專利名稱：小麥低分子量麥谷蛋白亞基的聚丙烯酰胺凝膠電泳方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及小麥麥谷蛋白亞基的分離方法，特別涉及小麥低分子量麥谷蛋白亞基的聚丙烯酰胺凝膠電泳方法，。
背景技術(shù)：
小麥麥谷蛋白亞基是小麥的一類重要的儲(chǔ)藏蛋白。研究表明，亞基的組成對(duì)小麥面粉的加工品質(zhì)和營養(yǎng)品質(zhì)有重要影響，不同亞基和亞基組合對(duì)加工品質(zhì)的影響或貢獻(xiàn)大小不同。麥谷蛋白亞基按分子量大小分為高分子量谷蛋白亞基和低分子量谷蛋白亞基。兩類亞基對(duì)品質(zhì)的貢獻(xiàn)，早先研究認(rèn)為高分子量亞基的貢獻(xiàn)較大。經(jīng)過進(jìn)一步研究認(rèn)為低分子量亞基對(duì)品質(zhì)，尤其是加工品質(zhì)有相當(dāng)貢獻(xiàn)。對(duì)蛋白亞基的分離是研究亞基和亞基對(duì)品質(zhì)作用的基礎(chǔ)，也可利用麥谷蛋白亞基對(duì)小麥種質(zhì)資源進(jìn)行分類研究。
聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)，經(jīng)過國內(nèi)外研究者的創(chuàng)立和改良，目前是應(yīng)用最為廣泛的分離麥谷蛋白亞基的技術(shù)，在分離構(gòu)成多采用β巰基乙醇來打破二硫鍵，解聚蛋白質(zhì)。在我國，對(duì)麥谷蛋白亞基的研究多集中于對(duì)高分子量亞基的電泳分離和研究，主要原因之一在于低分子量麥谷蛋白亞基難以分離或分離不清。因此要進(jìn)一步擴(kuò)大我國在蛋白亞基、品質(zhì)、品質(zhì)育種等方面的成就，必須在研究高分子量麥谷蛋白亞基的同時(shí)，注意對(duì)低分子量谷蛋白亞基的研究，分析其對(duì)品質(zhì)的影響和其與高分子量亞基之間的相互作用。這就意味著必須要改良現(xiàn)有凝膠電泳技術(shù)體系，建立一種簡單，高效的能清晰分離低分子量谷蛋白亞基的凝膠電泳技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，對(duì)常用的蛋白凝膠電泳方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，提供一種小麥低分子量麥谷蛋白亞基的聚丙烯酰胺凝膠電泳方法，該方法簡單，高效，能夠清晰的單向一步分離低分子量麥谷蛋白亞基。
為了實(shí)現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明采取如下的技術(shù)解決方案1.一種小麥麥谷蛋白亞基低分子量的聚丙烯酰胺凝膠電泳方法，其特征在于，具體包括下列步驟1)小麥麥谷蛋白亞基的提取與處理首先將種子研壓破碎成粉末；然后使用體積分?jǐn)?shù)50％異丙醇，去除醇溶蛋白和沉淀蛋白后加入樣品緩沖液50ul，該樣品緩沖液含有24％甘油，8％十二烷基硫酸鈉，0.012％溴酚蘭的0.125MTris-Hcl，緩沖液的pH值為6.8，35℃～40℃水浴1h備用；2)單向一步分離高、低分子量谷蛋白亞基電泳A.采用電泳儀進(jìn)行垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳，壓條封邊后，將交聯(lián)度2.6％的10％pH8.8丙烯酰氨分離膠灌至膠板的4/5處，立即用蒸餾水或無水乙醇封頂，凝膠半小時(shí)以上；B.棄去封頂水或無水乙醇，用4％交聯(lián)度1.3％的PH為6.8的丙烯酰氨濃縮膠灌滿膠板，插入長城齒梳子，凝膠半小時(shí)以上；C.用Tris-甘氨酸電極緩沖液，其中含0.3％Tris，0.1％SDS，0.4M甘氨酸，pH值為8.3，在20mA恒壓電泳11h-12h。
3)脫色用G250考馬斯亮蘭染色3h，清水脫色24h，即可清晰分離出低分子量麥谷蛋白亞基。
本發(fā)明的方法，去除了小麥高、低分子量麥谷蛋白中醇溶蛋白對(duì)分離效果的干擾，并且樣品緩沖液中不使用有臭味的β巰基乙醇；丙烯酰胺凝膠分離膠使用交連度為2.6％的10％丙烯酰胺凝膠，降低分子篩孔度，一步同時(shí)分離高、低分子量亞基，達(dá)到了更好的分離效果；電極緩沖液采用0.4M甘氨酸，增大了緩沖液電泳的離子效應(yīng)，配合凝膠清晰的分離出低分子量麥谷蛋白亞基；使用清水脫色即可，節(jié)約藥品成本。


圖1是采用本發(fā)明清晰分離的低分子量麥谷蛋白亞基圖片。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明參考了朱金寶和Morel等提出的聚丙烯酰胺凝膠電泳方法，并對(duì)其中部分作了調(diào)整和改進(jìn)，其主要步驟是1.小麥麥谷蛋白亞基的提取1)切取1/3種子放入1.5ml離心管，將其研壓破碎成粉末。
2)在粉末中加入120ul體積分?jǐn)?shù)50％異丙醇，60℃水浴30min，10000rpm離心10分鐘，棄去上清，重復(fù)一次，去除醇溶蛋白對(duì)分離條帶特別是D、B、C區(qū)的干擾。
3)加入160ul含0.3％二硫蘇糖醇的50％異丙醇，60℃水浴30min。加入等體積含1.4％4-己烯基吡啶的50％異丙醇溶液，60℃水浴30min，10000rpm離心10分鐘，小心移取200ul上清液于另一試管。
4)在試管中加入上清液4倍體積的丙酮，在35℃-40℃水浴30min，10000rpm離心10分鐘，棄去上清。
5)加入含有24％甘油，8％十二烷基硫酸鈉，0.012％溴酚蘭的0.125MTris-Hcl樣品緩沖液(PH6.8)50ul，35℃-40℃水浴1h備用。
2.單向一步分離高、低分子量谷蛋白亞基電泳1)采用北京六一儀器廠生產(chǎn)的ECP三恒電泳儀進(jìn)行垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳，壓條封邊后，將交聯(lián)度2.6％的10％pH8.8丙烯酰氨分離膠灌至膠板的4/5處，立即用蒸餾水或無水乙醇封頂，凝膠半小時(shí)以上。
2)棄去封頂水或無水乙醇，用4％交聯(lián)度1.3％的pH6.8丙烯酰氨濃縮膠灌滿膠板，插入長城齒梳子，凝膠半小時(shí)以上。
3)用Tris-甘氨酸電極緩沖液(含0.3％Tris，0.1％SDS，0.4M甘氨酸，PH8.3)在20mA恒壓電泳11-12h(指示線剛剛遷移出凝膠)。
3.脫色用G250考馬斯亮蘭染色3h，清水脫色24h即可分離出低分子量麥谷蛋白亞基(如圖1所示)。
本發(fā)明的方法與改進(jìn)前的技術(shù)的不同之處參見下表

權(quán)利要求
1.一種低分子量小麥麥谷蛋白亞基的聚丙烯酰胺凝膠電泳方法，其特征在于，包括如下步驟1)小麥麥谷蛋白亞基的提取與處理首先將1/3種子研壓破碎成粉末；然后使用體積分?jǐn)?shù)50％異丙醇，去除醇溶蛋白和沉淀蛋白后加入緩沖液50ul，該緩沖液中含有24％的甘油，8％的十二烷基硫酸鈉，0.012％溴酚蘭的0.125MTris-Hcl，緩沖液的pH值為6.8，35℃～40℃水浴1h備用；2)單向一步分離高、低分子量谷蛋白亞基電泳A.采用電泳儀進(jìn)行垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳，壓條封邊后，將交聯(lián)度2.6％的10％pH8.8丙烯酰氨分離膠灌至膠板的4/5處，立即用蒸餾水或無水乙醇封頂，凝膠半小時(shí)以上；B.棄去封頂水或無水乙醇，用4％交聯(lián)度1.3％的PH為6.8的丙烯酰氨濃縮膠灌滿膠板，插入長城齒梳子，凝膠半小時(shí)以上；C.用Tris-甘氨酸電極緩沖液，其中含0.3％Tris，0.1％SDS，0.4M甘氨酸，pH值為8.3，在20mA恒壓電泳11-12h。3)脫色用G250考馬斯亮蘭染色3h，清水脫色24h，即可清晰分離出低分子量麥谷蛋白亞基。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種小麥麥谷蛋白亞基低分子量的聚丙烯酰胺凝膠電泳方法，該方法對(duì)常用的蛋白凝膠電泳方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，去除了小麥高、低分子量麥谷蛋白中醇溶蛋白對(duì)分離效果的干擾，并且樣品緩沖液中不使用有臭味的β巰基乙醇；丙烯酰胺凝膠分離膠使用交連度為2.6％的10％丙烯酰胺凝膠，降低分子篩孔度，一步同時(shí)分離高、低分子量亞基，達(dá)到了更好的分離效果；電極緩沖液采用0.4M甘氨酸，增大了緩沖液電泳的離子效應(yīng)，配合凝膠清晰的分離出低分子量麥谷蛋白亞基；使用清水脫色即可，節(jié)約藥品成本。該方法簡單，高效，能夠清晰的單向一步分離低分子量麥谷蛋白亞基。
文檔編號(hào)C07K14/415GK1876675SQ200610042829
公開日2006年12月13日 申請(qǐng)日期2006年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月18日
發(fā)明者張宏, 吉萬全, 王長有, 王秋英, 任志龍, 王亞娟, 蔡?hào)|明 申請(qǐng)人:西北農(nóng)林科技大學(xué)