專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種羥基積雪草甙化學(xué)對(duì)照品的分離制備方法一種羥基積雪草甙化學(xué)對(duì)照品的分離制備方法駄領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種從羥基積雪草甙提取物中分離獲得純度大于98%的羥基積雪草甙化學(xué)對(duì)照品的制備方法。羥基積雪草甙(Madecassoside)是積雪草中一種重要的活性化學(xué)成分，屬于五環(huán)三萜類(lèi)化合物。羥基積雪草甙的結(jié)構(gòu)式如下OHOH羥基積雪草的制備方法主要有如下方法:1.大孔吸附樹(shù)脂吸附法秦路平等(中國(guó)專(zhuān)利CN12110訴C，2005年公開(kāi))報(bào)道了積雪草總甙的提取方法，該方法采用皂甙型大孔吸附樹(shù)脂吸附積雪草提取物，經(jīng)蒸餾水洗脫，去除雜質(zhì)后，以水醇洗脫，得到積雪草總甙溶液，乙酸乙酯結(jié)晶，減壓濃縮至干，經(jīng)核磁共振分析，所得總皂甙主要由積雪草甙和羥基羥基積雪草甙組成，兩種成分占總該提取物的60%以上。2.正相色譜法陳瑤等(中國(guó)專(zhuān)利CN1377649，2002年公開(kāi))報(bào)道了采用正相色譜制備羥基積雪草甙的方法以積雪草總甙為原料，進(jìn)行硅膠正相層析，氯仿甲醇為洗脫液，收取其中的2:l比例部分洗脫液，回收獲得羥基積雪草甙晶體。3.離子交換色譜法A"盧瓦索等報(bào)道(中國(guó)專(zhuān)利CN1774257，2006年公開(kāi))報(bào)道積雪草甙、羥基積雪草甙和另一種五環(huán)三萜成分特米諾甙總含量為75%混合物可以通過(guò)如下方法獲得積雪草地上部分的醇提取物經(jīng)過(guò)陰離子樹(shù)脂后，用液/液提取的方法進(jìn)行選擇性脫脂，濃縮脫脂后的水一醇液依次通過(guò)陽(yáng)離子樹(shù)脂、陰離子樹(shù)脂獲得混合物。該混合物如通過(guò)選擇性色譜分離可以獲得羥基積雪草甙和特米諾甙兩種成分總量占混合物含量95%以上的混合物。羥基積雪草是積雪草中一種具有很強(qiáng)生物活性的化合物，將積雪草甙和羥基積雪草甙共同做為研究對(duì)象開(kāi)展有關(guān)研究成為積雪草植物研究的趨勢(shì)。積雪草苷和羥基積雪草苷含量之和大于40%的積雪草總甙可以用來(lái)用于防治冠心病、心絞痛、心肌梗死、腦血栓形成、腦梗塞等心腦血管疾病。當(dāng)積雪草甙、羥基積雪草甙和特米諾甙三種成分總量占混合物含量75%以上時(shí)具有抗炎作用，可以用于治療多種炎性疾病及銀屑病、白癜風(fēng)等皮膚疾病。但目前羥基積雪草甙的提取方法都無(wú)法穩(wěn)定獲得純度為98%以上的羥基積雪草甙化學(xué)對(duì)照品，無(wú)法滿(mǎn)足羥基積雪草藥材或相關(guān)制劑的質(zhì)量分析及控制要求。制約了積雪草及羥基積雪草甙的科學(xué)研究及應(yīng)用。開(kāi)發(fā)一種可以獲得克級(jí)純度在98%以上羥基積雪草甙化學(xué)對(duì)照品的方法是當(dāng)前積雪草研究的難點(diǎn)。針對(duì)該問(wèn)題,我們開(kāi)發(fā)了一種可以獲得10克/月以上規(guī)模、純度在98%以上羥基積雪草甙的制備方法。
發(fā)明內(nèi)容為克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，優(yōu)化分離條件，本發(fā)明的目的在于提供一種分離時(shí)間短、分離效果好、產(chǎn)品純度高(純度在98%以上)的羥基積雪草甙化學(xué)對(duì)照品的分離制備方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案對(duì)照品的分離制備方法，以重量含量3097%(優(yōu)選6097%)的羥基積雪草甙提取物為原料，以制備型髙效液相色譜為分離手段，以甲醇-水溶液為洗脫體系，獲得純度98%以上羥基積雪草甙化學(xué)對(duì)照品；具體步驟為，(1)樣品預(yù)處理將重量含量3097%的羥基積雪草甙提取物用甲醇或乙醇溶液溶解，配置成重量濃度為2060mg/ml的積雪草甙提取物溶液，經(jīng)0.220.45nm微孔濾膜過(guò)濾；(2)色譜柱處理高效液相色譜柱選擇制備型高效液相色譜柱，以520倍柱體積的洗脫體系溶液平衡色譜柱；洗脫體系溶液為甲醇水溶液，其體積濃度為50—80%;(3)進(jìn)樣將過(guò)濾后的樣品溶液通過(guò)六通閥或泵進(jìn)樣，進(jìn)樣體積為l100ml;(4)洗脫采用洗脫體系溶液洗脫色譜柱，流速控制在10600ml/min，在線紫外監(jiān)測(cè)，收集含有羥基積雪草甙的洗脫液；(5)羥基積雪草甙化學(xué)對(duì)照品的獲得減壓濃縮所收集到的羥基積雪草甙洗脫液至干，獲得純度高于98%的羥基積雪草甙化學(xué)對(duì)照品。所述制備型高效液相柱選用商品化或自己裝填的制備型高效液相柱;其填料可為C8或C18鍵合相填料；自己裝填的制備型高效液相柱裝填方式為濕法裝柱，填料粒徑為5-20nm，柱效在2000以上；在線紫外檢測(cè)，其檢測(cè)波長(zhǎng)為l卯nm220nm，具體監(jiān)測(cè)波長(zhǎng)根據(jù)樣品中干擾成分與羥基積雪草甙的靈敏度確定，在所選擇波長(zhǎng)下，可以靈敏監(jiān)測(cè)到千擾成分與羥基積雪草甙的信號(hào)；羥基積雪草甙洗脫液收集后，減壓濃縮，濃縮溫度控制在4070'C。以本方法從羥基積雪草提取物中分離羥基積雪草甙化學(xué)對(duì)照品具有如下優(yōu)點(diǎn)和進(jìn)步1.本發(fā)明以制備型高效液相為分離手段，在保證羥基積雪草甙得到高效分離的前提下，提高了羥基積雪草甙化學(xué)對(duì)照品的產(chǎn)量，可以獲得克級(jí)純度在訴％以上的羥基積雪草甙化學(xué)對(duì)照品。2.本發(fā)明所述的甲醇-水洗脫體系能有效的保證羥基積雪草甙與其他成分得到有效分離，從而保證分離的效果。3.本發(fā)明采用紫外監(jiān)測(cè)器在線監(jiān)測(cè)，監(jiān)測(cè)波長(zhǎng)為200至220nm間任一波長(zhǎng)，使羥基積雪草甙的分離情況可以直接監(jiān)測(cè)，并可以選擇性收集，顯著提高收集效果。4.本發(fā)明所述方法操作簡(jiǎn)便，條件溫和，能有效的保證羥基積雪草甙的穩(wěn)定性。5.可產(chǎn)業(yè)推廣。色譜柱規(guī)格為20X250mm時(shí)，其規(guī)?？蛇_(dá)到10克/月以上。圖i為本發(fā)明實(shí)施例i制備的羥基積雪草甙化學(xué)對(duì)照品的純度分析色譜圖。具體實(shí)肪式下面通過(guò)實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。實(shí)施例i本實(shí)施例中，以30%的羥基積雪草甙提取物為原料，以5阿C18鍵合相填料為吸附劑，以含有甲醇-水(50:50，體積比)溶液為洗脫溶劑，具體工藝步驟如下1.樣品預(yù)處理羥基積雪草甙提取物用甲醇溶解，配置成濃度為60mg/ml的羥基積雪草甙溶液，經(jīng)0.22阿微孔濾膜過(guò)濾。2.色譜柱處理制備型高效液相柱選擇為日本Sheshido生產(chǎn)的固定相為C18的制備柱(5pm，20X250mm)，以約5倍柱體積的洗脫體系溶液平衡色譜柱。3.上樣將過(guò)濾后的樣品溶液通過(guò)六通閥進(jìn)樣，進(jìn)樣體積為lml。4.洗脫流速控制在10ml/min，在線200nm紫外監(jiān)測(cè)，收集含有羥基積雪草武的洗脫液，5.羥基積雪草甙化學(xué)對(duì)照品的獲取減壓濃縮羥基積雪草甙洗脫液，減壓濃縮，濃縮溫度控制在7(TC。得到純度為98.89。/。的羥基積雪草甙化學(xué)對(duì)照品；如圖1所示，其分析結(jié)果如表l所示表l<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實(shí)施例2本實(shí)施例中，以60%羥基積雪草甙提取物為原料，以10pm的C8鍵合相填料為吸附劑，以含有甲醇-水(70:30,體積比)溶液為洗脫溶劑，具體工藝步驟如下1.樣品預(yù)處理60%羥基積雪草甙提取物用乙醇溶解，配置成濃度為40mg/ml的羥基積雪草甙溶液，經(jīng)0.45Mm微孔濾膜過(guò)濾。2.色譜柱處理制備型高效液相柱是自己裝填的制備柱，填料為粒徑為10拜的C18鍵合相填料，濕法裝柱，色譜柱規(guī)格為50X250mm，以約10倍柱體積的洗脫體系溶液平衡色譜柱。3.上樣將過(guò)濾后的樣品溶液通過(guò)六通閥進(jìn)樣，進(jìn)樣體積為5ml。4.洗脫流速控制在90ml/min，在線207nm紫外監(jiān)測(cè)，收集含有羥基積雪草甙的洗脫液，5.羥基積雪草甙化學(xué)對(duì)照品的獲取減壓濃縮羥基積雪草甙洗脫液，減壓濃縮，濃縮溫度控制在60'C。得到純度為98.91°/。的羥基積雪草甙化學(xué)對(duì)照品。實(shí)施例3本實(shí)施例中，以60%的羥基積雪草甙提取物為原料，以10jjm的C18鍵合相填料為吸附劑，以含有甲醇-水(60:40，體積比)溶液為洗脫溶劑，具體工藝步驟如下1.樣品預(yù)處理羥基積雪草甙提取物用甲醇溶解，配置成濃度為40mg/ml的羥基積雪草甙溶液，經(jīng)0.45nm微孔濾膜過(guò)濾。2.色譜柱處理制備型高效液相柱是自己裝填的制備柱，填料為粒徑為IO拜的C18鍵合相填料，色譜柱規(guī)格為75X250mm，以約10倍柱體積的洗脫體系溶液平衡色譜柱。3.上樣將過(guò)濾后的樣品溶液通過(guò)六通閥進(jìn)樣，進(jìn)樣體積為10ml。4.洗脫流速控制在150ml/min，在線200nm紫外監(jiān)測(cè)，收集含有羥基積雪草甙的洗脫液，5.羥i積雪草甙化學(xué)對(duì)照品的獲取減壓濃縮羥基積雪草甙洗脫液，減壓濃縮，濃縮溫度控制在651C。得到純度為98.14%的羥基積雪草甙化學(xué)對(duì)照品。實(shí)施例4本實(shí)施例中，以卯％的羥基積雪草甙提取物為原料，以20nmC18鍵合相填料為吸附劑，含有甲醇-水(80:20，體積比)溶液為洗脫溶劑，具體工藝步驟如下1.樣品預(yù)處理羥基積雪草甙提取物用甲醇溶解，配置成濃度為40mg/ml的羥基積雪草甙溶液，經(jīng)0.45jim微孔濾膜過(guò)濾。2.色譜柱處理制備型髙效液相柱是自己裝填的制備柱，填料為粒徑為20pm的C18鍵合相填料，色譜柱規(guī)格為100X270mm，以約10倍柱體積的洗脫體系溶液平衡色譜柱。3.上樣將過(guò)濾后的樣品溶液通過(guò)六通閥進(jìn)樣，進(jìn)樣體積為20ml。4.洗脫流速控制在300ml/min,在線207nm紫外監(jiān)測(cè)，收集含有羥基積雪草武的洗脫液，5.羥'基積雪草甙化學(xué)對(duì)照品的獲取減壓濃縮羥基積雪草甙洗脫液，減壓濃縮，濃縮溫度控制在60'C。得到純度為98.95%的羥基積雪草甙化學(xué)對(duì)照品。實(shí)施例5本實(shí)施例中，以80%的羥基積雪草甙提取物為原料，以10阿C18鍵合相填料為吸附劑，含有甲醇-水(75:25，體積比)溶液為洗脫溶劑，具體工藝步驟如下1.樣品預(yù)處理羥基積雪草甙提取物用甲醇液溶解，配置成濃度為30mg/ml的羥基積雪草甙溶液，經(jīng)0.45nm微孔濾膜過(guò)濾。2.色譜柱處理制備型高效液相柱是自己裝填的制備柱，填料為粒徑為10拜的C18鍵合相填料，色譜柱規(guī)格為150X250mm，以約10倍柱體積的洗脫體系溶液平衡色譜柱。3.上樣將過(guò)濾后的樣品溶液通過(guò)六通閥進(jìn)樣，進(jìn)樣體積為lOOml。4.洗脫流速控制在600ml/min，在線220nm紫外監(jiān)測(cè)，收集含有羥基積雪草甙的洗脫液，5.羥i積雪草甙化學(xué)對(duì)照品的獲取減壓濃縮羥基積雪草甙洗脫液，得到純度為98.20%的羥基積雪草甙化學(xué)對(duì)照品。實(shí)施例6本實(shí)施例中，以97%的羥基積雪草甙提取物為原料，以l(HimC18鍵合相填料為吸附劑，含有甲醇-水(65:35，體積比)溶液為洗脫溶劑，具體工藝步驟如下1.樣品預(yù)處理羥基積雪草甙提取物用甲醇-水(65:35，體積比)溶液溶解，配置成濃度為40mg/ml的羥基積雪草甙溶液，經(jīng)0.45pm微孔濾膜過(guò)濾。2.色譜柱處理制備型高效液相柱是自己裝填的制備柱，填料為粒徑為20pm的C18鍵合相填料，色譜柱規(guī)格為150X250mm，以約10倍柱體積的洗脫體系溶液平衡色譜柱。3.上樣將過(guò)濾后的樣品溶液通過(guò)六通閥進(jìn)樣，進(jìn)樣體積為100ml。4.洗脫流速控制在600ml/min，在線220nm紫外監(jiān)測(cè)，收集含有羥基積雪草甙的洗脫液，5.羥，基積雪草甙化學(xué)對(duì)照品的獲取減壓濃縮羥基積雪草甙洗脫液，減壓濃縮，濃縮溫度控制在7ox:。得到純度為98.34%的羥基積雪草甙化學(xué)對(duì)照品。權(quán)利要求1.一種羥基積雪草甙化學(xué)對(duì)照品的分離制備方法，其特征在于以重量含量30～97％的羥基積雪草甙提取物為原料，以制備型高效液相色譜為分離手段，以甲醇-水溶液為洗脫體系，獲得純度98％以上羥基積雪草甙化學(xué)對(duì)照品；具體步驟為，(1)樣品預(yù)處理將重量含量30～97％的羥基積雪草甙提取物用甲醇或乙醇溶液溶解，配置成重量濃度為20～60mg/ml的積雪草甙提取物溶液，經(jīng)0.22～0.45μm微孔濾膜過(guò)濾；(2)色譜柱處理高效液相色譜柱選擇制備型高效液相色譜柱，以5～10倍柱體積的洗脫體系溶液平衡色譜柱；洗脫體系溶液為甲醇水溶液，其體積濃度為50～80％；(3)進(jìn)樣將過(guò)濾后的樣品溶液進(jìn)樣，進(jìn)樣體積為1～100ml；(4)洗脫采用洗脫體系溶液洗脫色譜柱，流速控制在10～600ml/min，在線紫外監(jiān)測(cè)，收集含有羥基積雪草甙的洗脫液；(5)羥基積雪草甙化學(xué)對(duì)照品的獲得減壓濃縮所收集到的羥基積雪草甙洗脫液至干，獲得純度高于98％的羥基積雪草甙化學(xué)對(duì)照品。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述羥基積雪草甙化學(xué)對(duì)照品的分離制備方法，其特征在于所述原料為重量含量6097%的羥基積雪草甙提取物。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述羥基積雪草甙化學(xué)對(duì)照品的分離制備方法，其特征在于所述制備型高效液相柱選用商品化或自己裝填的制備型高效液相柱；其填料可為C8或C18鍵合相填料。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述羥基積雪草甙化學(xué)對(duì)照品的分離制備方法，其特征在于所述自己裝填的制備型高效液相柱裝填方式為濕法裝柱。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述羥基積雪草甙化學(xué)對(duì)照品的分離制備方法，其特征在于所述制備型高效液相柱的柱效在2000以上。6.根據(jù)權(quán)利要求3所述羥基積雪草甙化學(xué)對(duì)照品的分離制備方法，其特征在于所述制備型高效液相柱的填料粒徑為5-20miti。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述羥基積雪草甙化學(xué)對(duì)照品的分離制備方法，其特征在于所述在線紫外檢測(cè)，其檢測(cè)波長(zhǎng)為l卯nm220nm。8根據(jù)權(quán)利要求1所述羥基積雪草甙化學(xué)對(duì)照品的分離制備方法，其特征在于所述羥基積雪草甙洗脫液收集后，減壓濃縮，濃縮溫度控制在607ox:。全文摘要本發(fā)明涉及一種羥基積雪草甙化學(xué)對(duì)照品的分離制備方法，以重量含量30～97％的羥基積雪草甙提取物為原料，以制備型高效液相色譜為分離手段，以一定比例的甲醇-水溶液為洗脫體系，獲得純度大于98％的羥基積雪草甙化學(xué)對(duì)照品；工藝步驟有樣品預(yù)處理，色譜柱處理，進(jìn)樣，洗脫，在線監(jiān)測(cè)，收集含有羥基積雪草甙的洗脫液，減壓濃縮羥基積雪草甙洗脫液至干，即得羥基積雪草甙化學(xué)對(duì)照品。經(jīng)高效液相色譜法監(jiān)測(cè)，羥基積雪草甙的含量可達(dá)到98％以上。文檔編號(hào)C07J63/00GK101210039SQ20061013509公開(kāi)日2008年7月2日申請(qǐng)日期2006年12月27日優(yōu)先權(quán)日2006年12月27日發(fā)明者肖紅斌,高明哲申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所