專利名稱：Aβ肽片段對血管生成的調(diào)節(jié)的制作方法
相關申請的交叉引用本申請要求2005年11月10目申請的美國臨時申請?zhí)?0/735,472的權益，其內(nèi)容通過引用結合到本文中。
發(fā)明領域
本發(fā)明涉及用于治療由病理性血管生成介導的疾病和病理病癥或過程的組合物和方法，該方法包括給予受累于這些疾病、病癥或過程的患者全長Aβ肽的生物活性片段。
相關領域描述
阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是西方國家老年性癡呆的主要原因，以胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結的進行性累積、胞外實質(zhì)老年斑和腦血管沉積物為特征(Sissodia等，F(xiàn).A.S.E.B.J.9366-370(1995))。老年斑和腦血管沉積物的主要成分是β-淀粉樣肽，是由39-43個氨基酸殘基Aβ肽組成的聚合形式，由淀粉樣前體蛋白(APP)蛋白水解后產(chǎn)生(Naidu等，1995J.Biol.Chem.2701369-1374；Gorevic等，1986J.Neuropathol.Exp.Neurol.45，647-64；Selkoe等，1986J.Neurochem.46，1820-34)。老年斑的主要蛋白質(zhì)成分是β/A4淀粉樣蛋白，是一種42-43個氨基酸的肽。

伴有腦淀粉樣蛋白血管病(CAA)的血管病理是晚期AD病例的標準，腦淀粉樣蛋白血管病是在尸體解剖時觀察到的一種最普遍的異常情況(Ellis等，Neurology 461592-1596(1996))。某些血管病變，例如影響腦內(nèi)皮和室周白質(zhì)病變的微血管變性，在大多數(shù)AD病例中清晰可見(Ellis等，Neurology 461592-1596(1996)；Kalaria，Ann.N.Y.Acad.Sci.893113-125(1999))。此外，在AD腦微血管和毛細血管中觀察到形態(tài)變化；具體地說，末端小血管通常具有局灶性收縮及具有不規(guī)則形狀和排列的平滑肌細胞(Hashimura等，Jpn.J.PsychiatryNeurol.45661-665(1991))。AD腦的毛細血管通常顯示出具有不規(guī)則收縮的異常的管腔表面(abluminal surface)，并沿其管道擴張(Kimura等，Jpn.J.Psychiatry Neurol.45671-676(1991))。包括正電子發(fā)射斷層掃描(PET)和單光子發(fā)射計算機斷層掃描(SPECT)的功能成像技術揭示，在符合AD臨床標準之前個體存在血液灌注不足，表明血管畸形發(fā)生在疾病過程的早期(Nagata等，Neurobiology of Aging 21301-307(2000)；Johnson等，Neurobiology of Aging 21289-292(2000))。在包括腦血管損傷(例如創(chuàng)傷性腦損傷、腦卒中和腦動靜脈畸形)的其它疾病中，血管生成是主要的反應(Mendis等，Neurochem.Res.231117-23(1998)；Slevin等，Stroke 311863-70(2000)；Hashimoto等，Circ.Res.89111-3(2001))。已知有關AD腦內(nèi)腦血管損傷多血癥的報道，預期會引起血管生成修復反應，盡管在這一領域中的研究甚少。

已經(jīng)開發(fā)出幾種測定法以研究參與血管生成過程(粘附、遷移、生長、侵襲和分化)的具體步驟。了解Aβ對血管生成的作用，可能對了解其在AD中所觀察到的微腦血管畸形中的作用具有價值。在AD腦內(nèi)，已知Aβ肽在血管周圍形成原纖維沉積物，引起腦淀粉樣蛋白血管病(CAA)(Pardridge等，1987J.Neurochem.49，1394-401；Jellinger K.A.，Attems J.2005J.Neurol.Sci.229-230，37-41)。在AD腦內(nèi)可溶性和沉積性Aβ水平的增加可能引起血管損傷、炎癥/神經(jīng)膠質(zhì)增生，減少腦血流量(Paris等，2000Ann.N.Y.Acad.Sci.903，97-109；Johnson等，2005Radiology.234，851-9)。多項研究表明，血管功能削弱和血流量減少是AD腦特有的特征(Nicoll等，2004Neurobiol.Aging.25，589-97和603-4；Paris等，2004Brain Res.999，53-61；Beckmann等，2003J.Neurosci.23，8453-9；Farkasm等，2001“Cerebralmicrovascular pathology in aging and Alzheimer′s disease(衰老和阿爾茨海默病的腦微血管病理)”，Prog.Neurobiol.64，575-611)。最近，有研究表明AD中血管生成削弱，這與參與血管分化的基因改變有關(Wu等，2005Nat.Med.11，959-65)。已知在AD轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，腦毛細血管密度降低(Paris等，2004Neurosci.Lett.360，80-5；Lee等，2005Brain Res.Bull.65，317-22)。從TgAPPsw小鼠腦獲取的內(nèi)皮細胞和動脈外植體中，在重建的基底膜上，毛細血管樣結構形成削弱，表明在TgAPPsw小鼠中血管生成反應的異常變化得到最新的證實(Paris等，2004Neurosci.Lett.360，80-5)。

Paris等人的美國專利公布號2003/0077261公開了Aβ肽可以用作抗血管生成藥，而且公開了Aβ肽和APP的序列以及編碼它們的核酸序列，這些序列見

圖10所附序列表。

在多項不同的體外和體內(nèi)測定中，血管生成均被Aβ肽抑制(Paris等，2004Angiogenesis.7，75-85)。在體外，人腦微血管內(nèi)皮細胞接種至基質(zhì)膠(Matrigel)時，Aβ1-40和Aβ1-42可以劑量依賴性地抑制毛細血管形成，在高劑量時可促使毛細血管變性。還發(fā)現(xiàn)全長Aβ肽的突變型(包括1或2個氨基酸置換)，是有生物活性的抗血管生成藥。然而，低劑量時，Aβ似乎是促血管生成的(Paris等，2004Angiogenesis.7，75-85；Cantara等，2004F.A.S.E.B.J.18，1943-5)。
發(fā)明概述
我們預料不到地發(fā)現(xiàn)，全長Aβ肽的生物活性片段可用作抗血管生成藥。這些抗血管生成Aβ肽片段可用來治療由不需要和/或不受控制的血管生成介導的病理病癥(稱為“血管生成性疾病”)，如本文將進一步描述一樣。

因此，第一方面，本發(fā)明提供多種抗血管生成Aβ肽片段以及包含一種或多種該類片段的組合物。在一個實施方案中，生物活性Aβ肽片段的長度可為8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38或39個氨基酸。

在一個具體的實施方案中，抗血管生成Aβ肽片段是Aβ1-28肽片段、Aβ10-35肽片段、Aβ12-28肽片段、Aβ13-20肽片段或其其它的生物活性片段或變異體或同源物。

在一個具體的實施方案中，抗血管生成Aβ肽片段是Aβ12-28，含有氨基酸序列HHQKLVFF或其生物活性片段、變異體或同源物。

在另一個具體的實施方案中，抗血管生成Aβ肽片段是Aβ13-20或氨基酸序列HHGKLVFF或其生物活性變異體或同源物。變異體可以包括例如氨基酸置換。

在另一個實施方案中，本發(fā)明是包含抗血管生成Aβ肽片段和一種或多種藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑的藥物組合物。

第二方面，本發(fā)明提供通過給予有需要的受治療者有效量的生物活性Aβ肽片段，用于治療由病理性血管生成介導的疾病或病癥的方法，其中所述片段的長度介于8和39個氨基酸之間?？寡苌葾β肽片段任選與一種或多種治療藥物聯(lián)合或交替給藥。受治療者可以是例如哺乳動物(例如人)。

在一個實施方案中，本發(fā)明是通過給予有需要的受治療者有效量的生物活性Aβ肽片段用于治療癌癥的方法，任選與一種或多種化療藥物聯(lián)合或交替給藥。

在一個具體的實施方案中，本發(fā)明是通過給予有需要的受治療者有效量的Aβ12-38肽片段治療癌癥的方法，所述肽片段含有氨基酸序列HHQKLVFF或其生物活性片段、變異體或同源物。

在另一個具體的實施方案中，治療癌癥的方法包括給予有需要的受治療者有效量的Aβ13-20肽片段或氨基酸序列HHQKLVFF或其生物活性變異體或同源物。

可以通過任何合適的方式給予生物活性Aβ肽片段，該方式包括但不限于口服、胃腸外、靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、肺部、黏膜、局部、經(jīng)皮、皮下、肌內(nèi)、鞘內(nèi)或腹膜內(nèi)給藥。

本發(fā)明第三方面提供診斷方法和用于檢測和測定生物體液和組織中抗血管生成Aβ肽片段活性的試劑盒。

本發(fā)明第四方面提供診斷方法和篩選化合物的試劑盒，所述化合物通過干預Aβ肽片段的抗血管生成作用，在治療阿爾茨海默病中是有效的治療藥。

本發(fā)明另一方面是肽片段在......中的用途 附圖簡述
圖1是毛細血管總長度的曲線圖，用劑量為0μM、1μM、5μM和10μM的實施例8所述的各種Aβ肽片段占對照治療的百分比表示。

圖2A和圖2B是HUVEC樣品細胞增殖和細胞粘附的直方圖，用與實施例9所述的各種Aβ肽片段孵育后占對照的百分比表示。

圖3是毛細血管總長度的直方圖，用實施例10所述的肝素(0.5mg/ml或1mg/ml)、Aβ1-42肽、Aβ+肝素(500μg/ml)和Aβ+肝素(1mg/ml)治療占對照治療的百分比表示。

圖4是毛細血管總長度的曲線圖，用劑量為0μM、1μM、5μM和10μM的實施例11所述的Aβ1-28、Aβ1-28GGQGL和Aβ1-28AAQAL占對照治療的百分比表示。

圖5是與實施例11所述的Aβ肽片段孵育后形成的毛細血管照片(放大4倍)。

圖6是毛細血管總長度的曲線圖，用劑量為0μM、1μM、5μM和10μM的實施例12所述肽HHHQKLVFF、VHHQKLVII和VHHQKLVKK占對照治療的百分比表示。

圖7是響應實施例13所述的200ng VEGF、VEGF+0.5μg Aβ12-28、VEGF+2.5μg Aβ12-28和VEGF+5.0μg Aβ12-28的大鼠角膜微囊袋試驗(corneal micropocket assay)中血管生成指數(shù)(AI)的直方圖。

圖8是響應實施例14所述的VEGF、5μg Aβ1-28GGQGL及0.5μg、2.5μg和5μg Aβ12-28和HHH-肽(HHHQKLVFF)的大鼠角膜微囊袋試驗中血管生成指數(shù)(AI)的直方圖。

圖9是按實施例14所述經(jīng)7天孵育后大鼠角膜微囊袋的代表型照片，包括VEGF對照和0.5μg、2.5μg和5.0μg Aβ12-28。

圖10是Aβ肽和APP以及編碼它們的核酸的序列表，參見Paris等人的美國專利公布號2003/0077261。
發(fā)明詳述
抗血管生成療法是用于抑制腫瘤進程的頗有吸引力的方法，因為腫瘤生長取決于足夠的血液供給。本文公開了抑制血管生成的衍生自Aβ序列的短肽，可用于抗癌療法。

本發(fā)明提供抗血管生成Aβ肽片段，可用于治療不需要和/或不受控制的血管生成或病理性血管生成介導的病理病癥。本文提供具體的抗血管生成基序(HHQKLVFF)，可用于抗腫瘤療法或抗血管生成療法。
抗血管生成肽片段
本發(fā)明提供抗血管生成Aβ肽片段，用于治療與病理或不需要的血管生成相關的病癥或疾病。

本文所用術語“Aβ肽片段”是指全長Aβ肽的抗血管生成片段(例如Aβ1-40、Aβ1-42、Aβ1-43)，包括Aβ肽片段變異體、同源物(例如哺乳動物的直向同源物)和同等型(isoform)，除非另有說明。該術語還包括被一個或多個等同氨基酸或非天然氨基酸置換的片段。

在一個實施方案中，Aβ肽片段的氨基酸數(shù)比全長Aβ肽所得到的氨基酸總數(shù)少至少一個氨基酸。全長Aβ肽衍生自一種或多種淀粉樣前體蛋白(APP)同等型，即跨膜糖蛋白的蛋白酶解加工產(chǎn)物(Kang，J.等，Nature(Lond.).(1987)325733-736)。39-43個氨基酸長的Aβ肽氨基酸序列始于APP的胞外域，并延伸至跨膜區(qū)。APP被β-分泌酶和γ-分泌酶連續(xù)切割后形成Aβ。在所有類型的AD斑塊中都分別發(fā)現(xiàn)了Aβ1-42和Aβ1-43的形式，表明這些形式在AD病理中十分重要。

在一個具體的實施方案中，Aβ肽片段的氨基酸數(shù)比全長Aβ1-40肽中存在的氨基酸總數(shù)少至少一個氨基酸。Aβ1-40肽片段由例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38或39個氨基酸組成。

在另一個具體的實施方案中，Aβ肽片段的氨基酸數(shù)比全長Aβ1-42肽存在的氨基酸總數(shù)少至少一個氨基酸。Aβ1-42片段由例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40或41個氨基酸組成。

在另一個具體的實施方案中，Aβ肽片段的氨基酸數(shù)比全長Aβ1-43肽存在的氨基酸總數(shù)少至少一個氨基酸。Aβ1-43片段由例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、41或42個氨基酸組成。

在一個實施方案中，片段由例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28個或更多個氨基酸殘基組成，包括序列HHQKLVFF。

在一個實施方案中，一種或多種以下的生物活性Aβ肽片段可以用來治療與不需要或病理性血管生成相關的疾病或病癥Aβ1-28肽、Aβ10-35肽、Aβ12-28肽、Aβ13-20肽或其生物活性片段或變異體。

抗血管生成Aβ肽片段優(yōu)選含有HHQK蛋白聚糖結合區(qū)，因為無該序列的片段(Aβ25-35、Aβ17-28和Aβ34-42)沒有活性，這表明需要肝素結合基序HHQK來介導Aβ的抗血管生成活性。Aβ10-16片段是無活性的，即使含有HHQK序列，這表明HHQK蛋白聚糖結合基序不足以抑制血管生成，需要其它相鄰的殘基。具體地說，抑制血管生成還需要緊接HHQK域后的LVFF序列。因此，優(yōu)選的Aβ肽片段含有氨基酸序列HHQKLVFF。

在一個實施方案中，片段由例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、25、36、37、38個或更多個氨基酸殘基組成并且包括序列HHQKLVFF。該片段可能包括一個或多個(例如2、3或4個)等同氨基酸(例如包括非天然氨基酸)置換。

在一個實施方案中，Aβ肽片段是含有氨基酸序列HHQKLVFF的Aβ12-28肽或其生物活性片段或變異體。

在另一個實施方案中，Aβ肽片段是Aβ13-20肽片段或氨基酸序列HHQKLVFF或其生物活性片段或變異體。

在另一個實施方案中，Aβ肽片段是例如10、20、30或40個氨基酸的Aβ肽片段。

肽片段可以通過例如化學合成法得到，或者由宿主細胞重組產(chǎn)生。

同樣地，術語變異體和同源物也可互換使用?！白儺悺被颉巴础彪钠螒斫鉃槭侵赶鄬τ谔烊欢嚯男蛄校行揎椀亩嚯男蛄?，修飾例如至少一個氨基酸的缺失、添加或置換，嵌合異源多肽的截短、延伸或添加。任選“變異”或“同源”肽片段可含有突變或翻譯后修飾。

在“變異”或“同源”多肽或肽片段中，優(yōu)選為其氨基酸序列與天然多肽序列具有80.0％-99.9％(含80.0％和99.9％)同一性的多肽或肽片段。這些百分數(shù)是純粹統(tǒng)計性質(zhì)的，兩個肽序列之間的差異可能隨機分布并遍及整個序列長度中。

與本發(fā)明多肽具有百分比同一性的“變異”或“同源”多肽序列可任選與本發(fā)明多肽序列具有以下的百分比同一性80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。術語等同氨基酸在本文是指能夠在基礎結構中有一個氨基酸被置換，而基本上不改變相應肽的生物活性的任何氨基酸，見下文。

可對Aβ的HHQKLVFF(基序)區(qū)進行數(shù)個置換而又能保持置換肽的抗血管生成性質(zhì)。準確地講，下式表示對于HHQKLVFF的這種等同置換 [RH]-H-[NQ]-[RK]-[ILV]-[ILV]-F-F
該基序的示例性序列見表1。如果具體的肽序列是天然存在蛋白質(zhì)的一部分，則注明了來源。
表1
使用檢索自http://motif.genome.jp/MOTIF2.html的基序以在NR-AA Trembl/Swissprot數(shù)據(jù)庫中檢索肽組合。本領域已知肽序列中物理化學等同氨基酸的置換(Eisenberg等，1984“Amino acidscaleNormalized consensus hydrophobicity scale(氨基酸標度歸一化共有疏水性標度)”，J.Mol.Biol.179125-142；Mathura等，2001，“New quantitative descriptors for amino acids based on multidimensionalscaling of a large number of physical-chemical properties(用于氨基酸的基于大量理化性質(zhì)多維定標的新的定量描述符)”，J.Mol.Modeling7445-453)。

在一個實施方案中，Aβ肽片段由表1所列的一個肽序列組成，或者包括表1所列的一個肽序列，任選具有等同氨基酸置換。

本發(fā)明還提供能夠誘發(fā)免疫反應的生物活性肽片段。免疫反應可提供與肽片段反應的組分(抗體或細胞免疫反應組分(例如B-細胞，輔助、細胞毒和/或抑制性T-細胞))。

可以用蛋白酶(例如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或膠原酶)或用化學試劑(例如溴化氰(CNBr))切割多肽來獲得本文所述片段?；蛘?，可以在高的酸性環(huán)境(例如pH 2.5)產(chǎn)生多肽片段。還可以通過化學合成，或者使用用含有多肽片段編碼核酸的表達載體轉(zhuǎn)化的宿主制備這些多肽片段。轉(zhuǎn)化宿主細胞含有核酸，按照眾所周知的方法進行培養(yǎng)；因此，在合適的調(diào)節(jié)和/或表達元件控制下，可表達這些片段。

可以通過Aβ基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物拼接中的變化、基因重組或者通過化學合成對肽進行修飾。這些肽與待修飾多肽序列相比可含有至少一個修飾。這些修飾可包括包含在多肽內(nèi)氨基酸的添加、置換、缺失。

保守置換即一種類型的一個氨基酸被同一類型的另一個氨基酸置換落入本發(fā)明的范圍內(nèi)，只要置換不實質(zhì)性改變多肽的生物活性。例如，非極性氨基酸的類型包括Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe、Gly和Trp；不帶電荷的極性氨基酸類型包括Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn和Gln；酸性氨基酸的類型包括Asp和Glu；堿性氨基酸的類型包括Lys、Arg和His。在一些情況下，可以進行非保守置換，只是這些置換不顯著降低多肽的生物活性。

為了延長所提供的多肽的壽命，采用非天然氨基酸，例如D型氨基酸或者氨基酸類似物(例如含硫的氨基酸形式)，可能是有利的。還可以采用延長多肽壽命的備選方法。例如，肽片段可通過重組修飾以包括延長血漿或血清半壽期的元件。這些元件包括但不限于抗體恒定區(qū)(參見例如美國專利第5,565,335號，特此通過引用全部結合到本文中，包括其中引用的所有參考文獻)，或者其它元件，例如參見美國專利號6,319,691、6,277,375或5,643,570，這些專利中的每一個都通過引用全部結合到本文中，包括各相應專利中所引用的所有參考文獻?；蛘?，多核苷酸和基因可重組性融合到用于制備免疫原性構建體的元件中，該構建體是為了疫苗制劑目的，或者用于分離所提供的多肽。

所公開的肽片段可進一步含有促進片段與用于遞送或診斷目的的載體分子連接的接頭。接頭還可用來使片段與固相支持基質(zhì)連接，用于親和純化法。在一個實施方案中，接頭尤其不包括其中片段是蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫檢索中已鑒定的其它肽、多肽或蛋白質(zhì)的亞序列。換句話說，其它肽、多肽或蛋白質(zhì)的非相同部分，不被認為是這一方面的“接頭”。適于實施本發(fā)明“接頭”的非限制性實例包括化學接頭(例如Pierce公司，Rockford，Ill.出售的化學接頭)、允許免疫原性片段與載體分子連接的肽(參見例如美國專利號6,121,424、5,843,464、5,750,352和5,990,275所公開的接頭，特此通過引用全部結合到本文中)。在不同實施方案中，接頭的長度可多達50個氨基酸，多達40個氨基酸，多達30個氨基酸，多達20個氨基酸，多達10個氨基酸或多達5氨基酸。

在其它具體的實施方案中，肽可表示為融合或嵌合蛋白產(chǎn)物(通過肽鍵與異源蛋白質(zhì)序列(例如不同的蛋白質(zhì))連接)。可以通過本領域已知方法將合適的編碼所需氨基酸序列的核酸序列在合適的編碼框內(nèi)與其它序列連接，通過本領域公知的方法表達嵌合產(chǎn)物，來制備這樣的嵌合產(chǎn)物(參見例如美國專利第6,342,362號，特此通過引用全部結合到本文中；Altendorf等，1999-WWW，2000“Structure andFunction of the Fo Complex of the ATP Synthase from Escherichia Coli(來自大腸桿菌的ATP合酶Fo復合體的結構與功能)”，J.ofExperimental Biology 20319-28，G.B.；Baneyx 1999Biotechnology10411-21；Eihauer等，2001J.Biochem.Biophys.Methods 49455-65；Jones等，1995J.Chromatography 7073-22；Jones等，1995J.ofChromatography A.7073-22；Margolin等，2000Methods 2062-72；Puig等，2001Methods 24218-29；Sassenfeld等，1990Tib.Tech.888-93；Sheibani等，1999Prep.Biochem.& Biotechnol.29(1)77-90；Skerra等，1999Biomolecular Engineering 1679-86；Smith等，1998The Scientist 12(22)20；Smyth等，2000Methods inMolecular Biology，13949-57；Unger等，1997The Scientist11(17)20；這些文獻的每一篇都通過引用全部結合到本文中)?；蛘撸梢酝ㄟ^蛋白質(zhì)合成技術(例如使用肽合成儀)來制備這樣的嵌合產(chǎn)物。融合肽可包含如上所述的多肽和一個或多個蛋白轉(zhuǎn)導域(proteintransduction domain)。這些融合肽特別用于遞送貨物多肽(cargopolypeptide)穿過細胞膜。

增加組織內(nèi)Aβ肽片段的活性量用于治療多種血管生成性疾病，例如癌癥、腫瘤和/或惡性腫瘤。因此，按照所提供的方法，可以通過直接給予罹患血管生成性疾病的患者Aβ肽片段(例如外部遞送Aβ肽片段)，或者通過間接方法或基因方法(例如給予編碼Aβ肽片段的多核苷酸或者上調(diào)內(nèi)源Aβ肽片段活性)，來增加組織內(nèi)Aβ肽片段的活性量?？梢杂帽景l(fā)明方法治療的這些癌癥、腫瘤和/或惡性腫瘤的非限制性實例包括前列腺癌、乳腺癌、黑素瘤、慢性髓細胞白血病、子宮頸癌、腺癌、成淋巴細胞白血病、結腸直腸癌和肺癌。

肽片段或其編碼核酸可用于篩選或輔助診斷疑患血管源性或血管生成介導的疾病的個體。本文所公開的肽片段及其編碼核酸可以通過使用互補序列，用來檢測雜交測定中的Aβ肽。Aβ肽片段含量顯著增加的存在與阿爾茨海默病適應癥有關。Aβ肽含量顯著減少的存在與血管生成性疾病適應癥(例如惡性腫瘤或癌癥)有關。可以通過眾所周知的方法檢測Aβ基因產(chǎn)物，包括但不限于蛋白質(zhì)印跡、酶聯(lián)免疫測定(ELISA)、放射免疫測定(RIA)、RNA印跡、DNA印跡、基于PCR的測定或本領域技術人員已知的用于基因產(chǎn)物定量測定的其它測定法。這些資料結合專業(yè)人員可獲得的其它資料，有助于作出診斷。

一方面，本發(fā)明涉及通過給予患者生物活性Aβ肽片段，抑制需要抗血管生成療法的患者的血管生成的方法。

在一個實施方案中，通過給予患者治療有效量的Aβ肽片段治療的病理病癥選自癌癥、關節(jié)炎、動脈粥樣硬化、牛皮癬、黃斑變性和糖尿病性視網(wǎng)膜病。

在一個實施方案中，使用生物活性Aβ肽片段的變異體，其中變異體在21位氨基酸、或22位氨基酸、或23位氨基酸上或其組合位上有置換。在一個具體的實施方案中，置換是保守置換，它并不實質(zhì)性地改變多肽的生物活性。

可以利用將多肽遞送至細胞的各種方法以實施本發(fā)明所提供的方法。例如，蛋白轉(zhuǎn)導域(protein transduction domain，PTD)可與多肽融合，產(chǎn)生融合多肽，其中PTD能夠?qū)⒍嚯呢浳锟缪獫{膜轉(zhuǎn)導(Wadia，J.S.和Dowdy，S.F.，Curr.Opin.Biotechnol.2002，13(1)，52-56)。PTD的實例包括果蠅(Drosophila)同源異型轉(zhuǎn)錄蛋白觸角足(Antp)、單純皰疹病毒結構蛋白VP22和人免疫缺陷疾病1(HIV-1)轉(zhuǎn)錄激活因子Tat蛋白。

按照本發(fā)明所提供的血管生成抑制方法，可以給予患者重組細胞，其中重組細胞經(jīng)基因修飾以表達本文所公開的Aβ肽片段。

可以采用本發(fā)明所提供的血管生成抑制方法治療患有癌癥的患者或者作為癌癥預防方法?？梢圆捎帽景l(fā)明所提供的腫瘤抑制方法治療患有多種癌癥的患者，癌癥包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、黑素瘤、慢性髓細胞白血病、子宮頸癌、腺癌、成淋巴細胞白血病、結腸直腸癌和肺癌。按照本發(fā)明所提供的方法，可與Aβ肽片段聯(lián)合給予其它不同的抗癌或抗腫瘤化合物，例如細胞毒藥物。
編碼Aβ片段的核苷酸序列
另一方面，本發(fā)明提供分離和/或純的核苷酸序列，該核苷酸序列包含編碼本文所公開的肽片段氨基酸序列的多核苷酸序列。

本發(fā)明還提供分離的核酸分子，該核酸分子包含編碼Aβ肽片段的多核苷酸。本發(fā)明一方面提供分離的核酸分子，該核酸分子包含具有選自以下核苷酸序列的多核苷酸(a)編碼本文所述(包括表1所列)多肽的任何氨基酸序列的核苷酸序列；和(b)與(a)中任何核苷酸序列互補的核苷酸序列。

本發(fā)明另外的實施方案包括分離的核酸分子，該核酸分子包含多核苷酸，具有與上述(a)或(b)中任何核苷酸序列有至少90％同一性的核苷酸序列，更優(yōu)選至少95％、96％、97％、98％或99％同一性。

根據(jù)本發(fā)明，核苷酸、多核苷酸或核酸序列應當理解為是指雙鏈DNA、單鏈DNA或所述DNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(例如RNA分子)。核酸、多核苷酸或核苷酸序列可以是通過分離方法分離的、純化的(或部分純化的)，分離方法包括但不限于離子交換層析、分子大小排阻層析(molecular size exclusion chromatography)、親和層析或基因工程方法例如擴增、克隆或亞克隆。

任選多核苷酸序列還可含有一個或多個編碼異源多肽序列的多核苷酸(例如促進本發(fā)明多肽純化的標記(參見例如美國專利第6,342,362號，特此通過引用全部結合到本文中；Altendorf等，1999-WWW，2000“Structure and Function of the Fo Complex of the ATPSynthase from Escherichia Coli(來自大腸桿菌的ATP合酶Fo復合體的結構與功能)”，J.of Experimental Biology 20319-28，G.B.；Baneyx1999Biotechnology 10411-21；Eihauer等，2001J.Biochem.Biophys.Methods 49455-65；Jones等，1995J.Chromatography 7073-22；Jones等，1995J.of Chromatography A.7073-22；Margolin等，2000Methods 2062-72；Puig等，2001Methods 24218-29；Sassenfeld等，1990Tib.Tech.888-93；Sheibani等，1999Prep.Biochem.&Biotechnol.29(1)77-90；Skerra等，1999Biomolecular Engineering1679-86；Smith等，1998The Scientist 12(22)20；Smyth等，2000Methods in Molecular Biology，13949-57；Unger等，1997TheScientist 11(17)20；這些文獻的每一篇都通過引用全部結合到本文中)，或者可從商家購買的標記例如STRATAGENE(La Jolla，Calif.)、NOVAGEN(Madison，Wis.)、QIAGEN，Inc.，(Valencia，Calif.)或者INVITROGEN(San Diego，Calif.)。
載體
其它方面提供含有一種或多種本發(fā)明所提供的多核苷酸的載體，例如含有編碼生物活性Aβ肽片段的核苷酸的載體。載體可以是疫苗載體、復制載體或擴增載體。在一些實施方案中，多核苷酸與能夠引起多核苷酸序列表達的調(diào)節(jié)元件操作性連接。這種載體還包括染色體載體、附加型載體和病毒衍生載體，例如衍生自細菌質(zhì)粒、噬菌體、轉(zhuǎn)座子、酵母附加體、插入元件、酵母染色體元件、病毒(例如桿狀病毒)、乳多空病毒(例如SV40)、痘苗病毒、腺病毒、禽豆病毒、假性狂犬病病毒和反轉(zhuǎn)錄病毒的載體，以及衍生自上述載體來源組合的載體，例如衍生自質(zhì)粒和噬菌體基因元件(例如黏粒和噬菌粒)的載體。

如上所述，載體還包含提供在給定宿主細胞中，表達和/或分泌由所提供的核苷酸序列編碼的多肽(例如Aβ肽片段)所必需的元件。載體可含有一種或多種選自以下的元件啟動子、翻譯起始信號、翻譯終止信號和合適的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)。在某些實施方案中，載體可以穩(wěn)定地保存在宿主細胞內(nèi)，任選含有指導翻譯蛋白質(zhì)分泌的信號序列。其它實施方案提供在轉(zhuǎn)化宿主細胞內(nèi)不穩(wěn)定的載體。載體可以整合到宿主基因組中，或者可以是自主復制載體。

在一個具體的實施方案中，載體包含啟動子與以下成分操作性連接編碼蛋白質(zhì)或肽的核酸序列、一個或多個復制起點和任選一個或多個選擇標記(例如抗生物素抗性基因)。用于多肽表達的非限制示例性的載體包括pBr型載體、pET型質(zhì)粒載體(PROMEGA)、pBAD質(zhì)粒載體(INVITROGEN)或下面實施例中所提供的載體。此外，載體用于轉(zhuǎn)化宿主細胞以克隆或表達所提供的核苷酸序列。

可以用來控制表達的啟動子包括但不限于CMV啟動子、SV40早期啟動子區(qū)(Bernoist和Chambon 1981 Nature290304-310)、勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)中3′長末端重復序列內(nèi)所包含的啟動子(Yamamoto等，1980Cell 22787-797)、皰疹病毒胸苷激酶啟動子(Wagner等，1981Proc.Natl.Acad.Sci.USA781441-1445)、金屬硫蛋白基因的調(diào)節(jié)序列(Brinster等，1982Nature29639-42)；含有啟動子的原核載體，例如β-內(nèi)酰胺酶啟動子(Villa-Kamaroff等，1978Proc.Natl.Acad.Sci.USA 753727-3731)或tac啟動子(DeBoer等，1983Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8021-25)；還可參見“Useful Proteins from Recombinant Bacteria(得自重組細菌的有益蛋白質(zhì))”，Scientific American，1980，24274-94；包含胭脂氨酸合成酶啟動子區(qū)的植物表達載體(Herrera-Estrella等，1983Nature303209-213)或花椰菜花葉病毒35S RN啟動子(Gardner等，1981Nucl.Acids Res.92871)和光合作用酶核酮糖二磷酸羧化酶啟動子(Herrera-Estrella等，1984Nature 310115-120)；得自酵母或真菌的啟動子元件，例如Gal 4啟動子、ADC(醇脫氫酶)啟動子、PGK(磷酸甘油激酶)啟動子和/或堿性磷酸酶啟動子。
同源核苷酸序列
本文所提供的有“同源的”或“修飾的”核苷酸序列。修飾的核酸序列應當理解為是指按照本領域技術人員熟知的技術經(jīng)誘變獲得，并且與正常序列相比是被修飾的任何核苷酸序列。例如，表達多肽的調(diào)節(jié)序列和/或啟動子序列的突變，導致多肽表達水平改進，提供了“修飾的核苷酸序列”。同樣地，置換、缺失或添加核酸至多核苷酸提供“同源的”或“修飾的”核苷酸序列。在不同實施方案中，“同源的”或“修飾的”核酸序列具有與天然(天然存在的)Aβ肽片段基本相同的生物活性或血清活性。“同源的”或“修飾的”核苷酸序列還應理解為是指本發(fā)明多核苷酸或編碼如下所述“修飾多肽”的任何核苷酸序列的剪接變異體。

本文所述同源核苷酸序列包括與所述核苷酸序列堿基的百分比同一性介于至少(或者至少約)80.0％-99.9％(含80.0％和99.9％)之間、或85％-99％之間、或90％-99％之間、或95％-99％之間的核苷酸序列。

在不同實施方案中，與所述核苷酸序列堿基具有百分比同一性的同源序列，可與本發(fā)明多核苷酸序列具有以下的百分比同一性80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。

可以運用本領域已知的各種序列比較算法和程序，評價蛋白質(zhì)和核酸序列同源性。這些算法和程序包括但絕不僅限于TBLASTN、BLASTP、FASTA、TFASTA和CLUSTALW(Pearson和Lipman，1988Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85(8)2444-2448；Altschul等，1990J.Mol.Biol.215(3)403-410；Thompson等，1994Nucleic AcidsRes.22(2)4673-4680；Higgins等，1996Methods Enzymol.266383-402；Altschul等，1990J.Mol.Biol.215(3)403-410；Altschul等，1993NatureGenetics 3266-27)。

本發(fā)明還提供與本文所公開的任何多核苷酸序列互補的核苷酸序列。因此，本發(fā)明應理解為包括其核苷酸與本發(fā)明序列核苷酸互補的任何DNA，以及方向是逆轉(zhuǎn)的DNA(例如反義序列)。

本發(fā)明還進一步提供本文所公開的多核苷酸序列的片段。多核苷酸序列的代表性片段應當理解為是指具有從其所衍生序列的至少8或9個連續(xù)核苷酸、優(yōu)選至少12個連續(xù)核苷酸、更優(yōu)選至少15個連續(xù)核苷酸或至少20個連續(xù)核苷酸的任何核苷酸片段。這些片段的上限是Aβ1-42肽編碼序列中存在的多核苷酸的總數(shù)(或者在某些實施方案中，是本文所規(guī)定的可讀框(ORF))。還使用編碼具體肽的合適片段。例如，可以用之前規(guī)定的是Aβ肽片段同源物或其片段的核苷酸序列，來實施本發(fā)明抑制血管生成的方法。
雜交和檢測探針
在這些代表性片段中，優(yōu)選能夠在嚴格條件與核苷酸序列雜交的片段。下文將提供高度嚴格或中等嚴格的條件，選擇以使兩個互補的DNA片段雜交。按照本領域眾所周知的方法(參見例如Sambrook等，1989Molecular Cloning，A Laboratory Manual(分子克隆實驗室指南)，第二版，Cold Spring Harbor Press，N.Y.，第9.47-9.57頁)，對于較長或較短的寡核苷酸，本領域技術人員將采用用于大小約300個堿基的多核苷酸的雜交條件。

本發(fā)明還提供檢測探針(例如所公開的多核苷酸序列的片段)用于與目標序列或者與由目標序列產(chǎn)生的擴增子雜交。這種檢測探針最好具有至少以下數(shù)目核苷酸的序列9、12、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100。或者，檢測探針可包含所公開核酸的連續(xù)核苷酸的以下個數(shù)8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127個和多至例如128個。本發(fā)明中，檢測探針還可用作標記探針或引物。標記探針或引物用放射性化合物或者用另一類型的標記進行標記?；蛘?，非標記核苷酸序列可以直接用作探針或引物；然而，序列一般用放射性元素(32P、35S、3H、125I)標記，或者用例如生物素、乙酰氨基芴、洋地黃毒苷、5-溴-脫氧尿苷或熒光素等分子標記，以提供可用于多項應用中的探針。

本發(fā)明所公開的核苷酸序列還可用于分析系統(tǒng)，例如DNA芯片。DNA芯片及其用途是本領域眾所周知的(參見例如美國專利號5,561,071、5,753,439、6,214,545、Schena等，1996BioEssays18427-431；Bianchi等，1997Clin.Diagn.Virol.8199-208；這些文獻的每一篇都通過引用全部結合到本文中)和/或由供應商提供，例如AFFYMETRIX，Inc.(Santa Clara，Calif.)。

可以采用不同嚴格性程度的雜交。條件越嚴格，雙鏈體形成需要的互補性越高。條件的嚴格程度可通過溫度、探針濃度、探針長度、離子強度、時間等予以控制。優(yōu)選用本領域眾所周知的技術在中等至高度嚴格性條件下進行雜交，參見例如Keller，G.H.，M.M.Manak 1987DNA Probes(DNA探針)，Stockton Press，New York，N.Y.，第169-170頁。

舉例來說，在DNA印跡上用32P標記的基因特異性探針與固定化DNA的雜交可通過標準方法進行(Maniatis等，1982Molecular CloningA Laboratory Manual(分子克隆實驗室指南)，ColdSpring Harbor Laboratory，New York)。一般而言，在允許檢測與示例性多核苷酸序列同源的目標序列的中等至高度嚴格性條件下，進行雜交和隨后的洗滌。對于雙鏈DNA基因探針，可在6x SSPE、5x Denhardt雜交溶液(Denhardt′s solution)、0.1％SDS、0.1mg/ml變性DNA中，在低于DNA雜合解鏈溫度(Tm)20-25℃下過夜進行雜交。解鏈溫度用以下公式表示(Beltz等，1983Methods of Enzymology，R.Wu，L.Grossman和K.Moldave[主編]Academic Press，New York100266-285)。

Tm＝81.5℃+16.6Log[Na+]+0.41(％G+C)-0.61(％甲酰胺)-600/堿基對雙鏈體長度。

通常如下進行洗滌
(1)在1x SSPE、0.1％SDS中于室溫下兩次15分鐘(低嚴格性洗滌)；
(2)在0.2x SSPE、0.1％SDS中于Tm-20℃下一次15分鐘(中等嚴格性洗滌)。

對于寡核苷酸探針，可以在6x SSPE、5x Denhardt雜交溶液、0.1％SDS、0.1mg/ml變性DNA中，在低于雜合解鏈溫度(Tm)10-20℃下過夜進行雜交?？梢杂孟铝泄角蟪龉押塑账崽结樀腡m
Tm(℃)＝2(T/A堿基對數(shù)目)+4(G/C堿基對數(shù)目)(Suggs等，1981ICN-UCLA Symp.Dev.Biol.Using Purified Genes(使用純化基因)，D.D.Brown[主編]，Academic Press，New York，23683-693)。

洗滌可如下進行
(1)在1x SSPE、0.1％SDS中于室溫下兩次15分鐘(低嚴格性洗滌)；
(2)在1x SSPE、0.1％SDS中于雜交溫度下一次15分鐘(中等嚴格性洗滌)。

一般而言，可以改變鹽和/或溫度以改變嚴格性。標記DNA片段長度＞70個左右的堿基時，可以采用下列條件
1低1或2X SSPE，室溫，低1或2X SSPE，42℃。中等0.2X或1X SSPE，65℃。高0.1X SSPE，65℃。

再以另一個非限制性實例來說，步驟還可用高嚴格性條件如下進行在65℃下，在由6x SSC、50mM Tris-HCl(pH 7.5)、1mM EDTA、0.02％PVP、0.02％菲可(Ficoll)、0.02％BSA和500μg/ml變性鮭魚精DNA組成的緩沖液中，使含有DNA的濾膜進行預雜交8小時至過夜。在含有100μg/ml變性鮭魚精DNA和5-20x106cpm 32P標記探針的預雜交混合物中，使濾膜在65℃(優(yōu)選的雜交溫度)下進行雜交48小時?；蛘?，在SSC緩沖液、對應于0.15M NaCl和0.05M檸檬酸鈉的1x SSC存在下，在65℃下進行雜交步驟。隨后，可在含有2x SSC、0.01％PVP、0.01％菲可和0.01％BSA的溶液中，在37℃下將濾膜洗滌1小時后，在0.1x SSC中于50℃洗滌45分鐘?；蛘?，可以在含有2x SSC和0.1％SDS或者0.5x SSC和0.1％SDS或者0.1xSSC和0.1％SDS的溶液中，在68℃下將濾膜洗滌15分鐘時間。洗滌步驟后，可用放射自顯影檢測雜交探針?？梢圆捎玫钠渌邍栏裥詶l件是本領域眾所周知的(參見例如Sambrook等，1989MolecularCloning，A Laboratory Manual(分子克隆實驗室指南)，第二版，ColdSpring Harbor Press，N.Y.，第9.47-9.57頁；Ausubel等，1989CurrentProtocols in Molecular Biology(最新分子生物學實驗技術)，GreenPublishing Associates和Wiley Interscience，N.Y.，每個文獻都通過引用全部結合到本文中)。

使用中等嚴格性條件步驟的另一非限制性實例如下使含有DNA的濾膜預雜交，然后在5x SSC緩沖液和標記探針存在下，在60℃溫度下雜交。隨后，在50℃下。在含有2x SSC的溶液中進行濾膜洗滌，可通過放射自顯影檢測雜交探針?？梢圆捎玫钠渌械葒栏裥詶l件是本領域眾所周知的(參見例如Sambrook等，1989MolecularCloning，A Laboratory Manual(分子克隆實驗室指南)，第二版，ColdSpring Harbor Press，N.Y.，第9.47-9.57頁；Ausubel等，1989CurrentProtocols in Molecular Biology(最新分子生物學實驗技術)，GreenPublishing Associates和Wiley Interscience，N.Y，每個文獻都通過引用全部結合到本文中)。

雙鏈體形成和穩(wěn)定性取決于兩條雜合鏈之間的實際的互補性，以及如上觀察到的可以耐受的某種程度的錯配。因此，本發(fā)明的探針序列包括所述序列的突變(單突變和多突變)、缺失、插入及其組合，其中所述突變、插入和缺失使得與目標靶多核苷酸形成穩(wěn)定的雜合?？砂丛S多方法在給定的多核苷酸序列中產(chǎn)生突變、插入和缺失，這些方法為普通技術人員所知。其它方法可能在不久的將來為大眾所知。

本領域還眾所周知的是，可以使用限制性內(nèi)切酶獲得本發(fā)明DNA序列的功能片段。例如，Bal31外切核酸酶可以方便地用于DNA的定時有限消化(一般稱作“堿基除去(erase-a-base)法”)。參見例如Maniatis等，1982Molecular CloningA Laboratory Manual(分子克隆實驗室指南)，Cold Spring Harbor Laboratory，New York；Wei等，1983J.Biol.Chem.25813006-13512。本發(fā)明所公開的核酸序列還可用作核酸分析方法中的分子量標記。
宿主細胞
本發(fā)明提供用本發(fā)明的多核苷酸轉(zhuǎn)化的宿主細胞和由轉(zhuǎn)化宿主細胞產(chǎn)生的Aβ肽片段。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細胞包含表達載體，該表達載體含有Aβ肽片段的多核苷酸序列。其它實施方案提供用核酸轉(zhuǎn)化的宿主細胞。還有其它實施方案提供包含表達載體的轉(zhuǎn)化細胞，該載體中含有Aβ片段多核苷酸序列?？梢栽谠试S所提供的核苷酸序列復制和/或表達的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化宿主細胞。按照本領域已知方法，從培養(yǎng)基中回收表達多肽，純化待進一步使用。

可以用桿狀病毒載體，從真核系統(tǒng)或原核系統(tǒng)選擇宿主細胞，例如細菌細胞(革蘭氏陰性或革蘭氏陽性)、酵母細胞、動物細胞、植物細胞和/或昆蟲細胞。在一些實施方案中，用于多肽表達的宿主細胞包括但不限于以下文獻所給出的宿主細胞美國專利號6,319,691、6,277,375、5,643,570、5,565,335；Unger等，1997The Scientist11(17)20；或者Smith等，1998The Scientist 12(22)20，這些文獻中的每一篇都通過引用全部結合到本文中，包括各相應專利或文獻中所引用的所有參考文獻。其它示例性和非限制性宿主細胞包括葡萄球菌(Staphylococcus spp.)、腸球菌(Enterococcus spp.)、大腸桿菌(E.coli)和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)；真菌細胞，例如鏈霉菌(Streptomycesspp.)、曲霉菌(Aspergillus spp.)、釀酒酵母(S.cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、漢遜酵母(Hansenula polymorpha)、乳酸克魯維酵母(Kluveromyces lactis)和解脂耶羅維亞酵母(Yarrowia lipolytica)；昆蟲細胞例如果蠅S2和夜蛾(Spodoptera)Sf9細胞；動物細胞例如CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、293和Bowes黑素瘤細胞和植物細胞?？梢允褂酶鞣N各樣的表達系統(tǒng)以產(chǎn)生本文所提供的多肽，可以按照本領域已知方法對多核苷酸進行修飾以提供用于在具體表達系統(tǒng)中表達的最佳密碼子使用。

此外，可以選擇調(diào)節(jié)插入序列表達，修飾基因產(chǎn)物，和/或以特殊方式加工基因產(chǎn)物的宿主細胞菌株。在某些誘導物存在下，可提高某些啟動子的表達；因此，可以控制基因工程多肽的表達。此外，不同的宿主細胞對于蛋白質(zhì)翻譯和翻譯后的加工和修飾(例如糖基化、磷酸化)具有特征性和特異性機制?？梢赃x擇合適的細胞系或宿主系統(tǒng)以確保所表達的外源蛋白質(zhì)所需要的修飾和加工。例如，在細菌系統(tǒng)中表達可以用來產(chǎn)生未糖基化的核心蛋白產(chǎn)物，而在酵母中表達將產(chǎn)生糖基化產(chǎn)物。在哺乳動物細胞內(nèi)表達可以用來提供異源蛋白質(zhì)的“天然”糖基化。此外，不同的載體/宿主表達系統(tǒng)可能不同程度地影響加工反應。

可以通過眾所周知的方法將核酸和/或載體導入宿主細胞，例如磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖介導的轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)染、顯微注射、陽離子脂質(zhì)介導的轉(zhuǎn)染、電穿孔、轉(zhuǎn)導、劃痕標記(scrapeloading)、基因槍(ballistic introduction)和感染(參見例如Sambrook等，1989Molecular CloningA Laboratory Manual(分子克隆實驗室指南)，2.sup.nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.)。

本發(fā)明還提供由本文所公開的多核苷酸序列編碼的多肽、衍生物或變異體(例如剪接變異體)的表達?；蛘撸景l(fā)明提供表達的多肽片段，該多肽片段得自多肽、衍生物或變異體，而多肽、衍生物或變異體由衍生自本文所公開的多核苷酸序列的多核苷酸片段編碼。在任一個實施方案中，所公開的序列可被第二核酸序列調(diào)節(jié)，使得在用本發(fā)明的重組DNA分子轉(zhuǎn)化的宿主內(nèi)表達多肽或片段。例如本領域已知的任何啟動子/增強子元件可控制蛋白質(zhì)或肽的表達。

本發(fā)明還提供用于鑒定樣品中Aβ基因或其片段或變異體存在的基于核酸的方法。這些方法可利用本發(fā)明提供的核酸，并且是本領域技術人員熟知的(參見例如Sambrook等，1989MolecularCloning，A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Press，N.Y.，第9.47-9.57頁或Abbaszadega等，2001Reviews in Biology andBiotechnology(生物學與生物工程學綜述)，1(2)21-26)。用于這些方法的技術中有酶促基因擴增(或者PCR)、DNA印跡、RNA印跡或利用核酸雜交，用于鑒定樣品中多核苷酸序列的其它技術?？梢岳煤怂醽砗Y選個體與Aβ基因或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物失調(diào)相關的疾病。

本發(fā)明還提供由本發(fā)明核苷酸序列編碼的多肽。本發(fā)明還提供至少5個氨基酸的多肽片段，該多肽由本發(fā)明的多核苷酸編碼。
藥物劑型和給藥
本文所用術語“給藥”或“給予”是指將藥物遞送給患者的方法?？梢愿淖兘o藥方法，這取決于一種或多種藥物和所需的效果?？梢赃m于治療藥的任何方法實施給藥，例如通過口服、胃腸外、黏膜、肺部、局部、基于導管、直腸、顱內(nèi)、腦室內(nèi)、大腦內(nèi)、陰道內(nèi)或子宮內(nèi)遞藥。胃腸外遞藥可包括例如皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動脈內(nèi)注射和注射到器官組織內(nèi)，特別是注射到腫瘤組織內(nèi)。黏膜遞藥可包括例如鼻內(nèi)遞藥。口服或鼻內(nèi)遞藥可包括拋射劑給藥。肺部遞藥可包括藥物吸入?；趯Ч艿倪f藥可包括通過離子電滲導管型遞藥(iontopheretic catheter-based delivery)?？诜f藥可包括口服包衣丸劑遞藥或者口服液體制劑給藥。給藥一般還可包括與藥學上可接受的載體一起遞藥，載體例如緩沖劑、多肽、肽、多糖綴合物、脂質(zhì)體和/或脂質(zhì)。也可考慮給予基因療法，其中治療藥是當作為轉(zhuǎn)錄物或多肽進入患者體內(nèi)表達時，能夠?qū)崿F(xiàn)治療目的多核苷酸。

在一個實施方案中，以有效量給予Aβ肽片段以抑制病理性血管生成。本文所用術語“血管生成”是指新血管形成的過程，其對各種正常身體活動(例如生殖、發(fā)育和傷口修復)是必不可少的。據(jù)信該過程包括復雜的分子相互影響，既刺激又抑制內(nèi)皮細胞(毛細血管的主要細胞)的生長。在正常條件下，這些分子似乎較長期地維持微脈管系統(tǒng)在靜止狀態(tài)下(即無毛細血管生長的狀態(tài))。然而，必要時(例如傷口修復期間)，這些細胞可進行快速的增殖，并在短時間內(nèi)更新。盡管在正常條件下，血管生成是受高度調(diào)節(jié)的過程，但許多病癥(以“血管生成性疾病”為特征)是由血管生成持續(xù)性失調(diào)引起的。換句話說，血管生成失調(diào)既可直接引起具體的病理病癥，又可使現(xiàn)有病理病癥惡化。例如眼部新血管形成被認為是最普遍的致盲原因，引起大約20種眼病。在某些現(xiàn)有疾病中(例如關節(jié)炎)，新形成的毛細血管侵襲關節(jié)，破壞軟骨。糖尿病中，在視網(wǎng)膜中新形成的毛細血管侵襲玻璃體，出血，致盲。腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移也依賴于血管生成(Folkman，J.，CancerResearch，46467-473，1986；Folkman，J.，Journal of the National CancerInstitute，824-6，1989)。例如，有研究表明，增大超過2mm的腫瘤，必需獲得自身血供給，并且是通過誘導新毛細血管的生長來實現(xiàn)的。一旦這些新血管深入到腫瘤內(nèi)，便為腫瘤細胞進入循環(huán)，轉(zhuǎn)移至遠距離位置(例如肝、肺或骨)提供了途徑(Weidner，N.等，The New EnglandJournal of Medicine，324(1)1-8，1991)。

可以按照制備藥用組合物的已知方法，制備本發(fā)明的藥物組合物。各種劑型記載于多種已知的并且易為本領域技術人員獲得的資料中。例如Remington′s Pharmaceutical Sciences(雷氏藥學大全)(Martin E W 1995Easton Pennsylvania Mack Publishing Company，19.sup.th ed.)記載了可與本發(fā)明聯(lián)用的劑型。適于胃腸外給藥的劑型包括例如無菌注射水溶液，它含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和為待接受者提供血液等滲劑型的溶質(zhì)；水性和非水性無菌混懸劑，它可包括懸浮劑和增稠劑。劑型可裝入單位劑量容器或多劑量容器內(nèi)，例如密封的安瓿瓶和小瓶，并且可以保存在凍干條件下，臨用前僅需要無菌液體載體(例如水)條件以注射。可以由無菌粉針劑、顆粒劑、片劑等制備臨用時配制的注射溶液劑和混懸劑。應當理解的是，除上述具體提及的成分以外，本發(fā)明的劑型可包括本領域常用的考慮所述劑型類型的其它藥物。

在一個實施方案中，以緩釋劑型遞送Aβ肽片段。該劑型釋出延長，半壽期延長。適于使用的控釋系統(tǒng)包括但不限于擴散控制系統(tǒng)、溶劑控制系統(tǒng)和化學控制系統(tǒng)。擴散控制系統(tǒng)包括例如貯庫裝置(reservoir device)，其中一種或多種Aβ肽片段被包封在一個裝置內(nèi)，因此肽片段的釋放受到穿過擴散屏障滲透的控制。常見的貯庫裝置包括例如膜、膠囊、微膠囊、脂質(zhì)體和中空纖維。單片(基質(zhì))裝置(Monolithic(matrix)device)是第二種類型的擴散控制系統(tǒng)，其中Aβ肽片段分散或者溶于控速骨架片(例如聚合物骨架片)。肽片段均勻分散在整個控速基質(zhì)中，通過基質(zhì)擴散來控制釋藥速度。適用于單片基質(zhì)裝置的聚合物包括天然存在的聚合物、合成聚合物、合成性修飾的天然聚合物以及聚合物衍生物。

可以采用本領域已知方法，確定Aβ肽片段的治療有效劑量和最佳劑量范圍。本文所公開的示例性測定法提供了對于獲得抗血管生成和/或抗腫瘤效果的合適劑量的指導。同樣地，可以確定獲得治療效果的Aβ肽片段的最低劑量。在一個實施方案中，以μM劑量范圍的等同劑量給予Aβ肽片段。在另一個實施方案中，以等同于約1μM至約100μM的量給予Aβ肽片段。在另一個實施方案中，以等同于約2μM至約10μM的量給予Aβ肽片段?？梢越o予的藥物劑型可包括例如1-10,000mg、10-1000mg、50-900mg、100-800mg或200-500mg。

本發(fā)明還涉及診斷和/或篩選方法以及篩選化合物的試劑盒，該化合物通過干預Aβ肽片段的抗血管生成作用，在阿爾茨海默病治療中是有效的治療藥。

一方面，本發(fā)明包括鑒定干預Aβ誘導的血管生成抑制的化合物的方法，其中該方法包括以下步驟(a)使能夠進行血管生成的第一生物樣品與試驗化合物、生物活性量的Aβ肽片段和血管生成藥接觸；和(b)測定發(fā)生在第一生物樣品中血管生成的程度。任選該方法可包括以下步驟(c)單獨使能夠進行血管生成的第二生物樣品與生物活性量的Aβ肽片段和血管生成藥接觸；(d)測定發(fā)生在第二生物樣品中血管生成的程度；和(e)將發(fā)生在第一生物樣品中血管生成的程度與發(fā)生在第二生物樣品中的血管生成程度進行比較。這樣，步驟(c)-(d)可用作對照。優(yōu)選在第一和第二生物樣品中使用相同的Aβ肽片段。

可用本領域已知方法(例如本文所述方法)進行血管生成程度的測定，并且可以定性或定量測定。例如，可以利用癌癥或腫瘤生長的分子標記或細胞標記。還可通過測定生物樣品中內(nèi)皮細胞增殖量或血管生長程度，來測定血管生成的程度。

方法和試劑盒中使用的生物樣品可包括具有血管生成和/或腫瘤發(fā)育的各種生物液體和組織。例如，生物樣品可以是動脈組織、角膜組織、內(nèi)皮細胞、臍帶組織、絨毛尿囊膜等等。

血管生成藥可以是在生物樣品中能夠誘導血管生成的任何分子、化合物或細胞。例如，血管生成藥可以是營養(yǎng)因子，例如神經(jīng)營養(yǎng)因子。血管生成因子可以是細胞因子或生長因子例如血管內(nèi)皮生長因子、血小板衍生生長因子和堿性成纖維細胞生長因子?？稍隗w內(nèi)(例如在動物模型內(nèi))或體外進行本發(fā)明的診斷和/或篩選方法。

另一方面，本發(fā)明包括試劑盒，用于鑒定干預Aβ誘導的血管生成抑制的化合物。試劑盒可包括含有至少一種Aβ肽片段的隔室和任選含有血管生成藥的隔室。此外，試劑盒可任選包括含有一種或多種生物樣品的隔室。

另一方面，本發(fā)明提供用于鑒定干預Aβ誘導的抗腫瘤活性的化合物的方法，該方法包括以下步驟(a)使第一腫瘤組織與試驗化合物和生物活性量的Aβ肽片段接觸；和(b)測定發(fā)生在腫瘤組織中的腫瘤生長程度。任選該方法還可包括以下步驟(c)單獨使第二腫瘤組織與生物活性量的Aβ肽片段接觸；(d)測定發(fā)生在第二腫瘤組織中的腫瘤生長程度；和(e)將發(fā)生在第一腫瘤組織中的腫瘤生長程度與發(fā)生在第二腫瘤組織中的腫瘤生長程度進行比較。這樣，可利用步驟(c)-(d)作為對照?？捎帽绢I域已知方法(包括本文所述方法)定量或定性測定腫瘤生長的程度。例如，可以利用癌癥或腫瘤生長的分子標記或細胞標記。

另一方面，本發(fā)明包括用于鑒定干預Aβ誘導的抗腫瘤活性的化合物的試劑盒。試劑盒可包括含有至少一種Aβ肽片段的隔室和任選含有至少一種腫瘤組織的隔室。此外，試劑盒可任選包括含有一種或多種生物樣品的隔室。

可以用本發(fā)明的方法和試劑盒篩選的試驗化合物可包括任何物質(zhì)、藥物或分子，包括例如小分子和活細胞或死細胞。

本方法可以治療許多患者，包括任何脊椎動物種類。優(yōu)選患者是哺乳動物種類。從所公開的治療方法中獲益的哺乳動物種類包括但不限于猿、黑猩猩、猩猩、人、猴；馴養(yǎng)動物(例如寵物)，例如狗、貓、豚鼠、倉鼠、越南大肚豬(Vietnamese pot-bellied pig)、兔和白鼬；馴養(yǎng)農(nóng)用動物，例如牛、水牛、野牛、馬、驢、豬、綿羊和山羊；一般是見于動物園的外來動物，例如熊、獅子、老虎、豹、大象、河馬、犀牛、長頸鹿、羚羊、樹懶、瞪羚、斑馬、角馬、草原土撥鼠、樹袋熊、袋鼠、負鼠、浣熊、熊貓、土狼、海豹、海獅、海象、水獺、鼠海豚、海豚和鯨。
腫瘤和癌癥的治療
在一個實施方案中，本發(fā)明提供用于治療需要這種治療的動物或人的腫瘤、癌癥或其它增殖性疾病的方法，該方法包括給予治療有效量的(任選以單位劑型)本文所述的Aβ肽片段。本發(fā)明還提供抑制有需要的動物或人的血管生成的方法，該方法包括給予治療有效量的(任選以單位劑型)本文所公開的Aβ肽片段。

本發(fā)明提供在一個實施方案中用來治療腫瘤和癌癥的Aβ肽片段和包含該片段的藥物組合物，所述腫瘤和癌癥包括但不限于以下組織或器官的癌癥或腫瘤乳腺、前列腺、肺、支氣管、結腸、尿道、膀胱、腎、胰腺、甲狀腺、胃、腦、食道、肝、肝內(nèi)膽管、子宮頸、皮膚、喉、心臟、睪丸、小腸、甲狀腺、外陰、膽囊、胸膜、眼、鼻、耳、鼻咽、輸尿管、胃腸系統(tǒng)、直腸組織、胰腺、頭頸部?？梢灾委煹陌┌Y包括但不限于非霍金奇淋巴瘤(non-Hodgkinlymphoma)、黑素瘤、多發(fā)性骨髓瘤、急性髓細胞白血病、慢性淋巴細胞白血病、霍金奇淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)、慢性髓細胞白血病、急性淋巴細胞白血病、癌、腺癌；肉瘤；淋巴瘤和白血病。

在一個細分實施方案中，可以使用Aβ肽片段治療例如前列腺癌、肺癌、結腸直腸癌、膀胱癌、皮膚黑素瘤、胰腺癌、白血病、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、非霍金奇淋巴瘤和卵巢癌。

在另一個細分實施方案中，可以使用Aβ肽片段治療上皮細胞癌和腫瘤，包括皮膚癌、子宮頸癌、肛門癌、食道癌、肝細胞癌(肝內(nèi))、喉癌、腎細胞癌(腎內(nèi))、胃癌、睪丸癌和甲狀腺癌。

在另一個細分實施方案中，Aβ肽片段用來治療血液惡性腫瘤(血液和骨髓)，包括白血病、淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤。

在又一個細分實施方案中，Aβ肽片段用來治療肉瘤，包括骨肉瘤(骨內(nèi))、軟骨肉瘤(起于軟骨)和橫紋肌肉瘤(肌內(nèi))。

在另一個細分實施方案中，Aβ肽片段用來治療各種各樣起源的癌癥和腫瘤，包括腦腫瘤、胃腸道間質(zhì)瘤(GIST)、間皮瘤(胸膜或心包膜內(nèi))、胸腺瘤、畸胎瘤和黑素瘤。

可以治療的腫瘤的實例包括但不限于惡性腦腫瘤，例如成膠質(zhì)細胞瘤；惡性肺腫瘤，例如腺癌；或者乳腺惡性腫瘤、結腸惡性腫瘤、腎惡性腫瘤、膀胱惡性腫瘤、頭頸部惡性腫瘤。

可以治療的增殖性疾病包括但不限于造血異常，例如白血病、淋巴瘤或紅細胞增多癥；眼病，例如糖尿病性視網(wǎng)膜病、黃斑變性、青光眼或色素性視網(wǎng)膜炎?？梢灾委煹难仔约膊“ǖ幌抻陬愶L濕性關節(jié)炎、骨關節(jié)炎、肺纖維變性、結節(jié)病樣肉芽腫(sarcoidgranulomas)、牛皮癬或哮喘。

在一個實施方案中，可以使用Aβ肽片段治療癌、肉瘤、淋巴瘤、白血病和/或骨髓瘤。在其它實施方案中，可以使用本文所公開的Aβ肽片段治療實體瘤。

在其它實施方案中，本文所述的Aβ肽片段可用于治療癌癥，包括但不限于下表2a中所列癌癥。





Aβ肽片段的抗血管生成活性
雖然不受限于任何理論，但是有可能序列HHQKLVFF正是賦予抗血管生成活性的Aβ序列。

多項研究表明，細胞表面上的肝素和各種蛋白聚糖可與Aβ肽結合(Snow等，1995Arch.Biochem.Biophys.320，84-95；McLaurin等，2000Eur.J.Biochem.267，6353-61；McKeon J，HollandLA.2004Electrophoresis 25，1243-8)，并且有研究表明，硫酸乙酰肝素蛋白聚糖與AD腦內(nèi)的淀粉樣蛋白沉積物締合(van Horssen等，2001Acta Neuropathol.(Berl).102，604-14)。硫酸肝素蛋白聚糖還通過允許特定的生長因子(例如堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF))與細胞表面相互作用，而在血管生成中發(fā)揮重要作用。因此，蛋白聚糖被認為可調(diào)節(jié)生長因子與受體的相互作用(Rusnati M，Presta M.1996Int.J.Clin.Lab.Res.26，15-23；Dougher等，1997GrowthFactors.14，257-68)。本文顯示，加入外源肝素能夠有效地使Aβ1-42抗血管生成活性逆轉(zhuǎn)。僅加入肝素引起輕微地血管生成抑制，這與表明過量肝素對血管生成抑制作用的研究是一致的。有研究指出，這種作用的機制是通過增加組織因子途徑抑制劑的釋放(Mousa SA，Mohamed S.2004 Thromb.Haemost.92，627-33)。

細胞表面蛋白聚糖(例如硫酸乙酰肝素蛋白聚糖)可與各種生長因子(包括VEGF和bFGF)結合并表現(xiàn)出活性(Iozzo RV，SanAntonio JD.2001J.Clin.Invest.108，349-55；Presta等，2005CytokineGrowth Factor Rev.16，159-78；Sanderson等，2005J.Cell Biochem.9月7日，(先期電子出版物))。Aβ有可能與這些蛋白聚糖結合，對生長因子與細胞的結合和相互作用產(chǎn)生影響。因此，當血管生成測定含有肝素結合性生長因子時，加入過量肝素可能起著結合到Aβ肽外部的作用，防止了它們與細胞表面結合，從而對抗Aβ的抗血管生成活性?；蛘?，有研究表明，Aβ與VEGF上的肝素結合基序發(fā)生直接的相互作用(Yang等，2005J.Neurochem.93，118-27)；因此，Aβ與肝素的結合有可能阻止其與VEGF結合，逆轉(zhuǎn)了Aβ的抗血管生成活性。肝素(和其它糖胺聚糖)還可能影響Aβ肽的構象性質(zhì)，改變原纖維形成速率(Castillo等，1999J.Neurochem.72，1681-7；Cohlberg等，2002Biochemistry.41，1502-11)，從而提供不能阻止血管生成的肽。Aβ肽體外的抗血管生成活性似乎與其構象性質(zhì)有關，因為含有較高β-折疊含量的Aβ制品是較有效的抗血管生成劑(Gebbink等，2000Biochim.Biophys.Acta.1502，16-30)。另外，肽的可溶性低聚體是特別抗血管生成的，然而原纖維形式則是無活性的(Paris等，2005Brain Res.Mol.Brain Res.136，212-30；Skovseth等，2005Blood 105，1044-51)，這表明為了抑制血管生成，Aβ肽中的特定殘基需要暴露出來。

Aβ肽序列內(nèi)對于賦予抗血管生成活性很重要的一個基序是推定蛋白聚糖結合區(qū)(HHQK)(Cardin，A.D.；Weintaub，H.J.R.1989Arteriosclerosis.9，21-32；Snow等，1995Arch.Biochem.Biophys.320，84-95；McLaurin等，2000Eur.J.Biochem.267，6353-61；McKeon等，2004Electrophoresis.25，1243-8)。已知蛋白聚糖在血管生成期間起著調(diào)節(jié)作用(Moon等，2005J.Cell Physiol.203，166-76；Tkachenko等，2005Circ.Res.96，488-500；Presta等，2005Cytokine Growth FactorRev.16，159-78)。同樣地，多項研究表明硫酸乙酰肝素蛋白聚糖在AD發(fā)病機制中的重要作用，這就表明干預這些分子與Aβ結合可以是治療上有益的(Leveugle等，1994，Neuroreport.5，1389-92；Kisilevsky等，2002J.Mol.Neurosci.19，45-50)。

對于抗血管生成活性的另一個可能的重要序列是與HHQK基序相鄰，向著C端部分的4個氨基酸(LVFF)。已知該區(qū)是組成β鏈的部分，因此對于肽的低聚反應很重要(Morimoto等，2004J.Biol.Chem.279，52781-8；Irie等，2005J.Biosci.Bioeng.99，437-47)。最近有研究表明，在Aβ10-42的構象模型中，其高度疏水殘基17-20暴露于二聚體中，而在另一項研究中則顯示該區(qū)埋入原纖維體(fibrillarform)中(Mathura等，2005Biochem.Biophys.Res.Commun.332，585-92；Olofsson等，2005J.Biol.Chem.10月7日，(先期電子出版物))。

為了進一步研究Aβ可通過在細胞表面上阻止生長因子與蛋白聚糖結合而起作用的可能性，置換Aβ12-28的推定蛋白聚糖結合序列HHQK上的三個殘基。本文顯示用天然氨基酸置換型GGQG或AAQA替換野生型HHQK，完全破壞野生型Aβ12-28肽的抗血管生成作用。此外，通過用VEGF誘導血管生成的大鼠角膜微囊袋模型，證實了Aβ12-28體內(nèi)的抗血管生成功效。AD患者腦內(nèi)的VEGF水平增加(Kalaria等，1998Brain Res.Mol.Brain Res.62，101-5；Tarkowski等，2002Neurobiol Aging.23，237-43)，但是這與腦血管形成增加無關(Buee等，1997Ann.N.Y.Acad.Sci.826，7-24)。因此，AD腦內(nèi)Aβ的累積可導致VEGF活性的抑制。VEGF是神經(jīng)營養(yǎng)性的，對于維持血管完整性很重要，還是腦卒中或頭損傷后血管重塑的關鍵因子(Slevin等，2000Neuroreport 11，2759-64；Shore等，2004Neurosurgery.54，605-12)。Aβ在AD腦內(nèi)對VEGF的拮抗作用可以解釋為什么AD患者和AD轉(zhuǎn)基因小鼠模型在腦卒中后恢復不良(Koistinaho等，2002Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99，1610-5；Wen等，2004J.Biol.Chem.279，22684-92；Koistinaho M，Koistinaho J.2005Brain Res.Brain Res.Rev.48，240-50)。

本文所提供的實施例支持僅蛋白聚糖結合基序可能不足以誘發(fā)抗血管生成作用，需要緊接該序列的氨基酸(LVFF)以介導Aβ的抗血管生成活性的結論。有研究表明在Aβ低聚體的構象模型中，LVFF序列(氨基酸17-20)是肽的暴露區(qū)(Mathura等，2005Biochem.Biophys.Res.Commun.332，585-92)。

還觀察到Aβ34-42的促血管生成作用。在本文所述的網(wǎng)絡實驗(network assay)中觀察到Aβ34-42片段的促血管生成活性與之前曾觀察到的低濃度下Aβ1-40/42肽的促血管生成活性是一致的(Paris等，2004Angiogenesis.7，75-85；Cantara等，2004F.A.S.E.B.J.18，1943-5)。當形成單體和二聚體時，Aβ的折疊可使C端34-42序列暴露出來。隨后該區(qū)可以埋入更高層次的低聚體或原纖維體中。Aβ1-42原纖維最新的NMR研究證實，殘基28-42是溶劑達不到的，而且即使在長時間后，主干酰胺也不會發(fā)生氘交換(Olofsson等，2005J.Biol.Chem.10月7日，(先期電子出版物))。因此，低濃度下Aβ1-40/42肽的促血管生成作用可能是由其主要的單體或二聚體狀態(tài)暴露出C端區(qū)的促血管生成基序所致(Olofsson等，2005J.Biol.Chem.10月7日，(先期電子出版物)；Fraser等，1994J.Mol.Biol.244，64-73；van Horssen等，2001Acta Neuropathol.(Berl).102，604-14；Rusnati，M；Presta，M.1996Int.J.Clin.Lab.Res.26，15-23；Dougher等，1997Growth Factors.14，257-68；Mousa等，2004Thromb.Haemost.92，627-33；Iozzo等，2001J.Clin.Invest.108，349-55；Presta等，2005Cytokine Growth Factor Rev.16，159-78；Sanderson等，2005J.Cell Biochem.9月7日，(先期電子出版物))。
聯(lián)合療法
一方面，為了治療癌癥、腫瘤或其它增殖性疾病，本文所公開的肽片段可與至少一種另外的化療藥物聯(lián)用。另外的藥物可與本文所公開的化合物聯(lián)合或交替給藥。藥物可以形成同一組合物的部分，或者以單獨的組合物在同一時間或不同時間給藥。

第二治療藥的實例包括但不限于IL-12、類視色素、干擾素、血管生長抑素、內(nèi)皮生長抑素、沙利度胺、凝血酶致敏蛋白-1、凝血酶致敏蛋白-2、卡托普利(captopryl)、抗腫瘤藥物例如α干擾素、COMP(環(huán)磷酰胺、長春新堿、甲氨蝶呤和潑尼松)、依托泊苷、mBACOD(甲氨蝶呤、博來霉素、多柔比星、環(huán)磷酰胺、長春新堿和地塞米松)、PRO-MACE/MOPP(潑尼松、甲氨蝶呤(w/leucovin rescue)、多柔比星、環(huán)磷酰胺、泰素、依托泊苷/氮芥、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼)、長春新堿、長春堿、血管抑制素(angioinhibin)、TNP-470、聚硫酸戊聚糖、血小板因子4、血管生長抑素、LM-609、SU-101、CM-101、Techgalan、沙利度胺、SP-PG和放射性藥物。

其它實例包括具有抗有絲分裂作用的藥物(抗有絲分裂抑制劑)，例如靶向細胞骨架組分的抗有絲分裂抑制劑，包括微管調(diào)節(jié)劑例如紫杉烷類(taxane)藥物(例如泰素、紫杉醇、泰素帝、多西他賽)、鬼臼毒素或長春花屬生物堿(長春新堿、長春堿)；抗代謝藥(例如5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、吉西他濱、嘌呤類似物例如噴司他丁、甲氨蝶呤)；烷化劑或氮芥類(例如亞硝基脲、環(huán)磷酰胺或異環(huán)磷酰胺)；靶向DNA的藥物例如蒽環(huán)霉素藥類、阿霉素、多柔比星、鹽酸表柔比星制劑或表柔比星；靶向拓撲異構酶的藥物(拓撲異構酶抑制劑)例如依托泊苷；激素類和激素激動劑或拮抗劑例如雌激素、抗雌激素(他莫昔芬及相關化合物)和雄激素、氟他胺、亮丙瑞林、戈舍瑞林、環(huán)丙孕酮或奧曲肽；靶向腫瘤細胞信號轉(zhuǎn)導的包括抗體衍生物在內(nèi)的藥物例如曲妥單抗；烷化藥物例如鉑類藥物(順鉑、卡鉑、奧沙利鉑、伯爾定)或亞硝基脲；可能影響腫瘤轉(zhuǎn)移的藥物例如基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑；基因療法和反義藥物；抗體治療藥；海洋源的其它生物活性化合物例如膜海鞘素類(didemnin)例如aplidine；皮質(zhì)類固醇；類固醇類似物，例如地塞米松；抗炎藥物，包括非甾類藥物(例如對乙酰氨基酚或布洛芬)或類固醇類及其衍生物，特別是地塞米松和鎮(zhèn)吐藥，包括5HT-3抑制劑(例如格拉司瓊或昂丹司瓊)。

第二治療藥的其它實例包括下表1a所公開的藥物。
表1a 化療藥物
用于本文所公開肽的測定法
可以采用本領域已知的血管生成測定法。參見例如美國專利申請2003/0077261A1(Paris等)，其中記載了大鼠主動脈環(huán)、牛、小鼠和人的血管生成測定法。

可以采用環(huán)微血管增生定量測定法，參見例如美國專利申請2003/0077261A1(Paris等)，其中用與奧林巴斯(OLYMPUS)BX60顯微鏡連接的數(shù)碼攝像機，拍攝環(huán)微血管培養(yǎng)物，用Image ProPlus軟件有選擇性地檢測增生區(qū)域。

可以采用內(nèi)皮細胞遷移測定法，參見美國專利申請2003/0077261A1(Paris等)，其中采用改進的Boyden小室測定法(BDBioCoat MATRIGEL侵襲小室)，評價成人腦內(nèi)皮細胞的遷移，參見Soker等1998、Nakamura等1997。

可以采用裸小鼠腫瘤異種移植物模型，參見例如美國專利申請2003/0077261A1(Paris等)，其中將A-549(人肺腺癌)和U87-MG(人成膠質(zhì)細胞瘤)細胞植入8周齡的雌性裸小鼠體內(nèi)。在用Aβ肽治療前、治療后和治療期間，測量生長在動物內(nèi)的腫瘤。在每項體內(nèi)抗腫瘤研究結束之日，摘取腫瘤，定量測定微血管。

根據(jù)以下非限制性實施例，將更詳盡地理解本發(fā)明。
實施例 (材料與方法在實施例1-7提供) 實施例1細胞培養(yǎng)和試劑
所有體外實驗都使用傳代3-4次的原代人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)，細胞購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，VA)。將細胞培養(yǎng)在F12K培養(yǎng)基(ATCC，VA)中，培養(yǎng)基補充了10％胎牛血清(Invitrogen，CA)、0.1mg/ml肝素和0.03mg/ml內(nèi)皮細胞生長補充劑(Sigma-Aldrich，MO)。在所有時間內(nèi)，細胞都保存在37℃和5％CO2的無菌細胞培養(yǎng)箱內(nèi)。
實施例2Aβ肽的制備
所有肽都購自Biosource，CA，需要時配制。為了使β-折疊結構的形成減到最少并促進α-螺旋二級結構，將1mg凍干肽溶于1ml 1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇(HFIP)。使肽在化學通風櫥中風干1小時后，在真空離心蒸發(fā)濃縮器(Thermo-Savant，NY)中再干燥30分鐘。將所得透明薄膜重新懸浮于100％二甲亞砜(DMSO)至1mM濃度。隨后將肽等分并保存在-80℃下。
實施例3毛細血管形成測定法
將500μl培養(yǎng)基中的HUVEC(7.5x104細胞/ml)接種至24孔板內(nèi)的F12K培養(yǎng)基(ATCC，VA)的基質(zhì)膠基底膜基質(zhì)(Invitrogen，CA)的頂層，培養(yǎng)基含有4％血清(Invitrogen，CA)、0.1mg/ml肝素和0.03mg/ml內(nèi)皮細胞生長補充劑(Sigma-Aldrich，MO)。使細胞與肽(或?qū)φ諚l件)孵育24小時。對照孔接收相同體積的用于稀釋肽的溶媒(DMSO)。按一式三份進行網(wǎng)絡形成實驗，每孔隨機選擇至少2個視野，用四倍物鏡拍照。用Image Pro Plus軟件(MediaCybernetic，Inc.，MD)測量毛細血管長度。
實施例4細胞增殖測定法
將HUVEC(5x103細胞/孔)接種至96孔板。使細胞與肽(或?qū)φ諚l件)孵育24小時。按照生產(chǎn)商的方法(Biovision Inc.，CA)進行快速細胞增殖測定。
實施例5細胞粘附測定法 將HUVEC(1x104細胞/孔)接種至預包被有基底膜蛋白復合物的96孔板上。使細胞與肽(或?qū)φ諚l件)孵育2.5小時。對于細胞粘附測定，采用Innocyte細胞粘附測定法(Calbiochem，CA)和按照生產(chǎn)商說明書的方法。
實施例6大鼠角膜微囊袋試驗
按前述方法(Paris D，Townsend K，Quadros A，Humphrey J，Sun J，Brem S，Wotoczek-Obadia M，DelleDonne A，Patel N，Obregon DF，Crescentini R，Abdullah L，Coppola D，Rojiani AM，Crawford F，Sebti SM，Mullan M.(2004)Angiogenesis.7，75-85)，用僅含VEGF(200ng)，或者含有VEGF(200ng)與不同含量Aβ肽片段組合的hydron小珠，進行該項測定。植入后7天測定血管生長反應。測量血管增生的長度和寬度，運用公式LxW＝AI計算血管生成指數(shù)(AI)。大鼠用膠態(tài)炭灌注，摘出眼球，在10％緩沖福爾馬林中固定。在奧林巴斯(Olympus)解剖顯微鏡下取出角膜，放在有晶體封固劑的載玻片上。
實施例7統(tǒng)計分析
用ANOVA與用Scheffe或Bonferroni事后比較，對于Windows版本10.1用SPSS，進行統(tǒng)計分析。
實施例8Aβ肽片段對毛細血管形成的作用
在實施例3所述測定中，檢測不同的Aβ肽和肽片段抑制毛細血管網(wǎng)絡形成的能力，包括1μM、5μM和10μM的Aβ1-42、Aβ1-40、Aβ1-28、Aβ12-28、Aβ17-28、Aβ25-35、Aβ10-35、Aβ10-16和Aβ34-42。對于每個治療組(n≥8)定量測定毛細血管總長度，用占對照治療的百分比表示(圖1)。

事后分析顯示在5μM和10μM劑量下，對照與Aβ1-40、Aβ1-42、Aβ1-28、Aβ10-35和Aβ12-28之間的顯著性差異(P＜0.005)。所測肽中，Aβ1-28、Aβ12-28、Aβ10-35、Aβ1-40和Aβ1-42活性最強。Aβ25-35在5μM下略有活性，但在10μM沒有活性，其它肽(Aβ10-16、Aβ17-28和Aβ34-42)不顯示任何抗血管生成活性(圖1)。與之相反，Aβ34-42以劑量依賴性方式促進血管生成。這些數(shù)據(jù)表示保持Aβ肽抗血管生成活性所需要的最小序列包括在殘基12-28內(nèi)。此外，Aβ12-28片段抗血管生成，而17-28片段(缺失HHQK基序)無活性的觀察結果表明，存在于殘基13-16之間的蛋白聚糖結合區(qū)(HHQK)是抗血管生成活性所必需的。
實施例9Aβ肽片段對細胞增殖和細胞粘附的作用
分別用實施例4和實施例5所述測定法，檢測不同的Aβ肽片段對細胞增殖和細胞粘附到基底膜復合物上的抑制能力。

所有的肽治療顯著地抑制細胞增殖(P＜0.005)。ANOVA顯示任何所測肽之間沒有顯著性的重要作用。事后檢驗法顯示不同肽之間無顯著性差異(P＞0.005)。雖然所有所測片段都能夠抑制HUVEC的細胞增殖，但是不同肽之間在功效上沒有明顯差異(圖2a)。然而，ANOVA和事后檢驗法顯示，所測片段中都不能顯著影響細胞粘附到包含層粘連蛋白、膠原IV、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和巢蛋白的基底膜復合物上(P＞0.005)(圖2b)。因此，Aβ肽片段抗血管生成活性的差異可能與對細胞增殖或粘附的作用無關。
實施例10肝素對毛細血管形成的作用
為了證實Aβ肽內(nèi)的推定肝素結合序列的重要性，將肝素加到樣品中，用實施例3所述毛細血管形成測定法，定量測定Aβ肽的抗血管生成活性。

定量測定每個治療組(n≥8)的毛細血管總長度，用占對照治療的百分比表示。事后分析顯示以下情況的顯著性差異對照和所有治療組之間(P＜0.001)、Aβ和Aβ+肝素500μg/ml之間(P＜0.001)、Aβ和Aβ+肝素1mg/ml之間(P＜0.001)。加入500μg/ml和1mg/ml的肝素有效地逆轉(zhuǎn)由Aβ1-42誘導的毛細血管形成抑制(圖3)。僅加入肝素還引起輕微的血管生成抑制。
實施例11蛋白聚糖結合區(qū)突變型Aβ肽片段對毛細血管形成的作用
因為加入肝素逆轉(zhuǎn)Aβ1-42的抗血管生成活性，所以推測肽內(nèi)的蛋白聚糖結合區(qū)對賦予抗血管生成活性十分重要。為了驗證這個假設，用氨基酸置換(存在于HHQK蛋白聚糖結合基序的3個氨基酸置換為GGQG或AAQA)制備成一種抗血管生成的肽片段(Aβ1-28)，已知該氨基酸置換有效抑制Aβ與硫酸乙酰肝素蛋白聚糖結合(McLaurin等，Eur.J.Biochem.2000，267，6353-61；Olofssen等，J.Biol.Chem 2005，10月7日，先期電子出版物)。然后，用實施例3所述毛細血管形成測定法，測定突變型Aβ肽片段的作用。

定量測定每個治療組(n≥8)的毛細血管總長度，用占對照的百分比表示。ANOVA顯示野生型Aβ1-28顯著的劑量依賴的重要作用(P＜0.001)，Aβ1-28GGQGL(P＝0.566)或Aβ1-28AAQAL(P＝0.380)則沒有重要作用。事后分析顯示野生型Aβ1-28在1μM、5μM和10μM下有顯著作用(P＜0.005)，但是突變型Aβ1-28肽在任何測試劑量下都沒有顯著作用。

Aβ蛋白聚糖結合區(qū)的氨基酸置換完全破壞了Aβ1-28肽的抗血管生成活性(圖4)(見表2肽序列一覽表)。
表210μM Aβ肽序列抗血管生成活性一覽表 實施例12LVFF突變型Aβ肽片段對毛細血管形成的作用
用實施例3所述毛細血管形成測定法，通過測定始于HHQK序列由9個氨基酸組成的肽片段(表2，片段1-3)，來確定接近HHQK序列C端一側VFF氨基酸序列的作用。

定量測定每個治療組(n≥6)的毛細血管總長度，用占對照的百分比表示。ANOVA顯示對于野生型(HHHQKLVFF)的顯著性重要作用，但是對于突變型肽則無。事后分析顯示野生型肽在1μM、5μM和10μM下有顯著作用(P＜0.005)，但是LVFF突變型肽在任何測試劑量下都無顯著作用。

這些結果都支持僅含有HHQK和VFF基序的肽序列才有效抑制毛細血管形成測定中血管生成的結論(圖6)。然而，僅含有YEVHHQK序列的Aβ10-16片段無活性，表明僅該區(qū)不足以具備抗血管生成活性。
實施例13大鼠角膜微囊袋試驗中Aβ12-28肽片段的作用
為了確定體外表現(xiàn)出抗血管生成的Aβ12-28肽片段是否體內(nèi)也抗血管生成，用實施例6所述大鼠角膜微囊袋試驗測定Aβ12-28。使角膜微囊袋孵育7天。在對200ng VEGF、VEGF+0.5μg Aβ12-28、VEGF+2.5μg Aβ12-28和VEGF+5.0μg Aβ12-28的反應中，對從大鼠角膜微囊袋試驗得到的數(shù)據(jù)進行定量。ANOVA顯示Aβ劑量顯著性的重要作用，事后分析顯示在5μg劑量下的顯著性作用(P＜0.001)。血管生成指數(shù)用平均值+/-SEM表示。

這些結果支持在該體內(nèi)測定法中Aβ12-28能夠劑量依賴性地抑制VEGF誘導的血管生成的結論(圖7)，證實了得自體外實驗的數(shù)據(jù)。
實施例14Aβ12-28、Aβ12-28突變型和Aβ13-20在大鼠角膜微囊袋試驗中的作用
按照實施例6所述大鼠角膜微囊袋試驗方法，測試不同Aβ肽片段和突變型的作用。對得自響應200ng VEGF、5.0μg Aβ12-28GGQGL突變型肽和0.5μg、2.5μg和5.0μg Aβ12-28和Aβ13-20(HHH-肽或HHQKLVFF)反應的測定數(shù)據(jù)進行定量。Aβ12-28GGQGL突變型在體內(nèi)對抑制血管生成無活性。較短的HHH-肽在體內(nèi)表現(xiàn)出抗血管生成(P＜0.05，以劑量依賴性方式)。結果見圖8。圖9是毛細血管的四倍放大照片。
權利要求
1.一種抗血管生成Aβ肽片段或其變異體或同源物，其中所述片段的長度介于8和39個氨基酸之間。
2.權利要求1的抗血管生成Aβ肽片段，其中所述片段的長度為8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38或39個氨基酸。
3.權利要求1的抗血管生成Aβ肽片段，其中所述片段是Aβ1-28、Aβ10-35、Aβ12-28或Aβ13-20。
4.權利要求3的抗血管生成Aβ肽片段，其中所述片段是Aβ12-28。
5.權利要求1的抗血管生成Aβ肽片段，其中所述片段是Aβ13-20。
6.權利要求5的抗血管生成Aβ肽片段，其中所述Aβ12-28片段包含氨基酸序列HHQKLVFF或其變異體或同源物。
7.權利要求5的抗血管生成Aβ肽片段，其中所述Aβ13-20肽片段是氨基酸序列HHQKLVFF或其變異體或同源物。
8.權利要求1的抗血管生成Aβ肽片段，其中所述變異體或同源物具有與天然Aβ肽片段約80.0％至約99.9％的氨基酸同一性。
9.權利要求1的抗血管生成Aβ肽片段，其中所述片段是含有至少一個氨基酸置換的變異體。
10.權利要求9的抗血管生成Aβ肽片段，其中所述氨基酸置換是非天然氨基酸或氨基酸類似物。
11.權利要求1的抗血管生成Aβ肽片段，還另包含接頭。
12.權利要求1的抗血管生成Aβ肽片段，其中所述片段與第二肽或蛋白質(zhì)連接。
13.一種藥物組合物，所述組合物包含權利要求1的抗血管生成Aβ肽片段和藥學上可接受的載體。
14.權利要求13的藥物組合物，其中所述藥物組合物是控釋劑型。
15.權利要求14的藥物組合物，其中所述控釋劑型是聚合物骨架片。
16.一種治療由病理性血管生成介導的疾病或病癥的方法，該方法包括給予有需要的受治療者有效量的生物活性Aβ肽片段或其變異體或同源物，其中所述片段的長度介于8和39個氨基酸之間。
17.權利要求16的方法，其中所述片段的長度為8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38或39個氨基酸。
18.權利要求16的方法，其中所述片段是Aβ1-28。
19.權利要求16的方法，其中所述片段是Aβ10-35。
20.權利要求16的方法，其中所述片段是Aβ12-28。
21.權利要求16的方法，其中所述片段是Aβ13-20。
22.權利要求16的方法，其中所述片段是氨基酸序列HHQKLVFF或其變異體或同源物。
23.權利要求16的方法，其中所述疾病或病癥是癌癥。
24.權利要求16的方法，其中所述疾病或病癥是增殖性疾病。
25.權利要求16的方法，其中所述疾病或病癥是炎性疾病。
26.權利要求16的方法，其中所述受治療者是哺乳動物。
27.權利要求16的方法，其中所述受治療者是人。
28.權利要求16的方法，其中所述生物活性Aβ肽片段通過選自以下的途徑給予口服、胃腸外、靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、肺部、黏膜、局部、經(jīng)皮、皮下、肌內(nèi)、直腸、顱內(nèi)、腦室內(nèi)、大腦內(nèi)、陰道內(nèi)、子宮內(nèi)、鞘內(nèi)或腹膜內(nèi)給藥。
29.權利要求16的方法，其中所述生物活性Aβ肽片段與藥學上可接受的載體聯(lián)合給予受治療者。
30.權利要求16的方法，其中所述Aβ肽片段是以控釋劑型給予受治療者。
31.權利要求16的方法，其中所述控釋劑型包括聚合物骨架片。
32.權利要求16的方法，該方法還包括一種或多種另外的治療藥與生物活性Aβ肽片段聯(lián)合或交替給藥。
33.權利要求32的方法，其中所述另外的治療藥是化療藥物。
34.權利要求16的方法，其中所述Aβ肽片段作為融合肽給予患者。
35.一種治療癌癥的方法，該方法包括給予有需要的受治療者有效量的生物活性Aβ肽片段或其變異體或同源物，其中所述片段的長度介于8和39個氨基酸之間。
36.權利要求35的方法，其中所述片段的長度為8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38或39個氨基酸。
37.權利要求的35方法，其中所述片段選自Aβ1-28、Aβ10-35、Aβ12-28和Aβ13-20。
38.權利要求37的方法，其中所述片段是Aβ13-20。
39.權利要求38的方法，其中所述Aβ13-20肽片段是氨基酸序列HHQKLVFF或其變異體或同源物。
40.權利要求35的方法，其中所述癌癥選自肺癌、乳腺癌、前列腺癌、子宮癌、結腸癌和非霍金奇淋巴瘤。
41.權利要求35的方法，其中所述受治療者是哺乳動物。
42.權利要求35的方法，其中所述受治療者是人。
43.權利要求35的方法，該方法還包括給予一種或多種另外的治療藥。
44.權利要求43的方法，其中所述另外的治療藥是化療藥物。
45.權利要求44的方法，其中所述化療藥物選自烷化劑、亞硝基脲、抗代謝藥、拓撲異構酶抑制劑、有絲分裂抑制劑、皮質(zhì)類固醇抑制劑。
49.一種鑒定干預Aβ誘導的血管生成抑制的化合物的方法，該方法包括(a)使能夠進行血管生成的第一生物樣品與試驗化合物、生物活性量的Aβ肽片段和血管生成藥接觸；和(b)測定發(fā)生在第一生物樣品中血管生成的程度。
50.權利要求49的方法，該方法還包括(c)單獨使能夠進行血管生成的第二生物樣品與生物活性量的Aβ肽片段和血管生成藥接觸；(d)測定發(fā)生在第二生物樣品中血管生成的程度和(e)將發(fā)生在第一生物樣品中血管生成的程度與發(fā)生在第二生物樣品中的血管生成的程度進行比較。
51.抗血管生成Aβ肽片段或其變異體或同源物，任選與藥學上可接受的載體一起在制備用于治療病理性血管生成相關疾病或病癥的藥物中的用途，其中所述片段的長度介于8和39個氨基酸之間。
52.權利要求51的用途，其中所述片段是包含氨基酸序列HHQKLVFF的Aβ1-28片段或其變異體或同源物。
53.權利要求51的用途，其中所述肽片段具有氨基酸序列HHQKLVFF或其變異體或同源物。
54.權利要求51的用途，其中所述藥學上可接受的載體適于口服、胃腸外、靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、肺部、黏膜、局部、經(jīng)皮、皮下、肌內(nèi)、直腸、顱內(nèi)、腦室內(nèi)、大腦內(nèi)、陰道內(nèi)、子宮內(nèi)、鞘內(nèi)或腹膜內(nèi)給藥。
全文摘要
本發(fā)明提供用于抑制血管生成的Aβ肽片段。本發(fā)明還提供通過給予有效量的Aβ片段，用于治療病理性或不需要的血管生成及其相關病癥和疾病的方法。在一個具體的實施方案中，肽片段包括序列HHQKLVFF。
文檔編號C07K7/08GK101558080SQ200680041301
公開日2009年10月14日 申請日期2006年11月13日 優(yōu)先權日2005年11月10日
發(fā)明者D·帕里斯, M·J·穆蘭 申請人:羅斯坎普研究有限責任公司