專利名稱：：與白細(xì)胞介素-1受體1型結(jié)合的競爭性域抗體形式的制作方法與白細(xì)胞介素-1受體1型結(jié)合的竟?fàn)幮杂蚩贵w形式相關(guān)申請本申請要求2005年12月1號(hào)提交的美國臨時(shí)申請No.60/742,218的利益。上述申請的全部教導(dǎo)在此引作參考。
背景技術(shù)：
：白細(xì)胞介素-1(IL-1)是一種重要的對幾種類型的細(xì)胞有生物效應(yīng)的免疫應(yīng)答介質(zhì)。白細(xì)胞介素-1與兩種受體白細(xì)胞介素-1受體1型(IL-1R1、CD121a、p80)和白細(xì)胞介素-1受體2型(IL-1R1、CDwl21b)相結(jié)合，白細(xì)胞介素-1受體1型與IL-1結(jié)合將信號(hào)向細(xì)胞內(nèi)傳遞，白細(xì)胞介素-1受體2型與IL-1結(jié)合不傳遞信號(hào)，而是作為IL-1內(nèi)源性調(diào)節(jié)劑。另一種調(diào)節(jié)IL-1與IL-1R1相互作用的內(nèi)源性蛋白是白細(xì)胞介素-1受體拮抗劑(IL-lra)。IL-lra與IL-1R1結(jié)合，但不激活I(lǐng)L-1R1以傳遞信號(hào)。通過IL-1R1與IL-1(例如IL-la或IL-1(3)結(jié)合傳遞的信號(hào)誘導(dǎo)廣譜的可致病的生物活性。例如通過IL-1R1與IL-i(例如IL-la或IL-lp)結(jié)合傳遞的信號(hào)可導(dǎo)致局部及全身性炎癥，產(chǎn)生另外的炎性介質(zhì)(如IL-6、11-8、TNF),發(fā)燒，激活免疫細(xì)胞(如淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞)，食欲不振，低血壓，白細(xì)胞減少癥和血小板減少。通過IL-1R1與IL-1(例如IL-la或IL-ip)結(jié)合傳遞的信號(hào)對非免疫細(xì)胞也有作用，如刺激軟骨細(xì)胞釋放膠原酶和其他降解軟骨骨細(xì)胞。(參見例如HalleguaandWeisman,Ann.Theum.Dis.61:960-967(2002).)。因此，IL-1和IL-1R1的相互作用已牽涉幾種疾病如關(guān)節(jié)炎(如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、骨性關(guān)節(jié)炎)和炎癥性腸病的發(fā)病機(jī)理。某些與白細(xì)胞介素-1受體1型(IL-1R1)結(jié)合并使其無活性(如IL-lra)的物質(zhì)，已被證明是某些炎癥疾病的有效治療劑，如中度到嚴(yán)重的活動(dòng)性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。不過，其他與IL-1R1結(jié)合的物質(zhì)如抗IL-1R1抗體AMG108(Amgen公司)已不能滿足臨床研究中主要終點(diǎn)的要求。存在著對拮抗IL-1R1的改進(jìn)藥物，以及施用此種藥物治療疾病的方法的需求。發(fā)明概述本發(fā)明涉及與IL-1R1結(jié)合，并抑制IL-1(如IL-lot和/或IL-l卩)和IL-lra與IL-1R1結(jié)合的域抗體(dAb)單體，以及包括此種dAb單體的配體。這種配體和dAb單體可用作治療劑，治療炎癥、疾病或全部或部分由IL-1與IL-1R1結(jié)合所誘導(dǎo)的生物學(xué)功能所介導(dǎo)的其他疾病(如局部或全身性炎癥，炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生(如IL-6、II-8、TNF),發(fā)燒，免疫細(xì)胞的激活(如淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞)，厭食癥，低血壓，白細(xì)胞減少，血小板減少)。本發(fā)明的配體或dAb單體可與IL-1R1結(jié)合，并抑制IL-1R1功能，從而產(chǎn)生治療效果。此外，為診斷或其他目的本發(fā)明的配體或dAb單體可用于檢測或定量例如生物樣本中的IL-1R1。一方面，本發(fā)明涉及一種域抗體(dAb)單體，該域抗體單體能特異性結(jié)合白細(xì)胞介素-1受體1型(IL-1R1)，并抑制白細(xì)胞介素-1(IL-1，如白細(xì)胞介素-la(IL-la)和/或白細(xì)胞介素-ip(IL畫1(3))和白細(xì)胞介素-1受體拮抗劑((IL-lra)與IL-1R1的結(jié)合。優(yōu)選地，所述dAb單體抑制IL-1與IL-1R1結(jié)合，IC50S1)iM。在一些實(shí)施方案中，在體外檢測中所述dAb單體抑制IL-1誘導(dǎo)的MRC-5細(xì)胞(ATCC檢索號(hào)CCL-171)釋放白細(xì)胞介素-8，ND50$1^M，或優(yōu)選^1nM。在其他實(shí)施方案中，在全血檢測中所述dAb單體抑制IL-1誘導(dǎo)的白細(xì)胞介素-6的釋放，ND50S1^M。在其他實(shí)施方案中，在全血檢測中所述dAb單體抑制IL-1誘導(dǎo)的白細(xì)月包介素-6的釋放，ND50^1jiM。所述dAb單體內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)框架區(qū)(FR)可包括(a)人框架區(qū)的氨基酸序列，(b)人框架區(qū)氨基酸序列的至少8個(gè)毗連氨基酸，或(c)人種系抗體基因片段編碼的氨基酸序列，其中所述框架區(qū)如Kabat所定義。所述dAb單體中一個(gè)或多個(gè)框架區(qū)的氨基酸序列可以與人種系抗體基因片段編碼的相應(yīng)框架區(qū)氨基酸序列相同，或相對于人種系抗體基因片段編碼的相應(yīng)框架區(qū)，一個(gè)或多個(gè)所述框架區(qū)的氨基酸序列總共含有最高達(dá)5個(gè)氨基酸的差異。所述dAb單體中FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列可以與人種系抗體基因片段編碼的相應(yīng)框架區(qū)氨基酸序列相同，或相對于人種系抗體基因片段編碼的相應(yīng)框架區(qū)，F(xiàn)R1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列總共含有最高達(dá)IO個(gè)氨基酸的差異。dAb單體可包括FR1、FR2和FR3區(qū)，所述FR1、FR2和FR3的氨基酸序列可以與人種系抗體基因片段編碼的相應(yīng)框架區(qū)氨基酸序列相同。在一些實(shí)施方案中，人種系抗體基因片段是DPK9和JK1。在一些實(shí)施方案中，所述dAb單體與選自下列的dAb竟?fàn)幣cIL-1R1的結(jié)合DOM4-130-30(SEQIDNO:3)、DOM4-130-46(SEQIDN0:4)、DOM4-130-51(SEQIDNO:5)、DOM4-130-53(SEQIDNO:6)、DOM4-130-54(SEQIDNO:7)、DOM4-130(SEQIDNO:215)、DOM4-130-1(SEQIDNO:216)、DOM4-130-2(SEQIDNO:217)、DOM4-130-3(SEQIDNO:218)、DOM4畫130-4(SEQIDNO:219)、DOM4-130-5(SEQIDNO:220)、DOM4-130-6(SEQIDNO:221)、DOM4-130-7(SEQIDNO:222)、DOM4-130-8(SEQID<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>、to:ONai63S)On-On-W/VOGt、to:ONGtl加S)61I_0￡I-柳OG、(I￡￡:ONCII加S)SII-On陽,Oa、(0￡￡:ONCQ。3s)"I-on-w/voa、(6Z￡:onai03s)911-0u-t7woa、(s^:onaid3s)sn-on寸woa、("￡:onaib3s)wi-on-WMoa、(9乙e:0Naib3S)ni-on，oa、Congi加s)ni-on寸woa、(ra:onaib3S)1n陽0n-w^oa、(k。onaiDas)oii-on-wMOG、(ZZ￡:ONai53S)60I-0H卞WOa、(IZ￡:ONGIb3S)801_0￡1，OG、(0Z￡:(MaiZX)I-On寸WOa、(6I￡:ONai加S)901-on-t/woa、(si。onaib3S)soi-on-w^oa、(ai。onai。3S)WH-On-WAIOa、(9I￡:ONGIO)l-OU寸WOa、(Sl￡:ONaib3s)zoi-on寸iAioa、(wonai加s)ioi-on-剛oa、Iaib3S)、(乙ie:ONgi加S)66-0￡i-t7WO(i、<ai加s)、(0I￡:ONCQt)3s)、<:60e:ONai加s)96-on-w/voa、(80￡:omgiD3S)、1:膨onaiDas)176-on-i/woa、(90￡:ONGI加S)、<ai加s)ai63S)、〔區(qū):ONaid3s)06—0ni7]/VOG、(度:ONGI。3s)68—0￡l-W/MOG、〔IOS:ONai、(00￡:ONGI加S)、〔66Z::ONai98-on寸woaai。3S)、〔A6Z:ONaid3s)、(96Z:ONai。3s)、CONai加S)、(嫁:ONGI。3s)、ai加S)、(,ONGI。3s)6Zron-i7woa、(區(qū)ONaiD3S)、(06乙:ONGI63S)、〔ONai加S)ai63S)、ai加S)K-on"tiA[oa、(98乙:0尺GIb3S)、〔弧:OMai加S)ai加S)、aib3S)ai加S)、〔IS::ONai加s)89-on-wA[oa、(0SZ:OMai。3S)、〔6":OM<formula>formulaseeoriginaldocumentpage34</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage35</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage36</formula>c/wWwwWwwwwwWWwwwwwwWWwWWwCOCOGOGOCOCOGOGOCO00enON卜m卜mIT)卜ONCOin卜ONCOin卜CM巾m。COIT)in力。卜卜卜ci<id>cicicimmCOmm。mmmCO。mmmCOmenCOCO4*4丄v丄丄v丄丄Vl丄V上丄Vl丄v丄丄v丄丄Vl丄v丄M丄v丄ooo〇〇〇oOoooOOoooOooOOOOooOoooQQQQ:235):237):239):243):245):247):249)in:253):255):257):259)>o:263):265):267):269):275):277):279)>~ioomoo:285):287):289)NO:OO6OOOOOOOO6OOOO6OOO6OOOQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQOwc/owOWw00W00Wwww00ww00wc/Wc/wc/Wwwwwc/Ww00wwwo(N<NooCM寸COmoom導(dǎo)等oo寸o(Nin寸00wo。oo<i1OmCOd>mm。mcimmm<imcim<imCO<immmd>mm她OG-tsoa-tsoa-寸MDa-寸pvoa-寸WOG-寸woa-寸SOG-寸woa-寸M:S-寸IAIOa她oa-寸woa-tsoa—寸IA5a-寸woa-寸woa-達(dá)oa,(OSSNa,SNCIA寸9SNCI-(09SNCI,(§0NCI-(寸寸SNCISNCI-(O寸SNCI-(9￡§Na-(KSNCIMIII/6城浮每I,Z-SIS008900S-oa!soa,(ZK:ONaibws)6n-0n-寸IAIOa-(IK:ONaib3s)sn-oel-寸MDa-(OK6Naiaas)An-o￡I-s〇a-(6ONcnaia3s)寸n-on-寸woa-(9￡￡:ONcnen-on-寸PN5G-(SONaibws)rn-on-寸woa,(Ke:ONQ富)in-on-on-寸woa,(I￡￡:ONaia3s)8u-on-寸wod-(OONaia3s)aib3s)UI-on-Ioa-(SZ:SNaias)3II-0n-sod-oa-寸woa-(OZSN。1a3s)AOI-§-IOCI-(61￡劍aibs)90I-0n-寸IAIOa二SU6NLaibws)SOI-on-寸？3a-(/J￡:ONaia3s)寸OI-on-寸PMOa,(9I§Nai富)SI-oa-ioa,(5I￡:ONaib3s)SI-on-寸woa,(寸Ie:ONaiaas)IOI-on-寸wod,(ue:ONGIC>3S)00I-on-寸IA5a,(n￡:ONQIb3s)66-0n-寸wocl,(II。ONaia3s)86-0u-寸woa,(ot￡6Ncna3s)A6-0n-寸woa,(SOSN。1b3s)S5-寸MXI,(寸OSN。1b3s)I6-oe5F§,(IONaiD3S)06-0el-寸MDa,(SSN9a3s)6s-on-寸w8。1旨)s-on-soa,(寸6SNcn富)IS-OSI-寸MXI,(16SN。1ssn-loa,(06SN。163S)Asn-達(dá)OG<formula>formulaseeoriginaldocumentpage39</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage40</formula>DOM4-130-101(SEQIDNO:314)、DOM4-130-102(SEQIDNO:315)、DOM4-130-103(SEQIDNO:316)、DOM4-130-104(SEQIDNO:317)、DOM4-130-105(SEQIDNO:318)、DOM4-130-106(SEQIDNO:319)、DOM4-130-107(SEQIDNO:320)、DOM4-130-108(SEQIDNO:321)、DOM4-130-109(SEQIDNO:322)、DOM4-130-110(SEQIDNO:323)、DOM4-130-111(SEQIDNO:324)、DOM4-130-112(SEQIDNO:325)、DOM4-130-113(SEQIDNO:326)、DOM4-130-114(SEQIDNO:327)、DOM4-130-115(SEQIDNO:328)、DOM4-130-116(SEQIDNO:329)、DOM4-130-117(SEQIDNO:330)、DOM4畫130-118(SEQIDNO:331)、DOM4隱130畫119(SEQIDNO:332)、DOM4-130-120(SEQIDNO:333)、D0M4-130-121(SEQIDNO:334)、DOM4-130-122(SEQIDNO:335)、DOM4-130-123(SEQIDNO:336)、DOM4-130-124(SEQIDNO:337)、DOM4-130-125(SEQIDNO:338)、DOM4-130-126(SEQIDNO:339)、DOM4-130-127(SEQIDNO:340)、DOM4-130-128(SEQIDNO:341)、DOM4-130-129(SEQIDNO:342)、DOM4-130-130(SEQIDNO:343)、DOM4-130-131(SEQIDNO:344)、D0M4-130-132(SEQIDNO:345)和DOM4-130-133(SEQIDNO:346)。優(yōu)選地，所述dAb單體與人IL-1R1結(jié)合的親和力常數(shù)(KD)為約300nM至約5pM,由表面等離子體共振測定。另一方面，本發(fā)明涉及包括dAb單體和半衰期延長部分的配體，該dAb單體特異性結(jié)合白細(xì)胞介素-l受體1型(IL-1R1),抑制白細(xì)胞介素-1(IL國l,例如白細(xì)胞介素-loc(IL-la)和/或白細(xì)胞介素-l卩(IL-ip))和白細(xì)胞介素-1受體拮抗劑(IL-lra)與IL-1R1的結(jié)合。該半衰期延長部分可以是聚烷撐二醇部分、血清白蛋白或其片段、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體或其轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合部分、或包含與延長體內(nèi)半衰期的多肽結(jié)合的位點(diǎn)的抗體或抗體片段。在一些實(shí)施方案中，該半衰期延長部分是包含與血清白蛋白或新生兒Fc受體結(jié)合的位點(diǎn)的抗體或抗體片段。在具體實(shí)施方案中，所述半衰期延長部分是一個(gè)免疫球蛋白單可變域，其與本文公開的抗血清白蛋白dAb竟?fàn)幣c人血清白蛋白的結(jié)合。在其他具體實(shí)施方案中，半衰期延長部分是包含一氨基酸序列的免疫球蛋白單可變域，所述氨基酸序列有至少90%的氨基酉吏序列與本文公開的抗血清白蛋白dAb的氨基酸序列相同。在進(jìn)一步具體實(shí)施方案中，本發(fā)明是包括與IL-1R1特異性結(jié)合，并抑制IL-1和受體結(jié)合，但不抑制IL-lra和IL-1R1結(jié)合的dAb單體的配體，其中所述dAb單體選自DOM4-130-30,DOM4-130-46，DOM4-130-51，DOM4-130-53和DOM4-130-54。該配體可以是例如dAb單體或所述dAb單體的同源二聚體、同源三聚體或同源寡聚體。該配體可以進(jìn)一步包括與血清白蛋白如DOM7h-8結(jié)合的dAb單體。例如在一些實(shí)施方案中，該配體包括DOM4-130-54和DOM7h-8。在其他具體實(shí)施方案中，本發(fā)明是一種配體，其包括與IL-1R1特異性結(jié)合，并抑制IL-1和IL-lra與IL-1R1結(jié)合的dAb單體，以及和肺瘤壞死因子受體1(TNFR1)特異性結(jié)合的dAb單體。如果需要，所述配體可以進(jìn)一步包括半衰期延長部分。優(yōu)選地，所迷對TNFR1具有結(jié)合特異性的dAb單體與本文公開的抗TNFR1dAb竟?fàn)幣cTNFR1的結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，所述對TNFR1具有結(jié)合特異性的dAb單體包含氨基酸序列，該氨基酉^列與本文公開的抗TNFR1dAb的氨基酸序列具有至少90%的氨基酸序列一致性。本發(fā)明還涉及編碼dAb單體或配體的分離的或重組核酸，以及包括所述重組核酸的載體(如表達(dá)載體)。本發(fā)明還涉及包括重組核酸或載體的宿主細(xì)胞，以及一種制備配體或dAb單體的方法，該方法包括在適合編碼本發(fā)明的配體或dAb單體的核酸表達(dá)的條件下使本發(fā)明的宿主細(xì)胞保持穩(wěn)定。本發(fā)明還涉及包括dAb單體或配體，以及生理學(xué)上可接受載體的藥物組合物。例如一種靜脈注射、肌肉注射、腹腔內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、鞘內(nèi)注射、關(guān)節(jié)內(nèi)、皮下、肺部、鼻腔內(nèi)、陰道或直腸給藥的藥物組合物。本發(fā)明還涉及一種包括本發(fā)明藥物組合物的給藥裝置。例如所述給藥裝置可以是非腸道給藥裝置、靜脈注射給藥裝置、肌肉注射給藥裝置、腹腔內(nèi)給藥給藥裝置、透皮給藥裝置、肺部給藥裝置、動(dòng)脈內(nèi)給藥裝置、鞘內(nèi)注射給藥裝置、關(guān)節(jié)內(nèi)給藥裝置、皮下給藥裝置、鼻腔內(nèi)給藥裝置、陰道給藥裝置或直腸給藥裝置。這種給藥裝置的例子包括注射器、透皮給藥裝置(如貼片)、膠嚢、片劑、噴霧器、吸入器、霧化器、氣霧器、起霧器、干粉吸入器、定量吸入器、定量噴霧器、定量起霧器、定量霧化器和導(dǎo)管。本發(fā)明還涉及一種治療炎癥疾病的方法，其包括將治療有效量的本發(fā)明的dAb單體或配體施用于對其有需要的受試者。本發(fā)明還涉及用于治療、診斷和/或預(yù)防的本發(fā)明的dAb單體或配體，以及本發(fā)明的dAb單體或配體在制備治療本文所述疾病(如炎癥疾病、關(guān)節(jié)炎、呼吸疾病)的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及治療疾病(如炎癥疾病、關(guān)節(jié)炎、呼吸疾病)的方法，其包括將治療有效量的耐蛋白酶降解的dAb單體施用于對其有需要的受試者。本發(fā)明還涉及耐蛋白酶降解，用于治療、診斷或預(yù)防的dAb單體，以及本發(fā)明的此種dAb單體在制備治療本文所述疾病(如炎癥疾病、關(guān)節(jié)炎、呼吸疾病)的藥物中的應(yīng)用。附圖簡述圖1是體外檢測結(jié)果圖，其中檢測dAbs抑制IL-1誘導(dǎo)的經(jīng)培養(yǎng)MRC-5細(xì)胞(ATCC目錄號(hào)CCL-171)釋放IL-8的能力。圖l顯示在此種細(xì)胞檢測中被稱為DOM4-130的抗IL-1R1dAb的典型劑量反應(yīng)曲線。在所述檢測中DOM4-130的ND5o約為500-1000nM。圖2和圖3是體外檢測結(jié)果圖，其中檢測了經(jīng)歷親和力成熟的dAbs抑制IL-1誘導(dǎo)的經(jīng)培養(yǎng)MRC-5細(xì)胞(ATCC目錄號(hào)CCL-171)釋放IL-8的能力。圖2是DOM4-130-3的劑量反應(yīng)曲線，DOM4-130-3是DOM4-130親和力成熟的變體。與DOM4-130為500國1000nM的ND50(見圖1)相比，所述才企測中DOM4-130-3的冊50為約30nM。圖3是DOM4-130-46和DOM4-130-51，以及白細(xì)胞介素1受體拮抗劑(IL-lra)的劑量反應(yīng)曲線，DOM4-130-46和DOM4-130-51是DOM4-130的親和力成熟的變體。檢測中DOM4-130-46的NDso為約1nM,DOM4-130-51的NDso為約300pM。圖4A和4B是傳感圖，顯示既非DOM4-130-3(圖4A),也非IL-lot(圖4B)與已經(jīng)和IL-lra結(jié)合的IL-1R1結(jié)合。IL-lra被注入并流經(jīng)固定化的IL-1R1的表面，與固定化的受體結(jié)合(注射1，在圖4A和4B中從0至60秒)。然后注入或DOM4-130-3或IL-la(注射2，在圖4A和4B中從60至120秒)。在傳感圖中可以看出，既非DOM4-130-3,也非IL-la與已經(jīng)和IL-lra結(jié)合的IL-1R1結(jié)合。圖5顯示在竟?fàn)幮越Y(jié)合ELISA中，濃度增加的DOM4-130-3或IL-la抑制IL-lra和IL-1R1結(jié)合。濃度增加的DOM4-130-3或IL-la與500pMIL-lra混合，混合物被加到IL-1R1包被的ELISA板上。圖6顯示體外檢測結(jié)果，其中檢測了dAbs抑制IL-1誘導(dǎo)的人全血中IL-6釋放的能力。圖7A-7Z圖解了與人IL-1R1結(jié)合的幾種人dAbs的氨基酸序列。在一些所述序列中，CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸加了下劃線。圖8A-8Z、8AA-8ZZ、8AAA和8BBB圖解了編碼圖7A-7Z所示人dAbs的核酸的核苷酸序列。在一些所述序列中，編碼CDR1、CDR2和CDR3的核苷酸加了下劃線。圖9A是通過與小鼠血清白蛋白(MSA)結(jié)合而選得的三種Vks的氨基酸序列的比對。所述經(jīng)比對的氨基酸序列來自被稱為MSA16、MSA12和MSA26的Vks,MSA16也被稱作DOM7m-16(SEQIDNO:723)、MSA12也被稱作DOM7m-12(SEQIDNO:724),MSA26也被稱作DOM7m-26(SEQIDNO:725)。圖9B是通過與大鼠血清白蛋白(RSA)結(jié)合選得的六種Vks的氨基酸序列的比對。所述經(jīng)比對的氨基酸序列來自被稱為DOM7r-l(SEQIDNO:726)、DOM7r-3(SEQIDNO:727)、DOM7r-4(SEQIDNO:72S)、DOM7r-5(SEQIDNO:729)、DOM7r匿7(SEQIDNO:730)和DOM7r-8(SEQIDNO:731)的Vks。圖9C是通過與人血清白蛋白(HSA)結(jié)合選得的六種Vks的氨基酸序列的比對。所述經(jīng)比對的氨基酸序列來自稱為DOM7h-2(SEQIDNO:732)、DOM7h-3(SEQIDNO:733)、DOM7h-4(SEQIDNO:734)、DOM7h-6(SEQIDNO:735)、DOM7h陽l(SEQIDNO:736)和DOM7h-7(SEQIDNO:737)的Vks。圖9D是通過與人血清白蛋白的結(jié)合選得的七種VHs的氨基酸序列的比對以及共有序列(SEQIDNO:738)。所述經(jīng)比對的氨基g吏序列來自被稱為DOM7h-22(SEQIDNO:739)、DOM7h-23(SEQIDNO:740)、DOM7h-24(SEQIDNO:741)、DOM7h-25(SEQIDNO:742)、DOM7h-26(SEQIDNO:743)、DOM7h-21(SEQIDNO:744)和DOM7h-27(SEQIDNO:745)的VHs。圖9E是通過與人血清白蛋白(HSA)以及大鼠血清白蛋白結(jié)合選得的三種Vks的氨基酸序列的比對。所述經(jīng)比對的氨基酸序列來自被稱為DOM7h-8(SEQIDNO:746)、DOM7r-13(SEQIDNO:747)和DOM7r隱14(SEQIDNO:748)的Vks。圖IO圖解了通過與大鼠血清白蛋白(RSA)結(jié)合選得的Vks的氨基酸序列。該圖解序列來自被稱為DOM7r-15(SEQIDNO:749)、DOM7r-16(SEQIDNO:750)、DOM7r-17(SEQIDNO:751)、DOM7r-18(SEQIDNO:752)和DOM7r-19(SEQIDNO:753)的Vks。圖11A-11B圖解了與大鼠血清白蛋白(RSA)結(jié)合的vhs的氨基酸序列。該圖解序列來自被稱為DOM7r-20(SEQIDNO:754)、DOM7r-21(SEQIDNO:755)、DOM7r-22(SEQIDNO:756)、DOM7r-23(SEQIDNO:757)、DOM7r-24(SEQIDNO:758)、DOM7r-25(SEQIDNO:759)、DOM7r-26(SEQIDNO:760)、DOM7r-27(SEQIDNO:761)、DOM7r-28(SEQIDNO:762)、DOM7r-29(SEQIDNO:763)、DOM7r-30(SEQIDNO:764)、DOM7r-31(SEQIDNO:765)、DOM7r-32(SEQIDNO:766)和DOM7r-33(SEQIDNO:767)的VHs。圖12圖解了與WO2004/041862中公開的小鼠血清白蛋白結(jié)合的幾種駝?lì)?Came/W)VHHs的氨基酸序列。序列A(SEQIDNO:768)、序列B(SEQIDNO:769)、序列C(SEQIDNO:770)、序列D(SEQIDNO:771)、序列E(SEQIDNO:772)、序列F(SEQIDNO:773)、序列G(SEQIDNO:774)、序列H(SEQIDNO:775)、序列I(SEQIDNO:776)、序列J(SEQIDNO:777)、序列K(SEQIDNO:77S)、序列L(SEQIDNO:779)、序列M(SEQIDNO:780)、序列N(SEQIDNO:781)、序列O(SEQIDNO:782)、序列P(SEQIDNO:783)、序列Q(SEQIDNO:784)。圖13A-13V圖解了能與人TNFR1特異性結(jié)合的幾種人免疫球蛋白可變域的氨基酸序列。所述氨基酸序列是連續(xù)的沒有空位；符號(hào)已被插入所述序列中，表示互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)的位置。CDR1兩側(cè)是~，CDR2兩側(cè)是，以及CDR3兩側(cè)是。圖14A-14B圖解了能與小鼠TNFR1特異性結(jié)合的幾種人免疫球蛋白可變域的氨基酸序列。所述氨基酸序列是連續(xù)的沒有空位；符號(hào)已被插入一些序列中，表示互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)的位置。CDR1兩側(cè)是，CDR2兩側(cè)是~，以及CDR3兩側(cè)是~。發(fā)明詳述本說明書結(jié)合供參考的實(shí)施方案以清楚和簡潔的方式描述了本發(fā)明。實(shí)施方案可有不同組合或拆分，并不偏離本發(fā)明，這是本文的意圖所在并應(yīng)被理解。本文所用的術(shù)語"配體"指包括與所需靶標(biāo)特異性結(jié)合的域的多肽。優(yōu)選地，所述結(jié)合域是與所需靶抗原(如受體蛋白)特異性結(jié)合的免疫球蛋白單可變域(如VH、Vl、Vhh)。所述結(jié)合域還可以包括與合適形式的所需靶抗原特異性結(jié)合的免疫球蛋白單可變域的一種或多種互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs),使得所述結(jié)合域與所述耙抗原特異性結(jié)合。例如，所述CDRs可移植到合適的蛋白質(zhì)支架或骨架上，如親和體、SpA支架、LDL受體A類域或EGF域。此外，配體可以如本文所述是單價(jià)的(如dAb單體)、二價(jià)的(同型二價(jià)、異型二價(jià))或多價(jià)的(同型多價(jià)、異型多價(jià))。因此如本文所述"配體"包括由dAb組成的多肽，包括實(shí)質(zhì)上由此種dAb組成的多肽，包括合適形式的dAb(或dAb的CDRs)、雙特異性配體和多特異性配體的多肽，其中所述合適形式的dAb(或dAb的CDRs)如抗體形式(例如IgG樣形式、scFv、Fab、Fab，、F(ab，)2)或適合的蛋白支架或骨架，如親和體、SpA支架、LDL受體A類域或EGF域，所述雙特異性配體包括與第一靶蛋白、抗原或表位(如IL-1R1或TNFR1)結(jié)合的dAb,以及與另一靶蛋白、抗原或表位(如血清白蛋白)結(jié)合的第二dAb。結(jié)合域還可以是包括所需靶標(biāo)結(jié)合位點(diǎn)的蛋白域，如選自親和體、SpA域、LDL受體A類域、EGF域和Avimer的蛋白域(參見例如美國專利申請公開號(hào)2005/0053973、2005/0089932、2005/0164301)。"免疫球蛋白單可變域"指獨(dú)立于其他V區(qū)或v域而特異性結(jié)合抗原或表位的抗體可變域(VH,Vhh,VJ;但是本文所用的免疫球蛋白單可變域可以以與其他可變區(qū)或可變域一起的形式(如同源或異源多聚體)出現(xiàn)，其他可變區(qū)或可變域?qū)蚊庖咔虻鞍卓勺冇蚺c抗原的結(jié)合來說不是必須的(即免疫球蛋白單可變域結(jié)合抗原無需另外的可變域)。"免疫球蛋白單可變域"不僅包括分離的抗體單可變域多肽，還包括含有一種或多種抗體單可變域多肽序列的一種或多種單體。"域抗體"或"dAb"與本文所用的"免疫球蛋白單可變域"多肽是相同的。本文所用的免疫蛋白單可變域多肽指哺乳類免疫球蛋白單可變域多肽，優(yōu)選人，4旦還包括嚙齒類(如WO00/29004中公開的，其全部內(nèi)容在此引作參考)或駝?lì)?Ozme/W)VHHdAbs。駝?lì)?Ow犯/W)dAbs是來源于包括駱駝、大羊駝、羊駝、單峰駝和原駝的種的免疫球蛋白單可變域多肽，包括輕鏈天然缺失的重鏈抗體V冊。V冊分子比IgG分子約小IO倍，作為單(域)多肽，它們非常穩(wěn)定，可抗極端pH和溫度條件。本文所用的術(shù)語"劑量"指一次(單位劑量)，或確定時(shí)間間隔的兩次或多次施用于受試者的藥物(如抗IL-1R1dAb、TNFR1拮抗劑)的量。例如，劑量指一天(24小時(shí))(每日劑量)、兩天、一周、兩周、三周或一個(gè)或多個(gè)月(例如通過一次給藥，或通過兩次或更多次給藥)的過程中施用于受試者的藥物(如抗IL-1R1dAb、TNFR1拮抗劑)的量。劑量間的時(shí)間間隔可以是任何所需的時(shí)間量。當(dāng)兩種免疫球蛋白域?qū)儆谛纬赏磳蚪M的結(jié)構(gòu)家族或是來源于此種家族并保留此特征時(shí)，它們是"互補(bǔ)的"。例如，抗體的Vh域和V^域是互補(bǔ)的；丙個(gè)Vh域不是互樸的，兩種Vi域不是互補(bǔ)的?？稍诿庖咔虻鞍壮易宸肿拥钠渌蓡T中發(fā)現(xiàn)互補(bǔ)域，比如T細(xì)胞受體的Va和V(3(或y和S)域。人工的域，例如除非設(shè)計(jì)成與表位結(jié)合，否則不和表位結(jié)合的基于蛋白支架的域，是非互補(bǔ)的。同樣地，基于(例如)免疫球蛋白域和纖維連接蛋白域的兩個(gè)域不是互補(bǔ)的。"免疫球蛋白"指保留了抗體分子的免疫球蛋白折疊特征的多肽家族，抗體分子包含兩個(gè)P折疊片，并通常含有保守二硫鍵。免疫球蛋白超家族成員涉及體內(nèi)細(xì)胞和非細(xì)胞間相互作用的許多方面，包括在免疫系統(tǒng)中的普遍作用(例如抗體、T細(xì)胞受體分子等)，涉及細(xì)胞粘附(例如ICAM分子)和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(例如受體分子，如PDGF受體)。本發(fā)明適用于所有具有結(jié)合區(qū)的免疫球蛋白超家族分子。優(yōu)選地，本發(fā)明涉及抗體。"域(domain)，，指保留其三級(jí)結(jié)構(gòu)的折疊蛋白結(jié)構(gòu)，該三級(jí)結(jié)構(gòu)獨(dú)立于蛋白的其他部分。通常域是造成蛋白不連續(xù)的功能性質(zhì)的原因，在許多情況下域可能會(huì)增加，去除，或轉(zhuǎn)移到其他蛋白而不喪失蛋白剩余部分和/或域的功能。"單抗體可變域"是包括抗體可變域序列特征的折疊多肽域。因此它包括完整的抗體可變域和經(jīng)修飾的可變域，例如其中一個(gè)或多個(gè)環(huán)已被抗體可變域非特征序列所取代，或已被截?cái)嗟幕虬∟或C端延伸的抗體可變域，以及至少部分保留全長域的結(jié)合活性和特異性的可變域折疊片段。術(shù)語"庫"指不同變體的集合，例如多肽的變體，其一級(jí)結(jié)構(gòu)有差異。本發(fā)明所用的文庫涵蓋了包括至少1000種成員的多肽庫。術(shù)語"文庫，，指異質(zhì)多肽或核酸的混合物。庫由成員組成，每個(gè)成員都有單獨(dú)的多肽或核酸序列。在這層意義上，"文庫"與"庫，，意思是相同的。文庫成員間序列差異是造成庫多樣性的原因。文庫可以采用多肽或核酸的簡單混合物的形式，也可以是用核酸庫進(jìn)行轉(zhuǎn)化的有機(jī)體或細(xì)胞的形式，例如細(xì)菌、病毒、動(dòng)物或植物細(xì)胞等。優(yōu)選地，每種個(gè)體有機(jī)體或細(xì)胞包含僅一種或有限數(shù)量的文庫成員。有利的是所述核酸包含在表達(dá)載體中，以允許該核酸編碼的多肽的表達(dá)。因此優(yōu)選地文庫可采用宿主有機(jī)體種群的形式，每種有機(jī)體包含表達(dá)載體的一個(gè)或多個(gè)拷貝，該表達(dá)載體含有核酸形式的文庫單個(gè)成員，所述核酸能表達(dá)生成其相應(yīng)的多肽成員。因此宿主有機(jī)體的種群有可能編碼基因多樣性多肽變體的大庫。"抗體"(例如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE)或片段(如Fab、F(ab，)2、Fv、二硫鍵連接的Fv、scFv、閉合式構(gòu)象多特異性抗體、二硫鍵連接的scFv、雙價(jià)抗體)不管從任何物種自然產(chǎn)生，由重組DNA技術(shù)創(chuàng)造而來，還是從血清、B細(xì)胞、雜交瘤、轉(zhuǎn)染瘤、酵母或細(xì)菌分離得到都是可以的。"雙特異性配體"是包括本文定義的第一免疫球蛋白單可變域和第二免疫球蛋白單可變域的配體，其中可變區(qū)能與通常不被單特異合。例如，所述兩種表位可以在相同的半抗原上，但不是相同的表位，或沒有接近到能被單特異性配體結(jié)合。根據(jù)本發(fā)明的雙特異性配體是由具有不同特異性的可變域組成的，并且不包含相互補(bǔ)的具有相同特異性的可變域?qū)Αｋp特異性配體和制備雙特異性配體的合適方法在WO2004/058821、WO2004/003019和WO03/002609中公開，這些已出版的國際申請的全部教導(dǎo)都在此引作參考。"抗原"是與根據(jù)本發(fā)明的配體結(jié)合的分子。典型地，抗原與抗體配體結(jié)合，能提高抗體的體內(nèi)應(yīng)答?？乖梢允嵌嚯?、蛋白、核酸或其他分子。一般來說，對根據(jù)本發(fā)明的雙特異性配體進(jìn)行選擇以得到特異性針對特定抗原的靶標(biāo)。至于常規(guī)抗體和其片段，由可變的環(huán)(Ll、L2、L3和H1、H2、H3)定義的抗體結(jié)合位點(diǎn)能與抗原結(jié)合。"表位"是與免疫球蛋白VH/VL對常規(guī)結(jié)合的結(jié)構(gòu)單元。表位指抗體的最小結(jié)合位置，因此表現(xiàn)為抗體的特異性耙標(biāo)。至于單域抗體，表位指與分離的可變域結(jié)合的結(jié)構(gòu)單元。"通用框架"是單抗體框架序列，與Kabat定義的抗體保守序列區(qū)("SequencesofProteinsofImmunologicalInterest",美國衛(wèi)生和福利部)相對應(yīng)，或與ChothiaandLesk，(1987)J.Mol.Biol.196:910-917.定義的人種系免疫球蛋白庫或結(jié)構(gòu)相對應(yīng)。本發(fā)明提供了單個(gè)框架或一套這種框架的用途，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)雖然變化僅發(fā)生在高可變區(qū)，但所述框架允許衍生出幾乎所有結(jié)合特異性。"半衰期，，指體內(nèi)配體的血清濃度降低50%所需的時(shí)間，例如由于自然機(jī)制的配體降解和/或配體清除或多價(jià)螯合。本發(fā)明的配體通過與抗降解和/或清除或多價(jià)螯合的分子結(jié)合，在體內(nèi)穩(wěn)定，半衰期延長。典型地，此種分子是自然生成的蛋白，其本身在體內(nèi)半衰期長。與對半衰期增加的分子無特異性的類似配體相比，如果一種配體的功能活性持續(xù)更長的一段時(shí)間，則其半衰期增加。因此，把對HSA和靶標(biāo)分子有特異性的配體，和對HSA無特異性，不與HSA結(jié)合而與另一分子結(jié)合的相同配體，進(jìn)行比較。例如配體可以與靶標(biāo)分子上的第二個(gè)表位結(jié)合。典型地，半衰期增加10%、20%、30%、40%、50%或更多。增加范圍為2x、3x、4x、5x、10x、20x、30x、40x、50x或更多倍的半衰期是可能的?；蛘呋虼送?，增加范圍為高達(dá)30x、40x、50x、60x、70x、80x、90x、100x、150x或更多倍的半衰期是可能的。本文提及的術(shù)語"竟?fàn)?是指當(dāng)?shù)诙砦慌c其同源表位結(jié)合域結(jié)合時(shí)，第一表位與其同源表位結(jié)合域的結(jié)合受到抑制。例如結(jié)合可受到立體抑制，比如通過結(jié)合域的物理阻斷，或通過改變結(jié)合域的結(jié)構(gòu)或環(huán)境，這樣結(jié)合域?qū)Ρ砦坏挠H和力降低。氨基酸和核苷酸序列的比對、同源性、相似性或一致性，如本文所定義優(yōu)選采用BLAST2序列算法和預(yù)設(shè)參數(shù)(Tatusova,T.A."a/.，F(xiàn)5MSMcraWo/L幼，〃《187-188(1999))來處理及確認(rèn)?；蛘卟捎肂LAST算法(版本2.0)進(jìn)行序列比對，參數(shù)設(shè)為預(yù)設(shè)值。BLAST(BasicLocalAlignmentSearchTool,基本的局部比對搜索工具)是程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx采用的漸進(jìn)搜索算法；這些程序的有效性歸因于4吏用KarlinandAltschul，1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA87(6):2264-8的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法得到的結(jié)果。本發(fā)明涉及與IL-1R1結(jié)合，并抑制IL-1(如IL-la和/或IL-1P)和IL-lra與IL-IR1結(jié)合的dAb單體，以及包含此種dAb單體的配體。這種配體和dAb單體可用作治療劑，治療炎癥、疾病或其他全部或部分由IL-1與IL-1R1結(jié)合誘導(dǎo)的生物學(xué)功能所介導(dǎo)的疾病(如局部或全身性炎癥，炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生(如IL-6、11-8、TNF),發(fā)燒，免疫細(xì)胞的激活(如淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞)，厭食癥，低血壓，白細(xì)胞減少，血小板減少)。本發(fā)明的配體或dAb單體可與IL-1R1結(jié)合,并抑制IL-1R1功能，從而產(chǎn)生治療效果。此外，為診斷或其他目的，本發(fā)明的配體或dAb單體可用于檢測或定量如在生物樣本中的IL-iRl。與IL-1R1結(jié)合的配體和dAb單體本發(fā)明提供包含與IL-1R1結(jié)合的dAb的配體(例如包括這種dAb，dAb單體的雙特異性配體)，dAb與IL-1R1結(jié)合的的Kd為300nM至5pM(即3xl(T7至5xl(Ti2M),優(yōu)選50nM至20pM,更優(yōu)選5nM至200pM，最優(yōu)選1nM至100pM,例如1xl(T7M或更少，優(yōu)選1x10_8\1或更少，更優(yōu)選1x10一M或更少，有利的是lx1(T"M或更少，最優(yōu)選lx10"1M或更少；和/或K。ff速率常數(shù)為5x10-1s-'至1xl(rV'，優(yōu)選1xl(T2s-1至1x10-6s",更優(yōu)選5xl(T3s-1至1x10—5s-1，例如5x10"s"或更少，優(yōu)選1xl(T2s"或更少，有利的是1x10-3s"或更少，更優(yōu)選1xl(T4s"或更少，還更優(yōu)選1x10-5s"或更少，最優(yōu)選1x10"s"或更少，以上由表面等離子體共振測定。優(yōu)選地，配體或dAb單體抑制IL-1(即IL-la和/或IL-1(3)與IL-1R1結(jié)合，例如在受體結(jié)合檢測中，半數(shù)抑制濃度(IC50)等于或小于約1^M,例如IC50為約500nM至約50pM,優(yōu)選約100nM至約50pM,更優(yōu)選約10nM至約100pM,有利的是約1nM至約100pM;例如約50nM或更少，優(yōu)選約5nM或更少，更優(yōu)選約500pM或更少，有利的是約200pM或更少，最優(yōu)選100pM或更少。優(yōu)選地，配體或dAb與人IL-1R1結(jié)合,抑制人IL國1(即IL-la和/或IL-l卩)與人IL-1R1結(jié)合，并抑制與IL-1結(jié)合后通過人IL-1R1的信號(hào)傳導(dǎo)應(yīng)答。優(yōu)選地，配體或dAb單體在標(biāo)準(zhǔn)檢測中(如IL-1誘導(dǎo)的MRC-5細(xì)胞釋放白細(xì)胞介素-8,IL-1誘導(dǎo)的全血細(xì)胞釋放白細(xì)胞介素-6)中和(抑制其活性)IL-l或IL-lRl,半數(shù)中和量(ND50)少于或等于約1|LiM,例如ND50約500nM至約50pM，優(yōu)選約100nM至約50pM,更優(yōu)選約10nM至約100pM,有利的是約1nM至約100pM;例如約50nM或更少，優(yōu)選約5nM或更少，更優(yōu)選約500pM或更少，有利的是約200pM或更少，最優(yōu)選約100pM或更少。例如，在體內(nèi)檢測中配體或dAb單體可抑制IL-1誘導(dǎo)的(如IL-loc或IL-1卩誘導(dǎo)的)MRC-5細(xì)胞(ATCC檢索號(hào)No.CCL-171)釋放白細(xì)胞介素-8,ND50^10iaM、Sl(iM、^100nM、SlOnM、S1nM、S500pM、S300pM、S100pM或三10pM。在另一實(shí)施例中，在體外全血檢測中配體或dAb單體可抑制IL-1誘導(dǎo)的(如IL-la或IL-1卩誘導(dǎo)的)白細(xì)胞介素-6的釋放，ND50S10pM、^1)iM、^100nM、^10nM、^1nM、^500pM、^300pM、S100pM或^10pM。如本文所述，配體可以是單價(jià)的(例如dAb單體)或多價(jià)的(例如雙特異性的、多特異性的)。在具體實(shí)施方案中，配體是與人IL-1R1結(jié)合dAb單體，并包含如聚烷撐二醇部分的半衰期延長部分(如本文所述)。在其他實(shí)施方案中，配體是多價(jià)的并包含兩種或多種與IL-1R1結(jié)合的dAb單體。多價(jià)的配體可以包含兩個(gè)或多個(gè)與IL-1R1結(jié)合的特定dAb拷貝，或包含兩種或多種與IL-1R1結(jié)合的dAb。例如，如本文所述，配體可以是包括兩個(gè)或多個(gè)與IL-1R1結(jié)合的特定dAb拷貝的二聚體、三聚體或多聚體，或可以包括兩種或多種與IL-IR1結(jié)合的不同dAb。在一些實(shí)施例中，配體分別是包括兩種或三種與IL-1R1結(jié)合的特定dAb拷貝的同型二聚體或同型三聚體。優(yōu)選地，在標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞檢測中多價(jià)配體基本上不激動(dòng)IL-1R1(用作IL-1R1激動(dòng)劑)(即配體濃度為1nM、10nM、100nM、1pM、10pM、100luM、1000pM或5,000(iM時(shí)，在檢測中產(chǎn)生不超過約5%的由IL-1(100pg/ml)誘導(dǎo)，IL-1R1介導(dǎo)的活性)。在某些實(shí)施方案中，多價(jià)配體包含兩種或多種與IL-1R1所需表位或域結(jié)合的dAb。例如多價(jià)配體可包括兩個(gè)或多個(gè)和IL-lm竟?fàn)幣cIL-1R1結(jié)合的dAb拷貝。在另一實(shí)施例中，多價(jià)配體可包括兩個(gè)或多個(gè)不和IL-lra竟?fàn)幣cIL-1R1結(jié)合的dAb拷貝。在其他實(shí)施方案中，多價(jià)配體包含兩種或多種與IL-1R1的不同表位或域結(jié)合的dAb。在一個(gè)實(shí)施例中，多價(jià)配體包括與IL-1R1第一表位結(jié)合的第一dAb,和與IL-1R1第二不同表位結(jié)合的第二dAb。這種類型的配體可以以高親和力與IL-1R1結(jié)合，并且與其他配體形式如dAb單體相比，對與在其表面高濃度過度表達(dá)IL-1R1或表達(dá)IL-1R1的細(xì)胞結(jié)合的選擇性更高。在某些實(shí)施方案中，當(dāng)施用有效量時(shí)，本發(fā)明的配體或dAb單體在模型疾病(如炎癥疾病)中是有效的。一般炎癥疾病模型中的有效量為約1mg/kg至約10mg/kg(如約1mg/kg、約2mg/kg、約3mg/kg、約4mg/kg、約5mg/kg、約6mg/kg、約7mg/kg、約8mg/kg、約9mg/kg或約10mg/kg)。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)為本文所述的慢性炎癥疾病模型是用于預(yù)測對人的療效的。如本文所述，現(xiàn)有技術(shù)沒有暗示在這些模型中使用配體或dAb單體，或它們會(huì)是有效的。幾種合適的呼吸疾病動(dòng)物纟莫型為本領(lǐng)域所知，并一皮本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)為是用于預(yù)測對人的療效的。例如合適的呼吸疾病動(dòng)物模型包括慢性阻塞性肺疾病模型(參見Groneberg,DA"a/.，RespiratoryResearch5:18(2004)),以及哮喘模型(參見Coffman"/，J!ikfe/.20/(12):1875-1879(2001))。例如配體或dAb單體在香煙煙霧誘導(dǎo)的慢性阻塞性肺部疾病(COPD)小鼠模型中是有效的(參見如WrightJLandChurgA.，Cte722:301S-306S(2002))。例如與合適的對照相比，使用有效量的配體或dAb單體可減少或延緩COPD癥狀的出現(xiàn)。在具體實(shí)施方案中，在標(biāo)準(zhǔn)關(guān)節(jié)炎模型(如炎性關(guān)節(jié)炎或骨關(guān)節(jié)炎)中，配體或dAb單體是有效的。幾種有效的;f莫型是本領(lǐng)域所知的，例如小鼠膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型(參見如Juarranz,aa/.，^W/zr/他i^earc/zT7zerapy,7:R1034-R1045(2005)),大鼠佐劑誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(參見如Halloran,M.&"/.,J/ww朋o/.,65:7492(1999),Hallomn,M.a/.,JrAn'fe;/2ew"2.,39:810(1996)),兔實(shí)驗(yàn)性骨關(guān)節(jié)炎(參見如Spriet，da/.(9故oaW/w他a"<iCaW//age,13:171-179(2005),以及幾種小鼠骨關(guān)節(jié)炎模型(參見如Helminen,aa/.，臉畫to/ogy,化848-856(2002))。例如可通過把Arthrogen-CIA佐劑和Arthrogen-CIA膠原(MD-biosciences公司)的乳劑注射動(dòng)物，從而在DBA/1小鼠中誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎。注射約21天后，可施用(如通過腹腔注射)待檢測的配體或dAb單體。臨床關(guān)節(jié)炎的分值等級(jí)從0到4,可用于測量動(dòng)物四肢的每個(gè)肢體，正常肢體的值設(shè)為零，涉及多關(guān)節(jié)的發(fā)炎最嚴(yán)重的肢體設(shè)為4。施用有效量的配體或dAb單體可降低小鼠膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型中四肢關(guān)節(jié)炎分值總和的平均值，例如與合適的對照相比，四肢關(guān)節(jié)炎分值總和的平均值可降低約1至約16,約3至約16，約6至約16,約9至約16,或約12至約16，或與合適的對照組相比，可延遲關(guān)節(jié)炎癥狀的產(chǎn)生，例如約1天，約2天，約3天，約4天，約5天，約6天，約7天，約10天，約14天，約21天或約28天。在另一實(shí)施例中，使用治療有效量的配體可使標(biāo)準(zhǔn)的小鼠膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型中四肢關(guān)節(jié)炎分值總和的平均值為0至約3，約3至約5,約5至約7，約7至約15，約9至約15,約10至約15,約12至約15，或約14至約15。在其他實(shí)施方案中，配體或dAb單體在小鼠ARE關(guān)節(jié)炎模型中是有效的(Kontoyiannis1563-74(2002))。例如與合適的對照相比，施用有效量的配體可降低小鼠ARE關(guān)節(jié)炎才莫型中關(guān)節(jié)炎分值的平均值，例如降低約0.1至約2.5，約0.5至約2.5,約1至約2.5,約1.5至約2.5,或約2至約2.5。在另一實(shí)施例中，與合適的對照相比，施用治療有效量的配體可延遲小鼠ARE關(guān)節(jié)炎模型中癥狀的出現(xiàn)，例如約1天，約2天，約3天，約4天，約5天，約6天，約7天，約10天，約14天，約21天或約28天。在另一實(shí)施例中，施用治療有效量的配體可使小鼠ARE關(guān)節(jié)炎模型中關(guān)節(jié)炎分值的平均值為0至約0.5,約0.5至約1,約1至約1.5，約1.5至約2，或約2至約2.5。在其他實(shí)施方案中，配體或dAb單體在小鼠ARE炎癥性腸病(IBD)模型中是有效的(Kontoyiannis"a/"/五x;MW796:1563-74(2002))。例如與合適的對照相比，施用治療有效量的配體可降低在小鼠AREIBD模型中急性和/或慢性炎癥分值的平均值，例如降低約0.1至約2.5，約0.5至約2.5,約1至約2.5，約1.5至約2.5,或約2至約2.5。在另一實(shí)施例中，與合適的對照相比，施用治療有效量的配體可延遲小鼠AREIBD模型中IBD癥狀的出現(xiàn)，例如延遲約1天，約2天，約3天，約4天，約5天，約6天，約7天，約10天，約14天，約21天或約28天。在另一實(shí)施例中，施用治療有效量的配體可使小鼠AREIBD模型中急性和/或慢性炎癥分值的平均值為1至約0.5,0.5至約1,約1至約1.5,約1.5至約2，或約2至約2.5。在其他實(shí)施方案中，配體或dAb單體在葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的小鼠IBD模型中是有效的(參見OkayasuI.efa/.,Go^rae"fera/ogy9&694-702(1990);PodolskyK.，■/G^ferae"tero/.to;;/ZT:63-66(2003))。例如與合適的對照相比，施用治療有效量的配體可降低小鼠DSSIBD模型中嚴(yán)重程度分值的平均值，例如降低約0.1至約2.5,約0.5至約2.5,約1至約2.5,約1.5至約2.5,或約2至約2.5。在另一實(shí)施例中，與合適的對照相比，施用治療有效量的配體可延遲小鼠DSSIBD模型中IBD癥狀的出現(xiàn)，例如延遲約1天，約2天，約3天，約4天，約5天，約6天，約7天，約10天，約14天，約"天或約28天。在另一實(shí)施例中，施用治療有效量的配體可使小鼠DSSIBD模型中嚴(yán)重程度分值的平均值為0至約0.5,約0.5至約1,約1至約1.5,約1.5至約2，或約2至約2.5。在一些實(shí)施方案中，配體包4舌一種dAb,其對IL-1R1具有結(jié)合特異性，抑制IL-1(如IL-la和/或IL-ip)和IL-lra與IL-1R1結(jié)合，并與選自下述的dAb竟?fàn)幣cIL-1Rla的結(jié)合DOM4-130-30(SEQIDNO:3)、DOM4-130畫46(SEQIDN0:4)、DOM4-130-51(SEQIDNO:5)、DOM4陽l30-53(SEQIDNO:6)、DOM4-130-54(SEQIDNO:7)、DOM4-130(SEQIC>NO:215)、DOM4-130-1(SEQIDNO:216)、DOM4-130-2(SEQIDNO:217)、DOM4-130-3(SEQIDNO:218)、DOM4-130-4(SEQIDNO:219)、DOM4響130-5(SEQIDNO:220)、DOM4-130-6(SEQIDNO:221)、DOM4陽130-7(SEQIDNO:222〕、DOM4-130-8(SEQIDNO:223)、DOM4陽130-9(SEQIDNO:224)、DOM4-130-10(SEQIDNO:225)、DOM4-130-11(SEQIDNO:226〕、DOM4-130-12(SEQIDNO:227)、DOM4-130-13(SEQIDNO:228)、DOM4-130-14(SEQIDNO:229)、DOM4-130-15(SEQIDNO:230)、DOM4-130-16(SEQIDNO:231)、DOM4-130-17(SEQIDNO:232)、DOM4-130-18(SEQIDNO:233)、DOM4-130-19(SEQIDNO:234)、DOM4-130-20(SEQIDNO:235)、DOM4-130-21(SEQIDNO:236〕、DOM4-130-22(SEQIDNO:237)、DOM4-130-23(SEQIDNO:238〕、DOM4-130-24(SEQIDNO:239)、DOM4-130-25(SEQIDNO:240〕、DOM4-130-26(SEQIDNO:241)、DOM4-130-27(SEQIDNO:242〕、DOM4-130-28(SEQIDNO:243)、DOM4-130-31(SEQIDNO:244〕、DOM4-130-32,IDNO:245)、DOM4-130-33(SEQIDNO:246〕、DOM4-130-34(SEQIDNO:247)、DOM4-130-35(SEQIDaib3S)16-on寸woa、(0)￡:ONai加s)、(I0￡:ONai加s)、(66Z:ONai加s)、(A6乙:OMaib3S)、(S6Z:ONaiD3S)18-on寸]Aioaai6Zron-,oaai加s)a-on一wwoa、(68乙:ONai加s)aiaiD3S)ai加s)69-on-wwoa、(IW:OMai加s)、(6/X:OMaibas)ai加s)aiai6s-on寸woaai、(69Z:ONai、(膨ONLai加s)、(S9乙:OMaib3S)is一on-w^oacn加s)cn、(6SZ:ONLGI加s)ai加s)、("乙:ONLGI、(￡K:ONLai6￡-on-w^oaaiGI。3S)、(贏:ONGI、(00￡:ONGI加s)GI、(96乙:ONGIbsts)、06Z:OMGIt)3S)os-on-兩oa、(Z6Z:ONGIb3S)GI。3S)、(膨ONGI。3S)、(9SZ:ONGI、OSZ:ONaiaib3S)、(08乙:ONai。3S)、(8":ONaib3S)、(9/Z:ONai。3S)、CONaiD3S)、(乙":ONaiD3S)、(0":ONai9S-0n—WAKXIai、(99Z:ONaib3S)、(跳:OM。3S)、(，:ONai加S)、(09Z:ONcnD3S)、(8SZ:ONaib3S)t^匪ou預(yù)oa、(9S乙:ONaiai、(乙S乙:ONaiTONai。3S)NO:304)、DOM4-130-92(SEQIDNO:305)、DOM4-130-93(SEQIDNO:306)、DOM4-130-94(SEQIDNO:307)、DOM4-130-95(SEQIDNO:308)、DOM4-130-96(SEQIDNO:309)、DOM4-130-97(SEQIDNO:310)、DOM4-130-98(SEQIDN0:311)、DOM4-130-99(SEQIDNO:32)、DOM4-130-100(SEQIDNO:313)、DOM4-130-101(SEQIDNO:314)、DOM4-130-102(SEQIDNO:315)、DOM4-130-103(SEQIDNO:316)、DOM4-130-104(SEQIDNO:317)、DOM4-130-105(SEQIDNO:318)、DOM4-130-106(SEQIDNO:319)、DOM4-130-107(SEQIDNO:320)、D0M4-130-108(SEQIDNO:321)、DOM4-130-109(SEQIDNO:322)、DOM4-130-110(SEQIDNO:323)、DOM4-130-111(SEQIDNO:324)、DOM4-130-112(SEQIDNO:325)、DOM4-130-113(SEQIDNO:326)、DOM4-130-114(SEQIDNO:327)、DOM4-130-115(SEQIDNO:328)、D0M4-130-U6(SEQIDNO:329)、DOM4-130-117(SEQIDNO:330)、DOM4-130-118(SEQIDNO:331)、DOM4-130-119(SEQIDNO:332)、DOM4-130-120(SEQIDNO:333)、DOM4-130-121(SEQIDNO:334)、DOM4-130-122(SEQIDNO:335)、D0M4-130-123(SEQIDNO:336)、DOM4-130-124(SEQIDNO:337)、DOM4-130-125(SEQIDNO:338)、DOM4-130-126(SEQIDNO:339)、DOM4-130-127(SEQIDNO:340)、DOM4-130-128(SEQIDNO:341)、D0M4-130-129(SEQIDNO:342)、DOM4-130-130(SEQIDNO:343)、DOM4-130-131(SEQIDNO:344)、DOM4-130-132(SEQIDNO:345)、和DOM4-130-133(SEQIDNO:346)。在一些實(shí)施方案中，配體包括一種dAb，其能與IL-IR特異性結(jié)合，抑制IL-1(即EL-la和/或IL-lf3)和IL-Ira與IL-1R1結(jié)合，并包含氨基酸序列，該氨基酸序列與選自下述的dAb的氨基酸序列具有至少約80%,至少約85%,至少約90%,至少約91%,至少約92%,至少約93%,至少約94%,至少約95%,至少約96%，至少09aiDws)Isn-5I0a,(SSNai6寸-0u-!oa,(I9SNai富)A寸-0二-55CI,(6§Naia3s)s寸-on-寸woa,(S:ON。1富)5s-寸SOCI,(SSSNai旨)I寸-on-寸woa,(￡SSNaia3s)6s二-寸ia,(S:ON。1富)卜sel-寸soa,(ioNQI富)Ssn-寸MXI,(Z-寸SMaib3s)Isn-達(dá)oa,(e寸SNai旨)gsn-達(dá)oa,(6esNaiaas)6l-0n-ioa,(e￡SNaib3s)卜I-on-ioa,(S:ONai富)ssn-soa,(6ZSNalbs)II-oeI-soa,(SSN。1富)S￡5IAKXI,(ISSNaia3s)sn-達(dá)oaQ富)osn-寸PMOa,(闊6N。1a3s)9寸-0er寸woa,(S-ONQ富)ia-soa,(S:ONcn富)3sn-IOCI,(寸寸SN。1富)zsn-達(dá)oa,(9￡SN。1旨)Osn-Ioa,(寸？ONcnas)SI-on-寸WOG,(§ON9富)9I-0n-達(dá)s,(ioNCIIb3s)寸I-on-SOG,(SNSNCIIa3s)zl-on-寸WOG,(9ZSNaiOI-on-寸MXI-(寸ZSNaia3s)2s-寸woa-(SISN(卜ISNaisn-寸woa,(9I§N。153S)I-on-寸woa,(SIr6NaiD3S)on-寸Fsa,(/;ONgia3s)-on-寸jmoci,(寸ONQaws)9寸-on-寸PN5CI,(￡6Nait>3s)oe,oel-寸pvoa^、Tlls.l^s,f一容。/066寂、T喊《％S6^<formula>formulaseeoriginaldocumentpage61</formula>130-107(SEQIDNO:320)、DOM4-130-108(SEQIDNO:321)、DOM4-130-109(SEQIDNO:322)、DOM4-130-110(SEQIDNO:323)、DOM4-130-111(SEQIDNO:324)、DOM4-130-112(SEQIDNO:325)、DOM4-130-113(SEQIDNO:326)、DOM4-130-114(SEQIDNO:327)、DOM4-130-115(SEQIDNO:32S)、DOM4-130-116(SEQIDNO:329)、DOM4-130-U7(SEQIDNO:330)、DOM4-130-118(SEQIDNO:331)、DOM4-130-119(SEQIDNO:332)、DOM4-130-120(SEQIDNO:333)、DOM4-130-121(SEQIDNO:334)、DOM4-130-122(SEQIDNO:335)、DOM4-130-123(SEQIDNO:336)、DOM4-130-124(SEQIDNO:337)、DOM4-130-125(SEQIDNO:338)、DOM4-130-126(SEQIDNO:339)、DOM4-130-127(SEQIDNO:340)、DOM4-130-128(SEQIDNO:341)、DOM4-130-129(SEQIDNO:342)、DOM4-130-130(SEQIDNO:343)、DOM4-130-131(SEQIDNO:344)、DOM4-130-132(SEQIDNO:345)、和DOM4-130-133(SEQIDNO:346)。在一些實(shí)施方案中，配體包4會(huì)一種dAb,其與IL-1R1結(jié)合，并與本文所述的任何dAb竟?fàn)幣cIL-1R1(如人IL-1R1)的結(jié)合。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，配體包括選自下述的dAb單體DOM4-130-30、DOM4-130-46、DOM4-130-51、DOM4-130-53和DOM4-130-54。例如配體可以是任何這些dAb的單體，或異型或同型二聚體，三聚體或寡聚物。如果需要，配體可進(jìn)一步包括半衰期延長的部分，如聚乙二醇部分。在一些實(shí)施例中，配體包括選自下述的dAb單體DOM4-130-30、DOM4-130-46、DOM4-130-51、DOM4-130-53和DOM4-130-54,以及與血清白蛋白結(jié)合的dAb單體。例如，配體可以是包括DOM4-130-54和DOM7h-8的雙特異性配體。dAb單體可以包括任何合適的免疫球蛋白可變域，優(yōu)選包括人可變域或包括人框架區(qū)的可變域。在某些實(shí)施方案中，dAb單體包括如本文所述的通用框架。所述通用框架可以是VL框架(V人或Vk)，例如包括由人種系DPK1、DPK2、DPK3、DPK4、DPK5、DPK6、DPK7、DPK8、DPK9、DPKIO、DPK12、DPK13、DPK15、DPK16、DPK18、DPK19、DPK20、DPK21、DPK22、DPK23、DPK24、DPK25、DPK26或DPK28免疫球蛋白基因片段編碼的框架氨基酸序列的框架。如果需要，所述VL框架可進(jìn)一步包括由人種系Jk1、Jk2、Jk3、Jk4或Jic5免疫球蛋白基因片段編碼的框架氨基酸序列。在其他實(shí)施方案中，所述通用框架可以是VL框架(VX或Vk),例如包括由人種系DP4、DP7、DP8、DP9、DPIO、肥l、DP33、DP38、DP45、DP46、DP47、DP49、DP50、DP51、DP53、DP54、DP65、DP66、DP67、DP68或DP69免疫球蛋白基因片段編碼的框架氨基酸序列的框架。如果需要，所述Vi框架可進(jìn)一步包括由人種系JH1、JH2、JH3、JH4、JH4b、JH5和JH6免疫球蛋白基因片段編碼的框架氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，所述dAb單體包括一種或多種框架區(qū)，其包含與由人種系抗體基因片段編碼的相應(yīng)框架區(qū)氨基酸序列相同的氨基酸序列，或相對于由人種系抗體基因片段編碼的所述相應(yīng)框架區(qū)氨基酸序列，一種或多種所述框架區(qū)的氨基酸序列總共包含最高達(dá)5個(gè)氨基酸的差異。在其他實(shí)施方案中，所述dAb單體的FW1、FW2、FW3和FW4的氨基酸序列與人種系抗體基因片段編碼的相應(yīng)框架區(qū)氨基酸序列相同，'或相對于由所述人種系抗體基因片段編碼的相應(yīng)框架區(qū)氨基S吏序列，F(xiàn)W1、FW2、FW3和FW4的氨基酸序列總共包含最高達(dá)IO個(gè)氨基酸的差異。在其他實(shí)施方案中，所述dAb單體包括FW1、FW2和FW3區(qū)，所述FW1、FW2和FW3區(qū)的氨基酸序列與人種系抗體基因片段編碼的相應(yīng)框架區(qū)氨基酸序列相同。在具體實(shí)施方案中，所述dAb單體配體包括DPK9Vl框架，或逸自DP47、DP45和DP38的Vh框架。所述dAb單體可包括如蛋白A、蛋白L和蛋白G的通用性配體的結(jié)合位點(diǎn)。在某些實(shí)施方案中，所述配體或dAb單體實(shí)質(zhì)上是抗聚集的。例如在一些實(shí)施方案中，當(dāng)在常夫見用于藥物制劑的溶劑如鹽水、緩沖液、檸檬酸緩沖液、水、乳液，以及任何這些溶劑與如FDA批準(zhǔn)的賦形劑中的1-5mg/ml、5-10mg/ml、10-20mg/ml、20-50mg/ml、50-100mg/ml、100-200mg/ml或200-500mg/ml的配體或dAb溶液，在約22。C，22-25。C,25-30。C，30-37。C，37-40。C,40-50。C,50-60oC,60-70oC，70-80°C，15-20oC,10-15oC,5-10°C,2-5。C,0-2。C,-10。(至0°(:，-20。C至-10。C，-40。C至-20。C,-60。C至-40。C,或-80°(3至-60°(:下，維持約一段時(shí)間如IO分鐘、l小時(shí)、8小時(shí)、24小時(shí)、2天、3天、4天、l周、2周、3周、1個(gè)月、2個(gè)月、3個(gè)月、4個(gè)月、6個(gè)月、l年或2年時(shí)，少于約10%，少于約9%,少于約8%,少于約7%，少于約6%，少于約5%，少于約4%，少于約3%,少于約2。/?；蛏儆诩s1%的所述配體或dAb單體聚集?？梢允褂萌魏魏线m的方法評(píng)定聚集，如通過顯微鏡檢查，肉眼觀察或光譜法或任何其他合適的方法評(píng)估濁度。優(yōu)選地，通過動(dòng)態(tài)光散射評(píng)定聚集?？咕奂呐潴w或dAb單體有幾處優(yōu)點(diǎn)。例如，作為通過使用合適的如大腸桿菌的生物制備體系表達(dá)的可溶性蛋白，這種配體或dAb單體可以容易地大量制得，與常規(guī)的多肽相比還可以在更高濃度下制成制劑和/或存儲(chǔ)，聚集現(xiàn)象和活性損失都更少。此外，抗聚集的配體或dAb單體比其他的抗原或表位結(jié)合的多肽(如常規(guī)抗體)制備更經(jīng)濟(jì)。例如，一^:來說打算用于體內(nèi)的抗原或表位結(jié)合多肽的制備包括去除聚集多肽的方法(如凝膠過濾法)。無法去除此種聚集體可導(dǎo)致出現(xiàn)不適合體內(nèi)應(yīng)用的制品，因?yàn)槔绱蛩阌米鬓卓箘┑目乖Y(jié)合多肽的聚集體可通過誘導(dǎo)耙抗原的交聯(lián)或聚集成簇而表現(xiàn)出激動(dòng)劑的作用。蛋白聚集體還可以通過誘導(dǎo)受試者對其被施用物質(zhì)的免疫應(yīng)答，降低治療多肽的療效。相比之下，可以制備本發(fā)明的抗聚集配體或dAb單體進(jìn)行體內(nèi)應(yīng)用，.無需包括去除聚集體的方法步驟，還可體外使用，而沒有多肽聚集體造成的上述不利之處。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)溫度加熱到Ts并冷卻到Tc時(shí)，所述配體或dAb單體可逆地解折疊，其中Ts高于dAb的熔點(diǎn)，Tc低于dAb的熔點(diǎn)。例如當(dāng)溫度加熱到80°C并冷卻到約室溫時(shí)，所述dAb單體可逆地解折疊?？赡娴亟庹郫B的多肽，解折疊時(shí)喪失功能，但重折疊后重獲功能。這種多肽與解折疊時(shí)聚集的多肽或非正確重折疊的多肽(錯(cuò)誤折疊的多肽)不同，即解折疊時(shí)聚集的多肽或非正確重折疊的多肽無法重獲功能?？蓪Χ嚯慕庹郫B或重折疊進(jìn)^"評(píng)定，例如采用任何合適的方法直接或間接地檢測多肽結(jié)構(gòu)。例如，檢測多肽結(jié)構(gòu)可通過圓二色性(CD)(即遠(yuǎn)紫外CD,近紫外CD),熒光(如色氨酸側(cè)鏈的熒光)，對蛋白水解的易感性，核磁共振(NMR),或通過檢測或測量依賴于正確折疊的多肽的功能(例如與靶配體結(jié)合，與通用性配體結(jié)合)。在一個(gè)實(shí)施例中，多肽解折疊是采用功能分析來評(píng)定的，在所述功能分析中結(jié)合功能的喪失(即結(jié)合通用型和/或靶配體，結(jié)合底物)表明多肽是解折疊的。配體或dAb單體解折疊和重折疊的程度可采用解折疊或熱變性曲線來確定。以溫度為縱坐標(biāo)，折疊多肽的相對濃度為橫坐標(biāo)作圖可得解折疊曲線。折疊配體或dAb單體的相對濃度可使用任何合適的方法(例如CD、焚光、結(jié)合分析)直接或間接地確定。例如可制備配體或dAb單體溶液，用CD確定溶液的橢圓度。得到的橢圓度值代表折疊配體或dAb單體的百分比相對濃度。溶液中的配體或dAb單體隨后通過逐漸升高溶液溫度而解折疊，在合適的增量處可確定橢圓度(例如每次升高一度后)。然后溶液中配體或dAb單體通過逐漸降低溶液溫度而重折疊，在合適的增量處確定橢圓度。用數(shù)據(jù)可繪制出解折疊曲線和重折疊曲線。解折疊和重折疊曲線是典型的S型，包括其中配體或dAb單體分子折疊的部分，其中配體或dAb單體分子不同程度解折疊的解折疊/重折疊轉(zhuǎn)變，以及其中配體或單體分子解折疊的部分。重折疊曲線在Y軸的截距是復(fù)性的重折疊配體或dAb單體的相對量。復(fù)性率至少約50%，或至少約60%,或至少約70%，或至少約75%，或至少約80%,或至少約85%,或至少約90%,或至少約95%，表明該配體或dAb單體可逆地解折疊。在優(yōu)選實(shí)施例中，所述配體或dAb單體解折疊的可逆性通過制備配體或dAb單體溶液并繪制熱解折疊和重折疊曲線來確定。所述配體或dAb單體溶液可在任何合適的溶劑中制備，如其pH適合配體或dAb溶解的水溶液緩沖液(如高于或低于等電點(diǎn)(pl)三個(gè)單位的pH值)。所述配體或dAb單體溶液要濃到足以檢測解折疊/折疊。例如，所述配體或dAb溶液可以是約0.1pM至約100)LiM，或優(yōu)選約1fiM至約10pM。如果所述配體或dAb單體的熔點(diǎn)(Tm)已知，則溶液可加熱至約低于Tm10度(Tm-10),通過橢圓度或熒光評(píng)定折疊(如200nm-250誰遠(yuǎn)紫夕卜CD掃描，CD波長固定在235讓或225nm;色氨酸的熒光發(fā)射光譜在300至450nm，激發(fā)波長298nm),以提供折疊的配體或dAb單體的相對百分比。溶液隨后以預(yù)定增量被加熱到至少高出TmlO度(Tm+10)(如增加約0.1至約l度)，在每個(gè)增量處測定橢圓度或熒光。然后所述配體或dAb單體按預(yù)定增量冷卻到至少Tm-10進(jìn)行重折疊，在每個(gè)增量處測定橢圓度或熒光。如果所述配體或dAb單體的熔點(diǎn)未知，溶液可通過從約25。C逐漸加熱至約100。C而解折疊，然后逐漸冷卻至至少約25。C而重折疊，在每次加熱或冷卻的增量處測定橢圓度或熒光。獲得的數(shù)據(jù)可繪制解折疊曲線和重折疊曲線，其中重^斤疊曲線在Y軸上的截距是復(fù)性的重折疊蛋白的相對量。在一些實(shí)施方案中，所述dAb單體不包括駝?lì)?0"^//力免疫球蛋白可變域，或一種或多種駝?lì)?Came"J)種系抗體基因片段編碼的免疫球蛋白可變域獨(dú)有的框架氨基酸。優(yōu)選地，當(dāng)在大腸桿菌(￡.CO//)或畢赤酵母菌種(如巴斯德畢赤酵母(尸.pw/on's))中表達(dá)時(shí)，所述配體或dAb單體分泌量至少約0.5mg/L。在其他優(yōu)選實(shí)施方案中，當(dāng)在大腸桿菌或畢赤酵母菌種(如巴斯德畢赤酵母)中表達(dá)時(shí)，所述dAb單體分泌量為至少約0.75mg/L，至少約1mg/L，至少約4mg/L,至少約5mg/L,至少約10mg/L,至少約15mg/L,至少約20mg/L，至少約25mg/L,至少約30mg/L,至少約35mg/L,至少約40mg/L,至少約45mg/L,或至少約50mg/L，或至少約100mg/L，或至少約200mg/L,或至少約300mg/L，或至少約400mg/L,或至少約500mg/L,或至少約600mg/L,或至少約700mg/L,或至少約800mg/L,至少約900mg/L,或至少約lg/L。在其他優(yōu)選實(shí)施方案中，當(dāng)在大腸桿菌或畢赤酵母菌種(如巴斯德畢赤酵母)中表達(dá)時(shí)，所述dAb單體的分泌量至少約1mg/L到至少約lg/L，至少約1mg/L到至少約750mg/L,至少約100mg/L到至少約1g/L,至少約200mg/L到至少約1g/L，至少約300mg/L到至少約1g/L,至少約400mg/L到至少約1g/L,至少約500mg/L到至少約lg/L,至少約600mg/L到至少約1g/L，至少約700mg/L到至少約1g/L,至少約800mg/L到至少約lg/L,或至少約900mg/L到至少約lg/L。雖然當(dāng)在大腸桿菌或畢赤酵母菌種(如巴斯德畢赤酵母)中表達(dá)時(shí)，本文所述的配體或dAb單體是可被分泌的，但它們還可使用任何合適的方法制備，如化學(xué)合成方法或不采用大腸桿菌或畢赤酵母菌種的生物制備方法。與血清白蛋白結(jié)合的dAb單體本發(fā)明的配體包括與血清白蛋白(SA)結(jié)合的dAb單體，IQ為lnM至500jiM(即xl(T9至5xl(T4),優(yōu)選100nM至10^M。優(yōu)選地，對于包括第一抗SA的dAb和抗另一靶標(biāo)的第二dAb的雙特異性配體，笫二dAb對其靶標(biāo)的親和力(例如用BiaCore的表面等離子共振測量的Kd和/或K。ff)是第一dAb對SA親和力的1至100000倍(優(yōu)選100至100000,更優(yōu)選1000至100000，或10000至IOOOOO倍)。例如，第一dAb與SA結(jié)合的親和力約為10^M，而第二dAb與其靶標(biāo)結(jié)合的親和力為100pM。優(yōu)選地，血清白蛋白是人血清白蛋白(HSA)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一dAb(或dAb單體)與SA(即HSA)結(jié)合的Kd約為50,優(yōu)選70,更優(yōu)選100、150或200nM。在某些實(shí)施方案中，與SA結(jié)合的所述dAb單體抗聚集，可逆解折疊和/或包括與IL-1R1結(jié)合的dAb單體的上述框架區(qū)。在特定實(shí)施方案中，與血清白蛋白結(jié)合的抗體的抗原結(jié)合片段是與血清白蛋白結(jié)合的dAb。在某些實(shí)施方案中，該dAb與人血清白蛋白結(jié)合，并與選自下述的dAb竟?fàn)幣c白蛋白結(jié)合DOM7m-16(SEQIDNO:723)、DOM7m-12(SEQIDNO:724)、DOM7m-26(SEQIDNO:725)、DOM7r-l(SEQIDNO:726)、DOM7r漏3(SEQIDNO:727)、DOM7r-4(SEQIDNO:728)、DOM7r-5(SEQIDNO:729)、DOM7r-7(SEQIDNO:730)、DOM7r-8(SEQIDNO:731)、DOM7h-2(SEQIDNO:732)、DOM7h-3(SEQIDNO:733)、DOM7h-4(SEQIDNO:734)、DOM7h-6(SEQIDNO:735)、DOM7h-l(SEQIDNO:736)、DOM7h-7(SEQIDNO:737)、DOM7h-8(SEQIDNO:746)、DOM7r-13(SEQIDNO:747)、DOM7r-14(SEQIDNO:748)、DOM7h-22(SEQIDNO:739)、DOM7h-23(SEQIDNO:740)、DOM7h-24(SEQIDNO:741)、DOM7h-25(SEQIDNO:742)、DOM7h-26(SEQIDNO:743)、DOM7h-21(SEQIDNO:744)、DOM7h-27(SEQIDNO:745)、DOM7r-15(SEQIDNO:749)、DOM7r-16卿IDNO:750)、DOM7M7(SEQIDNO:751)、DOM7r-18(SEQIDNO:752)、DOM7r-19(SEQIDNO:753)、DOM7r-20(SEQIDNO:754)、DOM7r-21(SEQIDNO:755)、DOM7r-22(SEQIDNO:756)、DOM7r-23(SEQIDNO:757)、DOM7r-24(SEQIDNO:758)、DOM7r-25(SEQIDNO:759)、DOM7r-26(SEQIDNO:760)、DOM7r-27(SEQIDNO:761)、DOM7r-28(SEQIDNO:762)、DOM7r-29(SEQIDNO:763)、DOM7r-30(SEQIDNO:764)、DOM7r-31(SEQIDNO:765)、DOM7r-32(SEQIDNO:766)和DOM7r隱33(SEQIDNO:767)。在某些實(shí)施方案中，dAb與人血清白蛋白結(jié)合，并包含氨基酸序列，該氨基酸序列與選自下述dAb的氨基酸序列具有至少約80%,或至少約85%,或至少約90%,或至少約95°/。，或至少約96%,或至少約97%,或至少約98%,或至少約99%的氨基酸序列一致性DOM7m-16(SEQIDNO:723)、DOM7m-12(SEQIDNO:724)、DOM7m-26(SEQIDNO:725)、DOM7r-l(SEQIDNO:726)、DOM7r-3(SEQIDNO:727)、DOM7r-4(SEQIDNO:728)、DOM7r畫5(SEQIDNO:729)、DOM7r-7(SEQIDNO:730)、DOM7r-8(SEQIDNO:731)、DOM7h-2(SEQIDNO:732)、DOM7h-3(SEQIDNO:733)、DOM7h-4(SEQIDNO:734)、DOM7h-6(SEQIDNO:735)、DOM7h-l(SEQIDNO:736)、DOM7h-7(SEQIDNO:737)、DOM7h-8(SEQIDNO:746)、DOM7r-13(SEQIDNO:747)、DOM7r-14(SEQIDNO:748)、DOM7h-22(SEQIDNO:739)、DOM7h-23(SEQIDNO:740)、DOM7h-24(SEQIDNO:741)、DOM7h-25(SEQIDNO:742)、DOM7h-26(SEQIDNO:743)、DOM7h-21(SEQIDNO:744)、DOM7h-27,IDNO:745)、DOM7r-15(SEQIDNO:749)、DOM7r-16(SEQIDNO:750)、DOM7r-17(SEQIDNO:751)、DOM7r-18(SEQIDNO:752)、DOM7r-19(SEQIDNO:753)、DOM7r-20(SEQIDNO:754)、DOM7r-21(SEQIDNO:755)、DOM7r-22(SEQIDNO:756)、DOM7r-23(SEQIDNO:757)、DOM7r-24(SEQIDNO:758)、DOM7r-25(SEQID,DOM7r-26(SEQIDNO:760)、DOM7r-27(SEQID,DOM7r-28(SEQIDNO:762)、DOM7r-29(SEQIDNO:763)、DOM7r-30(SEQIDNO:764)、DOM7r-31(SEQIDNO:765)、DOM7r-32(SEQIDNO:766)和DOM7r-33(SEQIDDOM7h畫23(SEQIDDOM7h-25(SEQIDDOM7h-21(SEQID例如，與人血清白蛋白結(jié)合的所述dAb可包含氨基酸序列，該氨基酸序列與下述序列具有至少約90%，或至少約95%，或至少約96%，或至少約97%,或至少約98%，或至少約99%的氨基@1序列一致性DOM7h-2(SEQIDNO:732)、DOM7h-3(SEQIDNO:733)、DOM7h-4(SEQIDNO:734)、DOM7h-6(SEQIDNO:735)、DOM7h-l(SEQIDNO:736)、DOM7h陽7(SEQIDNO:737)、DOM7h-8(SEQIDNO:746)、DOM7r-13(SEQIDNO:747)、DOM7r-14(SEQIDNO:748)、DOM7h-22(SEQIDNO:739)NO:740)、DOM7h-24(SEQIDNO:741)-NO:742)、DOM7h-26(SEQIDNO:743)NO:744)和DOM7h-27(SEQIDNO:745)。氨基酸序列的一致性優(yōu)選釆用合適的序列比對算法和預(yù)設(shè)參數(shù)進(jìn)4亍測定，例如BLASTP(KarlinandAltschul,尸roc.A^//.Jcadt7&4S7(6):2264-2268(1990))。在進(jìn)一步具體實(shí)施方案中，所述dAb是與人血清白蛋白結(jié)合，并具有選自下述的氨基酸序列的VkdAb:DOM7h-2(SEQIDNO:732)、DOM7h-3(SEQIDNO:733)、DOM7h-4(SEQIDNO:734)、DOM7h-6(SEQIDNO:735)、DOM7h-l(SEQIDNO:736)、DOM7h-7(SEQIDNO:737)、DOM7h-8(SEQIDNO:746)、DOM7r-13(SEQIDNO:747)和DOM7r-14(SEQIDNO:748),或是具有選自下述氨基酸序列的VHdAb:DOM7h-22(SEQIDNO:739)、DOM7h-23(SEQIDNO:740)、DOM7h-24(SEQIDNO:741)、DOM7h-25(SEQIDNO:742)、DOM7h-26(SEQIDNO:743)、DOM7h-21(SEQIDNO:744)和DOM7h-27(SEQIDNO:745)。在其他實(shí)施方案中，與血清白蛋白結(jié)合的抗體的抗原結(jié)合片段是與人血清白蛋白結(jié)合，并包括任何前述氨基酸序列的CDRs的dAb。合適的與血清白蛋白結(jié)合的駝?lì)?Cflwe/W)VHH包括在WO2004/041862(AblynxN.V.)和本文(SEQIDNOS:768-784)公開的那些。在某些實(shí)施方案中，駝?lì)?Ozwe/W)Vhh與人血清白蛋白結(jié)合，并包含氨基酸序列，該氨基酸序列與下述序列具有至少約80%，或至少約85%,或至少約90%,或至少約95°/。，或至少約96%，或至少約97%,或至少約98%,或至少約99。/。的氨基S吏序列一致性SEQIDNO:768、SEQIDNO:769、SEQIDNO:770、SEQIDNO:771、SEQIDNO:772、SEQIDNO:773、SEQIDNO:774、SEQIDNO:775、SEQIDNO:776、SEQIDNO:777、SEQIDNO:77S、SEQIDNO:779、SEQIDNO:780、SEQIDNO:781、SEQIDNO:782、SEQIDNO:783或SEQIDNO:784。氨基酉l/f列的一致性優(yōu)選采用合適的序列比對算法和預(yù)設(shè)參數(shù)進(jìn)行測定，例如BLASTP(KariinandAltschul，Ato/.Jcad<97(6):2264-2268(1990))。在一些實(shí)施方案中，所述配體包括抗血清白蛋白的dAb,該dAb與本文公開的任何抗血清白蛋白dAb竟?fàn)幣c血清白蛋白(例如人血清白蛋白)的結(jié)合。與腫瘤壞死因子受體l(TNFRl)結(jié)合的dAb單體本發(fā)明的配體可以包括與TNFRl結(jié)合的dAb單體。TNFRl是跨膜受體，其含有與配體結(jié)合的胞外區(qū)，以及缺乏內(nèi)在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性但可與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子結(jié)合的胞內(nèi)區(qū)。TNFRl與相結(jié)合的TNF的復(fù)合體含有三條TNFRl鏈和三條TNF鏈(Bannera/.,CW/，73(3)431-445(1993).)。該TNF配體是與三種TNFR1鏈連接的三聚體。(Id.)在所述受體-配體復(fù)合體中所述三條INFR1鏈緊密簇生在一起，此聚集成簇是TNFR1介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)的前提條件。實(shí)際上，與TNFR1結(jié)合的多價(jià)物質(zhì)如抗TNFR1抗體，在沒有TNF時(shí)可誘導(dǎo)TNFRl聚集成簇和信號(hào)傳導(dǎo)，并作為TNFRl激動(dòng)劑廣泛使用(參見如Belka"a/.,￡MS<9,"(6):1156-1165(1995);Mandik-Nayakdo/.,/,ww麗o/,M7:1920-1928(2001).)。因此，與TNFRl結(jié)合的多價(jià)物質(zhì)一般不是TNFRl的有效拮抗劑，即便其阻斷TNFa和TNFRl的結(jié)合。TNFRl的胞外區(qū)包括一種十三個(gè)氨基酸的氨基末端片段(SEQIDNO:996(人)的1-13個(gè)氨基酸;SEQIDNO:997(小鼠)的氨基酸1-13)，域1(SEQIDNO:996(人)的氨基酸14-53;SEQIDNO:997(小鼠)的氨基酸14-53),域2(SEQIDNO:996(人)的氨基酸54_97;SEQIDNO:997(小鼠)的氨基酸54-97),域3(SEQIDNO線(人)的氨基酸98-138;SEQIDNO:997(小鼠)的氨基酸98-138),以及域4(SEQIDNO:996(人)的氨基酸139-167;SEQIDNO:997(小鼠)的氨基酸139-167),域4后面是近膜區(qū)(SEQIDNO:996(人)的氨基酸168-182;SEQIDNO:997(小鼠)的氨基酸168-183)的(參見Banner"a/.，CW/73(3)431-445(〗993)和Loetscher^a/.,Ce〃W(2)351-359(1990).)。域2和3與連接的配體(TNFp、TNFa)接觸(Banner"a/.，Ce//，73(3)431-445(1993).)。TNFRl的細(xì)胞外區(qū)域還包含一種域，其被稱為配體組裝前結(jié)構(gòu)域或PLAD域(SEQIDNO:996(人)的氨基酸1-53;SEQIDNO:997(小鼠)的氨基酸1-53)(美國政府，WO01/58953;Denga/"胸匿Mec/,:dwe,doi:10.1038/nml304(2005))。通過包括域4內(nèi)或近膜區(qū)內(nèi)TNFRl(分別為SEQIDNO:213的氨基酸168-182，SEQIDNO:215的氨基酸168-183)水解的方法，TNFRl從體內(nèi)細(xì)胞表面脫落，生成可溶形式的TNPR1?？扇艿腡NFR1保留了與TNFa結(jié)合的能力，并因此也保留了作為TNPa活性內(nèi)源性抑制劑的功能。人TNFR1的胞外區(qū)有以下氨基酸序列SGTT(SEQIDNO:996)。鼠(小鼠)TNPR1的胞外區(qū)有以下氨基酸序列VCNCHAGFFLRESECVPCSHCKKNEECMKLCLPPPLANVTNPQDSGTA(SEQIDNO:997)。適合在本發(fā)明中使用的抗TNFRldAb(例如本文所述的配體)可特異性結(jié)合腫瘤壞死因子受體i(TNFRl;p55;CDl加a)。優(yōu)選地，TNFRl的拮抗劑對腫瘤壞死因子2(TNFR2)沒有結(jié)合特異性，或基本上不拮抗TNFR2。在標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞檢測中當(dāng)拮抗劑(1nM、10nM、100nM、1pM、10iuM或100|uM)對TNFa(100pg/ml)誘導(dǎo)的TNFR2介導(dǎo)的活性的抑制不超過5%時(shí)，TNFRl的拮抗劑基本上不拮抗TNFR2。在某些實(shí)施方案中，與TNFRl結(jié)合的所述dAb單體抗聚集，可逆地解折疊和/或包括與IL-1R1結(jié)合的dAb單體的上述框架區(qū)。合適的抗TNFRldAb和包括這樣的dAb的配體不誘導(dǎo)可導(dǎo)致受體激活和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的TNFRl在細(xì)胞表面的交聯(lián)或聚集成簇。在具體實(shí)施方案中，所述配體包括與TNFRl的域1結(jié)合的抗TNFRl的dAb。在進(jìn)一步具體實(shí)施方案中，所述配體包括與TNFRl的域1結(jié)合的抗TNFRl的dAb,并與TAR2m-21-23竟?fàn)幣c小鼠TNTFR1的結(jié)合或與TAR2h-205竟?fàn)幣c人TNFR1的結(jié)合。在某些實(shí)施方案中，抗TNFR1的dAb與TNFRl的域2和/或域3結(jié)合。在具體實(shí)施方案中，抗TNFR1的dAb與TAR2h-10-27、TAR2h-131-8、TAR2h國15-8、TAR2h-35-4、TAR2h-154-7、TAR2h-154-10或TAR2h-185-25竟?fàn)幒蚑NFR1(如人和/或小鼠TNFR1)的結(jié)合。優(yōu)選地，適于在本發(fā)明所述配體中使用的抗TNFR1的dAb單體與TNFR1結(jié)合，Kd為300nM至5pM(即3x10-7至5x10"2M),優(yōu)選50nM至20pM,更優(yōu)選5nM至200pM,最優(yōu)選1nM至100pM,例如1x10'7M或更少，優(yōu)選1xl(T8M或更少，更優(yōu)選1x10—9M或更少，有利的是1xM或更少，最優(yōu)選1x10—11M或更少；和/或K。ff速率常數(shù)為5x10"s"至1xlO^s",優(yōu)選1x10-2s"至1xl(T6s",更優(yōu)選5x10-3s-1至1xIO-5s-1,例如5x10"s-1或更少，優(yōu)選1x10-2s"或更少，有利的是lxlO-3s"或更少，更優(yōu)選lx10-4s"或更少，還更優(yōu)選1x10—5s"或更少，最優(yōu)選1xl(T6s"或更少，以上由表面等離子共振測定。(Kd=K^ff/K。n)。適于在本發(fā)明中使用的某些抗TNFR1的dAb單體與人TNFR1特異性地結(jié)合，表面等離子共振測定Kd為50nM至20pM,K。ff速率常數(shù)為5x10"s"至lxl(T7s-〗。一些抗TNFR1的dAb單體抑制TNPoc和TNFR1的結(jié)合。例如一些抗TNFR1的dAb單體抑制TNFa和TNPR1的結(jié)合，半數(shù)抑制濃度(IC50)為500nM至50pM,優(yōu)選100nM至50pM,更優(yōu)選10nM至100pM,有利的是1nM至100pM;例如50nM或更少，優(yōu)選5nM或更少，更優(yōu)選500pM或更少，有利的是200pM或更少，最優(yōu)選100pM或更少。優(yōu)選地，TNFR1是人TNFR1。其他抗TNFR1的dAb單體不抑制TNFoc和TNFR1的結(jié)合，但抑制TNFR1介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)。例如抗TNFR1的dAb單體可以抑制TNPoc誘導(dǎo)的TNFR1聚集成簇，TNFR1聚集成簇可引發(fā)TNFR1介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)。例如某些抗TNFRl的dAb單體可結(jié)合TMFR1，并抑制TNFRl介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)，但基本上不抑制TNFoc和TNFRl的結(jié)合。例如，抗TNFRl的dAb單體抑制TNFa誘導(dǎo)的TNFRl在細(xì)胞表面的交聯(lián)或聚集成簇。這樣的dAb(例如本文所迷的TAR2m-21-23)是有利的，因?yàn)樗鼈兛梢赞卓辜?xì)胞表面的TNFRl,但基本上不減少內(nèi)源性可溶TNFRl的抑制活性。例如抗TNFRl的dAb可以結(jié)合TNFRl,但在受體結(jié)合檢測中抑制TNFa和TNFRl的結(jié)合不超過約10%,不超過約5%，不超過約4%，不超過約3%，不超過約2%，或不超過約1%。而且在這些實(shí)施方案中，在標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞檢測中抗TNFRl的dAb抑制TNFa誘導(dǎo)的TNFRl的交聯(lián)和/或TNFRl介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)至少約10%,至少約20%,至少約30%，至少約40%,至少約50%,至少約60°/。，至少約70%,至少約80%，至少約卯％,至少約95%,或至少約99%。因此，將包括這種dAb單體的配體施用于對其有需要的哺乳動(dòng)物，能補(bǔ)充抑制TNFa和TNFRl體內(nèi)活性的內(nèi)源性調(diào)節(jié)途徑。優(yōu)選地，在標(biāo)準(zhǔn)纟企測(如本文所述的標(biāo)準(zhǔn)L929或標(biāo)準(zhǔn)HeLaIL-8檢測)中，所述配體或dAb單體中和(抑制其活性)TNFRl,半數(shù)中和量(ND50)為500nM至50pM,優(yōu)選100nM至50pM,更優(yōu)選10nM至lOOpM，有利的是1nM至100pM;例如50nM或更少，優(yōu)選5nM或更少，更優(yōu)選500pM或更少，有利的是200pM或更少，最有利的是100pM或更少。在其他實(shí)施方案中，在標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞檢測中(如本文所述的標(biāo)準(zhǔn)L929或標(biāo)準(zhǔn)HeLaIL-8檢測)所述抗TNFRl的dAb單體與TNFRI結(jié)合并拮抗TNFRl的活性，ND50S100nM，在檢測中濃度S10pM時(shí)，dAb激發(fā)TNFRl的活性^5%。在其他實(shí)施方案中，所述抗TNFRl的dAb單體對TNFRl具有結(jié)合特異性，Kd如本文所述，并抑制標(biāo)準(zhǔn)小鼠LPS/D-半乳糖胺誘導(dǎo)的感染性休克模型中的致死率(即與合適的對照相比，防止或減低致死率至少約10%)。優(yōu)選地，當(dāng)給藥量為約5mg/kg或更優(yōu)選約lmg/kg時(shí)，在標(biāo)準(zhǔn)小鼠LPSZD-半乳糖胺誘導(dǎo)的感染性休克模型中，與合適的對照相比，抗TNFR1的dAb單體抑制致死率至少約25%,或至少約50%)。在具體實(shí)施方案中，在標(biāo)準(zhǔn)細(xì)月包4全測，如本文所述的標(biāo)準(zhǔn)L929或標(biāo)準(zhǔn)HeLaIL-8檢測中，本發(fā)明的抗TNFR1的dAb單體和包括此種dAb單體的配體基本上不激動(dòng)TNFR1(用作TNFR1激動(dòng)劑)(即在檢測中當(dāng)濃度為1nM、10nM、100nM、1|iM、10(^M、100|iM、1000pM或5,000jiM時(shí)，TNFa(100pg/ml)誘導(dǎo)的TNFR1介導(dǎo)的活性不超過5%)。在其他實(shí)施方案中，所述配體包括與腫瘤壞死因子受體1(TNFR1、p55、CD120a)特異性結(jié)合的域抗體(dAb)單體，Kd為300nM至5pM，并包含氨基酸序列，其至少約80%,至少約85%，至少約90%,至少約91%,至少約92%，至少約93%,至少約94%,至少約95%，至少約96%,至少約97%,至少約98%,或至少約99%與選自下列的氨基酸序列或dAb同源TAR2h-12(SEQIDNO:785)、TAR2h-13(SEQIDNO:786)、TAR2h-14(SEQIDNO:787)、TAR2h-16(SEQIDNO:788)、TAR2h-17(SEQIDNO:789)、TAR2h-18(SEQIDNO:790)、TAR2h-19(SEQIDNO:791)、TAR2h-20(SEQIDNO:792)、TAR2h-21(SEQIDNO:793)、TAR2h-22(SEQIDNO:794)、TAR2h-23(SEQIDNO:795)、TAR2h-24(SEQIDNO:796)、TAR2h-25(SEQIDNO:797)、TAR2h畫26(SEQIDNO:798)、TAR2h-27(SEQIDNO:799)、TAR2h-29(SEQIDNO駕)、TAR2h-30(SEQIDNO彌)、TAR2h-32(SEQIDNO:802)、TAR2h-33(SEQIDNO:803)、TAR2h-10-1(SEQIDNO:804)、TAR2h-10-2(SEQIDNO:805)、TAR2h-10-3(SEQIDNO:806)、TAR2h腸10-4(SEQIDNO儒)、TAR2h番5(SEQIDNO:808)、TAR2h-10-6(SEQIDNO:809)、TAR2h-10-7(SEQIDNO:810)、TAR2h隱10-8(SEQID<formula>formulaseeoriginaldocumentpage77</formula>ai加s)on-，v丄、(乙乙6:ONGI加s)〔IZ6:ONai謝匪頓v丄、(0Z6:ONGI加s)漲-砌v工、〔616:ONaib3S)術(shù)-戦v工、(816:ONai加s)緊頓V丄、〔AI6:ONai加s)簡-戦v工'(916:OMai冊-頓v丄、〔W6:ONaizoi-頓v工、(W6:ONai加s)ioi-職v工、〔￡I6:ONai加s)ooi-，v工'fel6:OMai加s)66-鎖V1、〔II6:ONaiA6畫戰(zhàn)V丄、(016:ONai96-職V工、(606:ONaiS6-戦V工、(806:ONaiD3S)旨q^w丄、(厶06:ONGIb3S)￡6-TOVJL、(906:ONai。3S)Z6-q雨丄、(S06:ONai63S)16-戰(zhàn)v工、(藩ONaiD3S)06-戰(zhàn)V丄、(區(qū)ONai加s)68-戦V工、(■ONai63S)88-，V丄、(賜:ONai加s)A8扁戰(zhàn)V工、(006:OMai加s)98-q^W丄、(668:ONai加s)S8-qravi、(■ONai加s)t78-戦V丄、(藩ONaib3S)(968:ONai乙8-qraV丄、(S68:ONai18-聰Vl、(藩OMai加S)os-戰(zhàn)v丄、(￡68:ONai、(藩onlai加S)(藩onai、(068:ONaiD3S)s-isi-戦v丄、(688:ONai。3S)OI隱qraV丄、(S8S:0Ndl。3S)S-0I寸SI,3^V工、(A88:ONaib3S)K-S8I隱戦V1、(98S:ONaib3S)乙8-SI-q，丄、(SSS:ON、(柳:O、〖aib3S)s-si曙，v丄、(哪:ONai、(潔:ONai(188:ONai。3S)si-聰v丄、ai加s)6A-H3W丄、ai8Zr憶V工、(8丄8:ONai加s)Z2-qrW丄、(Z28:ONai加S)9Zr悩V丄、ai加s)SA-鎖V丄、ai加S)i/Zr鎖V丄、ai"國q^iv工、("8:ONai加S)"-聰v丄、(，ONtai加s)u-q^iv丄、(U8:ONaiai(柳:ONai丄9-qwv工、(柳:ONai。3S)99丄、<formula>formulaseeoriginaldocumentpage79</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage80</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage81</formula>aib3S)on-戰(zhàn)vi、(W6:0Nai。3S)〔1176:ONai。3S)sn-戰(zhàn)v工、厶n-戰(zhàn)v工、〔6e6:ONai。3s)(8￡6:ONaiwi-頓v丄、("6:ONai53S)廿n-qrw工、(9E6:ONCII53S)(S￡6:ONaizn-職v丄、(17￡6:0naiin-，v工、〔ee6:ONai加s)o:i-頓v丄、Conai加s)6H-頓v丄、aiD3S)川-，v工、(0￡6:OMai。3S)"I-，V丄、(6z6:ONai加s)aisii-戰(zhàn)v工、(z26:onai加s)川-，v丄、(9Z6:ONai。3S)ni-戰(zhàn)v丄、(W6:ONai加s)(ONait)3S)in-q雨工、(K6:ONaiD3S)(k6:ONaiD3S)(iz6:ONai謝-戦v丄、(0乙6:ONaib3S)乙oi-悩v工、(616:ONai錫-鎖v丄、(816:ONai加S)、("6:ONaib3S)術(shù)誦戦v丄、(916:ONai53S)(SI6:ONai加s)乙oi-qrav丄、(w6:onlcn加S)I(H-職V丄、(￡16'頂GIooi-頓v丄'(H6:ONai66-TOV工、(116:ONaiA6-職V工、(016:ONaid3s)96-職V丄、(606:ONai03S)S6-卿V工、(806:ONai加S)t76-q3W丄、(A06:ONaibas)S6醫(yī)戦V丄、(906:ONaib3S)乙6-，V1、(S06:ONai加S)16-職V工、(W)6:ONaib3S)06-頓V丄、(賜:ONai加S)68-頓v工、(乙06:ONai加S)8S,^W丄、(賜:ONai加S)A8-戦V工、(006:OMcnD3S)98-H3W丄、(66S:ONai加S)S8-戦V丄、(868:OMai加S)則，丄、(勝ONait)3S)"-q^w丄、(968，aib3S)乙8-qSW丄、(湖:ON18-，V丄、(柳:OMaib3S)08-q^V丄、(湖:ONai。3S)、(藩ONai卜"-戦v工、(168:ONai加S)、(068:ON[ais-isi-職v丄、(6S8:ONaibss)乙-i7i-qrav丄、(ss8:onai。3S)s-oi-Ki-qwv工、<formula>formulaseeoriginaldocumentpage83</formula>NO:987)、TAR2m-24(SEQIDNO:988)、TAR2m-21-23(SEQIDNO:989)、TAR2m-21-07(SEQIDNO:990)、TAR2m-21-43(SEQIDNO:991)、TAR2m-21-48(SEQIDNO:992)、TAR2m-21-10(SEQIDNO:993)、TAR2m-21-06(SEQIDNO:994)和TAR2m-21-17(SEQIDNO:995)。在一些實(shí)施方案中，所述配體包括與TNFR1結(jié)合，并與本文所述任何dAb竟?fàn)幣cTNFR1(例如小鼠和/或人TNFR1)的結(jié)合的dAb單體。耐蛋白酶的dAb本發(fā)明還涉及耐蛋白酶降解的dAb單體(例如絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、基質(zhì)金屬蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、彈性蛋白酶、糜蛋白酶、羧肽酶、組織蛋白酶(例如組織蛋白酶G)、蛋白酶3)，還涉及包括耐蛋白酶dAb的配體。蛋白酶(如絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、基質(zhì)金屬蛋白酶)在蛋白的正常更新和代謝中發(fā)揮作用。但是在某些生理狀態(tài)下，如炎癥狀態(tài)(如COPD)和癌癥，出現(xiàn)在組織、器官或動(dòng)物中(如肺中，在腫瘤中或靠近腫瘤)的蛋白酶量可增加。蛋白酶的這種增加可導(dǎo)致內(nèi)源性蛋白和施用的治療肽、多肽和蛋白的加速降解和失活。事實(shí)上，一些可體內(nèi)使用(如用于治療、診斷或預(yù)防疾病)的物質(zhì)因?yàn)楸坏鞍酌缚焖俳到夂褪Щ睿詢H有有限的療效。本發(fā)明涉及耐蛋白酶降解的dAb或包括dAb的配體。本發(fā)明所述耐蛋白酶的dAb有幾種優(yōu)點(diǎn)。例如耐蛋白酶的dAb可施用于受試者，與對蛋白酶敏感的物質(zhì)相比能保持更長的體內(nèi)活性。因此，耐蛋白酶dAb的功能會(huì)保持一段時(shí)間，足以產(chǎn)生生物效應(yīng)。耐蛋白酶降解的dAb與蛋白酶在適于蛋白酶活性的條件下孵育至少約2小時(shí)，至少約3小時(shí)，至少約4小時(shí)，至少約5小時(shí)，至少約6小時(shí)，至少約7小時(shí)，至少約8小時(shí)，至少約9小時(shí)，至少約10小時(shí)，至少約11小時(shí)，至少約12小時(shí)，至少約24小時(shí)，至少約36小時(shí)，或至少約48小時(shí)時(shí)，大體上沒有被蛋白酶降解。與所述蛋白酶共同孵育至少約2小時(shí)后，當(dāng)不超過約25%,不超過約20%,不超過約15%，不超過約14%,不超過約13%,不超過約12%,不超過約11%，不超過約10%,不超過約9%,不超過約8%,不超過約7%，不超過約6%,不超過約5%,不超過約4%，不超過約3%，不超過約2%,不超過約1%,或大體上沒有所述蛋白被蛋白酶降解時(shí)，則dAb大體上沒有被降解?？捎萌魏魏线m的方法如采用本文所述的SDS-PAGE，評(píng)估蛋白降解。耐蛋白酶能力可使用任何合適的的方法評(píng)估。例如可將蛋白酶加入合適緩沖(例如PBS)中的dAb溶液里，得到dAb/蛋白酶溶液，例如至少約0.01%(w/w)蛋白酶，約0.01%至約5%(w/w)蛋白酶，約0.05%至約5%(w/w)蛋白酶，約0.1%至約5%(w/w)蛋白酶，約0.5%至約5%(w/w)蛋白酶，約1%至約5%(w/w)蛋白酶，至少約0.01%(w/w)蛋白酶，至少約0.02%(w/w)蛋白酶，至少約0.03%(w/w)蛋白酶，至少約0.04%(w/w)蛋白酶，至少約0.05%(w/w)蛋白酶，至少約0.06%(w/w)蛋白酶，至少約0.07%(w/w)蛋白酶，至少約0.08。/0(w/w)蛋白酶，至少約0.09。/。(w/w)蛋白酶，至少約0.1%(w/w)蛋白酶，至少約0.2%(w/w)蛋白酶，至少約0.3%(w/w)蛋白酶，至少約0.4%(w/w)蛋白酶，至少約0.5%(w/w)蛋白酶，至少約0.6。/。(w/w)蛋白酶，至少約0.7。/。(w/w)蛋白酶，至少約0.8%(w/w)蛋白酶，至少約0.9%(w/w)蛋白酶，至少約1%(w/w)蛋白酶，至少約2%(w/w)蛋白酶，至少約3%(w/w)蛋白酶，至少約4%(w/w)蛋白酶，或約5%(w/w)蛋白酶的溶液。所述dAb/蛋白酶混合物可在適合蛋白酶活性的溫度下(例如37。C)孵育，在時(shí)間間隔處(例如在1小時(shí)、2小時(shí)、3小時(shí)等)取樣，終止蛋白酶反應(yīng)?？墒褂萌魏魏线m的方法分析樣品的蛋白降解，例如SDS-PAGE分析。結(jié)果可用于建立降解的時(shí)間進(jìn)程。在具體實(shí)施方案中，耐蛋白酶的dAb耐彈性蛋白酶降解。例如，所述耐彈性蛋白的dAb于37。C在0.04%(w/w)的彈性蛋白溶液中孵育至少約2小時(shí)時(shí)大體上沒有降解。優(yōu)選地，所述耐彈性蛋白的dAb于37。C在0.04%(w/w)的彈性蛋白溶液中孵育至少約12小時(shí)時(shí)大體上沒有降解。更優(yōu)選地，耐彈性蛋白的dAb于37。C在0.04%(w/w)的彈性蛋白溶液中孵育至少約24小時(shí)，至少約36小時(shí)，或至少約48小時(shí)時(shí)大體上沒有降解。在具體實(shí)施方案中，所述耐蛋白酶的dAb耐胰蛋白酶降解。例如所述耐胰蛋白酶的dAb于37°C在0.04%(w/w)的胰蛋白酶溶液中孵育至少約2小時(shí)時(shí)大體上沒有降解。優(yōu)選地，所述耐胰蛋白酶的dAb于37。C在0.04%(w/w)的胰蛋白酶溶液中孵育至少約3小時(shí)時(shí)大體上沒有降解。更優(yōu)選地，所述耐胰蛋白酶的dAb于37。C在0.04%(w/w)的胰蛋白酶溶液中孵育至少約4小時(shí)，至少約5小時(shí)，至少約6小時(shí)，至少約7小時(shí)，至少約8小時(shí)，至少約9小時(shí)，至少約10小時(shí)，至少約ll小時(shí)，或至少約12小時(shí)時(shí)大體上沒有降解。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明不包括WO2004/081026中公開的TARl-5-19。優(yōu)選地，所述耐蛋白酶的dAb是輕鏈可變域。例如所述耐蛋白酶的dAb可以是Vk或V入。dAb耐蛋白酶可能與其熔點(diǎn)(Tm)有關(guān)。一般來說，更高的熔點(diǎn)與耐蛋白酶有關(guān)。在一些實(shí)施方案中，所述耐蛋白酶dAb的Tm在約40。C至約95。C，約40。C至約85。C,約40。C至約80°C,約45°C至約95°C,約45°C至約85°C,45。C至約80°C,至少約40。C，至少約45°C，至少約50°C，至少約55°C，至少約60°C,至少約65°C,至少約70。C,至少約75°C，至少約80°C,至少約85°C,至少約90。C,或至少約95。C。所述耐蛋白酶的dAb可以特異性結(jié)合任何所需靶標(biāo)，如人或動(dòng)物蛋白，包括細(xì)胞因子、生長因子、細(xì)胞因子受體、生長因子受體、酶(如蛋白酶)、酶和DNA結(jié)合蛋白的輔助因子、脂類和碳水化合物。合適的靶標(biāo)包括但不限于細(xì)胞因子、生長因子、細(xì)胞因子受體、生長因子受體以及其它包括但不限于下述的蛋白ApoE、Apo-SAA、BDNF、心肌營養(yǎng)素-1、CEA、CD40、CD40配體、CD56、CD38、CD138、EGF、EGF受體、ENA-78、嗜酸粒細(xì)胞趨化因子、嗜酸粒細(xì)胞趨化因子-2、Exodus-2、FAPot、酸性FGF、堿性FGF、成纖維生長因子-10、FLT3配體、神經(jīng)趨化蛋白(CX3C)、GDNF、G-CSF、GM-CSF、GF-f31、人血清白蛋白、胰島素、IFN-Y、IGF-I、IGF-II、IL-loc、IL-1卩、IL-1受體、IL-1受體1型、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL畫6、IL-7、IL-8(72a.a.)、IL-8(77a.a.)、IL-9、IL-IO、IL-ll、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18(IGIF)、抑制素a、抑制素p、IP-IO、角質(zhì)細(xì)胞生長因子-2(KGF-2)、KGF、瘦素、LIF、淋巴趨化因子、苗勒管抑制物質(zhì)、單核細(xì)胞克隆抑制因子、單核細(xì)胞趨化蛋白、M-CSF、MDC(67a.a.)、MDC(69a.a.)、MCP-1(MCAF)、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MDC(67a.a.)、MDC(69a.a.)、MIG、MIP畫lct、MlP-lf3、MIP-3oc、MIP-3|3、MIP-4、髓系祖細(xì)胞抑制因子-1(MPIF-1)、NAP-2、神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)生長因子、P-NGF、NT-3、NT-4、制瘤素M、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PF-4、RANTES、SDFla、SDFip、SCF、SCGF、干細(xì)胞因子(SCF)、TARC、TGF-a、TGF-P、TGF-卩2、TGF-卩3、腫瘤壞死因子(TNF)、TNF-a、TNF-(3、TNF受體I、TNF受體II、TNIL-1、TPO、VEGF、VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD、VEGF受體1、VEGF受體2、VEGF受體3、GCP-2、GRO/MGSA、GRO-P、GRO-y、HCC1、1-309、HER1、HER2、HER3、HER4、血清白蛋白、vWF、淀4分樣蛋白(如a-淀粉樣蛋白)、MMP12、PDK1、IgE以及其他本文所^>開的靶標(biāo)。應(yīng)該理解該列舉絕非窮舉。在一些實(shí)施方案中，所述耐蛋白酶的dAb與肺部組織的耙標(biāo)結(jié)合，如選自下述的靶標(biāo)TNFR1、IL-1、IL-1R、IL-4、IL-4R、IL-5、IL-6、IL-6R、IL-8、IL-8R、IL-9、IL-9R、IL-IO、IL-12、IL隱12R、IL醫(yī)13、IL-13Ral、IL-13Ra2、IL-15、IL-15R、IL-16、IL-17R、IL-17、IL-18、IL-18R、IL-23、IL-23R、IL-25、CD2、CD4、CDUa、CD23、CD25、CD27、CD28、CD30、CD40、CD40L、CD56、CD138、ALK5、EGFR、FcERl、TGFb、CCL2、CCL18、CEA、CR8、CTGF、CXCL12(SDF-1)、糜酶、FGF、弗林蛋白酶、內(nèi)皮素-1、嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子(如嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子、嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子-2、嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子-3)、GM-CSF、ICAM-1、ICOS、IgE、IFNa、1-309、整合素、L-選擇素、MIF、MIP4、MDC、MCP-1、MMPs、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶、骨橋蛋白、OX-40、PARC、PD-1、RANTES、SCF、SDF-1、siglec8、TARC、TGFb、凝血酶、Tim-l、TNF、TRANCE、類胰蛋白酶、VEGF、VLA-4、VCAM、a鄰7、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR8、av卩6、avp8、cMET、CD8、vWF、淀粉樣蛋白(a隱淀4分樣蛋白)、MMP12、PDK1和IgE。本發(fā)明所述耐蛋白酶的dAb可體內(nèi)施用，與不能類似地抗蛋白酶降解的化合物相比，其保持功能更久。本發(fā)明耐蛋白酶降解的dAb可用于治療炎癥疾病(如通過肺部給藥方式對肺部局部給藥，如鼻腔給藥，如吸入給藥)。例如通過給予對其有需要的受試者治療有效量的耐蛋白酶降解的dAb單體。本發(fā)明還涉及用于治療、診斷和/或預(yù)防的耐蛋白酶降解的dAb單體，以及本發(fā)明的此種dAb在制備治療本發(fā)明所述疾病的藥物中的用途(例如炎癥疾病、關(guān)節(jié)炎、呼吸系統(tǒng)疾病)。在具體實(shí)施方案中，所述耐蛋白酶的dAb單體可通過肺部給藥用于治療炎癥疾病、關(guān)節(jié)炎，或呼吸系統(tǒng)疾病。該耐蛋白酶的dAb還可用于制備治療炎癥疾病、關(guān)節(jié)炎、或呼吸系統(tǒng)疾病的藥物，其中所述dAb單體經(jīng)肺部給藥。彈性蛋白酶和胰蛋白酶是肺部最常見的蛋白酶。優(yōu)選地，肺部給藥的耐蛋白酶的dAb耐彈性蛋白酶，耐胰酶，或耐彈性蛋白酶和胰酶。在具體實(shí)施方案中，所述耐蛋白酶的dAb單體(如耐彈性蛋白酶的dAb單體)和IL-1R1結(jié)合，并抑制IL-1(如IL-la和/或IL-1(3)和受體結(jié)合，但不抑制IL-lra和IL-1R1的結(jié)合，也不抑制IL-lra和包括此種dAb單體的配體結(jié)合。此種dAb單體可用作治療藥物以治療炎癥疾病，或其他全部或部分地由IL-1和IL-1R1結(jié)合誘導(dǎo)的生物功能所介導(dǎo)的疾病(例如局部或系統(tǒng)性炎癥，炎癥調(diào)節(jié)介質(zhì)(如IL-6、11-8、TNF)的產(chǎn)生，發(fā)燒，免疫細(xì)胞(如淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞)的激活、厭食癥、低血壓、白細(xì)胞減少、血細(xì)胞減少)。所述耐蛋白酶的dAb單體可以結(jié)合IL-1R1,并抑制IL-1R1功能而不干擾內(nèi)源性IL-1R1抑制途徑，例如內(nèi)源性IL-lra和內(nèi)源性IL-1R1的結(jié)合。因此這種dAb單體可施用于受試者以補(bǔ)充體內(nèi)抑制IL-1R1或IL-1活性的內(nèi)源性調(diào)節(jié)途徑。此外，與IL-1R1結(jié)合但不抑制IL-lra和IL-1R1結(jié)合的耐蛋白酶dAb單體作為診斷物質(zhì)使用是有利的，因?yàn)槠淇捎糜诮Y(jié)合、檢測、定量或測量樣本中的IL-1R1，并且不會(huì)與樣本中的IL-lra竟?fàn)幣cIL-1R1的結(jié)合。因此樣本中是否有以及有多少IL-1R1是可以準(zhǔn)確測定的。與IL-1R1結(jié)合，并抑制IL-1(如IL-la和/或IL-1(3)與受體結(jié)合，但不抑制IL-lra和IL-lRl結(jié)合的耐蛋白酶dAb單體(如耐彈性蛋白酶的dAb單體)還是有用的研究工具。例如這種dAb單體可用于識(shí)別與IL-1R1結(jié)合，但不抑制IL-lra和IL-1R1結(jié)合的物質(zhì)(如其他dAb,小的有機(jī)分子)。在一個(gè)說明性的實(shí)施例中，在如本文所述受體結(jié)合檢測的竟?fàn)幮訧L-1R1受體結(jié)合檢測中，檢測了待檢測的一種物質(zhì)或物質(zhì)的集合抑制IL-1與IL-1R1結(jié)合的能力。在這種檢測中抑制IL-1和IL-1R1結(jié)合的物質(zhì)，可隨后在類似的竟?fàn)幮訧L-1R1受體結(jié)合檢測中研究其是否與和IL-1R1結(jié)合但不抑制IL-lra和IL-1R1結(jié)合的dAb單體竟?fàn)?。在這種檢測中的竟?fàn)幮越Y(jié)合表明該物質(zhì)與IL-1R1結(jié)合,并抑制IL-1與受體的結(jié)合,但不抑制IL-lra與受體結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，所述耐蛋白酶的dAb與IL-1R1結(jié)合，并與本文公開的任何dAb竟?fàn)幣cIL-1R1的結(jié)合(例如人IL-1R1)。在一些實(shí)施方案中，所述dAb至少耐彈性蛋白酶和/或胰蛋白酶。在其他實(shí)施方案中，所述耐蛋白酶的dAb與抗IL-1R1的dAb竟?fàn)幣cIL-1R1的結(jié)合，其中所述抗IL-1R1的dAb包含氨基酸序列，其至少約80%,至少約85%,至少約90%,至少約91°/。，至少約92%，至少約93%,至少約94%,至少約95%,至少約96%,至少約97%,至少約98%,或至少約99%與選自SEQIDNO:l至SEQIDNO:349的氨基,列或dAb同源。在其他實(shí)施方案中，所述耐蛋白酶的dAb與抗IL-1R1的dAb竟?fàn)幣cIL-1R1的結(jié)合，其中所述抗IL-1R1的dAb包含氨基酸序列，其至少約80%，至少約85%,至少約90%,至少約91%,至少約92%,至少約93%,至少約94%,至少約95%,至少約96%，至少約97%,至少約98%,或至少約99%與選自SEQIDNO:l或SEQIDNO:2的氨基臥銀列或dAb同源。在其他實(shí)施方案中，所述耐蛋白酶的dAb與抗IL-1R1的dAb竟?fàn)幣cIL-1R1的結(jié)合，其中所述抗IL-1R1的dAb包含氨基酸序列，其至少約80%,至少約85%,至少約90%,至少約9'1%,至少約92%,至少約93%,至少約94%，至少約95%,至少約96%,至少約97°/。，至少約98%,或至少約99%與選自SEQIDNO:3至或SEQIDNO:7的氨基酸序列或dAb同源。在其他實(shí)施方案中，所述耐蛋白酶的dAb與抗IL-1R1的dAb竟?fàn)幣cIL-1R1的結(jié)合，其中所述抗IL-1R1的dAb包含氨基酸序列DOM4-130-54(SEQIDNO:7)或氨基酸序列，其至少約80%,至少約85%,至少約90%，至少約91%,至少約92%,至少約93%，至少約94%,至少約95%,至少約96%，至少約97%，至少約98%,或至少約99%與DOM4-130-54(SEQIDNO:7)同源。配體形式配體或dAb單體可形成單或多特異性抗體或抗體片段，或形成單或多非抗體結(jié)構(gòu)。合適的形式包括任何合適的多肽結(jié)構(gòu)，其中為了具有對結(jié)構(gòu)上抗原的結(jié)合特異性可包括抗體可變域或其一種或多種的CDR。各種合適的抗體形式為本領(lǐng)域所公知，例如IgG樣形式、嵌合抗體、人源化抗體、人抗體、單鏈抗體、雙特異性抗體、抗體重鏈、抗體輕鏈、抗體重鏈和/或輕鏈的同型二聚體和異型二聚體、任何上述的抗原結(jié)合片段(如Fv片段(單鏈Fv(scFv)、二硫鍵連接的Fv)、Fab片段、Fab，片段、F(ab，)2片段)、單可變域(如Vh、Vl、Vhh)、dAb和任何上述經(jīng)修飾的形式(如經(jīng)聚烷撐二醇(如聚乙二醇、聚丙二醇、聚丁二醇)或其他合適的聚合物共價(jià)連接修飾)。參見2003年6月30日提交的指定美國的PCT/GB03/002804(WO2004/081026),是關(guān)于PEG化的單可變域和dAb,制備相同的體內(nèi)半衰期增加的PEG化單可變域、dAb單體和多聚物的合適方法，合適的PEG,優(yōu)選流體大小的PEG,優(yōu)選流體大小的PEG化的單可變域和dAb單體以及多聚物。PCT/GB03/002804(WO2004/081026)的全部教導(dǎo)，包括上述所指的部分，都在此引作參考。配體可以形成所需dAb單體的二聚體、三聚體或多聚體形式，例如使用合適的接頭如(Gly4Ser)n,n=從1至8，例如2、3、4、5、6或7。如果需要，配體，包括dAb單體、二聚體和三聚體，可連接至抗體Fc區(qū)，包括Ch2和Ch3區(qū)的其中之一或兩者，以及任選的鉸鏈區(qū)。例如編碼作為單核苷酸序列連接到Fc區(qū)的配體的載體可用于制備這樣的多肽。配體和dAb單體還可結(jié)合和/或形成非抗體多配體結(jié)構(gòu)，從而形成與靶分子結(jié)合的多價(jià)復(fù)合體，因而有很好的親和力。例如天然的細(xì)菌受體如SpA可用作CDRs移植的支架以生成特異性結(jié)合一種或多種表位的配體。該方法的細(xì)節(jié)在US5,831,012中有描述。其他合適的支架包括基于纖維連接蛋白和親和體的那些。合適方法的細(xì)節(jié)在WO98/58965中有描述。其他合適的支架包括在vandenBeuken"a/.,J.^fo/.說o/.310:591-601(2001)中描述的脂籠蛋白和CTLA4，以及如在WO00/69907(MedicalResearchCouncil)中所描述的那些支架，其是基于例如細(xì)菌GroEL的環(huán)結(jié)構(gòu)或其他分子伴侶多肽。蛋白支架可以相結(jié)合；例如CDRs可移植到CTLA4支架上，與免疫球蛋白Vh或VL區(qū)合用以形成配體。同樣地，纖維連接蛋白、脂籠蛋白和其他支架可以相結(jié)合。制備任何所需形式的各種合適方法為本領(lǐng)域所知。例如抗體鏈和形式(例如IgG樣形式、嵌合抗體、人源化抗體、人抗體、單鏈抗體、雙特異性抗體、抗體重鏈、抗體輕鏈、抗體重鏈和/或輕鏈的同型二聚體和異型二聚體)可通過合適的表達(dá)構(gòu)建體的表達(dá)和/或合適細(xì)胞的培養(yǎng)(例如雜交瘤、異種雜交瘤、含有編碼所述形式的重組構(gòu)建物的重組宿主細(xì)胞)而制備。進(jìn)一步地，如抗體或抗體鏈的抗原結(jié)合片段的形式(如Fv片段(如單鏈Fv(scFv)、二硫鍵連接的Fv)、Fab片段、Fab，片段、F(ab，)2片段)可通過合適的表達(dá)構(gòu)建物的表達(dá)，或抗體的例如使用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶的酶消化而進(jìn)行制備。所述配體可以形成如WO03/002609中所述的雙特異性配體或多特異性配體，其所有的教導(dǎo)都在此引作參考。雙特異性抗體包括具有不同結(jié)合特異性的免疫球蛋白單可變域。這種雙特異性抗體可包括重鏈和輕鏈區(qū)的結(jié)合。例如該雙特異性配體可包括VH區(qū)和VL區(qū)，其可連接在一起形成scFv(例如使用合適的如Gly4Ser的接頭)，或形成其雙特異性抗體或抗原結(jié)合片段(如F(ab，)2片段)。所述雙特異性抗體不包括互補(bǔ)的VH/V^對，其形成與抗原或表位都結(jié)合的常規(guī)雙鏈抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)。而所述雙形式的配體包括VH/Vi互補(bǔ)對，其中所述V區(qū)具有不同的結(jié)合特異性。此外，如果需要?jiǎng)t所述雙特異性配體可包括一種或多種CH或CL域。如果需要還可包括鉸鏈區(qū)。域的這種組合可以例如模擬天然抗體，如IgG、IgM或其片^殳，如Fv、scFv、Fab或F(ab，)2分子。也可設(shè)想其他結(jié)構(gòu)如包括VH,Vl,Ch1和CL域的IgG分子的單臂。優(yōu)選地，雖然幾種這樣的配體可一起包含在同樣的蛋白中，但本發(fā)明的所述雙特異性配體僅包括兩種可變域，例如兩種這樣的配體可包含在IgG或多體免疫球蛋白，如IgM中?；蛘咴诹硪粚?shí)施方案中，多數(shù)雙特異性配體組合形成多聚體。例如，兩種不同的雙特異性配體組合形成四特異性分子。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，依照本發(fā)明的方法制備的雙特異性配體的輕或重可變域可以在相同的多肽鏈上，或者在不同的多肽鏈上。至于可變域在不同的多肽鏈上，它們可隨后可通過接頭，一般是彈性接頭(如多肽鏈)、化學(xué)連接基團(tuán)，或通過任何本領(lǐng)域所知的其他方法連接起來。所述多特異性配體具有超過一個(gè)表位的結(jié)合特異性。一般來說，所述多特異性配體包括兩個(gè)或多個(gè)表位結(jié)合域，如dAb或包括表位結(jié)合位點(diǎn)的非抗體蛋白域，如親和體、SpA域、LDL受體A類域、EGF域、Avimer。多特異性配體可如本文所述進(jìn)一步形成。在一些實(shí)施方案中，所述配體是IgG樣的形式。這樣的形式具有IgG分子的常規(guī)四條鏈結(jié)構(gòu)(兩條重鏈和兩條輕鏈)，其中一個(gè)或多個(gè)單可變域已被具有所需特異性的dAb或單可變域取代。優(yōu)選地每個(gè)可變域(兩個(gè)Vh區(qū)和雨個(gè)VL區(qū))被dAb或單可變域取代。包括在IgG樣形式中的所述dAb或單可變域可以具有相同的或不同的特異性。在一些實(shí)施方案中，所述IgG樣形式是四價(jià)的，可以有一種、兩種、三種或四種特異性。例如，所述IgG樣形式可以是單特異性的，包括具有相同特異性的四種dAb;雙特異性的，包括具有相同特異性的三種dAb和另一種具有不同特異性的dAb;雙特異性的，包括具有相同特異性的兩種dAb和兩種具有一般但不同特異性的dAb;三特異性的，包括具有相同特異性的第一和第二dAb，具有不同特異性的第三dAb和具有不同于第一、第二和第三dAb特異性的第四dAb;或四特異性的，包括四種dAb，每種都有不同的特異性。可以制備IgG樣形式的抗原結(jié)合片段(如Fab、F(ab，)2、Fab，、Fv、scFv)。優(yōu)選地該IgG樣形式或其抗原結(jié)合片段與TNFR1不交聯(lián)。半衰期延長的形式所述配體如dAb單體，可形成其體內(nèi)血清半衰期延長的形式。體內(nèi)半衰期增加對于免疫球蛋白的體內(nèi)應(yīng)用是有用的，尤其是抗體，最尤其的是如dAb小抗體片段。這樣的片段(Fvs、二硫鍵連接的Fvs、Fabs、scFvs、dAbs)從體內(nèi)被迅速清除，會(huì)限制其臨床應(yīng)用。如dAb單體的小的配體可以形成抗體的更大的抗原結(jié)合片段或抗體(如形成Fab、Fab，、F(ab)2、F(ab，)2、IgG、scFv)。配體(如dAb單體)可形成抗體的更大的抗原結(jié)合片段或更大的流體大小的抗體(如形成Fab、Fab，、F(ab)2、F(ab，)2、IgG、scFv)。還可形成更大的流體大小的配體，例如通過連接聚烷撐二醇基團(tuán)(如聚乙二醇(PEG)基團(tuán)、聚丙二醇、聚丁二醇)、血清白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體或至少其轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合部分、抗體Fc區(qū)，或通過與抗體域共軛。在一些實(shí)施方案中，所述配體(如dAb單體)是PEG化的。優(yōu)選地，所述PEG化的配體(如dAb單體)與IL-1R1結(jié)合，其親和力與非PEG化的相同配體大體相同。例如所述配體可以是與IL-1R1結(jié)合的PEG化的dAb單體，其中PEG化的dAb單體結(jié)合IL-1R1的親和力，與非PEG化形式的dAb親和力的差異不超過約1000的系數(shù)，優(yōu)選不超過約100的系數(shù),更優(yōu)選不超過約10的系數(shù)，或相對于非PEG形式其親和力大體沒有改變。.參見2003年6月30日提交的指定美國的PCT/GB03/002804(WO2004/081026),關(guān)于PEG化的單可變域和dAb，制備相同的體內(nèi)半衰期增加的PEG化單可變域、dAb單體和多聚物的合適方法，合適的PEG,優(yōu)選流體大小的PEG,優(yōu)選流體大小的PEG化單可變域、dAb單體和多聚物。PCT/GB03/002804(WO2004/081026)的全部教導(dǎo)，包括上述所指的部分，在此引作參考。本發(fā)明所述流體大小的配體(如dAb單體和多聚體)可使用本領(lǐng)域公知的方法測定。例如凝膠過濾層析法可用于測定流體大小的配體。測定流體大小的配體的合適凝膠過濾基質(zhì)如交聯(lián)瓊脂糖基質(zhì)，是公知的并且容易得到。配體形式的大小(如連接在dAb單體的PEG部分的大小)可隨所需的應(yīng)用而變化。例如如果希望配體離開循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)入外周組織，理想的是保持流體大小的配體小到利于從血流外滲?；蛘呷绻枰潴w在體循環(huán)中保留更長的時(shí)間，則可增加配體的大小，例如通過形成Ig樣蛋白或通過加上30至60kDa的PEG部分(如線性或支鏈的PEG30至40kDaPEG，比如加上兩個(gè)20kDa的PEG部分)。如本文所述，配體(如dAb單體)的流體大小及其血清半衰期還可通過卩吏所述配體與結(jié)合域(如抗體或抗體片段)共軛或相連接而增加，所述結(jié)合域指與增加體內(nèi)半衰期的抗原或表位相結(jié)合的結(jié)合域。例如所述配體(如dAb單體)可以與抗血清白蛋白或抗新生兒Fc受體抗體或抗體片^:，如抗SA或抗新生兒Fc受體dAb、Fab、Fab，或scFv,或抗SA親和體或抗新生兒Fc受體親和體共輒或連接。用于根據(jù)本發(fā)明的配體的合適白蛋白、白蛋白片段或白蛋白變體的例子在WO2005/077042A2中有描述，其全部在此引作參考。尤其地，下述白蛋白、白蛋白片段或白蛋白變體可用于本發(fā)明.SEQIDNO:l(如在WO2005/077042A2所描述的,該序列明確地在本公開中引作參考)；包括或由WO2005/077042A2中SEQIDNO:l的氨基酸1-387組成的白蛋白片段或變體；.白蛋白，或其片段或變體，包括選自下述氨基酸序列(a)WO2005/077042A2中SEQIDNO:l的氨基酸54至61;(b)WO2005/077042A2中SEQIDNO:l的氨基酸76至89;(c)WO2005/077042A2中SEQIDNO:l的氨基酸92至100;(d)WO2005/077042A2中SEQIDNO:l的氨基酸170至176;(e)WO2005/077042A2中SEQIDNO:l的氨基酸247至252;(f)WO2005/077042A2中SEQIDNO:l的氨基酸266至277;(g)WO2005/077042A2中SEQIDNO:l的氨基酸280至288;(h))WO2005/077042A2中SEQIDNO:l的氨基酸362至368;(i)WO2005/077042A2中SEQIDNO:l的氨基酸439至447;(j)WO2005/077042A2中SEQIDNO:l的氨基酸462至475;(k))WO2005/077042A2中SEQIDNO:l的氨基酸478至486;和(1))WO2005/077042A2中SEQIDNO:l的氨基酸560至566。用于根據(jù)本發(fā)明的配體的合適白蛋白、片段或類似物的進(jìn)一步的例子在WO2005/077042A2中有描述，其全部在此引作參考。尤其地，下述白蛋白、片段或變體可用于本發(fā)明.如在WO03/076567A2中描述的人血清白蛋白，如圖3(該序列信息明確地在^/>開中引作參考)；.人血清白蛋白(HA)由585個(gè)氨基酸的單非糖基化的多肽鏈組成，分子量為66,500(參見Meloun，"a/.,i^^S5&136(1975);Behrens,Wa/.，F(xiàn)ec/.Proc.34:591(1975》Lawn,a/.,TVwc/dcJc油ie觀rc/29:6102-6114(1981);Minghetti,da/.,J.淑.Oz綴267:6747(1986));如Weitkamp,&a/.，j朋.//w附.37:219(1973)中所描述的白蛋白的多態(tài)性變體或類似物或片段；.如EP322094中描述的白蛋白片段或變體，如HA(l-373)、HA(l-388)、HA(1-389)、HA(l-369)和HA(1匿419)以及1-369和1-419之間的片段。如EP399666中描述的白蛋白片段或變體，如HA(1-177)和HA(l-200)以及HA(1-X)之間的片段，其中X是178至199的任何數(shù)。如果一種或多種半衰期延長的部分(如白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白以及其片段以及類似物)被用于本發(fā)明的配體，則可以使用任何合適的方法-使其共軛，如通過與IL-1R1結(jié)合部分(如抗IL-1R1的dAb或抗體片段)直接融合，例如通過使用編碼融合蛋白的單核苷酸構(gòu)建物，其中所述融合蛋白被編碼為帶有位于所述IL-1R1結(jié)合部分N端或C端的半衰期延長部分的單多肽鏈?；蛘呖赏ㄟ^在各部分間使用肽接頭以實(shí)現(xiàn)共軛，如WO03/076567A2或WO2004/003019中描述的肽接頭(這些接頭的公開在本公開中引作參考，提供用于本發(fā)明的例子)。典型地，增加體內(nèi)血清半衰期的多肽是體內(nèi)自然生成并抗降解或抗內(nèi)源性機(jī)制的去除的多肽，所述內(nèi)源性機(jī)制是從有機(jī)體(如人)去除不需要的物質(zhì)。例如增加體內(nèi)血清半衰期的多肽可選自細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，血液中的蛋白，血腦屏障或神經(jīng)組織中的蛋白，集中在腎、肝、肺、心臟、皮膚或骨骼的蛋白、應(yīng)激蛋白、疾病特異性蛋白，或涉及Fc轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白。增加血清體內(nèi)半衰期的合適多肽，例如轉(zhuǎn)鐵蛋白受體特異性配體-神經(jīng)藥物融合蛋白(參見美國專利No.5,977,307,其教導(dǎo)在此引作參考)，腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞受體、轉(zhuǎn)鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(如可溶轉(zhuǎn)鐵蛋白受體)、胰島素、胰島素樣生長因子1(IGF1)受體、胰島素樣生長因子2(IGF2)受體、胰島素受體、凝血因子X、込1-抗胰蛋白酶和HNFla。增加血清半衰期的合適多肽還包括a-1糖蛋白(血清類粘蛋白；AAG)、a-l抗糜蛋白酶(ACT)、a-l微球蛋白(蛋白HC;AIM)、抗凝血酶III(ATIII)、載脂蛋白A-l(ApoA-l)、載脂蛋白B(ApoB)、銅藍(lán)蛋白(Cp)、補(bǔ)體成分C3(C3)、補(bǔ)體成分C4(C4)、CI酯酶抑制劑(CIINH)、C-反應(yīng)蛋白(CRP)、鐵蛋白(FER)、血色素結(jié)合蛋白(HPX)、脂蛋白(a)(Lp(a))、甘露糖結(jié)合蛋白(MBP)、肌紅蛋白(Myo)、前白蛋白(甲狀腺素運(yùn)載蛋白；PAL)、視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)和類風(fēng)濕因子(RF)。合適的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白包括，例如膠原、層粘連蛋白、整合素和纖維連接蛋白。膠原是細(xì)胞外基質(zhì)的主要蛋白。最近已知約有15種膠原分子在身體的不同部分被發(fā)現(xiàn)，如I型膠原(占身體膠原的90%)在骨骼、皮膚、腱、韌帶、角膜、內(nèi)臟器官中被發(fā)現(xiàn)，或II型膠原在軟骨、推間盤、脊索和眼玻璃體液中被發(fā)現(xiàn)。來自血液的合適蛋白包括，例如血漿蛋白(如纖維蛋白、a-2巨球蛋白、血清白蛋白、纖維蛋白原(如纖維蛋白原A、纖維蛋白原B)、血清淀粉樣蛋白A、結(jié)合珠蛋白、抑制蛋白、泛素、子宮球蛋白和|3-2-巨球蛋白)、酶和酶抑制劑(如纖溶酶原、溶菌酶、胱抑素C、a-1-抗胰蛋白酶和胰蛋白酶抑制劑)、免疫系統(tǒng)蛋白、如免疫球蛋白(如IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、免疫球蛋白輕鏈(K/入))、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(如視黃醇結(jié)合蛋白、cc-1巨球蛋白)、防御素(如，(3-防御素1、中性粒細(xì)胞防御素1、中性粒細(xì)胞防御素2和中性粒細(xì)胞防御素3)等等。血腦屏障或神經(jīng)組織中發(fā)現(xiàn)的合適蛋白包括，例如黑素皮質(zhì)素受體、髓鞘、抗壞血酸轉(zhuǎn)運(yùn)體等等。增加血清體內(nèi)半衰期的合適多肽還包括集中在腎的蛋白(如多嚢蛋白、IV型膠原、有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體Kl、Heymann抗原)、集中在肝臟的蛋白(如乙醇脫氫酶、G250)、集中在肺的蛋白(如與IgA結(jié)合的分泌片)、集中在心臟的蛋白(如與擴(kuò)張性心肌病相關(guān)的HSP27)、集中在皮膚的蛋白(如角蛋白)、骨特異性蛋白，如形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)，其為表現(xiàn)出成骨活性的轉(zhuǎn)化生長因子(3超家族蛋白的亞群(例如BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8),腫瘤特異性蛋白(如滋養(yǎng)層抗原、herceptin受體、雌激素受體、組織蛋白酶(如組織蛋白酶B,其可在肝臟及脾臟中發(fā)現(xiàn)))。合適的疾病特異性蛋白包括，例如僅在活化的T細(xì)胞上表達(dá)的抗原，包括LAG-3(淋巴細(xì)胞活化基因)、骨保護(hù)素配體(OPGL;參見A/^we402，304-309(1999));OX40(TNF受體家族成員，在活化的T細(xì)胞上表達(dá)，并在嗜人T細(xì)胞白血病病毒I型(HTLV-I)生成細(xì)胞中被特異性上調(diào)；參見/麵歸/.165(1):263-70(2000))。合適的疾病特異性蛋白還包括，例如金屬蛋白酶(與關(guān)節(jié)炎/癌癥相關(guān))，包括果蠅CG6512、人paraplegin、人FtsH、人AFG3L2、小鼠ftsH;以及血管生長因子，包括酸性成纖維細(xì)胞生長因子(FGF-1)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(FGF-2)、血管內(nèi)皮生長因子/血管滲透因子(VEGF/VPF)、轉(zhuǎn)化生長因子-a(TGFa)、腫瘤壞死因子-a(TNF-a)、血管生成素、白細(xì)胞介素-3(IL-3)、白細(xì)胞介素-8(IL-8)、血小板源性內(nèi)皮生長因子(PD-ECGF)、胎盤生長因子(P1GF)、中期因子血小板源性生長因子-BB(PDGF),以及趨化因子。增加血清體內(nèi)半衰期的合適多肽還包括如熱休克蛋白(HSPs)的應(yīng)激蛋白。HSPs正常是在細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)的。當(dāng)其在細(xì)胞間被發(fā)現(xiàn)時(shí)則表明細(xì)胞已經(jīng)死亡，細(xì)胞內(nèi)容物溢出。這種非禾呈序性細(xì)胞死亡(壞死)作為創(chuàng)傷、疾病或損傷的結(jié)果而發(fā)生，細(xì)胞外HSPs引發(fā)免疫系統(tǒng)的反應(yīng)。與細(xì)胞外HSP結(jié)合可導(dǎo)致本發(fā)明的組合物集中在疾病部位。涉及Fc轉(zhuǎn)運(yùn)的合適蛋白包括，例如Bmmbell受體(還被稱為FcRB)。該Fc受體有兩種功能，都對傳遞有潛在用處。所述功能是(1)通過胎盤從母親向孩子轉(zhuǎn)運(yùn)IgG(2)保護(hù)IgG免受講解從而延長其血清半衰期。人們認(rèn)為受體循環(huán)利用來自核內(nèi)體的IgG。(參見HolligerefAto說0fec/7朋/15(7):632-6(1997).)。配體半衰期的藥代動(dòng)力學(xué)分析和測定方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員來熟悉的。i羊情在爿Wa/.'ChemicalStabilityofPharmaceuticals:AHandbookforPharmacists和尸"ma/,Pharmacokinetcanalysis:APracticalApproach(1996)中可找到。供參考的還有"Pharmacokinetics",MGibaldi&DPerron,MarcelDekker出版，2ndRev.exedition(1982)，其描述了藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)如tot和tp半衰期和曲線下面積(AUC)。核酸分子、載體和宿主細(xì)胞本發(fā)明還提供編碼本文所述抗IL-1R1和dAb單體的分離的和/或重組核酸分子，包括雙特異性配體(如與IL-1R1和血清白蛋白結(jié)合的配體；與IL-1R1和TNPR1結(jié)合的配體)和多特異性配體(如與IL-1R1、血清白蛋白和TNFR1結(jié)合的配體)。本發(fā)明還提供分離的和/或重組核酸分子，其編碼抗dAb單體或配體的蛋白酶(如胃蛋白酶、胰蛋白酶、彈性蛋白酶、糜蛋白酶、羧砵酶、組織蛋白酶(如組織蛋白酶G)和蛋白酶3),所述配體包括本文所述的抗蛋白酶的dAb單體。在特定實(shí)施方案中，所述分離的和/或重組核酸包括編碼域抗體(dAb)的核苦酸序列，該域抗體與IL-1R特異性結(jié)合，抑制IL-1(如IL陽la和/或IL-1卩)和IL-lra與IL-1R1的結(jié)合，還包含氨基酸序列，其至少約80%,至少約85%,至少約90%,至少約91%,至少約92%,至少約93%，至少約94°/。，至少約95%，至少約96%，至少約97%,至少約98%,或至少約99%與選自下列的氨基酸序列或dAb同源DOM4-130-30(SEQIDNO:3)、DOM4-130-46(SEQIDNO:4)、DOM4-130-51(SEQIDNO:5)、DOM4-130-53(SEQIDNO:6)、DOM4-130-54(SEQIDNO:7)、DOM4-130(SEQID<formula>formulaseeoriginaldocumentpage101</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage102</formula>IDNO:326)、DOM4-130-114(SEQIDNO:327)、DOM4-130-115(SEQIDNO:328)、DOM4-130-116(SEQIDNO:329)、DOM4-130-117(SEQIDNO:330)、DOM4-130-118(SEQIDNO:331)、DOM4-130-119(SEQIDNO:332)、DOM4-130-120(SEQIDNO:333)、DOM4-130-121(SEQIDNO:334)、DOM4-130-122(SEQIDNO:335)、DOM4-130-123(SEQIDNO:336)、DOM4-130-124(SEQIDNO:337)、DOM4-130-125(SEQIDNO:338)、DOM4-130-126(SEQIDNO:339)、DOM4-130-127(SEQIDNO:340)、DOM4-130-128(SEQIDNO:341)、DOM4-130-129(SEQIDNO:342)、DOM4-130-130(SEQIDNO:343)、DOM4-130-131(SEQIDNO:344)、DOM4-130-132(SEQIDNO:345)和DOM4-130-133(SEQIDNO:346)。在特定實(shí)施方案中，所述分離的和/或重組核酸包括編碼域抗體(dAb)單體的核苷酸序列，該域抗體單體對IL-1R1具有結(jié)合特異性，抑制IL-1與受體的結(jié)合，其中所述核苷酸序列與選自下列的核苷酸序列具有至少約80%,至少約85%，至少約90%，至少約91%,至少約92%,至少約93%,至少約94%,至少約95%,至少約96%，至少約97%,至少約98%，或至少約99%的核苷酸序列一致性DOM4-130-30(SEQIDNO:3)、DOM4-130-46(SEQIDNO:4)、DOM4-130-51(SEQIDNO:5)、DOM4-130-53(SEQIDNO:6)、DOM4-130-54(SEQIDNO:7)、DOM4-130(SEQIDNO:215)、DOM4-130-1(SEQIDNO:216)、DOM4-130-2(SEQIDNO:217)、DOM4-130-3(SEQIDNO:218)、DOM4-130-4(SEQIDN〇:219)、DOM4-130-5(SEQIDNO:220)、DOM4-130-6(SEQIDNO:221)、DOM4-130-7(SEQIDNO:222)、DOM4-130-8(SEQIDNO:223)、DOM4-130-9(SEQIDNO:224)、DOM4-130-10(SEQIDNO:225)、DOM4-130-11(SEQIDNO:226)、DOM4-130-12(SEQIDNO:227)、DOM4-130-13(SEQIDNO:228)、DOM4-130-14(SEQID<formula>formulaseeoriginaldocumentpage104</formula>93I-0n-soa,(S￡SNai富)s-ou-soa-(卜？ONai富)寸3I-0n-寸PMOa,(9￡§Nai富)3-on!soa,(S￡￡6Naib3s)zn-on-寸MXI,(KSNaia3s)s-oa-寸Fsa,(￡￡SMaia3s)on-OSI-寸pvoa,(z￡￡:ONaiaws)6II-CS-達(dá)oa,(I￡￡:ON。1as)8II-0n-soa,富6Naia3s)z,n-oa她oaaias)9II-0￡I-soa,(S3￡6Naiaas)ai富)III-ou-寸Moa,(￡r￡:ONaibas)0II-0u-2oa,(ZZSNaia3s)601-oa-ss,(IZSNaibas)80SU-loa,(§:ONGI富)§-o￡I-ioa,(6I8NCJI富)901寸0I-0n-寸PN5a-(9I￡:ONaia3s)SI-o〔l-寸Moa,(SI￡:ONai富)SI-o￡I-ss,(寸ISNQI富)toI-c5-寸sxtaia3s)OOI-oa-寸woa,(ZK:ONaia3s)66-0n-寸MOCI(01SNQ富)en旨)S6-Oel-Ioaaib3s)寸6-on-寸jA5aaiaws)06-0n-寸MXJai63s)ss-on-達(dá)oaaib3s)98-0n-!§aibws)寸s-on-loa。1a3s)s-on-soaaibs)in-ioaaia3s)寸sn-達(dá)oa,(寸oe:ON(S6SN,(06SNaiaiaiaiaiaiaiaiaiaiaias)bs)b3s)b3s)z-6-§.I6-§.s-oa.6S￡I.SMOG寸Moa寸soa寸woa寸woass￡I-tss;60SN,(sor-ON;I0§N,(6S§N,(ssr-OM,(SEQIDNO:339)、DOM4-130-127(SEQIDNO:340)、DOM4-130-128(SEQIDNO:341)、DOM4-130-129(SEQIDNO:342)、DOM4-130-130(SEQIDNO:343)、DOM4-130-131(SEQIDNO:344)、DOM4-130-132(SEQIDNO:345)和DOM4-130-133(SEQIDNO:346)。在其他實(shí)施方案中，所述分離的和/或重組核酸包括編碼抗本文所述耐蛋白酶(如胃蛋白酶、胰蛋白酶、彈性蛋白酶、糜蛋白酶、羧肽酶、組織蛋白酶(如組織蛋白酶G)和蛋白酶3)的dAb的核香酉^列。本發(fā)明還提供包括本發(fā)明的重組核酸分子的載體。在特定實(shí)施方案中，該載體是包括一種或多種可操作地連接到本發(fā)明重組核酸的表達(dá)調(diào)控元件或序列的表達(dá)載體。本發(fā)明還提供包括本發(fā)明的重組核酸分子或載體的重組宿主細(xì)胞。合適的載體(例如質(zhì)粒、噬菌體展示載體)、表達(dá)調(diào)控元件、宿主細(xì)胞和制備本發(fā)明重組宿主細(xì)胞的方法在本領(lǐng)域是公知的，本文的實(shí)施例會(huì)進(jìn)一步說明。合適的表達(dá)載體可含有若干構(gòu)件，例如復(fù)制起點(diǎn)、選擇標(biāo)記基因、一種或多種表達(dá)調(diào)控元件如轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件(如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、終止子)和/或一種或多種翻譯信號(hào)、信號(hào)序列或前導(dǎo)序列等等。表達(dá)調(diào)控元件和信號(hào)序列如果存在，則由載體或其他來源提供。例如編碼抗體鏈的克隆核酸的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯調(diào)控序列可用于直接表達(dá)。可提供啟動(dòng)子用于所需宿主細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。啟動(dòng)子可以是組成型的或誘導(dǎo)型的。例如，啟動(dòng)子可以是可操作地連接到編碼抗體、抗體鏈或其部分的核酸上，從而引導(dǎo)核酸轉(zhuǎn)錄。可獲得各種原核細(xì)胞(如大腸桿菌的lac、tac、T3、T7啟動(dòng)子)和真核細(xì)胞(如猴病毒40早期或晚期啟動(dòng)子，勞氏肉瘤病毒長末端重復(fù)序列、巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子、腺病毒晚期啟動(dòng)子)宿主的合適啟動(dòng)子。此外，表達(dá)載體通常包括篩選攜帶所述載體的宿主細(xì)胞的選擇性標(biāo)記，對于復(fù)制表達(dá)載體來說，還包括復(fù)制起點(diǎn)。編碼具有抗菌或耐藥性的產(chǎn)物的基因是常用選擇性標(biāo)記，可用于原核細(xì)胞(如內(nèi)酰胺酶基因(耐氨千西林)、四環(huán)素抗性的ref基因)和真核細(xì)胞(如新霉素(G418或遺傳霉素)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(霉酚酸)、氨爺西林或潮霉素抗性基因)。二氪葉酸還原酶標(biāo)記基因在多種宿主細(xì)胞中允許用曱氨蝶呤進(jìn)行篩選。編碼宿主基因缺陷型標(biāo)記的基因產(chǎn)物的基因(Z￡t/2、[/iA5、//ZS3)常用于酵母中的選擇性標(biāo)記。使用病毒(例如桿狀病毒)或噬菌體載體，以及能整合到宿主細(xì)胞基因組的載體如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，也在考慮范圍中。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞和原核細(xì)胞(大腸桿菌)、昆蟲細(xì)胞(果蠅SchniederS2細(xì)胞、Sf9)和酵母(甲醇畢赤酵母、巴斯德畢赤酵母、釀酒酵母)中表達(dá)的合適的表達(dá)載體為本領(lǐng)域所公知。合適的宿主細(xì)胞可以是原核的，包括細(xì)菌細(xì)胞如大腸桿菌、枯草桿菌和/或其他合適的細(xì)菌；真核細(xì)胞，如真菌或酵母細(xì)胞(如畢赤酵母、曲霉、釀酒酵母、粟酒裂殖酵母、粗糙脈胞菌)或其他更低等的真核細(xì)胞，以及更高等的真核細(xì)胞如昆蟲細(xì)胞(果蠅SchniederS2細(xì)胞、Sf9昆蟲細(xì)胞(WO94/26087(O，Connor))，哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如COS細(xì)胞，如COS-1(ATCC檢索號(hào)No.CRL-1650)和COS-7(ATCC檢索號(hào)No.CRL-1651)、CHO(如ATCC檢索號(hào)No.CRL-9096、CHODG44(Urkub,G.andChasin,LA"A/a"77(7):4216-4220(1980》)、293(ATCC檢索號(hào)No.CRL-1573)、HeLa(ATCC檢索號(hào)No.CCL畫2)、CV1(ATCC檢索號(hào)No.CCL-70)、WOP(Dailey，L"&a/"JWto/.,54:739-749(1985)、3T3、293T(Pear，W.S.，Wa/.，戶roc.iVa".Jcadt/,6".A,90:8392-8396(1993))NS0細(xì)胞、SP2/0、HuT78細(xì)胞等等,或植物細(xì)胞(如^因草)。(參見如j長口Ausubel,F.M<a/.，eds.Cwrewf/Votoco/s&Mo/ecw/arGreenePublishingAssociatesandJohnWiley&SonsInc.(1993).)在一些實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是分離的宿主細(xì)胞，不是多細(xì)胞有機(jī)體(如植物或動(dòng)物)的一部分。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是非人的宿主細(xì)胞。本發(fā)明還提供制備本發(fā)明的配體(如dAb單體、雙特異性配體、多特異性配體)的方法，包括將包括本發(fā)明的重組核酸的重組宿主細(xì)胞保持在適合重組核酸表達(dá)的條件下，從而使重組核酸得以表達(dá)并且生成配體。在一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括分離所述配體?；诿庖咔虻鞍椎呐潴w的制備根據(jù)本發(fā)明的配體(如雙特異性配體、dAb單體)可根據(jù)以往確立的用于抗體工程領(lǐng)域的技術(shù)制備，用于scFv、"噬菌體"抗體和其他基因工程抗體分子的制備。用于制備所述抗體的技術(shù)如下列綜述和其引用文獻(xiàn)中所描述的Winter&Milstein,(1991)Atowe349:293-299;Pluckthun(1992)imm柳o/og/ca/130:151-188;Wright&a/.，(1992)iev./附wimo/.12:125-168;Hoiliger,P.&Winter,G.(1993)Cr.<9p.說otec/z".4,446-449;Carter,"a/.(1995)///ewato決er4,463-470;Chester,K.A.&Hawkins,R.E.(1995)7>ewfe腸/ec/zw.13,294-300;Hoogenboom,H.R.(1997)Ato鮮所ote由o/.15，125-126;Fearon,D.(1997)淑群說她c/z朋/.15，618-619;Pliickthun,A.&Pack，P.(1997)/mm朋otec/z朋/ogy3,83-105;Carter,P.&Merchant,A.M.(1997)C群.(9—.飾tec/wo/.8，449-454;Hoiliger,P.&Winter,G.(1997)Cawcer/w/wwwo/.T/wwzmo^er.45,128-130。篩選具有所需特異性的抗體可變域所采用的合適技術(shù)使用的是本領(lǐng)域已知的庫和篩選方法。使用從人B細(xì)胞采集到的重排V基因的天然庫(Marksda/.(1991)/艦淑.,222:581;Vaughan"a/.(1996)A^wreSZofec/z.,14:309)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。合成庫((Hoogenboom&Winter(1992)JMo/.腺.，227:381;Barbasa/.(1992)尸rac.編.Jcad5W.89:4457;Nissimda/.(1994)五MBOJ，13:692;Griffiths"g/.(1994)五MBOJ，13:3245;DeKruifda/.(1995)嵐編.,248:97)通常采用PCR技術(shù)由克隆免疫球蛋白V基因制備。PCR方法中的錯(cuò)誤可導(dǎo)致高度隨機(jī)性。Vh和/或Vl可針對靶抗原或表位分別進(jìn)行篩選，在這種情況下直接選擇單域結(jié)合，或者可一起進(jìn)行篩選。庫載體系統(tǒng)本領(lǐng)域已知的各種錄選系統(tǒng)都適用于本發(fā)明。這種系統(tǒng)的例子可直接檢測噬菌體X表達(dá)系統(tǒng)的噬菌體噬菌斑或溶源性細(xì)菌菌落，此二者如前所述(Huse&a/.(1989_jS"'e"ce,246:1275;CatonandKoprowski(1990)Prac.tV加/.』c^/.5W."S.A,87;Mullinaxaa/.(1990)尸rac.A^/.Jc^f.87:8095;Persson"a/.(1991)戶rac.A^f/.Xok/.aS.A，88:2432)，并在本發(fā)明中使用。雖然此種表達(dá)系統(tǒng)可用于篩選庫的多達(dá)106種不同成員，但真得不適合篩選更大的數(shù)量(大于106種成員)。庫構(gòu)建中特別使用的是能使核酸連接到其表達(dá)的多肽上的篩選展示系統(tǒng)。正如本文所使用的，篩選展示系統(tǒng)是借由合適的展示手段，通過與通用的和/或靶配體結(jié)合從而對庫的各個(gè)成員進(jìn)行篩選的系統(tǒng)。分離所需大庫成員的篩選方法為本領(lǐng)域所知，代表的如噬菌體展示技術(shù)。這種各種肽序列展示在絲狀噬菌體表面的系統(tǒng)(Scottand*Sm池(1990)249:386),已被證實(shí)可用于建立抗體片段(以及編碼它們的核苷酸序列)庫，這種庫用于體外篩選和擴(kuò)增與靶抗原結(jié)合的特異性抗體片段(McCaffertya/.,WO92/01047)。編碼可變域的核苷酸序列被連接到編碼引導(dǎo)其進(jìn)入大腸桿菌周質(zhì)空間的前導(dǎo)信號(hào)的基因片段上，結(jié)果得到的抗體片段展示在噬菌體表面，典型的是與噬菌體外殼蛋白(如pIII或pVin)相融合?；蛘呖贵w片段展示在X噬菌體衣殼(phagebody)外表面?；谑删w的展示系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)是，由于其為生物系統(tǒng)，所以選定的庫成員可僅通過使含有選定庫成員的噬菌體在細(xì)菌細(xì)胞中生長而得以擴(kuò)增。此外由于編碼多肽庫成員的所述核苷酸序列包含在噬菌體或P藍(lán)菌粒載體中，因而序列測定、表達(dá)和后續(xù)遺傳操作相對簡單。噬菌體抗體展示文庫和X噬菌體表達(dá)文庫的構(gòu)建方法為本領(lǐng)域所公知(McCaffertyda/.(1990)胸臟,348:552;Kang"(1991)尸亂編.爿cdC/:".,88:4363;Ciacksonda/.(1991)胸歸，352:624;Lowman&(1991)歷。c/z簡勿，30:10832;Burton&a/.(1991)Ptoc.Ato/.^cac/.aS.左，88:10134;Hoogenboom"a/.(1991)NucleicAcidsRes.,19:4133;Chang&a/.(1991)J./m附ww/"147:3610;Breitling"a/.(1991)Gewe,104:147;Marks&a/.(1991)supra;Barbasd(1992)supra;HawkinsandWinter(1992)乂./wmz#7o/.，22:867;Marksa/.,1992，J!5z'o/.C/2e附.，267:16007;Lemer&a/.(1992)5We臟,258:1313在此引作參考。一種特別有利的方法是4吏用scFv噬菌體文庫(Huston"a/.,1988,Proc.Natl.Acad.SciU.S.A.,85:5879-5883;Chaudhary"(1990)Proc.Natl.Acad.SciU.S.A.,87:1066-1070;McCafferty"(1990)supra;Ciacksona/.(1991)iVa^re,352:624;Marks&(1991)乂Afo/.5z'o/.，222:581;Chiswella/.(1992)TrendsBiotech"10:80;Marksa/.(1992)/說o/.C&m.,267)。已描述了展示在噬菌體外殼蛋白的scFv文庫的各種實(shí)施方案。噬菌體展示方法的改進(jìn)已為公眾所知，例如在WO96/06213和WO92/01047(MedicalResearchCouncila/.)以及WO97/08320(Morphosys)中所述，其在此都引作參考。其他產(chǎn)生多肽文庫的系統(tǒng)涉及為體內(nèi)合成庫成員使用無細(xì)胞酶促裝置。在一種方法中，通過多輪針對耙配體的篩選和PCR擴(kuò)增的交替操作，篩選RNA分子(TuerkandGold(1990)249:505;EllingtonandSzostak(1990)iVafw"，346:818)。類似的技術(shù)可用于鑒別與預(yù)先確定的人轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的DNA序列(ThiesenandBach(1990)iVwc/dc爿c/Aies.，18:3203;BeaudryandJoyce(1992)5Wewce，257:635;WO92/05258andW092/14843)。類似地，體外翻譯可作為生成大庫的方法用于合成多肽。這些一般包括穩(wěn)定的多核糖體復(fù)合物的方法在WO88/08453、WO90/05785、WO90/07003、W〇91/02076、WO91/05058和WO92/02536中有進(jìn)一步描述。如在W095/22625和W095/11922(Affymax公司)中公開的非基于噬菌體的可供選擇的展示系統(tǒng)，使用多核糖體展示用于篩選的多肽。進(jìn)一步的技術(shù)分類涉及人工小室里庫的篩選，該人工小室允許基因與其基因產(chǎn)品相連接。例如在WO99/02671、WO00/40712和Tawfik&Griffiths(1998)歷otec/wo/16(7),652-6中描述的油包水乳劑形成的微嚢中，可篩選其中核酸編碼所需基因產(chǎn)品的篩選系統(tǒng)。編碼具有所需活性基因產(chǎn)品的遺傳因子被分隔進(jìn)入微嚢中，而后在微嚢內(nèi)轉(zhuǎn)錄和/或翻譯生成其相應(yīng)的基因產(chǎn)品(RNA或蛋白)。隨后對生成具有所需活性基因產(chǎn)品的遺傳因子進(jìn)行分類。該方法通過各種方法檢測所需活性以篩選感興趣的基因產(chǎn)品。文庫構(gòu)建用于篩選的文庫可使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)構(gòu)建，例如如上所述或可商業(yè)渠道購買。用于本發(fā)明的文庫在如WO99/20749中有描述。一旦選定載體系統(tǒng)，并且一種或多種編碼感興趣的多肽的核酸序列被克隆到所述文庫載體，則可通過表達(dá)前的突變在被克隆的分子內(nèi)產(chǎn)生多樣性；或者如上所述，在突變和額外的幾輪篩選前，可表達(dá)并篩選被編碼的蛋白。通過標(biāo)準(zhǔn)分子方法對編碼結(jié)構(gòu)經(jīng)優(yōu)化的多肽的核酸序列進(jìn)行突變。特別使用的是聚合酶鏈反應(yīng)，或PCR(MullisandFaloona(1987)MeAoA五"2^wo/.，155:335,本文在此引作參考)。PCR采用由熱穩(wěn)定的，依賴DNA的DNA聚合酶催化若干次循環(huán)的DNA復(fù)制，擴(kuò)增感興趣的靶序列，這在本領(lǐng)域是公知的。各種抗體庫的構(gòu)建已在Winter"a/.(1994)J朋.iev./附附柳o/ogy72,433-55及其中引用的文獻(xiàn)里進(jìn)行了討論。使用模板DNA(至少lfg,更多地使用l-1000ng)以及至少25pmol的寡核苷酸引物進(jìn)行PCR;由于每個(gè)序列只需庫分子的一小部分即可表示，并且在之后的擴(kuò)增循環(huán)中數(shù)量受到限制，所以當(dāng)引物庫大部分是異質(zhì)的時(shí)，使用更大量的引物是有利的。典型的反應(yīng)混合物包括2plDNA、25pmol寡聚核苷酸引物、2.5(il10XPCR緩沖液1(Perkin-Elmer,FosterCity,CA)、0.4pl1.25pMdNTP、0.15卩l(xiāng)(或2.5單位)TaqDNA聚合酶(PerkinElmer，F(xiàn)osterCity,CA),去離子水加至總體積25(il。以礦物油覆蓋，使用程序熱循環(huán)儀進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR循環(huán)每一步的長度和溫度以及循環(huán)次數(shù)，依據(jù)效果的嚴(yán)格要求進(jìn)行調(diào)整。退火溫度和時(shí)間都是由引物預(yù)期與模板結(jié)合的效率以及可接受的錯(cuò)配程度來決定的；顯然地，當(dāng)核酸分子同時(shí)被擴(kuò)增和突變時(shí)，至少在第一輪合成中的錯(cuò)配是需要的。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都具備很好的對嚴(yán)格的引物退火條件進(jìn)行優(yōu)化的能力。采用的退火溫度為30。C至72。C。模板分子最初變性正常發(fā)生在92°C至99。C之間，4分鐘，隨后是20-40個(gè)循環(huán)，由變性(94至99°C,15秒至1分鐘)，退火(溫度如上述討論確定；1至2分鐘)，和延伸(72°C，1-5分鐘，取決于所述擴(kuò)增產(chǎn)物的長度)組成。最后的延伸一般是72°C,4分鐘，可能后續(xù)還有4°C下不確定(0至24小時(shí))的步驟。單可變域結(jié)合本發(fā)明中有用的免疫球蛋白可變域一旦選定，即可由本領(lǐng)域所知的各種方法結(jié)合，包括共價(jià)和非共價(jià)的方法。優(yōu)選的方法包括使用多肽接頭，如所述的例如與scFv分子連接(Bird"a/.,(1988)Science242:423-426)。有關(guān)合適4妄頭的討i侖在BirdSc/朋ce242,423-426;Hudsone/a/,Jo腦a//mm畫/231(1999)177-189;Hudson"a/，PraciV加Xcad5WUSA85,5879-5883中。接頭優(yōu)選柔性的，允許所述的兩個(gè)單域相互作用。一種接頭的例子是(Gly4Ser)n接頭，其中n=l至8,例如1、2、3、4、5、6、7或8。還可采用雙價(jià)抗體中使用的柔性較低的接頭(Holliger&a/.，(1993)戶roc#WJcaJ(USA)90:6444-6448)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所采用的接頭不是免疫球蛋白鉸鏈區(qū)?？勺冇蚩墒褂梅墙宇^的方法結(jié)合。例如通過自然生成或人為設(shè)計(jì)的半胱氨酸殘基得到的二疏橋可用于穩(wěn)定vH-VH、Vl-Vl或Vh-Vl二聚體(Reiterefa/.,(1994)7:697-704)，或通過重塑可變域間的界面以改善適配性從而改善相互作用的穩(wěn)定性(Ridgewaya/.,(1996)7:617-621;Zhu&a/.,(1997)7V她/"^SWewce6:781-788)。可采用其他連接或穩(wěn)定免疫球蛋白可變域的技術(shù)，特別是抗體Vh域，是適宜的。配體的表征配體(例如dAb單體，雙特異性配體)結(jié)合到其特異性抗原或表位，可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法包括ELISA，進(jìn)行檢測。在本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中，使用單克隆噬菌體ELISA對結(jié)合進(jìn)行抬r測。噬菌體ELISA可依據(jù)任何合適的方法進(jìn)行典型的方法如下所述。每輪篩選制得的噬菌體族群可通過ELISA篩選其與選定抗原或表位的結(jié)合，從而鑒定多克隆噬菌體抗體。來自這些族群的單個(gè)被感染的細(xì)菌克隆可隨后通過ELISA篩選以鑒定"單克隆"噬菌體抗體。篩選與抗原或表位結(jié)合的可溶抗體片段也是理想的，這也可以通過ELISA,使用例如針對C端或N端標(biāo)簽的試劑進(jìn)行(參見如Winter&a/.(1994)爿朋.Aev./ww朋o/ogy",433-55及其中引用的文獻(xiàn))。選定的噬菌體單克隆抗體的多樣化還可以通過PCR產(chǎn)物的凝膠電;水(Marks"a/.1991，sw/ra;Nissimda/.1994sw;ra)、才笨4十(Tomlinson&a/.,1992)J7kfo/.所o/,"7，776)或通過載體DNA的序列分析來評(píng)定。配體的結(jié)構(gòu)如果所述免疫球蛋白可變域是從V基因庫篩選的，例如使用本文所述的噬菌體展示技術(shù)，則這些可變域包含通用框架區(qū)(universalframeworkregion),這才羊就可以通過本文所述的特異性通用型配體對其進(jìn)行識(shí)別。通用框架區(qū)、通用性配體等等的用途在WO99/20749有描述。如果使用V基因庫，則多肽序列的變化優(yōu)選位于可變域的環(huán)結(jié)構(gòu)。所述可變域多肽序列可以或者用DNA改組技術(shù)或者突變來改變，以增強(qiáng)各可變域與其互補(bǔ)對間的相互作用。DNA改組技術(shù)是本領(lǐng)域所知的，并且在例如本文所引用的Stemmer,1994，Atowe370:389-391以及美國專利6,297,053中有教導(dǎo)。突變的其他方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。一般來說，篩選、制備以及形成配體所賓的核酸分子和載體構(gòu)建4勿可以用^口Sambrooka/.(1989」Mo/ecw/arC7om'"g:^L360rato7M"朋認(rèn)/,ColdSpringHarbor,USA.之類的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)手冊中所述的方法來構(gòu)建和操作。典型地用于本發(fā)明的核酸的操作是在重組載體上進(jìn)行的。本文所用的載體指用于將外源DNA引入細(xì)胞進(jìn)行其表達(dá)或復(fù)制的非連續(xù)的元件。這樣的載體的篩選、構(gòu)建，及隨后的使用方法已為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知。大量載體可以公開獲得，包括細(xì)菌質(zhì)粒，噬菌體，人工染色體以及附著體載體。此類載體可用于筒單克隆及突變；或者還可以用基因表達(dá)型載體?？珊Y選根據(jù)本發(fā)明所使用的載體，使其與編碼所希望大小的多肽序列多肽相適應(yīng)，典型的長度是0.25kb至40kb或更長。體外克隆操作后，用載體轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞。每個(gè)載體含有多種功能構(gòu)件，一般包括克隆(或多聚接頭)位點(diǎn)、復(fù)制起點(diǎn)，以及至少一個(gè)選擇標(biāo)記基因。如果給定的載體為表達(dá)載體，其額外有一個(gè)或多個(gè)下述構(gòu)件增強(qiáng)子元件、啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄終止及信號(hào)序列，各自定位于克隆位點(diǎn)的毗連區(qū)域，從而可操作地連接到編碼根據(jù)本發(fā)明的配體基因上。通常情況下，克隆與表達(dá)載體都含有使所述載體在一個(gè)或多個(gè)經(jīng)篩選的宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的核酸序列。典型地在克隆載體中，該序列使載體不依賴于宿主染色體DNA而自主復(fù)制，并含有復(fù)制起點(diǎn)或自主復(fù)制序列。各種細(xì)菌，真菌以及病毒的此類序列已眾所周知。所述質(zhì)粒pBR322的復(fù)制起點(diǎn)適合大多數(shù)革蘭氏-陰性菌，該2微米的質(zhì)粒起點(diǎn)適用于酵母，多種病毒起點(diǎn)(如SV40,腺病毒)對哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的克隆載體是有用的?？偟膩碚f，哺乳動(dòng)物表達(dá)載體不需要復(fù)制起點(diǎn)，除非這些用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的復(fù)制起點(diǎn)能復(fù)制高水平的DNA,比如COS細(xì)胞。有利的是，克隆或表達(dá)載體可包含篩選基因，也稱為選擇性標(biāo)記物。該基因編碼轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)介質(zhì)中存活或生長所必需的蛋白。沒有被含有篩選基因的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞將因此無法在培養(yǎng)介質(zhì)中存活。典型的篩選基因編碼賦予宿主細(xì)胞抗抗生素和其它毒素如氨千西林、新霉素、甲氨蝶呤或四環(huán)素性質(zhì)的蛋白，生長介質(zhì)中不補(bǔ)充缺少的營養(yǎng)或提供關(guān)鍵的營養(yǎng)成分。因?yàn)榫幋a根據(jù)本發(fā)明的配體的載體在大腸桿菌中復(fù)制最便利，所以大腸桿菌-選擇性標(biāo)記如賦予抗抗生素氨千西林性質(zhì)的P-內(nèi)酰胺酶基因，是有用的。這些可從大腸桿菌質(zhì)粒獲得，如pBR322或如pUC18或pUC19的pUC質(zhì)粒。表達(dá)載體通常含有啟動(dòng)子，其被宿主機(jī)體識(shí)別并可操作地連接到感興趣的編碼序列上。這樣的啟動(dòng)子可以是是誘導(dǎo)型的或組成型的。術(shù)語"可操作地連接"指并列連接，其中所述各構(gòu)件間的關(guān)系使其以預(yù)期方式發(fā)揮功能。調(diào)控序列"可操作地連接"到編碼序列，該連接方式是指在適宜于調(diào)控序列的條件下實(shí)現(xiàn)所述編碼序列的表達(dá)。適用于原核宿主的啟動(dòng)子包括如P-內(nèi)酰胺酶和乳糖啟動(dòng)子系統(tǒng)、堿性磷酸酯酶、色氨酸(tip)啟動(dòng)子系統(tǒng)，以及如tac啟動(dòng)子的雜合啟動(dòng)子。在細(xì)菌系統(tǒng)中應(yīng)用的啟動(dòng)子通常還含有可操作地連接到所述編碼序列的Shine-Delgarno序列。優(yōu)選的載體為表達(dá)載體，其使得對應(yīng)于多肽庫成員的核酸序列的表達(dá)成為可能。因此用第一和/或第二抗原或表位的篩選可通過分離增殖，表達(dá)多肽庫成員的單克隆的表達(dá)，或利用任何篩選展示系統(tǒng)進(jìn)行。如前所述，優(yōu)選的篩選展示系統(tǒng)為噬菌體展示系統(tǒng)。因此可利用噬菌體或噬菌粒載體，如pITl或pIT2。本發(fā)明中有用的前導(dǎo)序列包括pe舊、stll、ompA、phoA、bla和pelA.。一個(gè)例子是噬菌粒載體，其具有大腸桿菌.復(fù)制起點(diǎn)(用于雙鏈復(fù)制)，還有噬菌體復(fù)制起點(diǎn)(用于單鏈DNA的生成)。此類載體的操作及表達(dá)在本領(lǐng)域眾所周知(HoogenboomandWinter(1992)supra;Nissim"a/.(1994)supra)。簡而言之，所述載體含有P-內(nèi)酰胺酶基因，使噬菌粒具有選擇性，以及表達(dá)盒上游的lac啟動(dòng)子，該表達(dá)盒(N.綿至C端)由pelB前導(dǎo)序列(其引導(dǎo)表達(dá)的多肽進(jìn)入周質(zhì)空間)，多克隆位點(diǎn)(用于克隆所述文庫成員的核酸序列)，任選的一個(gè)或多個(gè)肽標(biāo)簽(4僉測用)，任選的一個(gè)或多個(gè)TAG終止密碼子以及噬菌體蛋白pill組成。因此，使用多種抑制型和非抑制型大腸桿菌林，加入葡萄糖，異丙基-P-D-硫代半乳糖苷(IPTG)或輔助噬菌體如VCSM13,所述載體能象質(zhì)粒那樣無表達(dá)地復(fù)制，僅產(chǎn)生大量的多肽庫成員或產(chǎn)生噬菌體，其中有些含有至少一個(gè)拷貝的融合在其表面的多肽-pIII。采用常規(guī)連接技術(shù)構(gòu)建編碼根據(jù)本發(fā)明配體的載體。被分離的載體或DNA片段被切割、剪裁，以所需形式再連接，從而生成所需載體。如果需要，可用已知的方法進(jìn)行分析，以確認(rèn)正確的序列出現(xiàn)在所構(gòu)建的載體中。構(gòu)建表達(dá)載體，體外制備轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，將DNA導(dǎo)入到宿主細(xì)胞，進(jìn)行分析以評(píng)價(jià)表達(dá)和功能的合適方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。用如Southern或Northern分析法，Western印跡，DNA、RNA或蛋白的斑點(diǎn)雜交技術(shù)，原位雜交技術(shù)，免疫細(xì)胞化學(xué)，或核酸或蛋白分子的序列分析的常規(guī)方法來檢測樣品中基因序列的出現(xiàn)，或?qū)ζ鋽U(kuò)增和/或表達(dá)進(jìn)行定量分析。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易想象，如果需要?jiǎng)t可如何調(diào)整這些方法。骨架如上所述，骨架起源可基于免疫球蛋白分子或非免疫球蛋白。優(yōu)選的免疫球蛋白骨架，如本文所定義，包括任意一種或多種選自下述的骨架:免疫球蛋白分子，其包含至少(i)抗體的CL區(qū)(k或X亞類)；或(ii)抗體重鏈的CH1區(qū)；包含抗體重鏈CH1與CH2區(qū)的免疫球蛋白分子；包含抗體重鏈CH1、CH2和CH3區(qū)的免疫球蛋白分子；或任意與抗體CL(k或X亞類)區(qū)相關(guān)聯(lián)的亞類(ii)。域的這樣的組合可如模擬天然抗體，比如IgG或IgM，或其片段，如Fv、scFv、Fab或F(ab，)2分子。本領(lǐng)域所屬的技術(shù)人員應(yīng)知道，該列舉并非窮舉。蛋白支架每個(gè)表位結(jié)合域都含有蛋白支架以及一個(gè)或多個(gè)CDRs,其涉及該域與一個(gè)或多個(gè)表位間的特異性相互作用。有利的是根據(jù)本發(fā)明的表位結(jié)合域含有三個(gè)CDRs。合適的蛋白支架包括任意選自下列的蛋白支架基于免疫球蛋白域的，基于纖連蛋白的，基于親和體的，基于CTLA4的，基于如GroEL的分子伴侶的，基于脂籠蛋白，以及基于細(xì)菌Fc受體SpA與SpD的蛋白支架。本領(lǐng)域所述的技術(shù)人員應(yīng)該明白，該列舉并非窮舉。構(gòu)建配體中使用的支架主鏈構(gòu)象的選擇免疫球蛋白超家族成員的多肽鏈都具有相似的折疊。例如盡管就其一級(jí)序列而言抗體是高度多樣的，序列比較和晶體結(jié)構(gòu)已揭示，與預(yù)期相反，抗體的6個(gè)抗原結(jié)合環(huán)區(qū)中的5個(gè)(Hl、H2、Ll、L2、L3)采取了有限數(shù)量的主鏈構(gòu)象，或典型結(jié)構(gòu)(ChothiaandLesk(1987)J.Mo/.說o/"196:901;Chothia"a/.(1989)iVaft^e,342:877)。因此對環(huán)長度與關(guān)鍵殘基的分析已能預(yù)測在大部分人抗體中發(fā)現(xiàn)的Hl、H2、Ll、L2與L3的主鏈構(gòu)象(Chothia&a/.(1992)乂Mo/.5z.o/"227:799;TomlinsonWa/.(1995)￡MSO14:4628;Williams"a/.(1996)/Afo/.S/o/.,264:220)。盡管就序列，長度和結(jié)構(gòu)而言，H3區(qū)更多樣化(因?yàn)镈片段的使用)，但對于短的環(huán)，它還是形成了有限數(shù)量的主鏈構(gòu)象，這取決于所述環(huán)和抗體框架中關(guān)鍵位置特定殘基的長度、出現(xiàn)或殘基類型(Martin"a/.(1996)JM/.所o/"263:800;Shirai"(1996)399:1)?？梢栽O(shè)計(jì)配體和/或域的庫，其中某些環(huán)的長度和關(guān)鍵殘基已經(jīng)過篩選，以確保成員的主鏈構(gòu)象是已知的。有利的是，如前所述這些是自然界中發(fā)現(xiàn)的免疫球蛋白超家族分子的真正構(gòu)象，以使其處于非功能狀態(tài)的機(jī)會(huì)最小化。種系V基因片段用作構(gòu)建抗體或T-細(xì)胞受體庫的合適的基本框架；其它序列也有用處。低頻率的變化可能會(huì)發(fā)生，這樣少量功能性成員可能具有不影響其功能的改變了的主鏈構(gòu)象。經(jīng)典結(jié)構(gòu)理論也可用于估計(jì)配體編碼的不同主鏈構(gòu)象的數(shù)量，以預(yù)測基于配體序列的主鏈構(gòu)象，并選擇不影響典型結(jié)構(gòu)的多樣化的殘基。眾所周知，在人的Vk區(qū)中，所述L1環(huán)可采用四個(gè)典型結(jié)構(gòu)之一，所述L2環(huán)具有單一的典型結(jié)構(gòu)，對L3環(huán)而言，有90%人的Vk區(qū)采用了四個(gè)或五個(gè)典型結(jié)構(gòu)之一(Tomlinson"a/.(1995)supra);因此，僅在Vk區(qū)，不同的典型結(jié)構(gòu)能結(jié)合產(chǎn)生一系列不同的主鏈構(gòu)象。鑒于V人區(qū)編碼不同系列的Ll，L2和L3環(huán)典型結(jié)構(gòu)，Vk與V入?yún)^(qū)能與編碼Hl和H2環(huán)幾種典型結(jié)構(gòu)的任何Vh區(qū)配對，觀察到的這五個(gè)環(huán)的典型結(jié)構(gòu)組合的數(shù)量是非常巨大的。這意味著，主鏈構(gòu)象中多樣性的產(chǎn)生對廣泛的結(jié)合特異性的產(chǎn)生可能是必須的。然而，通過構(gòu)建基于單一已知主鏈構(gòu)象的抗體庫已發(fā)現(xiàn)，與預(yù)期相反，對于產(chǎn)生實(shí)質(zhì)上以所有抗原為靶向的足夠多的多樣性而言，主鏈構(gòu)象的多樣性并不是必需的。更讓人驚訝的是，所述的單一主鏈構(gòu)象不必是共有結(jié)構(gòu)--單一的自然出現(xiàn)的構(gòu)象可用作為整個(gè)庫的基礎(chǔ)。因此，在優(yōu)選方面，本發(fā)明的所述雙特異性配體具有單一已知的主鏈構(gòu)象。選定的所述單一主鏈構(gòu)象優(yōu)選所討論的所述免疫球蛋白超家族類型分子中的普通構(gòu)象。觀測到的大量自然產(chǎn)生的分子所采取的構(gòu)象是普通構(gòu)象。因此，在本發(fā)明優(yōu)選的方面中，對于免疫球蛋白的每個(gè)結(jié)合環(huán)區(qū)而言，所述自然產(chǎn)生的不同主鏈構(gòu)象可分別考慮，然后選定具有不同環(huán)主鏈構(gòu)象的所需組合的自然產(chǎn)生的可變域。如果沒有自然產(chǎn)生的可變域，則可選擇最接近的等價(jià)物。優(yōu)選的是，不同環(huán)主鏈構(gòu)象的所需組合是通過選擇編碼所需主鏈構(gòu)象的種系基因片段創(chuàng)建的。更優(yōu)選的是，所述選定的種系基因片段在自然界上被頻繁表達(dá)。最優(yōu)選的是，它們是所有天然種系基因片段的被最頻繁表達(dá)的那些。在設(shè)計(jì)的配體(如dAbs)或其庫中，對于所述六個(gè)抗原結(jié)合環(huán)區(qū)的每個(gè)而言，可分別考慮不同主鏈構(gòu)象的發(fā)生率。對Hl、H2、Ll、L2和L3而言，選擇20%到40%的自然產(chǎn)生分子的抗原結(jié)合環(huán)區(qū)所采用的特定構(gòu)象。典型地，選定構(gòu)象的觀測到的發(fā)生率大于35%(即35%到100°/。)，理想的是50。/。以上或甚至65%以上。因?yàn)榻^大部分的H3環(huán)區(qū)不具有典型結(jié)構(gòu)，所以優(yōu)選顯示出典型結(jié)構(gòu)的那些環(huán)中常見的主鏈構(gòu)象。所以對于各個(gè)所述的環(huán)而言，選擇天然庫中最常觀測到的構(gòu)象。在人的抗體中，每個(gè)環(huán)最常見的典型結(jié)構(gòu)(CS)如下H1-CS1(表達(dá)庫的79%),H2匿CS3(46%)，Vk的Li-CS2(39%),L2-CS1(100%),Vk的L3-CS1(36%)(計(jì)算時(shí)假定k:X比為70:30,Hood"a/.(1967)CoWSpn'wgHarkrS拜.g麵A腸/"48:133)。對于有典型結(jié)構(gòu)的H3環(huán)，從殘基94至101有一鹽橋的7個(gè)殘基的CDR3長度(Kabat"a/.(1991)&《MewcMprafe/rao/z'mwwwo/og/ca/z'wfemst,美國衛(wèi)生福利部)看來是最常見的。EMBL數(shù)據(jù)庫中有至少16個(gè)人抗體序列有所需H3長度和關(guān)鍵殘基，以形成該構(gòu)象，蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中有至少兩種晶體結(jié)構(gòu)可用作抗體模建的基礎(chǔ)(2cgr與ltet)。具有這種經(jīng)典結(jié)構(gòu)組合的最頻繁表達(dá)的種系基因片段為VH片段3-23(DP-47)、Jh片段JH4b、Vk片段02/012(DPK9)和Jk片段Jk1。Vh片段DP45與DP38也是合適的。這些片段因此可在組合中使用，作為構(gòu)建具有所需單一主鏈構(gòu)象的庫的基礎(chǔ)?；蛘邔τ诿總€(gè)所述結(jié)合環(huán)而言，不是以自然產(chǎn)生的不同主鏈構(gòu)象為基礎(chǔ)分別選擇所述單一主鏈構(gòu)象，而是以自然產(chǎn)生的主鏈構(gòu)象的組合作為選擇單一主鏈構(gòu)象的基礎(chǔ)。就抗體而言，例如可以確定任意兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或全部六個(gè)抗原結(jié)合環(huán)的天然產(chǎn)生的典型結(jié)構(gòu)組合。此處優(yōu)選的是所述選定的構(gòu)象在'自然產(chǎn)生的抗體中是常見的，最優(yōu)選的是所述選定的構(gòu)象是天然庫中最頻繁觀察到的。因此，在人抗體中，例如當(dāng)考慮到五個(gè)抗體結(jié)合環(huán)，Hl、H2、Ll、L2與L3的自然結(jié)合時(shí)，可確定典型結(jié)構(gòu)的最經(jīng)常的組合，然后與H3環(huán)的最常見構(gòu)象相組合，作為選擇所述單一主鏈構(gòu)象的基石出。典型序列的多樣化已選定幾種已知的主鏈構(gòu)象，或優(yōu)選單一已知的主鏈構(gòu)象，為了生成具有結(jié)構(gòu)和/或功能多樣性的庫，本發(fā)明的配體(如dAbs)或庫可通過變化所述分子的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行構(gòu)建。這意味著生成了具有足夠的結(jié)構(gòu)和/或功能多樣性的變體，這樣所述變體能提供一系列活性。所述的所需多樣性典型地通過在一個(gè)或多個(gè)位置改變所選定的分子而產(chǎn)生。將要變化的位置可以以隨機(jī)或優(yōu)選的方式選擇。所迷改變可隨后或者通過隨機(jī)化過程，其中所述特定位置的氨基酸被任意氨基酸或其天然的或合成的類似物取代，從而產(chǎn)生非常大量的突變，或者被限定的氨基酸子集中的一個(gè)或多個(gè)取代，從而產(chǎn)生數(shù)量上更為有限的變體。已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了多種方法引入此種多樣性。易錯(cuò)PCR法(Hawkins"a/.(1992)JAfo/.Sz'o/.,226:889),化學(xué)誘變(Denga/.(1994)J!脂.C7z亂，269:9533)或細(xì)菌突變林(Lowa/.(1996)/M。/.祝o/"260:359)可用于將隨機(jī)突變引入編碼所述分子的基因中。選定位置突變的方法已經(jīng)為本領(lǐng)域所公知，包括錯(cuò)配寡核苷酸或簡并寡核苷酸的應(yīng)用，使用或是不使用PCR。例如通過針對所述抗原環(huán)進(jìn)行靶突變已建立了幾個(gè)合成的抗體庫。人破傷風(fēng)類毒素-結(jié)合Fab的H3區(qū)已經(jīng)隨機(jī)突變，形成一系列新結(jié)合特異性(Barbas""/.(1992)/Voc.Ato/./IcW.Sd.89:4457)。隨機(jī)或半隨機(jī)突變H3與L3區(qū)已連接到種系V基因片段以制備具有未突變框架區(qū)的大庫(Hoogenboom&Winter(1992)JAfo/.5/o/.，227:381;Barbas"a/.(1992)iVoc.A^/.爿c^/.5W.89:4457;Nissim"a/.(1994)一13:692;Griffiths"a/.(1994)層5013:3245;DeKruif"a/.(1995)/Mo/.5/o/.，248:97)。此種多樣化已擴(kuò)展到包括一些或所有的其它抗原結(jié)合環(huán)(Crameria/.(1996)淑,她d'2:100;Riechmann"a/.(1995)腸/rec/mo/ogy,13:475;Morphosys，W097細(xì)20,supra)。因?yàn)榄h(huán)隨機(jī)突變可能僅對H3就創(chuàng)建大約超過1015個(gè)結(jié)構(gòu)，對其它五個(gè)環(huán)創(chuàng)建類似的大量突變體，所以用當(dāng)前的轉(zhuǎn)化技術(shù)或甚至用無細(xì)胞系統(tǒng)以產(chǎn)生代表所有可能組合的庫是不可行的。例如在迄今為止構(gòu)建的最大的庫之一中，生成了6xl0"個(gè)不同的抗體，對該設(shè)計(jì)得到的庫而言，這只是可能的多樣性的一部分(Griffiths"a/.(1994)supra)。優(yōu)選地，僅直接涉及創(chuàng)建或修飾所述分子的所需功能的所述殘基被多樣化。對許多分子而言，該功能是與靶結(jié)合，因此多樣性應(yīng)集中于該靶結(jié)合位點(diǎn)，同時(shí)避免改變對所述分子整體裝配或維持選定的主鏈構(gòu)象關(guān)鍵的殘基。用于抗體域時(shí)典型序列的多樣化就基于抗體的配體(如dAbs)而言，所述靶標(biāo)結(jié)合位點(diǎn)最經(jīng)常是抗原結(jié)合位點(diǎn)。因此優(yōu)選只有抗原結(jié)合位點(diǎn)中的那些殘基發(fā)生變化。這些殘基在所述人抗體庫中是非常多樣化的，并且已知與高溶解性的抗體/抗原復(fù)合體相接觸。例如在L2中，已知位置50和53在自然產(chǎn)生的抗體中是多樣化的，觀測到其與抗原相接觸。相比之下，常規(guī)方法已使KabatWa/.定義的相應(yīng)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR1)中所有殘基多樣化，與所述的兩個(gè)相比，根據(jù)本發(fā)明使用的所述庫中大約7個(gè)殘基多樣化。這表明就為產(chǎn)生一系列抗原結(jié)合特異性所需的功能多樣性而言，有顯著的進(jìn)步。自然界中抗體多樣性是兩個(gè)過程的結(jié)果種系V,D,J基因片段的體細(xì)胞重組，以創(chuàng)建初始的原始文庫(所謂的種系與連接多樣性)，以及所迷得到的重排.V基因的體細(xì)胞超變異。人抗體序列的分析已表明，原始文庫的多樣性集中于抗原結(jié)合位點(diǎn)的中心，而體細(xì)胞的超變異將多樣性擴(kuò)展至原代庫中高度保守的抗原結(jié)合位點(diǎn)的外圍(參見Tomlinson"a/.(1996)/嵐編.,256:813)。該互補(bǔ)性或許已經(jīng)發(fā)展成有效的序列空間搜索策略，雖然顯然為抗體獨(dú)有，1"旦其可容易地應(yīng)用于其它多肽庫。所述經(jīng)變化的殘基是那些形成與耙的結(jié)合位點(diǎn)的子集。如果需要，靶結(jié)合位點(diǎn)中殘基的不同(包括重疊部分)子集是在篩選過程的不同階段被多樣化的。關(guān)于抗體庫，可以建立最初的"初始"庫，其中抗原結(jié)合位點(diǎn)中的一些而非全部的殘基被多樣化。此處上下文使用的術(shù)語"初始，，指沒有預(yù)先確定的靶的抗體分子。這些分子類似于沒有經(jīng)歷免疫多樣化的個(gè)體的免疫球蛋白基因編碼的分子，就如同胎兒或新生個(gè)體一樣，其體內(nèi)免疫系統(tǒng)尚未被各種各樣的抗原刺激物刺激過。該庫可隨后針對一系列抗原或表位進(jìn)行篩選。如果需要，則所述初始庫中經(jīng)多樣化的區(qū)域的外圍可引入進(jìn)一步的多樣性?？蓪υ摮墒斓膸旌Y選修飾過的功能，特異性或親和力。用于配體構(gòu)建的結(jié)合域的初始庫，其中所述抗原結(jié)合位點(diǎn)中的一些或所有殘基發(fā)生變化，該初始庫為本領(lǐng)域所知。(參見WO2004/058821、WO2004/003019和WO03/002609)。該"原始"文庫^t擬天然的原始庫，具有的多樣性局限于抗原結(jié)合位點(diǎn)中心的殘基，所述抗原結(jié)合位點(diǎn)在所述種系V基因片段中多樣化(種系多樣性)，或在所述重組過程中被多樣化(連接多樣性)。被多樣化的那些殘基包括但不限于H50、H52、H52a、H53、H55、H56、H58、H95、H96、H97、H98、L50、L53、L91、L92、L93、E94和L96。在所述"體細(xì)胞"庫中，多樣性局限于重組過程中被多樣化的(連接多樣性)或高度體細(xì)胞突變的殘基。那些被多樣化的殘基包括但不限于H31、H33、H35、H95、H96、H97、.H98、L30、L31、L32、L34和L96。以上所列的適于在這些庫中多樣化的所有殘基已知與一個(gè)或多個(gè)抗體抗原復(fù)合物相接觸。因?yàn)樵谶@兩個(gè)庫中，并非所有的抗原結(jié)合位點(diǎn)中的殘基被改變，所以如果需要，可在篩選過程中通過改變其余的殘基得到額外的多樣性。任何這些殘基的任何子集(或包括所述抗原結(jié)合位點(diǎn)的額外的殘基)可用于所述抗原結(jié)合位點(diǎn)的初始的和/或隨后的多樣化，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該是顯而易見的。在本發(fā)明所用的庫的構(gòu)建中，選定位置的多樣化典型地在核酸水平實(shí)現(xiàn)，通過改變詳細(xì)說明多肽序列的編碼序列，從而在該位置包含大量的可能氨基酸(全部20個(gè)或其子集)。用IUPAC命名法，用途最多的密碼子為NNK，其編碼所有的氨基酸殘基以及TAG終止密碼子。該NNK密碼子優(yōu)選地為引入所需多樣性而使用。能獲得同樣目的的其它密碼子也是有用的，包括所述NNN密碼子，其導(dǎo)致額外的終止密碼子TGA與TAA的產(chǎn)生。人抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)中側(cè)鏈多樣性的特點(diǎn)，是偏好某些氨基酸殘基的明顯傾向性。如果對在各個(gè)所述VH、Vk和V入?yún)^(qū)中十個(gè)最多樣化位置的氨基酸組成進(jìn)行總計(jì)，則超過76%的側(cè)鏈多樣性來自僅7個(gè)不同的氨基酸殘基，這些是絲氨酸(24%),酪氨酸(14%),天冬酰胺(11%),甘氨酸(9%),丙氨酸(7%)，天冬氨酸(6%)和蘇氨酸(6%)。對親水殘基和可提供主鏈柔性的小體積殘基的這種偏好可能反應(yīng)了傾向于和廣泛的抗原或表位結(jié)合的表面的演變，并可有助于解釋在初始庫中抗體的所需多樣性。因?yàn)閮?yōu)選的是模擬氨基酸的這種分布，所以待改變位置的氨基酸分布優(yōu)選模擬在抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)中看到的氨基酸。氨基酸取代中的此種偏好使得針對一系列靶抗原的對某些多肽的篩選更加容易應(yīng)用到任何多肽庫。形成待改變位置的氨基酸分布傾向性有多種方法(包括使用三核苷酸突變，參見WO97/08320),由于易于合成，所以優(yōu)選的方法是使用常規(guī)的簡并密碼子。通過將由簡并密碼子(每個(gè)位置單重、雙重、三重和四重簡并的比率相同)的所有組合編碼的氨基酸特征與所用的天然氨基酸比較，可能計(jì)算出最具代表性的密碼子。密碼子(AGT)(AGC)T、(AGT)(AGC)C與(AGT)(AGC)(CT)——分別用IUPAC命名法即DVT、DVC與DVY——是最接近于所需氨基酸特征的密碼子它們編碼22%絲氨酸與11%的酪氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、蘇氨酸和半胱氨酸。因此優(yōu)選地，用DVT、DVC或DVY密碼子之一在每個(gè)多樣化的位置構(gòu)建庫。治療和it斷組合物及用途本發(fā)明提供包括本發(fā)明的配體(如雙特異性配體、多特異性配體、dAb單體)和藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或輔料的組合物，本發(fā)明的方法的配體(如雙特異性配體、多特異性配體、dAb單體)可用于體內(nèi)治療或預(yù)防應(yīng)用、體內(nèi)診斷應(yīng)用等等。本發(fā)明的配體(如多特異性配體、雙特異性配體、dAb單體)的治療和預(yù)防用途包括將根據(jù)本發(fā)明的配體施用于接受的哺乳動(dòng)物，如人類。雙特異性和多特異性配體(如雙特異性抗體形式)以很強(qiáng)的親和力與多聚抗原結(jié)合。雙特異性或多特異性配體可使兩個(gè)抗原交聯(lián)，如在募集細(xì)胞毒T細(xì)胞以介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞系的殺傷中。優(yōu)選至少90%-95%均質(zhì)性的大體上純的如dAb單體的配體施用于哺乳動(dòng)物，最優(yōu)選均質(zhì)性98%-99°/。或更高的作為藥用，尤其所述哺乳動(dòng)物為人時(shí)。一旦如所需地部分純化或純化至均質(zhì)性，則該配體可用于診斷或治療(包括體外應(yīng)用)或用于開發(fā)和進(jìn)行檢驗(yàn)方法，免疫熒光染色法等等(Le&oviteandPernis,(1979and1981)ImmunologicalMethods,VolumesIandII,AcademicPress,NY)。例如發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的配體(如dAb單體)典型地在預(yù)防、抑制或治療炎癥或炎癥狀態(tài)，包括急性炎癥性疾病和/或慢性炎癥性疾病中的用途。還可施用本發(fā)明的配體(如dAb單體)以抑制IL-1(如IL-la和/或IL-lp)與IL-1R1結(jié)合而誘導(dǎo)的生物過程。在本申請中，術(shù)語"預(yù)防"涉及在疾病誘發(fā)前施用所述保護(hù)性的組合物。"抑制，，指在誘導(dǎo)事件后，但疾病臨床出現(xiàn)前施用該組合物。"治療"涉及疾病癥狀變得明顯后施用該該保護(hù)性組合物?？墒┯帽景l(fā)明的配體包括dAb單體，以預(yù)防、抑制或治療慢性炎癥性疾病，過敏性疾病，癌癥，細(xì)菌或病毒感染，自身免疫性疾病(其包括但不僅限于I型糖尿病，哮喘，多發(fā)性硬化癥，系統(tǒng)性紅斑狼瘉，炎癥性腸病(如Crohn病、潰瘍性結(jié)腸炎)，重癥肌無力和Behcet綜合征)，銀屑病，子宮內(nèi)膜異位癥和腹腔粘連(如腹部手術(shù)后)?？梢允┯帽景l(fā)明配體包括dAb單體，以預(yù)防、抑制或治療肺炎，慢性阻塞性呼吸系統(tǒng)疾病(如慢性支氣管炎、慢性阻塞性支氣管炎、肺氣肺)，哞喘(如類固醇抗藥性哮喘)，肺炎(例如細(xì)菌性肺炎，如金黃色葡萄球菌肺炎)，過敏性肺炎，遷延性肺嗜酸性粒細(xì)胞浸潤癥，環(huán)境性肺部疾病，支氣管擴(kuò)張癥，嚢性纖維化，間質(zhì)性肺疾病，原發(fā)性肺動(dòng)脈高壓，肺血栓栓塞癥，胸膜異常，縱隔異常，對膈肌異常，通氣不足，過度通氣，睡眠呼吸暫停，急性呼吸窘迫癥候群，間皮瘤，肉瘤，移植排斥反應(yīng)，移植物抗宿主病，肺癌，過敏性鼻炎，過敏癥，石棉肺，曲菌球，曲霉菌病，慢性支氣管炎，肺氣腫，嗜酸性粒細(xì)胞性肺炎，特發(fā)性肺纖維化，侵潤性肺炎球菌病(IPD)，流行性感冒，非結(jié)核性分枝桿菌，胸腔積液，肺塵埃沉著病，肺孢子蟲病，肺放線菌病，肺泡蛋白沉積癥，肺炭疽，肺水胂，肺栓塞，肺部發(fā)炎，肺組織細(xì)胞增多癥X(嗜酸性肉芽腫)，肺動(dòng)脈高血壓，肺諾卡菌病，肺結(jié)核，肺靜脈閉塞病，類風(fēng)濕性肺病，結(jié)節(jié)病，Wegener肉芽腫病，和非小細(xì)胞肺癌?？梢允┯帽景l(fā)明配體包括dAb單體，以預(yù)防、抑制或治療流感，呼吸道合胞病毒相關(guān)的呼吸系統(tǒng)疾病和病毒性肺(呼吸系統(tǒng))疾病?？梢允┯帽景l(fā)明配體包括dAb單體，以預(yù)防、抑制或治療骨關(guān)節(jié)炎或炎性關(guān)節(jié)炎。"炎性關(guān)節(jié)炎，，指在免疫系統(tǒng)引起或加劇關(guān)節(jié)炎癥的那些關(guān)節(jié)疾病，包括類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、幼年類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、脊柱關(guān)節(jié)病，如強(qiáng)直性脊柱炎、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、Reiter綜合征、銀屑病關(guān)節(jié)炎、銀屑病性脊推炎、腸病性關(guān)節(jié)炎、腸病性脊柱炎、幼年型脊柱關(guān)節(jié)病和未分化脊柱關(guān)節(jié)病。炎性關(guān)節(jié)炎普遍的特點(diǎn)是滑膜組織浸潤和/或關(guān)節(jié)液^f皮白細(xì)胞浸潤。根據(jù)本發(fā)明的與涉及內(nèi)吞作用的細(xì)胞外靶標(biāo)(如網(wǎng)格蛋白)結(jié)合的配體(雙特異性配體、多特異性配體、dAb單體)，可被內(nèi)吞使其達(dá)到細(xì)胞內(nèi)靶標(biāo)。此外，雙或多特異性配體提供了一種方式，通過該方式，能夠與細(xì)胞內(nèi)耙標(biāo)結(jié)合的結(jié)合域(如dAb單體)可以被傳送入細(xì)胞內(nèi)環(huán)境。這種戰(zhàn)略要求例如具有能使其保持細(xì)胞內(nèi)功能的物理性質(zhì)的雙特異性配體?；蛘呷绻罱K目的地細(xì)胞內(nèi)功能區(qū)隔是氧化性的，則折疊很好的配體可有二硫鍵。有利的是，雙或多特異性配體可用于靶向至細(xì)胞因子受體以及供了使與細(xì)胞因子受體或其它分子結(jié)合的兩個(gè)或多個(gè)結(jié)合域(如dAbs)活性起協(xié)同作用的方法，包括施用能與所述兩個(gè)或多個(gè)分子(如細(xì)胞因子受體)結(jié)合的雙或多特異性配體。在本發(fā)明的這個(gè)方明的這個(gè)方面涉及VH區(qū)和VL區(qū)的組合，僅VH區(qū)和僅VL區(qū)。在治療方面的協(xié)同作用可以以許多方式實(shí)現(xiàn)。例如只有當(dāng)配體耙向兩個(gè)靶標(biāo)時(shí)，靶標(biāo)組合才可能是治療上有活性的，而單獨(dú)靶向一個(gè)靶標(biāo)時(shí)是沒有治療效果的。在另一實(shí)施方案中，單獨(dú)靶向一個(gè)耙標(biāo)可有一些治療效果，但與第二個(gè)靶一起，則該組合治療效果協(xié)同增加(不僅是加和的效果)?？色@得用于篩選本發(fā)明配體在預(yù)防或治療疾病有效性的動(dòng)物沖莫型系統(tǒng)。易感小鼠中系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)的試驗(yàn)方法已為本領(lǐng)域所知(Knight"a/.(1978)/7kfed,147:1653;Reinersten"a/.(1978)^，￡^.乂M^.,299:515)。重癥肌無力(MG)是通過用來自另一物種的可溶性AchR蛋白誘發(fā)疾病，在SJL/J雌性小鼠上試驗(yàn)的(Lindstroma(1988)/附ww"o/.,42:233)。通過注射II型膠原，在敏感品系的小鼠上誘發(fā)關(guān)節(jié)炎(Stuart"a/.(1984)爿朋.iev.//wm,wo/.，42:233)。對通過注射分枝桿菌熱休克蛋白在易感大鼠上誘發(fā)的佐劑性關(guān)節(jié)炎模型已有描述(VanEdenef(1988)A^wre,331:171)。如同所述的，通過施用甲狀腺球蛋白誘發(fā)小鼠甲狀腺炎(Maronefa/.(1980)/￡平編.,152:1115)。胰島素依賴型糖尿病(IDDM)自然發(fā)生或如Kanasawa等(1984,D/a6e油一，27:113)所述的可在某些品系的小鼠上被誘發(fā)。小鼠與大鼠的EAE作為人MS的模型。在此模型中，脫髓鞘疾病是通過施用髓鞘堿性蛋白誘發(fā)的(參見Paterson(1986)rexf6ooA;o//wmwwop<^/zc>/ogy,Mischeref"/"eds.，G腿eandStratton,NewYork,pp.179-213;McFarlin"a/.(1973)Science,179:478;以及Satoh"(1987)//mm麗o/.,138:179)。其它合適的模型在本文中有描述。總的來說，所述配體以純化的形式與藥理學(xué)上合適的載體一起使用。典型地，這些載體包括水性或醇性/水性溶液，乳液或混懸液，包括鹽水和/或緩沖介質(zhì)。腸道外賦形劑包括氯化鈉溶液，林格氏液葡萄糖，葡萄糖與氯化鈉以及乳酸林格氏液。如果需要保持多肽復(fù)合物處于混懸態(tài)，合適的生理上可接受的賦型劑可以選用如羧曱基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、明膠和海藻酸鹽的增稠劑。.靜脈注射賦型劑包括如那些基于林格氏液葡萄糖的流體和營養(yǎng)補(bǔ)充劑以及電解質(zhì)補(bǔ)充劑。還可以有如抗菌劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體的防腐劑和其他添加劑。處方取決于給藥途徑，各種合適的處方均可使用，包括緩釋處方(參見如Mack(19'82)ie/w'"gto"SP/wrmacewfz'caZS"'ewces,16thEdition.)。所迷配體(如dAb單體)可以與一個(gè)或多個(gè)額外治療劑或活性物質(zhì)一起施用和/或配制。當(dāng)配體與其它治療劑施用時(shí)，該配體可以在其它治療劑施用之前、同時(shí)或之后施用?？偟膩碚f，該配體(如dAb單體)和其它物質(zhì)以提供治療效果重合的方式施用?？膳c本發(fā)明配體一起施用或配制的其它成分包括，例如免疫治療藥，如環(huán)孢菌素、曱氨蝶呤、阿霉素或順鉑，抗生素，抗真菌藥，抗病毒藥和免疫毒素。例如，當(dāng)施用拮抗劑以預(yù)防、抑制或治療肺部炎癥或呼吸系統(tǒng)疾病的時(shí)候，可以與磷酸二酯酶抑制劑(如磷酸二酯酶4抑制劑)，支氣管擴(kuò)張劑(如(32-受體激動(dòng)劑、抗膽堿能藥物、茶堿)，短效(3-受體激動(dòng)劑(如沙丁胺醇、沙丁胺醇、班布特羅、非諾特羅、乙基異丙腎上腺素(isoetherine)、異丙腎上腺素、左旋沙丁胺醇、間羥異丙基腎上腺素、吡布特羅、特布他林和比托特羅)，長效(3-受體激動(dòng)劑(如福莫特羅和沙美特羅)，短效抗膽堿能藥物(如異丙托溴銨和氧托溴銨)，長效抗膽石威能藥物(如p塞托溴銨)，茶堿(如短效制劑、長效制劑)，吸入性類固醇(如倍氯米松、布地奈德、氟尼縮松、氟替卡松丙酸酯和曲安奈德)，口服類固醇(如甲基強(qiáng)的松龍，強(qiáng)的松龍，氬化潑尼松和潑尼松)，短效P-受體激動(dòng)劑與抗膽^威能藥物(如沙丁胺醇/舒喘寧/異丙阿托品，和非諾特羅/異丙阿托品)聯(lián)合，長效(3-受體激動(dòng)劑與吸入性類固醇(如沙美特羅/氟替卡松，和福莫特羅/布地奈德)和溶黏液劑(如厄多司坦、乙酰半胱氨酸、溴己新(bromheksin)、羧甲司坦、愈創(chuàng)木酚甘油醚(guiafenesin)和石典化甘油)。當(dāng)施用所述拮抗劑以預(yù)防、抑制或治療關(guān)節(jié)炎(如炎性關(guān)節(jié)炎(如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎))時(shí)，其可以與病癥緩解性抗風(fēng)濕藥(如曱氨蝶呤、羥氯喹、柳氮磺胺吡啶、來氟米特、硫唑嘌呤、D-青霉胺、金制劑(口服或肌肉注射)、米諾環(huán)素、環(huán)孢菌素、葡萄球菌蛋白A),非甾體抗炎藥(如COX-2選擇性非甾體抗炎藥，如羅非昔布)，水楊酸類藥物，糖皮質(zhì)激素(如強(qiáng)的松)和鎮(zhèn)痛藥合用。藥物組合物可包括各種細(xì)胞毒或其它物質(zhì)與本發(fā)明配體合用的混合物，或甚至是根據(jù)本發(fā)明的具有不同特異性的配體的合用，如用不同的靶抗原或表位篩得的配體，無論它們在施用前是否混合。依據(jù)本發(fā)明的藥物組合物的給藥途徑可以是本領(lǐng)域所屬普通技術(shù)人員通常所知的任何給藥途徑。出于治療目的，包括但不限于免疫治療，本發(fā)明選定的配體可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)施用于任何患者。可以以任何合適的方式給藥，包括腸道外(如靜脈注射、肌肉注射、腹腔內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、鞘內(nèi)注射)，透皮吸收，經(jīng)肺給藥，或者還可以，恰當(dāng)?shù)赝ㄟ^導(dǎo)管直接灌注。給藥劑量與頻率取決于年齡，性別和患者狀態(tài)，其它藥物的共同給藥情況，禁忌癥和臨床醫(yī)生需考慮的其他參數(shù)。按指導(dǎo)給藥可以是局部的(如通過肺部給藥局部傳送到肺，如鼻腔內(nèi)給藥)或全身給藥。本發(fā)明的配體可以凍干存儲(chǔ)，使用前在合適的載體中重建。該技術(shù)已證明對常規(guī)免疫球蛋白是有效的，可以用本領(lǐng)域已知的凍干與重建技術(shù)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，凍干和重建可導(dǎo)致不同程度的抗體活性損失(例如用常規(guī)免疫球蛋白，IgM抗體的易于產(chǎn)生比IgG更大的活性損失)，并且可能要上調(diào)使用水平以補(bǔ)償該損失?？梢允┯煤斜景l(fā)明拮抗劑(如配體)或其混合物的組合物，以進(jìn)行預(yù)防性和/或治療性治療。在某些治療應(yīng)用中，實(shí)現(xiàn)選定細(xì)胞群落被至少部分抑制、抑制、調(diào)節(jié)、殺傷的足夠量，或一些其它可測量參數(shù)，被定義為"治療有效量"。例如為治療肺部炎癥和/或呼吸道疾病，抑制痰的量，抑制支氣管活檢炎癥的量，抑制呼吸困難的量，增加第l秒鐘用力呼吸容積的量，提高健康狀況改善的量，如St.George呼吸疾病問巻的合適問巻中量化的量(-如4分的改善分值)可施用于病患。在另一實(shí)施例中，為治療關(guān)節(jié)炎(如炎性關(guān)節(jié)炎(如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎))，可以施用足以使美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)核心設(shè)置指標(biāo)中至少三項(xiàng)實(shí)現(xiàn)20%或更大改善的量(Felsonetal.，ArthritisandRheumatism,38:727-735(1995))。達(dá)到該劑量所需的量取決于疾病的嚴(yán)重程度和患者的一般狀態(tài)，包括患者的年齡、性別、體重、一般健康狀況(如患者免疫系統(tǒng)狀態(tài))。基于這些和其它合適的標(biāo)準(zhǔn)，熟練的醫(yī)師可以確定要施用的配體的合適量。通常情況下，所述數(shù)量范圍為，每公斤體重0.005至5.0mg配體，更常用的劑量為0.05至2.0mg/kg/劑量。就預(yù)防應(yīng)用而言，含有本發(fā)明配體或其混合物的組合物還可以以相似略低的劑量施用，以預(yù)防、抑制或延遲疾病的發(fā)生(如持續(xù)緩解或保持穩(wěn)定，或預(yù)防急性期)。熟練的醫(yī)師能確定合適的劑量間隔以治療、抑制或預(yù)防疾病。施用本發(fā)明配體可多達(dá)每天4次，每周2次，每周1次，每隔兩個(gè)星期1次，每月1次，或每隔兩個(gè)月1次，給藥劑量如大約10嗎/kg至大約80mg/kg、大約100]ag/kg至大約80mg/kg、大約1mg/kg至大約80mg/kg、大約1mg/kg至大約70mg/kg、大約1mg/kg至大約60mg/kg、大約1mg/kg至大約50mg/kg、大約1mg/kg至大約40mg/kg、大約1mg/kg至大約30mg/kg、大約1mg/kg至大約20mg/kg、大約1mg/kg至大約10mg/kg、大約10(ig/kg至大約10mg/kg、大約10|ng/kg至大約5mg/kg、大約10(ig/kg至大約2.5mg/kg、大約1mg/kg、大約2mg/kg、大約3mg/kg、大約4mg/kg、大約5mg/kg、大約6mg/kg、大約7mg/kg、大約8mg/kg、大約9mg/kg或大約10mg/kg。在具體實(shí)施方案中，施用配體以治療、抑制或預(yù)防慢性炎癥疾病，每隔兩周一次每月一次，劑量大約104g/kg至大約10mg/kg(如大約10昭/kg,大約100(ag/kg,大約1mg/kg,大約2mg/kg，大約3mg/kg,大約4mg/kg，大約5mg/kg,大約6mg/kg,大約7mg/kg，大約8mg/kg,大約9mg/kg或大約10mg/kg)。如果相對于治療前出現(xiàn)的此類癥狀，或相對于沒有用該組合物治療的個(gè)體(人或模型動(dòng)物)或其它合適對照中的此類癥狀，減少了一個(gè)或多個(gè)癥狀(如減少至少10°/。或臨床評(píng)價(jià)表上至少一個(gè)點(diǎn))，則用本文描述的組合物進(jìn)行治療被視為"有效"。雖然針對的疾病不同癥狀會(huì)明顯不同，但普通熟練的臨床醫(yī)師或技術(shù)人員能判斷出來。對此類癥狀的判斷可以例如通過監(jiān)測疾病的一個(gè)或多個(gè)生化指標(biāo)水平(如與所述疾病相關(guān)的酶或代謝物水平，受影響的細(xì)胞數(shù)等)，通過監(jiān)測身體表現(xiàn)(如炎癥、腫瘤大小等)，或者通過被接受的臨床評(píng)分，例如擴(kuò)展病殘狀態(tài)評(píng)分(用于多發(fā)性硬化)，Irvine炎癥性腸病問巻(以32分評(píng)價(jià)對關(guān)于腸功能，全身癥狀，社會(huì)功能和情緒狀況的生活質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估--分值范圍從32到224，分值越高表明生活質(zhì)量越好)，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎生活質(zhì)量量表，美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)核心設(shè)置指標(biāo)，或其它本領(lǐng)域已知的可接受的臨床評(píng)估。疾病癥狀的持續(xù)(如一天或多天，優(yōu)選更長時(shí)間)減少至少10%或給定的臨床量表上減少一分或多分意味著"有效"治療。類似地，如果相對于沒有用所述化合物治療的類似個(gè)體(人或動(dòng)物)中的此種癥狀而言，一個(gè)或多個(gè)癥狀的出現(xiàn)或嚴(yán)重程度被延遲、減少或消除，則用本發(fā)明所述的組合物進(jìn)行預(yù)防是有效的。含有根據(jù)本發(fā)明的配體或其混合物的組合物，可用在預(yù)防以及治療設(shè)置上，以輔助改變、滅活、殺傷或移除哺乳動(dòng)物中選定的靶細(xì)胞群落。此外，本文所述選定的多肽庫可在體外使用或體外有選擇的殺傷、消耗或從異源細(xì)胞集合中有效除去靶細(xì)胞群落。按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，哺乳動(dòng)物的血液可在體外與配體，如抗體、細(xì)胞表面受體或其結(jié)合蛋白結(jié)合，從而殺死不需要的細(xì)胞或?qū)⑵鋸难褐幸瞥?，?吏血液回到哺乳動(dòng)物。含有根據(jù)本發(fā)明的拮抗劑(如配體)的組合物可用于預(yù)防及治療設(shè)置上，以輔助改變、滅活、殺傷或移除哺乳動(dòng)物中選定的靶細(xì)胞群落。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療、抑制或預(yù)防慢性炎癥疾病的方法，包含將治療有效劑量或數(shù)量的本發(fā)明配體施用于對其有需求的哺乳動(dòng)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療、抑制或預(yù)防關(guān)節(jié)炎(如炎性關(guān)節(jié)炎(如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，幼年類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，脊柱關(guān)節(jié)病，如強(qiáng)直性脊柱炎、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、Reiter綜合征、銀屑病關(guān)節(jié)炎、銀屑病性脊推炎、腸病性關(guān)節(jié)炎、腸病性脊柱炎、幼年型脊柱關(guān)節(jié)病和未分化脊柱關(guān)節(jié)病))的方法，包括將治療有效劑量或數(shù)量的本發(fā)明的配體施用于對其有需要的哺乳動(dòng)物。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療、抑制或預(yù)防炎癥性腸病(如Crohn病、潰瘍性結(jié)腸炎)的方法，包括將治療有效劑量或數(shù)量的本發(fā)明的配體施用于對其有需求的哺乳動(dòng)物。實(shí)施例實(shí)施例1方法選擇與篩選對于初篩，Vk域抗體單體4G-K2庫用IL-1R1-Fc融合蛋白進(jìn)行淘選(Axxora,Nottingham,UK)。初篩得到的域抗體進(jìn)行三輪進(jìn)一步的篩選。第1輪用蛋白G包被的磁珠(Dynal公司，Norway)和lOOnMIL-1R1-Fc篩選；第2輪用抗人IgG磁珠(Novagen，MerckBiosciences,Nottingham,UK)和10nMIL-1R1-Fc篩選；第3輪用蛋白G磁珠和1nMIL-1R1-Fc篩選。(Henderikx"a/.，Selectionofantibodiesagainstbiotinylatedantigens.AntibodyPhageDisplay:Methodsandprotocols,Ed.O'BrienandAtkin,HumanaPress(2002).)。各階^R的洗脫用1mg/ml胰蛋白酶-磷酸鹽緩沖液(PBS)進(jìn)行。對于親和力成熟篩選，使用了上述方法，但是做了如下改動(dòng)使用蛋白G磁珠進(jìn)行了兩輪篩選，第l輪用了1nMIL-lRl-Fc,第2輪用了100pMIL-1R1-Fc。通過質(zhì)粒提取(Qiagen)分離篩選得到(第2、3輪)的噬菌體載體，用與iVoI進(jìn)行限制性內(nèi)切，釋放dAb插入片段。該插入片段連接到噬菌體表達(dá)載體IMfefI酶切pDOM5),轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌林HB2151,用于dAb的可溶性表達(dá)和篩選。上清液受體結(jié)合分析(RBA)挑取單個(gè)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌落于含添加100(ig/ml羧千青霉素和0.1°/。(w/v)葡萄糖的2xTY的96孔板中，37。C生長至約OD6()(H).9,用ltnMIPTG誘導(dǎo)。在受體結(jié)合分析中檢測30°C誘導(dǎo)過夜后的上清液抑制IL-1(3與ELISA板捕獲的IL-1R1結(jié)合的能力。簡而言之，MaxiSorpTM免疫分析板(Nunc公司，Denmark)與抗IL-1RI小鼠單克隆抗體(R&DSystems,Minneapolis,USA)共同孵育過夜。各孔用含0.1%(v/v)Tween-20的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，用含l°/。(w/v)BSA的PBS封閉，而后與重組IL-1RI(500ng/ml,R&DSystems)孵育。含待篩選dAbs的大腸桿菌培養(yǎng)上清液置于洗過的檢測板孔中，該板室溫孵育30min,然后將IL-1卩(4ng/ml,R&DSystems)加入各孔并混合。用生物素?；目笽L-1卩抗體(R&DSystems)檢測IL-1卩結(jié)合，接著加入過氧化酶標(biāo)記的抗生物素抗體(Stratech,Soham,UK),然后與3,3'，5,5'-四曱基對二氨基聯(lián)苯(TMB)底物(KPL公司，Gaithersburg,USA)孵育。加入HCl終止反應(yīng)并在450匪處讀取吸收值。抗L-1RIdAb的活性引起IL-l卩結(jié)合的減弱，因此與僅有IL-1卩的對照相比吸收減弱。細(xì)胞分析檢測經(jīng)分離的dAbs抑制IL-1誘導(dǎo)的經(jīng)培養(yǎng)MRC-5細(xì)胞(ATCC目錄號(hào)CCL-171)釋放IL-8的能力。簡而言之，RPMI介質(zhì)中5000個(gè)胰蛋白酶消化的MRC-5細(xì)胞置于組織培養(yǎng)微孔板，用IL-la或IL-l卩(R&DSystems,終濃度200pg/ml)和待檢測的dAb稀釋液混合?；旌衔?7。C孵育過夜，細(xì)胞釋放到培養(yǎng)介質(zhì)中的IL-8用ELISA(DuoSet,R&DSystems)定量?？笽L-1RIdAb的活性引起與IL-1結(jié)合減弱，以及相應(yīng)的IL-8釋放減少。人全血分析人的全血與待檢測dAB的系列稀釋液一起孵育，混合物在37。C/5%C02孵育30分鐘。接著加入270或900pM(終濃度)的IL-1a或IL-l卩并混合，然后混合物在37。C/5%(202繼續(xù)孵育20小時(shí)。隨后將血離心(500xg,5min),ELISA(DuoSet,R&DSystems)法定量釋放到上清液中的IL-6?？笽L-1RIdAb的活性引起IL-1結(jié)合減弱，以及相應(yīng)的IL-6釋放減少。解離速率篩逸這些實(shí)驗(yàn)是使用偶聯(lián)有-600RU的IL-1RI(R&DSystems)的CM5芯片(Biacore)在BIACORE3000表面等離子共振儀上進(jìn)行的。分析物流經(jīng)IL-1RI包被的流動(dòng)池，以空白流動(dòng)池為線內(nèi)參比，在HBS-EP運(yùn)行緩沖液(Biacore)中的流速為30!_il/min。含有可溶性dAb的IO微升上清液用運(yùn)行緩沖液以1:1稀釋，以10jil/min流速注入(Kinject)，并允許其在緩沖液中解離。相比母本克隆，解離速率改善的克隆用肉眼鑒別或用BIAevaluation軟件v4.1測定。用表面等離子共振分析IL-la竟?fàn)庍@些研究是使用偶聯(lián)有600RU的IL-1RI(R&DSystems)的CM5芯片(Biacore)在BIACORE3000表面等離子共振儀上進(jìn)行的。分析物流經(jīng)IL-1RI包被的流動(dòng)池，以空白流動(dòng)池為線內(nèi)參比，在HBS-EP運(yùn)行緩沖液(Biacore)中流速為30jil/min。IL-lra(100nM，R&DSystems)在60秒內(nèi)注入，接著立即奪60秒內(nèi)用共注射裝置注入200nMDOM4-130-3dAb或100nMIL-la。'IL-lra竟?fàn)嶦LISAMaxiSorpTM免疫分析板(Nimc,Denmark)用ljag/mlIL-1R1-Fc包被過夜，然后用PBS洗滌3次，再用1。/。(v/v)Tween20的PBS封閉。再次洗滌免疫分析板，加入與DOM4-130-3或IL-la系列稀釋液混合的500pMIL-lm。用生物素?；目笽L-lra抗體(DuoSet,R&DSystems)檢測IL-lra與受體的結(jié)合，隨后如前所述加入鏈霉親和素-HRP,用3,3',5,5'-四曱基對二氨基聯(lián)苯(TMB)底物(KPL,Ga池ersburg，USA)顯色。與不含IL-lra的對照孔相比，A柳的減少表明與IL-Ira竟?fàn)幒虸L-1R1的結(jié)合。親和力成熟噬菌體庫的構(gòu)建用含NNK或NNS密碼子的簡并寡核苷酸進(jìn)行PCR反應(yīng)，使親和力待成熟的dAb中所需位置多樣化。然后通過組裝PCR生成全長多樣化插入片段。生成的插入片段用I與A^fI酶切，與經(jīng)切割的噬菌體載體(pDOM4)連接。該連接物通過電穿孔轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌林TBI,被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞置于含15pg/ml四環(huán)素的2xTY瓊脂平板上，生成>1><108克隆規(guī)模的庫。結(jié)果初篩與篩選初步噬菌體篩選用4G-K2庫進(jìn)行，將篩得物亞克隆到可溶性表達(dá)載體(pDOM5)中。用上清液RBA鑒定抑制IL-1與IL-1R1結(jié)合的dAb克隆，隨后表達(dá)，用蛋白L純化，在MRC-5細(xì)胞分析中測試其抑制IL-1誘導(dǎo)的IL-8釋放的能力。圖l是這樣的細(xì)胞分析中典型的被稱為DOM4-130的抗-IL-lRIdAb量效曲線。本分析中DOM4-130的ND50大約為500-1000nM。親和力成熟成熟階段I以DOM4-130為模板，構(gòu)建成熟庫，該庫具有在位置30、34、93和94處編碼全部20個(gè)氨基酸的多樣性。得到的噬菌體庫用IL-1R1-Fc對與IL-1R1的結(jié)合進(jìn)行可溶性篩選。第2輪篩得物克隆到噬菌體表達(dá)載體(pDOM5)中，dAbs在大腸桿菌中表達(dá)，以母本dAb為對照，篩選解離速率提高的表達(dá)上清液中的dAb。解離速率改善的克隆被表達(dá)，純化并在MRC-5/IL-8分析中檢測。圖2展示了改進(jìn)的變體DOM4-130-3的量效曲線，其ND5o大約為30nM。成熟階段n用DOM4-130為模板，用上述方法構(gòu)建成熟庫，但這次在CDR2中氨基酸殘基49、50、51及53處引入多樣性。對篩得的庫再次篩選解離速率提高的變體，解離速率提高是在MRC-5/IL-8細(xì)胞分析中檢測的。圖3是改進(jìn)的DOM4-130-46(NDs。約為1nM)和其它的變體DOM4-130-51的量效曲線。DOM4-130-51源于D0M4-130-46,加入了突變S67Y使DOM4-130-51的效價(jià)進(jìn)一步提高(ND50約為300pM)。通過引入氨基酸取代R107K,使該氨基ilf列回復(fù)到該位置的種系序列，從而生成這兩個(gè)dAbs的進(jìn)一步變體，即分別生成DOM4-130-53與DOM4-130-54。dAbs的表位特異性為了確定抗-IL-lRldAbs的表位特異性，進(jìn)行了竟?fàn)幮越Y(jié)合分析。用BIOCORE表面等離子共振儀進(jìn)行的研究中，注入IL-lra流經(jīng)偶聯(lián)有IL-1R1的芯片，然后立即注入DOM4-130-3或IL-la。結(jié)果見圖4A與4B。圖4B表明了DOM^130-3沒有與已和IL-lra結(jié)合的IL-1R1結(jié)合。注入IL-lra,接著注入IL-la，這兩種分子已知會(huì)竟?fàn)幣c受體的結(jié)合，則IL-la也不能與受體結(jié)合(圖4B)。本結(jié)果用竟?fàn)嶦LISA法得以證實(shí)，其中在DOM4-122-23或IL-la(系列濃度)存在下IL-lra與IL-1R1的結(jié)合得到了確認(rèn)。該ELISA結(jié)果表明，DOM4-130-3dAb或IL-lot濃度增加抑制了IL-lra和IL-1R1結(jié)合，證實(shí)了DOM4-130-3和IL-lra竟?fàn)幣cIL-1R1的結(jié)合(圖5)。實(shí)施例2蛋白酶穩(wěn)定性蛋白酶穩(wěn)定性dAbs和含有dAbs的配體可用于治療多種疾病，如炎癥疾病。此外，如本文所述，dAbs以及配體的半衰期可以如通過聚乙二醇化而改變。因而dAbs以及配體可以用于如全身給藥(如聚乙二醇化的dAb治療關(guān)節(jié)炎)或局部給藥(如dAb單體治療COPD)。研究了與IL-1R1結(jié)合的兩種dAb對彈性蛋白酶或胰蛋白酶作用的穩(wěn)定性。發(fā)現(xiàn)這兩種蛋白酶自然狀態(tài)時(shí)在肺中處于低水平，但是在如COPD的疾病狀態(tài)時(shí)，彈性蛋白酶等蛋白酶水平升高。本研究中使用了dAB單體DOM4430-54，和含有一個(gè)點(diǎn)突變的DOM4-130-54變體，所述點(diǎn)突變提供了特異性連接PEG的半胱氨酸殘基。將lmg/mlDOM4-130-54的PBS溶液與0.04%胰蛋白酶或彈性蛋白酶(人唾液白細(xì)月包彈性蛋白酶購自ElastinProductsCompanyInc)—起孵育。該dAb/蛋白酶混合物隨后在30。C孵育，在規(guī)定時(shí)間間隔取樣(0、1、3和24小時(shí))用于SDS-PAGE分析。在給定的時(shí)間點(diǎn)，加入SDS-PAGE上樣緩沖液(xlO濃儲(chǔ)存液)以終止反應(yīng)，接著在液氮里將樣品速凍。樣品用SDS-PAGS分析，使蛋白帶顯色，以揭示dAb的蛋白酶降解的時(shí)間過程。結(jié)果測試了兩種形式的DOM4-130-54:大腸桿菌表達(dá)的單體以及巴斯德畢赤酵母表達(dá)的半胱氨酸基因工程變體psoc，對彈性蛋白酶作用的穩(wěn)定性。DOM4-130-54的所述P80C點(diǎn)突變提供了特異性連接PEG的半胱氨酸殘基。彈性蛋白酶降解的時(shí)間過程揭示了即便是24小時(shí)后DOM4-130-54也沒有降解的跡象。該結(jié)果還表明了與DOM^130-M相比，引入所述P80C突變對該蛋白的穩(wěn)定性沒有影響。這些結(jié)果意味著所述P80C變體的三級(jí)結(jié)構(gòu)與DOM4-130-54的三級(jí)結(jié)構(gòu)沒有實(shí)質(zhì)性差別。還檢測了胰蛋白酶存在下單體dAbDOM4-130-54的穩(wěn)定性。胰蛋白酶降解的時(shí)間過程顯示DOM4-130-54可以穩(wěn)定至少3小時(shí)，僅在第24小時(shí)這個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀察到降解。本研究的結(jié)果表明dAbs是穩(wěn)定的，耐彈性蛋白酶或胰蛋白酶介導(dǎo)的降解。dAbs對蛋白酶降解作用所顯示的穩(wěn)定性說明dAb可以在體內(nèi)給藥，在足夠長的時(shí)間內(nèi)都有功能，從而產(chǎn)生顯著的生物效應(yīng)。例如本結(jié)果表明當(dāng)dAb施用于肺時(shí)，可耐蛋白酶降解，并因此保持足夠長時(shí)間的功能，從而產(chǎn)生顯著的生物效應(yīng)(如結(jié)合并抑制如IL-1R1的靶蛋白的活性)。雖然本發(fā)明已詳細(xì)說明，并以參考其優(yōu)選實(shí)施方案的方式進(jìn)行描述，但本領(lǐng)域所屬的技術(shù)人員應(yīng)該明白，其中可做出的形式及細(xì)節(jié)的各種變化不偏離所附權(quán)利要求包括的本發(fā)明的范圍。權(quán)利要求1、一種域抗體(dAb)單體，其對白細(xì)胞介素-1受體1型(IL-1R1)具有結(jié)合特異性并抑制白細(xì)胞介素-1(IL-1)、白細(xì)胞介素-1受體拮抗劑(IL-1ra)與IL-1R1結(jié)合。2、權(quán)利要求1所述dAb單體，其中所述IL-1選自白細(xì)胞介素-lct(IL-lcO和白細(xì)胞介素-l卩(IL-ip)。3、權(quán)利要求l所述dAb單體，其中所述dAb單體抑制所述IL-1與IL-1R1結(jié)合，其IC50不大于約1|iM。4、權(quán)利要求1所述dAb單體，其中所述dAb單體在體外檢測中抑制IL-l-誘導(dǎo)的MRC-5細(xì)胞(ATCC檢索號(hào)CCL-171)釋放白細(xì)胞介素-8,其ND50S1|uM。5、權(quán)利要求4所述dAb單體，其中所述dAb單體在體外檢測中抑制IL-l-誘導(dǎo)的MRC-5細(xì)胞(ATCC檢索號(hào)CCL-171)釋放白細(xì)胞介素-8,其ND50SlnM。6、權(quán)利要求1所述dAb單體，其中所述dAb單體在全血檢測中抑制IL-1-誘導(dǎo)的白細(xì)胞介素-6的釋放，其ND50^1;aM。7、權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的dAb單體，其中所述dAb單體中的一個(gè)或多個(gè)框架區(qū)(FR)包含(a)人框架區(qū)的氨基酸序列，(b)人框架區(qū)氨基S吏序列的至少8個(gè)毗連氨基酸，或(c)由人種系抗體基因片段編碼的氨基酸序列，其中所述框架區(qū)如Kabat所定義。8、權(quán)利要求7所述的dAb單體，其中所述dAb單體中一個(gè)或多個(gè)框架區(qū)的氨基酸序列與人種系抗體基因片段編碼的相應(yīng)框架區(qū)氨基酸序列相同，或相對于人種系抗體基因片段編碼的相應(yīng)框架區(qū)，一個(gè)或多個(gè)所述框架區(qū)的氨基酸序列總共含有最高達(dá)5個(gè)氨基酸的差異。9、權(quán)利要求7所述的dAb單體，其中所述dAb單體中FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列與人種系抗體基因片段編碼的相應(yīng)框架區(qū)氨基酸序列相同，或相對于人種系抗體基因片段編碼的相應(yīng)框架區(qū)，F(xiàn)R1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列總共含有最高達(dá)10個(gè)氨基酸的差異。10、權(quán)利要求7所述的dAb單體，其中所述dAb單體包括FR1、FR2和FR3區(qū)，所述FR1、FR2和FR3的氨基酉^列與人種系抗體基因片段編碼的相應(yīng)框架區(qū)氨基酸序列相同。11、權(quán)利要求7-10中任一項(xiàng)的所述dAb單體，其中所述人種系抗體基因片段是DPK9和JK1。12、權(quán)利要求1所述的dAb單體，其中所述dAb單體與選自下述的dAb竟?fàn)幣cIL-1R1的結(jié)合DOM4-130-30(SEQIDNO:3)、DOM4-130-46(SEQIDNO:4)、DOM4-130-51(SEQIDNO:5)、DOM4-130-53(SEQIDNO:6)、DOM4-130-54(SEQIDNO:7)、DOM4-130(SEQIDNO:215)、DOM4-130-1(SEQIDNO:216)、DOM4-130-2(SEQIDNO:217)、DOM4-130-3(SEQIDNO:218)、DOM4-130-4(SEQIDNO:219)、DOM4-130-5(SEQIDNO:220)、DOM4-130-6(SEQIDNO:221)、DOM4-130-7(SEQIDNO:222)、DOM4-130-8(SEQIDNO:223)、DOM4-130畫9(SEQIDNO:224)、DOM4-130-10(SEQIDNO:225)、DOM4-130匿U(SEQIDNO:226)、DOM4-130-12(SEQIDNO:227)、DOM4-130-13(SEQIDNO:228)、DOM4-130-14(SEQIDNO:229)、DOM4-130-15(SEQIDNO:230)、DOM4-130-16(SEQIDNO:231)、DOM4-130-17(SEQIDNO:232)、DOM4-l30-18(SEQIDNO:233)、DOM4-130-19(SEQIDNO:234)、DOM4-130-20(SEQIDNO:235)、DOM4-130-21(SEQIDNO:236)、DOM4-130-22(SEQIDNO:237)、DOM4-130-23(SEQIDNO:238)、DOM4-130-24(SEQIDNO:239)、DOM4-130-25(SEQIDNO:240)、DOM4-130-26(SEQIDNO:241)、DOM4-130-27(SEQIDNO:242)、DOM4-130-28(SEQIDNO:243)、DOM4-130-31(SEQIDNO:244)、，、(00￡:ONai、(,onai加s:、(96乙:ONai63S:、(膨onai加s:、(06乙:ONaib3S:、(88Z:ONaiD3S:、(98Z:ONaiD3S:、0ONai加s:、d:ONai。3S:、(oONaiD3S:、(9":onco加s:、Conaib3S:、(乙ZZ:ONai加S:、(0/Z:ONaib3S:、(89乙:ONaib3S乂99乙:ONai63S、(跳:ONaib3S、(Z9Z:ONaib3S、(09乙:ONaiD3S、(8W:ONaib3S、(9K:ONOQ加S、(t^:ONai加S、(W:ONaib3S、(owonaib3S、(817乙:ONaiD3S、(外乙:ONaib3S:頓oa頓oa￡8_0￡1頓OGis-on頓oa6ZrOH.頓OG頓oas綴i頓oa，oa預(yù)oa69-0￡1頓oa厶9掘頓OQ頓oa，oa頓OQ頓oa，oa-柳oq-兩og-酒oa6t-oei，oa"-on-柳oa-兩oa^-on預(yù)oa預(yù)oa66Z:ONai丄6Z:ONai加S::S6乙:ONCIIb3S:區(qū)onaib3S::I6S:ONaib3S::onaib3S::厶S乙:OMaib3S::SS乙:ONciib3S:駕:ONai:6":ONait)3S::AZZ:ONGI03S::"乙:ONaib3S::￡":ONaiD3S::UZ:ONGID3S::69Z:ONaiD3S::，ongib3s::￡9Z:ONai加S:i9r.ONaib3S:6WONai加s:W:ONGID3S::SS乙:ONGI加S:W:ONaiD3S::IW:ONaiD3S::6W:ONaiD3S::尻:ONai:脫:ONai加S:08-on-,oa9綴l-剛OQo綴i-柳oa99一on-w^oaw陽ou-,oaoi7-on-WAioa雖"/s蚩法承逢r法紛DOM4-130-88(SEQIDNO:301)、DOM4-130-89(SEQIDNO:302)、DOM4-130-90(SEQIDNO:303)、DOM4-130-91(SEQIDNO:304)、D0M4-130-92(SEQIDNO:305)、D0M4-130-93(SEQIDNO:306)、DOM4-130-94(SEQIDNO:307)、DOM4-130-95(SEQIDNO:308)、DOM4-130-96(SEQIDNO:309)、DOM4-130-97(SEQIDNO:310)、DOM4-130-98(SEQIDNO:311)、DOM4-130-99(SEQIDNO:312)、DOM4-130-100(SEQIDNO:313)、DOM4-130-101(SEQIDNO:314)、DOM4-130-102(SEQIDNO:315)、DOM4-130-103(SEQIDNO:316)、DOM4-130-104(SEQIDNO:317)、DOM4-130-105(SEQIDN0:31S)、DOM4-130-106(SEQIDNO:319)、DOM4-130-107(SEQIDNO:320)、DOM4-130-108(SEQIDNO:321)、D0M4-130-109(SEQIDNO:322)、DOM4-130-110(SEQIDNO:323)、DOM4-130-111(SEQIDNO:324)、DOM4-130-112(SEQIDNO:325)、DOM4-130-113(SEQIDNO:326)、DOM4-130-114(SEQIDNO:327)、DOM4-130-115(SEQIDNO:328)、DOM4-130-116(SEQIDNO:329)、DOM4-130-117(SEQIDNO:330)、DOM4-130-118(SEQIDNO:33丄)、DOM4-130-119(SEQIDNO:332)、DOM4-130-120(SEQIDNO:333)、DOM4-130-121(SEQIDNO:334)、DOM4-130-122(SEQIDNO:335)、DOM4-130-123(SEQIDNO:336)、DOM4-130-124(SEQIDNO:337)、DOM4-130-125(SEQIDNO:33S)、DOM4-130-126(SEQIDNO:339)、DOM4-130-127(SEQIDNO:340)、DOM4-130-128(SEQIDNO:341)、DOM4-130-129(SEQIDNO:342)、DOM4-130-130(SEQIDNO:343)、DOM4-130-131(SEQIDNO:344)、DOM4-130-132(SEQIDNO:345)和DOM4-130-133(SEQIDNO:346)。13、權(quán)利要求12所述的dAb單體，其中所述免疫球蛋白單可變域包含氨基酸序列，該氨基酸序列與選自下述的dAb的氨基酸序列具有至少約90%的氨基酸序列一致性DOM4-130-30(SEQID<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>丄寸WOG、(6I￡:ONCIIb3S)901-On—WAioa、(8I￡:ONaiD3S)SOI隱OH寸WOa、(AI￡:ONCIIb3S)tKH-On寸WOa、(9l「ONaiD3S)￡0I-0￡I-WAIOCI、(SI￡:ONCIIb3S)乙(H-0Hi7WOa、Ol￡:ONGI加s)ioi-on預(yù)oa、(￡ie:ONiai加s)ooi-on-,oa、(乙I「ONai66-0￡I-t7WOa、<GI63S)、(0I￡:ONai加s)〔60￡:OMGID3S)96-on-兩oa、(80￡:ONaiS6一on-w^oa、〔綴:ONGI、(90￡:ONaibas)GI、(區(qū):ONai16-on-剛oa"〔￡0￡:ONGI、(乙0。ONaiGIai:66t:ONGI、(縱:ONaiw-on-tiAioa、〔席ONGI178-0n寸WOG、(96Z:ONai加s)￡8-on-t7woa、GI63S)aiis-on-w/^oa、GI加S)、(S6Z:ONai加s)〔16乙:ONai加S)、(062:ONai加s)zzron-w^oa、〔68Z:ONGI。3S)ai加s)GI、(9SZ:ONGIb3S)￡A-on-t7Woa、GIt)3S)、(藩ONaiu-ou-wwoa、GIb3S)0Zr0￡I-i7WOaai加s)69—on寸woa、(，ONGI。3S)aiA9-on-WA[oa、(6":ONGI、C頂aibas)s9-on寸woa、GI。3S)、(9":ONai加s)￡9-0￡I-W/MOa、GI。3S)ai加s)i9-on-twoa、GI、(乙":ONai加s)6s-ou寸pvoa、〔IZZ:ONGIGIAS-on寸Pvoa、〔69Z:ONGI。3S)9S-on陽剛OGaiD3S)"-on寸woa、ai。3S)t^一on-WAioa雖"/9第法求逢r承汾DOM4-130-109(SEQIDNO:322)、DOM4-130-110(SEQIDNO:323)、DOM4-130-m(SEQIDNO:324)、DOM4-130-112(SEQIDNO:325)、DOM4-130-113(SEQIDNO:326)、DOM4-130-114(SEQIDNO:327)、DOM4-130-115(SEQIDNO:328)、DOM4-130-116(SEQIDNO:329)、DOM4-130-117(SEQIDNO:330)、D0M4-130-118(SEQIDNO:331)、DOM4-130-119(SEQIDNO:332)、DOM4-130-120(SEQIDNO:333)、DOM4-130-121(SEQIDNO:334)、DOM4-130-122(SEQIDNO:335)、DOM4-130-123(SEQIDNO:336)、DOM4-130-124(SEQIDNO:337)、D0M4-130-125(SEQIDNO:338)、DOM4-130-126(SEQIDNO:339)、DOM4畫130匿127(SEQIDNO:340)、DOM4-130-128(SEQIDNO:341)、D0M4-130-129(SEQIDNO:342)、DOM4-130-130(SEQIDNO:343)、DOM4-130-131(SEQIDNO:344)、DOM4-130-132(SEQIDNO:345)和DOM4-130-133(SEQIDNO:346)。14、權(quán)利要求1所述的dAb單體，其中所述dAb用表面等離子共振法測定，其與IL-1R1結(jié)合的親和力常數(shù)(KD)為約300nM至約5pM。15、一配體，其包含根據(jù)權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)的dAb單體，以及半衰期延長部分。16、權(quán)利要求15所述的配體，其中所述半衰期延長部分為聚烷撐二醇部分、血清白蛋白或其片段、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體或其轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合部分，或含有與提高體內(nèi)半衰期的多肽結(jié)合的位點(diǎn)的抗體或抗體片段。17、權(quán)利要求15所迷的配體，其中所述半衰期延長部分為聚乙二醇部分。18、權(quán)利要求16所述的配體，其中所述半衰期延長部分為含有血清白蛋白或新生兒Fc受體結(jié)合位點(diǎn)的抗體或抗體片段。19、權(quán)利要求18所述的配體，其中所述抗體或抗體片段為抗體片段，所述抗體片段為免疫球蛋白單可變域。20、權(quán)利要求19所述的配體，其中所述免疫球蛋白單可變域與選自下列的dAb竟?fàn)幣c人血清白蛋白的結(jié)合DOM7m-16(SEQIDNO:723)、DOM7m響12(SEQIDNO:724)、DOM7m-26(SEQIDNO:725)、DOM7r-l(SEQIDNO:726)、DOM7r-3(SEQIDNO:727)、DOM7r-4(SEQIDNO:728)、DOM7r畫5(SEQIDNO:729)、DOM7r-7(SEQIDNO:730)、DOM7r-8(SEQIDNO:731)、DOM7h畫2(SEQIDNO:732)、DOM7h-3(SEQIDNO:733)、DOM7h-4(SEQIDNO:734)、DOM7h-6(SEQIDNO:735)、DOM7h畫l(SEQIDNO:736)、DOM7h-7(SEQIDNO:737)、DOM7h-8(SEQIDNO:746)、DOM7r-13(SEQIDNO:747)、DOM7r-14(SEQIDNO:748)、DOM7h-22(SEQIDNO:739)、DOM7h-23(SEQIDNO:740)、DOM7h-24(SEQIDNO:741)、DOM7h-25(SEQIDNO:742)、DOM7h誦26(SEQIDNO:743)、DOM7h-21(SEQIDNO:744)、DOM7h-27(SEQIDNO:745)、DOM7r-15(SEQIDNO:749)、DOM7r-16(SEQIDNO:750)、DOM7r-17(SEQIDNO:751)、DOM7r-18(SEQIDNO:752)、DOM7r-19(SEQIDNO:753)、DOM7r陽20(SEQIDNO:754)、DOM7r-21(SEQIDNO:755)、DOM7r扁22(SEQIDNO:756)、DOM7r-23(SEQIDNO:757)、DOM7r-24(SEQIDNO:758)、DOM7r-25(SEQIDNO:759)、DOM7r-26(SEQIDNO:760)、DOM7r-27(SEQIDNO:761)、DOM7r-28,IDNO:762)、DOM7r-29(SEQIDNO:763)、DOM7r-30(SEQIDDOM7r-31(SEQIDNO:765)、DOM7r-32(SEQIDNO:766)和DOM7r-33(SEQIDNO:767)。21、權(quán)利要求20所述的配體，其中與人血清白蛋白結(jié)合的所述免疫球蛋白單可變域含有氨基酸序列，該氨基酸序列與選自下述的dAb的氨基酸序列具有至少約90%的氨基酸序列一致性DOM7m-(SEQIDNO:723)、DOM7m-12(SEQIDNO:724)、DOM7m-26(SEQIDNO:725)、DOM7r畫l(SEQIDNO:726)、DOM7r-3(SEQIDNO:727)、DOM7r-4(SEQIDNO:72S)、DOM7r-5(SEQIDNO:729)、DOM7r-7(SEQIDNO:730)、DOM7r-8(SEQIDNO:731)、DOM7h-2(SEQIDNO:732)、DOM7h-3(SEQIDNO:733)、DOM7h-4(SEQIDNO:734)、DOM7h-6(SEQIDNO:735)、DOM7h-l(SEQIDNO:736)、DOM7h-7(SEQIDNO:737)、DOM7h-8(SEQIDNO:746)、DOM7r-13(SEQIDNO:747)、DOM7r-14(SEQIDNO:748)、DOM7h-22(SEQIDNO:739)、DOM7h-23(SEQIDNO:740)、DOM7h-24(SEQIDNO:741)、DOM7h-25(SEQIDNO:742)、DOM7h-26(SEQIDNO:743)、DOM7h-21(SEQIDNO:744)、DOM7h畫27(SEQIDNO:745)、DOM7r-15(SEQIDNO:749)、DOM7r-16(SEQIDNO:750)、DOM7r-17(SEQIDNO:751)、DOM7r-18(SEQIDNO:752)、DOM7r畫19(SEQIDNO:753)、DOM7r-20(SEQIDNO:754)、DOM7r-21(SEQIDNO:755)、DOM7r-22(SEQIDNO:756)、DOM7r-23(SEQIDNO:757)、DOM7r-24(SEQIDNO:75S)、DOM7r-25(SEQIDNO:759)、DOM7r-26(SEQIDNO:760)、DOM7r-27(SEQIDNO:761)、DOM7r-28(SEQIDNO:762)、DOM7r-29(SEQIDNO:763)、DOM7r-30(SEQIDDOM7r-31(SEQIDNO:765)、DOM7r-32(SEQIDNO:766)和DOM7r-33(SEQIDNO:767)。22、一配體，含有對IL-1R1具有結(jié)合特異性并抑制IL-1和IL-lra與IL-1R1結(jié)合的dAb單體，其中所述dAb單體選自DOM4-130-30(SEQIDNO:3)、DOM4-130-46(SEQIDNO:4)、DOM4-130-51(SEQIDNO:5)、DOM4-130-53(SEQIDNO:6)和DOM4-130-54(SEQIDNO:7)。23、權(quán)利要求22所述的配體，其中所述配體為dAb單體。24、權(quán)利要求22所述的配體，其中所述配體為所述dAb單體的同型二聚體、同型三聚體或同型寡聚體。25、權(quán)利要求22所述的配體，其中所述配體為含有選自下述至少兩種不同dAb單體的異型二聚體、異型三聚體或異型寡聚體DOM4-130-30(SEQIDNO:3)、DOM4-130-46(SEQIDNO:4)、DOM4-130-51(SEQIDNO:5)、DOM4-130-53(SEQIDNO:6)、andDOM4-130-54(SEQIDNO:7)。26、權(quán)利要求22所述的配體，進(jìn)一步包含與血清白蛋白結(jié)合的dAb單體。27、權(quán)利要求26所述的配體，其中所述與血清白蛋白結(jié)合的dAb單體為DOM7h-8(SEQIDNO:746)。28、權(quán)利要求27所述的配體，其中所述配體包含DOM4-130-54(SEQIDNO:7)與DOM7h-8(SEQIDNO:746)。29、一配體，其包含對IL-1R1具有結(jié)合特異性并抑制IL-1和IL-lra與IL-1R1結(jié)合的dAb單體，以及對TNFRl具有結(jié)合特異性的dAb單體。30、權(quán)利要求29所述的配體，其中對IL-1R1具有結(jié)合特異性并抑制IL-1和IL-lra與IL-lRl結(jié)合的所述dAb單體與選自下述的dAb竟?fàn)幣cIL-1R1的結(jié)合DOM4-130-30(SEQIDNO:3)、DOM4-130-46(SEQIDNO;4)、DOM4-130-51(SEQIDNO:5)、DOM4-130-53(SEQIDNO:6)、DOM4-130-54(SEQIDNO:7)、DOM4-130(SEQIDNO:215)、DOM4-130陽1(SEQIDNO:216)、DOM4-130-2(SEQIDNO:217)、DOM4-130-3(SEQIDNO:218)、DOM4-130-4(SEQIDNO:219)、DOM4-130-5(SEQIDNO:220)、DOM4-130-6(SEQIDNO:221)、DOM4-130-7(SEQIDNO:222)、DOM4-130-8(SEQIDNO:223)、DOM4-130-9(SEQIDNO:224)、DOM4-130-10(SEQIDNO:225)、DOM4-130-11(SEQIDNO:226)、DOM4-130-12(SEQIDNO:227)、DOM4-130-13(SEQIDNO:228)、DOM4-130-14(SEQID<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>(SEQIDNO:339)、DOM4一130一127(SEQIDNO:340)、DOM4一130-128(SEQIDNO:341)、DOM4一130一129(SEQIDNO:342)、DOM4-130一130(SEQIDNO:343)、DOM4一130一131(SEQIDNO:344)、DOM4一130一132(SEQIDNO:345)和DOM4一130一133(SEQIDNO:346)。31、權(quán)利要求30所述的配體，其中對IL一IRI具有結(jié)合特異性并抑制IL一1和IL一1ra與IL一IRI結(jié)合的所述dAb單體含有氨基酸序列，該氨基酸序列與選自下述的dAb的氨基酸序列具有至少約90%的氨基酸序列一致性DOM4一130一30(SEQIDNO:3)、DOM4一130一46(SEQIDNO:4)、DOM4一130一51(SEQIDNO:5)、DOM4一130一53(SEQIDNO:6)、DOM4一130一54(SEQIDNO:7)、DOM4一130(SEQIDNO:215)、DOM4一130一1(SEQIDNO:216)、DOM4一130一2(SEQIDNO:217)、DOM4一130一3(SEQIDNO:218)、DOM4一130一4(SEQIDNO:219)、DOM4一130一5(SEQIDNO:220)、DOM4一130一6(SEQIDNO:221)、DOM4一130一7(SEQIDNO:222)、DOM4一130一8(SEQIDNO:223)、DOM4一130一9(SEQIDNO:224)、DOM4一130一10(SEQIDNO:225)、DOM4一130一11(SEQIDNO:226)、DOM4一130一12(SEQIDNO:227)、DOM4一130一13(SEQIDNO:228)、DOM4一130一14(SEQIDNO:229)、DOM4一130一15(SEQIDNO:230)、DOM4一130一16(SEQIDNO:231)、DOM4一130一17(SEQIDNO:232)、DOM4一130一18(SEQIDNO:233)、DOM4一130一19(SEQIDNO:234)、DOM4一130一20(SEQIDNO:235)、DOM4一130一21(SEQIDNO:236)、DOM4一130一22(SEQIDNO:237)、DOM4一130一23(SEQIDNO:238)、DOM4一130一24(SEQIDNO:239)、DOM4一130一25(SEQIDNO:240)、DOM4一130一26(SEQIDNO:241)、DOM4一130一27(SEQIDNO:242)、DOM4一130一28(SEQIDNO:243)、DOM4一130一31(SEQIDNO:244)、DOM4一130一32(SEQIDNO:245)、DOM4一130一33(SEQIDNO:246)、DOM4一130一34(SEQIDNO:247)、DOM4一130一35(SEQIDNO:248)、DOM4一130一36(SEQIDNO:249)、DOM4一130一37(SEQIDNO:250)、DOM4一130一38(SEQIDNO:251)、DOM4一130一39(SEQIDNO:252)、DOM4一130一40(SEQIDNO:253)、DOM4一130一41(SEQIDNO:254)、DOM4一130一42(SEQIDNO:255)、DOM4一130一43(SEQIDNO:256)、DOM4一130一44(SEQIDNO:257)、DOM4一130一45(SEQIDNO:258)、DOM4一130一46(SEQIDNO:259)、DOM4一130一47(SEQIDNO:260)、DOM4一130一48(SEQIDNO:261)、DOM4一130一49(SEQIDNO:262)、DOM4一130一50(SEQIDNO:263)、DOM4一130一51(SEQIDNO:264)、DOM4一130一52(SEQIDNO:265)、DOM4一130一53(SEQIDNO:266)、DOM4一130一54(SEQIDNO:267)、DOM4一130一55(SEQIDNO:268)、DOM4一130一56(SEQIDNO:269)、DOM4一130一57(SEQIDNO:270)、DOM4一130一58(SEQIDNO:271)、DOM4一130一59(SEQIDNO:272)、DOM4一130一60(SEQIDNO:273)、DOM4一130一61(SEQIDNO:274)、DOM4一130一62(SEQIDNO:275)、DOM4一130一63(SEQIDNO:276)、DOM4一130一64(SEQIDNO:277)、DOM4一130一65(SEQIDNO:278)、DOM4一130一66(SEQIDNO:279)、DOM4一130一67(SEQIDNO:280)、DOM4一130一68(SEQIDNO:281)、DOM4一130一69(SEQIDNO:282)、DOM4一130一70(SEQIDNO:283)、DOM4一130一71(SEQIDNO:284)、DOM4一130一72(SEQIDNO:285)、DOM4一130一73(SEQIDNO:286)、DOM4一130一74(SEQIDNO:287)、DOM4一130一75(SEQIDNO:288)、DOM4一130一76(SEQIDNO:289)、DOM4一130一77(SEQIDNO:290)、DOM4一130一78(SEQIDNO:291)、DOM4一130一79(SEQIDNO:292)、DOM4一130一80(SEQIDNO:293)、DOM4一130一81(SEQIDNO:294)、DOM4一130一82(SEQIDNO:295)、DOM4一130一83(SEQIDNO:296)、DOM4一130一84(SEQIDNO:297)、DOM4一130一85(SEQIDNO:298)、DOM4一130一86(SEQIDNO:299)、DOM4一130一87(SEQIDNO:300)、DOM4一130一88(SEQIDNO:301)、DOM4一130一89(SEQIDNO:302)、DOM4一130一90(SEQIDNO:303)、DOM4一130一91(SEQIDNO:304)、DOM4一130一92(SEQIDNO:305)、DOM4-130-93(SEQIDNO:306)、DOM4-130-94(SEQIDNO:307)、DOM4-130-95(SEQIDNO:308)、DOM4-130-96(SEQIDNO:309)、DOM4-130-97(SEQIDNO:310)、DOM4-130-98(SEQIDN0:3H)、DOM4-130-99(SEQIDNO:312)、DOM4-130-100(SEQIDNO:313)、DOM4-130-101(SEQIDNO:314)、DOM4-130-102(SEQIDNO:315)、DOM4-130-103(SEQIDNO:316)、D0M4-130-104(SEQIDNO:317)、DOM4-130-105(SEQIDNO:318)、DOM4-130-106(SEQIDNO:319)、DOM4-130-107(SEQIDNO:320)、DOM4-130-108(SEQIDNO:321)、DOM4-130-109(SEQIDNO:322)、DOM4-130-110(SEQIDNO:323)、DOM4-130-111(SEQIDNO:324)、DOM4-130-112(SEQIDNO:325)、DOM4-130-U3(SEQIDNO:326)、DOM4-130-114(SEQIDNO:327)、DOM4-130-115(SEQIDNO:328)、DOM4-130-116(SEQIDNO:329)、DOM4-130-117(SEQIDNO:330)、DOM4-130-118(SEQIDNO:331)、DOM4-130-119(SEQIDNO:332)、DOM4-130-120(SEQIDNO:333)、DOM4-130-121(SEQIDNO:334)、DOM4-130-122(SEQIDNO:335)、D0M4-130-123(SEQIDNO:336)、DOM4-130-124(SEQIDNO:337)、DOM4-130-125(SEQIDNO:33S)、DOM4-130-126(SEQIDNO:339)、DOM4-130-127(SEQIDNO:340)、DOM4-130-128(SEQIDNO:341)、DOM4-130-129(SEQIDNO:342)、DOM4-130-130(SEQIDNO:343)、DOM4-130-131(SEQIDNO:344)、DOM4-130-132(SEQIDNO:345)和DOM4-130-133(SEQIDNO:346)。32、權(quán)利要求29-31中任一項(xiàng)的所述配體，其中對TNFRl具有結(jié)合特異性的所述dAb單體與選自下列的dAb竟?fàn)幣cTNFRl的結(jié)合TAR2h-12(SEQIDNO:785)、TAR2h-13(SEQIDNO:786)、TAR2h-14(SEQIDNO:787)、TAR2h-16(SEQIDNO:7S8)、TAR2h-17(SEQIDNO:789)、TAR2h隱18(SEQIDNO:790)、TAR2h-19(SEQ<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>TAR2h-5(SEQIDTA線-5d2(SEQIDTAR2h腸5d4(SEQIDTAR2h-5d6(SEQIDTAR2h-5d8(SEQIDTAR2h-5dlO(SEQIDTAR2h-5dl2(SEQIDNO:959)、TAR2h畫178(SEQIDNO:960)、TAR2h-201(SEQIDNO:961)、TAR2h-202(SEQIDNO:962)、TAR2h-203(SEQIDNO:963)、TAR2h-204(SEQIDNO:964)、TAR2h-185-25(SEQIDNO:965)、TAR2h-154-10SEQIDNO:966)、TAR2h-205(SEQIDNO:967)、TAR2h-10(SEQIDNO:968)NO:969)、TA線畫5dl(SEQIDNO:970)、NO:971)、TAR2h-5d3(SEQIDNO:972)、NO:973)、TAR2h-5d5(SEQIDNO:974)、NO:975)、TAR2h-5d7(SEQIDNO:976)、NO:977)、TA線-5d9(SEQIDNO:978)、NO:979)、TAR2h-5dll(SEQIDNO:980)、NO:981)和TAR2h-5dl3(SEQIDNO:982)。33、權(quán)利要求32所述的配體，其中對TNFR1具有結(jié)合特異性的所述dAb單體含有氨基酸序列，該氨基酸序列與選自下述的dAb的氨基酸序列具有至少約90%的氨基酸序列一致性<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula><image>imageseeoriginaldocumentpage23</image>NO:979)、TAR2h-5dll(SEQIDNO:980)、TAR2h-5d12(SEQIDNO:981)和TAR2h-5d13(SEQIDNO:982)。34、權(quán)利要求29-33中任一項(xiàng)的配體，進(jìn)一步含有半衰期延長部分。35、權(quán)利要求34所述的配體，其中所述半衰期延長部分為聚烷撐二醇部分、血清白蛋白或其片^:、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體或其轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合部位，或含有提高體內(nèi)半衰期的多肽的結(jié)合位點(diǎn)的抗體或抗體片段。36、權(quán)利要求35所述的配體，其中所述半衰期延長部分為聚乙二醇部分。37、權(quán)利要求35所述的配體，其中所述半衰期延長部分為含有血清白蛋白或新生兒Fc受體結(jié)合位點(diǎn)的抗體或抗體片段。38、權(quán)利要求37所述的配體，其中所述抗體或抗體片段為抗體片段，所述抗體片段為免疫球蛋白單可變域。39、權(quán)利要求38所述的配體，其中所述免疫球蛋白單可變域與選自下列的dAb竟?fàn)幣c人血清白蛋白的結(jié)合DOM7m-16(SEQIDNO:723)、DOM7m-12(SEQIDNO:724)、DOM7m-26(SEQIDNO:725)、DOM7r-l(SEQIDNO:726)、DOM7r-3(SEQIDNO:727)、DOM7r-4(SEQIDNO:728)、DOM7r-5(SEQIDNO:729)、DOM7r-7(SEQIDNO:730)、DOM7r-8(SEQIDNO:731)、DOM7h-2(SEQIDNO:732)、DOM7h畫3(SEQIDNO:733)、DOM7h-4(SEQIDNO:734)、DOM7h-6(SEQIDNO:735)、DOM7h-l(SEQIDNO:736)、DOM7h-7(SEQIDNO:737)、DOM7h-8(SEQIDNO:746)、DOM7r-13(SEQIDNO:747)、DOM7r-14(SEQIDNO:74S)、DOM7h-22(SEQIDNO:739)、DOM7h-23(SEQIDNO:740)、DOM7h-24(SEQIDNO:741)、DOM7h-25(SEQIDNO:742)、DOM7h-26(SEQIDNO:743)、DOM7h-21(SEQIDNO:744)、DOM7h-27(SEQIDNO:745)、DOM7r一15(SEQIDNO:749)、DOM7r一16(SEQIDNO:750)、DOM7r一17(SEQIDNO:751)、DOM7r一18(SEQIDNO:752)、DOM7r一19(SEQIDNO:753)、DOM7r一20(SEQIDNO:754)、DOM7r一21(SEQIDNO:755)、DOM7r一22(SEQIDNO:756)、DOM7r一23(SEQIDNO:757)、DOM7r一24(SEQIDNO:758)、DOM7r一25(SEQIDNO:759)、DOM7r一26(SEQIDNO:760)、DOM7r一27(SEQIDNO:761)、DOM7r一28(SEQIDNO:762)、DOM7r一29(SEQIDNO:763)、DOM7r一30(SEQIDNO:764)、DOM7r一31(SEQIDNO:765)、DOM7r一32(SEQIDNO:766)和DOM7r一33(SEQIDNO:767)。40、權(quán)利要求39所述的配體，其中與人血清白蛋白結(jié)合的所述免疫球蛋白單可變域包含氨基酸序列，該氨基酸序列與選自下述的dAb的氨基酸序列具有至少約90％的氨基酸序列一致性DOM7m-16(SEQIDNO:723)、DOM7m一12(SEQIDNO:724)、DOM7m一26(SEQIDNO:725)、DOM7r一1(SEQIDNO:726)、DOM7r一3(SEQIDNO:727)、DOM7r一4(SEQIDNO:728)、DOM7r一5(SEQIDNO:729)、DOM7r一7(SEQIDNO:730)、DOM7r一8(SEQIDNO:731)、DOM7h一2(SEQIDNO:732)、DOM7h一3(SEQIDNO:733)、DOM7h一4(SEQIDNO:734)、DOM7h一6(SEQIDNO:735)、DOM7h一l(SEQIDNO:736)、DOM7h一7(SEQIDNO:737)、DOM7h一8(SEQIDNO:746)、DOM7r一13(SEQIDNO:747)、DOM7r一14(SEQIDNO:748)、DOM7h一22(SEQIDNO:739)、DOM7h一23(SEQIDNO:740)、DOM7h一24(SEQIDNO:741)、DOM7h一25(SEQIDNO:742)、DOM7h一26(SEQIDNO:743)、DOM7h一21(SEQIDNO:744)、DOM7h一27(SEQIDNO:745)、DOM7r一15(SEQIDNO:749)、DOM7r一16(SEQIDNO:750)、DOM7r一17(SEQIDNO:751)、DOM7r一18(SEQIDNO:752)、DOM7r一19(SEQIDNO:753)、DOM7r一20(SEQIDNO:754)、DOM7r一21(SEQIDNO:755)、DOM7r一22(SEQIDNO:756)、DOM7r一23(SEQIDNO:757)、DOM7r一24(SEQIDNO:758)、DOM7r一25(SEQIDNO:759)、DOM7r一26(SEQIDNO:760)、DOM7r一27(SEQIDNO:761)、DOM7r一28(SEQIDNO:762)、DOM7r一29(SEQIDNO:763)、DOM7r一30(SEQIDNO:764)、DOM7r一31(SEQIDNO:765)、DOM7r一32(SEQIDNO:766)和DOM7r一33(SEQIDNO:767)。41、一分離的核酸，其編碼權(quán)利要求1一40中任一項(xiàng)所述的dAb單體或配體。42、一重組核酸，其編碼權(quán)矛！J要求1一40中任一項(xiàng)所述的dAb單體或配體。43、一載體，其包含編碼權(quán)牙l」要求1一40中任一項(xiàng)的dAb單體或配體的核酸。44、權(quán)利要求43所述的載體，其中所述載體為表達(dá)載體。45、一宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求42的重組核酸。46、一宿主細(xì)胞，其包含權(quán)矛IJ要求43或44的載體。47、制備對IL一IRI具有結(jié)合特異性并抑制IL一1和IL一lra與IL-IRI結(jié)合的dAb單體或配體的方法，其包括將權(quán)牙！J要求45的宿主細(xì)胞維持在適合所述重組核酸表達(dá)的條件下。48、制備對IL一IRI具有結(jié)合特異性并抑制IL一1和IL一lra與IL-IRI結(jié)合的dAb單體或配體的方法，其包括將權(quán)利要求46的宿主細(xì)胞維持在適合所述載體表達(dá)的條件下。49、一藥物組合物，其含有權(quán)利要求1一40中任一項(xiàng)的dAb單體或配體，以及生理上可接受的載體。50、權(quán)利要求49所述的藥物組合物，其中所述組合物為靜脈注射給藥、肌內(nèi)注射給藥、腹腔內(nèi)給藥、動(dòng)脈內(nèi)給藥、鞘內(nèi)給藥裝置給藥、關(guān)節(jié)內(nèi)給藥或皮下給藥。51、權(quán)利要求49所述的藥物組合物，其中所述組合物為肺部給藥、鼻腔內(nèi)給藥裝置給藥、陰道給藥或直腸給藥。52、一給藥裝置，其含有權(quán)利要求49所述的藥物組合物。53、權(quán)利要求52所述的給藥裝置，其中所迷給藥裝置選自腸道外給藥裝置，靜脈給藥裝置，肌肉內(nèi)給藥裝置，腹腔內(nèi)給藥裝置，透皮給藥裝置，肺部給藥裝置，動(dòng)脈內(nèi)給藥裝置，鞘內(nèi)給藥裝置，關(guān)節(jié)內(nèi)給藥裝置，舌下給藥裝置，鼻腔內(nèi)給藥裝置，陰道給藥裝置，以及直腸給藥裝置。54、權(quán)利要求53所述的給藥裝置，其中所述裝置選自注射器、透皮給藥裝置、膠嚢、片劑、噴霧器、吸入器、霧化器、煙霧器、起霧器、干粉吸入器、定量吸入器、定量噴霧器、定量起霧器、定量霧化器和導(dǎo)管。55、一治療炎癥疾病的方法，其包含將治療有效量的權(quán)利要求1—40中任一項(xiàng)的dAb單體或配體施用于對其有需求的受試者。56、權(quán)利要求55所述的方法，其中所述炎癥疾病為關(guān)節(jié)炎。57、耐蛋白酶降解的域抗體(dAb)單體在疾病治療、診斷和/或預(yù)防中的用途。58、耐蛋白酶降解的域抗體(dAb)單體在制備治療炎癥疾病、關(guān)節(jié)炎或呼吸系統(tǒng)疾病的藥物中的用途。59、耐蛋白酶降解的域抗體(dAb)單體在制備肺部給藥的藥物中的用途。60、一治療炎癥疾病、關(guān)節(jié)炎或呼吸系統(tǒng)疾病的方法，其包含將治療有效量的耐蛋白酶降解的域抗體(dAb)單體施用于對其有需求的受試者。61、權(quán)利要求60所述的方法，其中所述dAb是通過肺部給藥的方式施用。62、權(quán)利要求57-61中^f壬一項(xiàng)的所述dAb單體、用途或方法，其中所述dAb單體耐彈性蛋白酶。63、權(quán)利要求57-62中任一項(xiàng)的所述dAb單體、用途或方法，其中所述dAb單體為免疫球蛋白輕鏈可變域。64、權(quán)利要求63所述的dAB單體、用途或方法，其中所述dAb單體為Vk。65、權(quán)利要求57-64中任一項(xiàng)的所述dAB單體、用途或方法，其中所述dAb對白細(xì)胞介素-1受體1型(IL-1R1)具有結(jié)合特異性。66、權(quán)利要求65所述的dAB單體、用途或方法，其中所述dAB單體與抗-IL-1R1dAb竟?fàn)幣cIL-1R1的結(jié)合，其中所述抗-IL-1R1dAb由選自SEQIDNO:l至SEQIDNO:349的氨基酸序列組成。67、權(quán)利要求66所述的dAB單體、用途或方法，其中所述dAB單體與抗-IL-lRldAb竟?fàn)幣cIL-1R1的結(jié)合，其中所述抗-IL-1R1dAb由選自SEQIDNO:3至SEQIDNO:7的氨基酸組成。全文摘要本發(fā)明涉及與IL-1R1結(jié)合并抑制IL-1(如IL-1α和/或IL-1β)和IL-1ra與IL-1R1結(jié)合的dAb單體，以及含有此種dAb單體的配體。本發(fā)明涉及耐蛋白酶的dAb單體，和含有耐蛋白酶dAb單體的配體。本發(fā)明還涉及包括載體在內(nèi)的編碼所述dAb單體和配體的核酸，含有該核酸的宿主細(xì)胞，以及制備dAb單體或配體的方法。本發(fā)明還涉及含有所述dAb單體或配體的藥物組合物，以及包含施用dAb單體或配體的治療方法。文檔編號(hào)C07K16/28GK101466734SQ200680051927公開日2009年6月24日申請日期2006年11月30日優(yōu)先權(quán)日2005年12月1日發(fā)明者A·巴斯蘭,I·M·湯林森,P·D·德魯,R·M·T·德維爾德特申請人:杜門蒂斯有限公司