定在研究級(jí)CM54-flowchannel(Fc)傳感器芯片(BiacoreAB,Sweden)上。注射不同量的H5N1病毒(A/Vietnam/1203/2004)的HA以分析所述HA蛋白與固定的IgG之間的結(jié)合相互作用。在每次測(cè)量結(jié)束時(shí)使用20mMNaOH再生以除去結(jié)合的HA，同時(shí)使芯片上剩余固定的IgG。確定CR6261、CR6323和CR6325抗體的親和性常數(shù)。注射五種濃度的4倍稀釋的HA(每次注射100^1)，隨后解離3600秒，使用10nl20mMNaOH再生。使用l:l(Langmuir)模型擬合所得數(shù)據(jù)。然而，不可計(jì)算精確的解離常數(shù)(KD)。這是由于在25X:非常低的解離速率(甚至用擴(kuò)展的測(cè)量方法測(cè)量)導(dǎo)致計(jì)算中不可接受的誤差所致。當(dāng)在37"C重復(fù)實(shí)驗(yàn)時(shí)，可辨別的解離發(fā)生，但是仍不足以精確測(cè)量KD。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以確定抗體的精確KD。據(jù)估計(jì)這些至少是在單數(shù)位nM范圍的親和性，很可能是在pM范圍的親和性。這些實(shí)驗(yàn)示出本發(fā)明的結(jié)合分子對(duì)于流感病毒HA蛋白中存在的其表位具有極高的親和性。下文提供了本文稱作SEQIDNO:58-143、SEQIDNO:212-237以及SEQIDNO:316-367的核酸和氨基酸序列的詳細(xì)描述。SEQ工DH):gaggtgcagctcttgcaaggcctggacaaggcaccgaagtatggagc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ctgggtcctcggtgaaggtc60tcctgcaaggcttctggagtcaccttcagttactatgctatgagctgggtgcgacaggcc120cctggacaagggcttgagtggatgggaggaatcagccctatgtttgggacaacaacctac180gcacagaagttccagggcagagtcacgattactgcggacgactccacgagtacagcctac240atggaggtgaggagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgcgagatcttcg300站ttactatgatagtgtatatgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagt360gctagcaccaagggccccagcgtgttccccctggcccccagcagcaagagcaccagcggc420ggcacagccgccctgrggctgcctggtgaaggactacttccccgagcccgtgaccgtgagc480tggaacagcggcgccttgaccagcggcgtgcacaccttccccgccgtgctgcagagcagc540ggcctgtacagcctgagcagcgtggtgaccgtgcccagcagcagcctgggcacccagacc600tacatctgcaacgtgaaccacaagcccagcaacaccaaggtggacaaacgcgtggagccc6S0aagagctgcgacaagacccacacctgccccccctgccctgcccccgagctgctgggcgga720ccctccgtgttcctgttcccccccaagcccaaggacaccctcatgatcagccggaccccc780gaggtgacctgcgtggtggtggacgtgagccacgaggaccccgaggtgaagttcaactgg840tacgtggacggcgtggaggtgcacaacgccaagaccaagecccgggaggagrcagtacaac300agcacctaccgggtggtgagcgtgctcaccgtgctgcaccaggactggctgaacggcaag960gagtacaagtgcaaggtgagcaacaaggccctgcctgcccccatcgagaagaccatcagc1020aaggccaagggccagccccgggagccccaggtgtacaccctgccccccagccgggaggag1080atgaccaagaaccaggtgtccctcacctgtctggtgaagggcttctaccccagcgacatc1140gccgtggagtgggagagcaacggccagcccgstgaacaactacaagaccaccccccctgtg1200ctggacagcgacggcagcttcttcctgtacagcaagctcaccgtggacaagagccggtgg1250cagcagggcaacgtgttcagctgcagcgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacc1320cagaagagcctgagcctgagccccggcaag1350SEQXDNO:365QVQLVQSGAEVKKPGSsVKVSCKASGVTFSYAMSwVRQAPGQGIjEWMGGISPMFGTTTYAQKFQGRVT工TADDsTSTAYMEVRSRSEDTAVYYCARSSNYYDSVDYWGQGTIiVTSSAsTKGPSVPIiAPSsKSTSGGTAAIiCIiVKDYFPEPVTVSwSGAIjTSGVHTFpAV1/QSSGIiYSIjsSVVTVPSSSIiGTQT工CVNHKPSTKVDKVEPKSCDKTHTCPPCP.APELjLiGGPSVFIjfPPKPKDTIiM工sRTPEVtCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHAKTKPREEQYNStRVVSVIiTVHQDWLNGKEKcKVSNKAIiPAPIEKTIsKAKGQPREPQVYTLjPPSREEMTKNQVSLiTCIiVK(3FYPSDIAVEwESNGQPENNYKTTPV!DSDGSFFLjYSKIiTVDKsRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLsLSPGKSEQIDNO:366cagtctgtcgtgacgcagccgccctc的agtcagtggccccaggacagacggcca的att60acctgtgggggacataacattggaagtaatagtgtgcactggtaccagcagaagccaggc120caggcccctgtgctggtcgtgtatgataatagcgaccggccctcagggatccctgagcga180ttctctggctccaactctgggaacacggccaccctgaccatcagcagggtcgaagccggg240gatgaggccgactsttactgtcaggtgtggggtagtagtagtgaccattatgtcttcgga300actgggaccaaggtcaccgtcctaggtgcggccgcaggccagcccaaggccgctcccagc360gtgaccctgttccccccctcctccgaggagctgcaggccaacaaggccaccctggtgtgc420<formula>formulaseeoriginaldocumentpage113</formula><table>tableseeoriginaldocumentpage113</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage114</column></row><table>*以1:1:1比率混合#以1:1比率混合X以1:1比率混合+以1:1比率混合表2:第二輪Vk,V入和VH擴(kuò)增<table>tableseeoriginaldocumentpage114</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage115</column></row><table>表3.第二輪VL區(qū)擴(kuò)增概括<table>tableseeoriginaldocumentpage116</column></row><table>116L60L6SOJL1L6J130PL6OL6SOJL2L6J260OL6SOJL3L6J310L7OL7SOJL1L7J130PL7OL7SOJL2L7J260OL7SOJL3L7J310L8OL8SOJL1L8J130PL8OL8SOJL2L8J260OL8SOJL3L8J310OL9SOJUL9J130PL9OL9SOJL2L9J260OL9SOJL3L9J310VL100%117表4.第二輪VH區(qū)擴(kuò)增概括<table>tableseeoriginaldocumentpage118</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage119</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage120</column></row><table>表7:/i4特異性免疫球蛋白的CDR區(qū)的數(shù)據(jù)。SEQIDNO在括號(hào)中給出<table>tableseeoriginaldocumentpage121</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage122</column></row><table>表8.HA特異性IgG的數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage123</column></row><table>*括號(hào)中示出組成重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變g(VL)的氨基酸表9.IgG對(duì)表達(dá)HA(H5N1TV)的PER.C6細(xì)胞的結(jié)合<table>tableseeoriginaldocumentpage124</column></row><table>*在50pg/ml未觀察到中和<table>tableseeoriginaldocumentpage125</column></row><table>表12.由ELISA(OD492nm)測(cè)定的抗-H5NlIgG對(duì)不同HA亞型的HA分子的交叉反應(yīng)性.ND:未確定<table>tableseeoriginaldocumentpage126</column></row><table>表14.用抗體預(yù)處理隨后用H5N1流感病毒致死攻擊的小鼠的臨床評(píng)分<table>tableseeoriginaldocumentpage127</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage128</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage129</column></row><table>表17.用H5N1病毒感染并在感染后不同時(shí)間點(diǎn)用抗體治療的小鼠的呼吸窘迫示出呼吸宭迫的小鼠數(shù)'研究天數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage130</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage131</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage132</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage133</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage134</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage135</column></row><table>參考文獻(xiàn)BoelEetal.(2000),Functionalhumanmonoclonalantibodiesofallisotypesconstructedfromphagedisplaylibrary-derivedsingle-chainFvantibodyfragments,J.Immunol.Methods239:153-166BurtonDRandBarbasCF(1994)，Humanantibodiesfromcombinatoriallibraries.Adv.Immunol,57:191-280ChouTCandPTalalay(1984)Quantitativeanalysisofdose-effectrelationships:thecombinedeffectsofmultipledrugsorenzymeinhibitors.AdvEnzymeRegul22:27-55DeKruifJetal.(1995a),Rapidselectionofcellsubpopulation-specifichumanmonoclonalantibodiesfromasyntheticphageantibodylibrary.ProcNatlAcadSdUSA92:3938DeKruifJetal.(1995b)Selectionandapplica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64所示重鏈CDR3區(qū)、SEQIDNO:265所示輕鏈CDRl區(qū)、SEQIDNO:266所示輕鏈CDR2區(qū)以及SEQIDNO:267所示輕鏈CDR3區(qū)的結(jié)合分子，o)包含SEQIDNO:268所示重鏈CDRl區(qū)、SEQIDNO:269所示重鏈CDR2區(qū)、SEQIDNO:270所示重鏈CDR3區(qū)、SEQIDNO:271所示輕鏈CDRl區(qū)、SEQIDNO:272所示輕鏈CDR2區(qū)以及SEQIDNO:273所示輕鏈CDR3區(qū)的結(jié)合分子，p)包含SEQIDNO:274所示重鏈CDRl區(qū)、SEQIDNO:275所示重鏈CDR2區(qū)、SEQIDNO:276所示重鏈CDR3區(qū)、SEQIDNO:277所示輕鏈CDRl區(qū)、SEQIDNO:278所示輕鏈CDR2區(qū)以及SEQIDNO:279所示輕鏈CDR3區(qū)的結(jié)合分子，q)包含SEQIDNO:280所示重鏈CDRl區(qū)、SEQIDNO:281所示重鏈CDR2區(qū)、SEQIDNO:282所示重鏈CDR3區(qū)、SEQIDNO:283所示輕鏈CDR1區(qū)、SEQIDNO:284所示輕鏈CDR2區(qū)以及SEQIDNO:285所示輕鏈CDR3區(qū)的結(jié)合分子，r)包含SEQIDNO:286所示重鏈CDRl區(qū)、SEQIDNO:287所示重鏈CDR2區(qū)、SEQIDNO:288所示重鏈CDR3區(qū)、SEQIDNO:289所示輕鏈CDRl區(qū)、SEQIDNO:290所示輕鏈CDR2區(qū)以及SEQIDNO:291所示輕鏈CDR3區(qū)的結(jié)合分子，s)包含SEQIDNO:292所示重鏈CDRl區(qū)、SEQIDNO:293所示重鏈CDR2區(qū)、SEQIDNO:294所示重鏈CDR3區(qū)、SEQIDNO:295所示輕鏈CDRl區(qū)、SEQIDNO:296所示輕鏈CDR2區(qū)以及SEQIDNO:297所示輕鏈CDR3區(qū)的結(jié)合分子，t)包含SEQIDNO:304所示重鏈CDRl區(qū)、SEQIDNO:305所示重鏈CDR2區(qū)、SEQIDNO:306所示重鏈CDR3區(qū)、SEQIDNO:307所示輕鏈CDRl區(qū)、SEQIDNO:308所示輕鏈CDR2區(qū)以及SEQIDNO:309所示輕鏈CDR3區(qū)的結(jié)合分子，以及u)包含SEQIDNO:310所示重鏈CDR1區(qū)、SEQIDNO:311所示重鏈CDR2區(qū)、SEQIDNO:312所示重鏈CDR3區(qū)、SEQIDNO:313所示輕鏈CDRl區(qū)、SEQIDNO:314所示輕鏈CDR2區(qū)以及SEQIDNO:315所示輕鏈CDR3區(qū)的結(jié)合分子。7.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的結(jié)合分子，其中所述結(jié)合分子是人單克隆抗體。8.編碼權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的結(jié)合分子的核酸分子。9.權(quán)利要求l-7任一項(xiàng)的結(jié)合分子用作藥物，優(yōu)選用于診斷、治療和/或預(yù)防流感感染。10.權(quán)利要求9的結(jié)合分子，其中所述流感感染是由于流感病毒所致，所述流感病毒與流行性爆發(fā)相關(guān)，或者具有流行性爆發(fā)相關(guān)的潛力。11.權(quán)利要求10的結(jié)合分子，其中所述與流行性爆發(fā)相關(guān)的流感病毒毒株選自如下一組H1N1、H5N1、H5N2、H5N8、H5N9、基于H2的毒株以及H9N2。12.—種藥物組合物，其包含權(quán)利要求l-7任一項(xiàng)的結(jié)合分子以及藥物可接受的賦形劑。13.權(quán)利要求l-7任一項(xiàng)的結(jié)合分子在制備用于診斷、預(yù)防和/或治療流感病毒感染的藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及結(jié)合流感病毒H5N1且對(duì)于流感病毒H5N1具有中和活性的結(jié)合分子如人單克隆抗體。本發(fā)明提供了編碼所述抗體的核酸分子、其序列和包含所述抗體的組合物以及鑒別和產(chǎn)生所述抗體的方法。所述抗體可用于流感病毒H5N1感染的診斷、預(yù)防和/或治療中。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗體提供了在體內(nèi)的交叉亞型保護(hù)作用，由此可以預(yù)防和/或治療基于H5、H2、H6、H9和H1的流感病毒亞型的感染。文檔編號(hào)C07K16/10GK101541832SQ200780041285公開日2009年9月23日申請(qǐng)日期2007年9月6日優(yōu)先權(quán)日2006年9月7日發(fā)明者C·A·德克呂夫,E·N·范登布林克,M·思羅斯比申請(qǐng)人:克魯塞爾荷蘭公司