專利名稱：海蜇膠原蛋白及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及海洋生物化工原料的改進，具體講是一種海蜇膠原蛋白及其制備方法。其屬于生物醫(yī)藥化工技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
海蜇，又名水母，屬腔腸動物。海蜇是肉食性的，以浮游生物，小的甲殼類、多毛類甚至小的魚類為食。身體呈傘體半球形，傘徑一般30至45厘米，大的可達100厘米。海蜇的表皮層與胃層之間為中膠層(mesoglea)，中膠層非常發(fā)達，占據(jù)了其身體的幾乎整個厚度，其中含有纖維及少量來源于外胚層的細胞。中膠層硬而厚，電子顯微鏡下可見中膠層有許多小纖維。中膠層中的主要成分是水分，其中含有極少量的蛋白質(zhì)及多糖，含有機物為5％，并以膠原蛋白質(zhì)的形式存在，這種物質(zhì)具有很強的彈性和粘合力。海蜇是我國久負盛名的食用大型浮游動物，近年來，養(yǎng)殖界攻克了人工育苗、螅狀體幼體越冬和幼蜇放流等技術(shù)難關(guān)，具有持續(xù)的海蜇資源供應(yīng)。海蜇皮主要成分為蛋白質(zhì)(膠原蛋白)，不含膽固醇和脂肪酸。有美國專利(USpatent6,894,029)報道了利用口冠水母科的口冠水母(Stomolophus meleagris)采用凍干、堿洗、酸洗、蛋白酶消化、分級鹽析工藝，制得類II膠原，用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。還有日本專利(JP2004099513)報道了利用洋須水母科的海月水母(Aureiiaaurita)，采用緩沖液萃取膠原、膠原沉淀和分離、膠原脫水、冷凍干燥工藝制備膠原，從海月水母中提取的活性水母膠原具有抗菌活性，microorganismPropionibacterium acnes瘡皰丙酸桿菌，是引起面部丘疹的致病菌。國內(nèi)較多文獻報道了從牛腱、豬皮、豬軟骨、魚皮、魚鱗中提取膠原蛋白的技術(shù)和工藝，均是采用酶解鹽析提取工藝，采用鹽析提取存在的問題是蛋白酶回收困難、鹽回收困難和酸性溶液的循環(huán)利用困難?，F(xiàn)有技術(shù)的海蜇膠原提取方法，均是采用將海蜇內(nèi)外胚層與中膠層混合提取。這種內(nèi)外胚細胞雜蛋白溶解和解離，對海蜇膠原提取帶來影響。另外大多采用膠原蛋白酶解離與鹽析工藝結(jié)合提取，鹽析工藝缺點是采用大量的食鹽，對形成含鹽廢水。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供一種海蜇膠原蛋白及其制備方法，采用新的純化工藝，有效回收提取工具酶，循環(huán)利用反應(yīng)體系，得到的活性膠原蛋白純度高，收得率高。
本發(fā)明的目的是由以下技術(shù)方案實現(xiàn)的，研制了一種海蜇膠原蛋白。所述的膠原蛋白是從海蜇的中膠層提取的，該膠原蛋白為白色纖維狀固體或淺黃色固體粉術(shù)，堆密度為0.110-0.645g/ml，該膠原蛋白在酸性溶液中完全溶解，呈澄清透明溶液；該膠原蛋白的單鏈分子量在10-30萬道爾頓，糖含量為2.5-5％，氨基酸含量為80-95％mg/100mg；其中，天門冬氨酸占7.9-8.3％，谷氨酸占10.0-12.9％，蘇氨酸占3.5-4.0％，纈氨酸占3.5-3.9％，異亮氨酸占2.2-2.5％，賴氨酸占3.4-3.8％，羥賴氨酸占2.0-2.7％。
一種上述海蜇膠原蛋白的制備方法，按如下步驟進行；(1)采用的原料為大型海蜇，使用鹽漬海蜇或新鮮海蜇；(2)原料的預(yù)處理；將經(jīng)鹽漬脫水后的海蜇，用濃度為0.1-0.5％的堿性溶液洗滌、浸泡；浸泡時間0.5-2h，浸泡后的溶液pH為6-8，堿洗時有氨氣產(chǎn)生，氣泡明顯；海蜇皮的上下皮層由原來的白色不透明，變?yōu)橥该?，而且容易剝離去掉，除去不良氣味，氨離子及雜質(zhì)；(3)分離中膠層；將堿性溶液洗滌、浸泡后的鹽漬脫水海蜇，去掉透明的上下皮層，可明顯見白色的中膠層，磨碎該白色的中膠層；(4)解離中膠層；采用蛋白酶解離磨碎的中膠層，酶用量0.1％-2％，解離溫度10-30℃，攪拌解離時間10-48h；(5)超濾分離濃縮；將上述蛋白酶解離的中膠層離解液，采用超濾膜過濾器，控制膜進口壓力在12kg/cm2，或采用外加電場10-70V/cm，截留濃縮分子量在10-30萬道爾頓的膠原蛋白，其截留率95％-98％；再將剩下的含有蛋白酶的離解液，采用醋酸纖維HFA-200膜，將蛋白酶截流分離出來，回收該蛋白酶重復(fù)循環(huán)使用；(6)分離濃縮的膠原蛋白再經(jīng)冷凍干燥，即采用慢速凍結(jié)方式，升華階段的真空度在10-30Pa，冷阱溫度在-50±0.1℃，得到白色纖維狀固體或淺黃色固體粉末。
所述的(1)步采用的大型海蜇原料包括根口水母科(Rhizostomalidae)的海蜇屬的海蜇(Rhopilema esculentum Kishinouye)；黃斑海蜇(Rhopilema hispidum)和葉腕水母科(Lobonematidae)的葉腕水母屬(Lobonema)的葉腕海蜇(LobonmaSmithi)。
所述的(1)步原料鹽漬海蜇質(zhì)量符合國家標準，即水分，小于68％，食鹽，18-25％，明礬，1.2-2.2％。
所述的(2)步原料的預(yù)處理中采用的堿性溶液為氫氧化鈉溶液，碳酸鈉溶液，碳酸氫鈉溶液。
所述的(4)步解離中膠層所采用的蛋白酶或為酸性蛋白酶，或堿性蛋白酶。
所述的(4)步解離中膠層之后，還可將濃縮的濕膠原蛋白，再經(jīng)膠原酶深度水解，該膠原酶的用量0.1-2.0％，解離溫度20-40℃，解離時間10-48h，得到水解多肽，即，得到含30個左右的氨基酸殘基的結(jié)構(gòu)膠原多肽，該多肽分子長度為30-50納米，分子量3000-20000道爾頓。
所述的(5)步超濾分離濃縮中所采用超濾膜，或采用聚合物膜Diaflo(XM30)，或采用聚芳醚砜膜，或采用中空纖維素膜，或采用非對稱超濾UF膜，或采用非對稱超濾FS膜，或采用非對稱超濾HF膜，或采用非對稱超濾T膜。
本發(fā)明海蜇膠原蛋白及其制備方法的優(yōu)點在于由于在(2)步原料的預(yù)處理中，將經(jīng)鹽漬脫水后的海蜇，用濃度為0.1-0.5％的堿性溶液洗滌、浸泡；堿洗時有氨氣產(chǎn)生，氣泡明顯；堿洗預(yù)處理目的是將海蜇皮上下皮層(即表皮層與胃層)，由原來的白色不透明，變?yōu)橥该?，軟化容易剝離，去除有色層；再是除去鹽漬過程中的明礬等雜質(zhì)和分解的氨類物質(zhì)等，恢復(fù)海蜇蛋白活性；使得(3)步分離中膠層，去掉透明的上下皮層，順利得到白色的中膠層，以便磨碎該白色的中膠層。由于在(4)步解離中膠層是，采用蛋白酶解離磨碎的中膠層，同時保留膠原蛋白的糖含量。采用苯酚-硫酸法(張維杰，1999)測定樣品中糖含量；以果糖為標準，于490nm處測定。由于采用超濾濃縮純化工藝，可以有效回收蛋白酶，使反應(yīng)體系循環(huán)利用。本工藝得到的膠原蛋白產(chǎn)品，明顯不同于牛、豬、魚等提取的膠原蛋白的特征。采用分離的脫水脫腥的中膠層，經(jīng)絞碎后，采用蛋白酶解離，超濾工藝，冷凍干燥，得到純度高，具有活性的膠原蛋白。若進一步得到膠原蛋白多肽，可以將未干燥膠原，再經(jīng)膠原酶深度水解，得到水解多肽，采用噴霧干燥工藝得到干粉，以利于存儲。經(jīng)不論從紫外吸收，常規(guī)氨基酸質(zhì)量分數(shù)測定，還是從紅外譜圖測定看，所提取的蛋白質(zhì)凝膠是膠原蛋白，與文獻報道的海蜇膠原蛋白相符，而且獲得的膠原蛋白純度也較高。本發(fā)明海蜇膠原蛋白以鹽漬海蜇原料計算，膠原蛋白收得率為3-5％。
具體實施例方式
實施例1)取鹽漬海蜇120g，在0.2M氫氧化鈉溶液100ml，浸泡2h，浸泡后的溶液為pH6.5，堿洗時有氨氣產(chǎn)生，氣泡明顯，可以除去氨離子及雜質(zhì)。海蜇皮由白色不透明，變?yōu)橥该?與冷凍脫水海蜇類似)，可明顯見中膠層。去掉上下皮層，白色中膠層切片后置冰柜中保存。
取上述中膠層，磨碎，加0.1M乙酸，20ml，再加600mg胃蛋白酶(華美，Sina-American Biotec，pepsin 1∶3000)，在室溫下攪拌解離30h。
采用超濾膜過濾器，控制膜進口壓力在1-2kg/cm2，并采用外加電場10-70V/cm，截留濃縮分子量在10-30萬道爾頓的膠原蛋白，其截留率98％；所采用超濾膜，或采用聚合物膜Diaflo(XM30)，或采用聚芳醚砜膜，或采用中空纖維素膜，或采用非對稱超濾UF膜，或采用非對稱超濾FS膜，或采用非對稱超濾HF膜，或采用非對稱超濾T膜。
分離濃縮的膠原蛋白再經(jīng)冷凍干燥，即采用慢速凍結(jié)方式，升華階段的真空度在10-30Pa，冷阱溫度在-50±0.1℃，得到3.851g纖維狀淺色固體的膠原蛋白，其收得率3.21％。本發(fā)明海蜇膠原蛋白以鹽漬海蜇原料計算，收得率的計算公式C％＝(m1/m)×100％，其中，C％為收率，m1為膠原蛋白重量(g)，m為鹽漬海蜇的重量(g)。
該膠原蛋白的堆密度為0.110-0.645g/ml；該膠原蛋白在酸性溶液中完全溶解，呈澄清透明溶液；該膠原蛋白的單鏈分子量在10-30萬道爾頓，糖含量為2.5-5％，氨基酸含量為80-95％mg/100mg；其中，天門冬氨酸占7.9-8.3％，谷氨酸占10.0-12.9％，蘇氨酸占3.5-4.0％，纈氨酸占3.5-3.9％，異亮氨酸占2.2-2.5％，賴氨酸占3.4-3.8％，羥賴氨酸占2.0-2.7％。
膠原蛋白的糖含量，采用苯酚-硫酸法(張維杰，1999)測定樣品中糖含量。以果糖為標準，于490nm處測定。以吸光值(A490)為橫坐標，糖濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得線性回歸方程A490＝0.004×C-0.0016，R＝0.9999。稱取0.114g樣品，用0.5M乙酸溶解定容至50ml，測定糖含量為3.09％。
再將剩下的含有蛋白酶的離解液，使用醋酸纖維膜(HFA-200)，將胃蛋白酶(分子量35000)截流以回收循環(huán)使用。
實施例(1)-(7)具體工藝條件與結(jié)果見表1

對照實施例取50g鹽漬海蜇，0.2M氫氧化鈉，100ml浸泡2h，取40g中膠層，破碎，0.5M乙酸250ml，0.5％蛋白酶250mg，攪拌室溫溫育，48h，15℃。離心，有大量為解離物。3.5M鹽析，有泡沫產(chǎn)生，4.5M有白色固體物，5.5M有大量絮狀沉淀，透析袋(8000-12000D)透析。冷凍，干燥24h，得到0.761g淺絮狀白色固體。得率1.52％。
本發(fā)明海蜇膠原蛋白氨基酸組成含量測定稱取干燥的海蜇膠原蛋白10mg，加入濃度為5.7mol/L的鹽酸溶液2mL，置于110度烘箱內(nèi)水解24h，用HITACHI835氨基酸自動分析儀測定，氨基酸含量為92.57mg/100mg。氨基酸組成含量結(jié)果見表2。
表2海蜇膠原蛋白氨基酸組成含量結(jié)果

本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員都會理解，在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)，對于上述實施例進行修改，添加和替換都是可能的，其都沒有超出本發(fā)明的保護范圍。
權(quán)利要求
1.一種海蜇膠原蛋白，其特征在于所述的膠原蛋白是從海蜇的中膠層提取的，該膠原蛋白為白色纖維狀固體或淺黃色固體粉末，堆密度為0.110-0.645g/ml，該膠原蛋白在酸性溶液中完全溶解，呈澄清透明溶液；該膠原蛋白的單鏈分子量在10-30萬道爾頓，糖含量為2.5-5％，氨基酸含量為80-95％mg/100mg；其中，天門冬氨酸占7.9-8.3％，谷氨酸占10.0-12.9％，蘇氨酸占3.5-4.0％，纈氨酸占3.5-3.9％，異亮氨酸占2.2-2.5％，賴氨酸占3.4-3.8％，羥賴氨酸占2.0-2.7％。
2.一種如權(quán)利要求1所述海蜇膠原蛋白的制備方法，其特征在于所述的制備方法按如下步驟進行；(1)采用的原料為大型海蜇，使用鹽漬海蜇或新鮮海蜇；(2)原料的預(yù)處理；將經(jīng)鹽漬脫水后的海蜇，用濃度為0.1-0.5％的堿性溶液洗滌、浸泡；浸泡時間0.5-2h，浸泡后的溶液pH為6-8，堿洗時有氨氣產(chǎn)生，氣泡明顯；海蜇皮的上下皮層由原來的白色不透明，變?yōu)橥该?，而且容易剝離去掉，除去不良氣味，氨離子及雜質(zhì)；(3)分離中膠層；將堿性溶液洗滌、浸泡后的鹽漬脫水海蜇，去掉透明的上下皮層，可明顯見白色的中膠層，磨碎該白色的中膠層；(4)解離中膠層；采用蛋白酶解離磨碎的中膠層，酶用量0.1％-2％，解離溫度10-30℃，攪拌解離時間10-48h；(5)超濾分離濃縮；將上述蛋白酶解離的中膠層離解液，采用超濾膜過濾器，控制膜進口壓力在1-2kg/cm2，或采用外加電場10-70V/cm，截留濃縮分子量在10-30萬道爾頓的膠原蛋白，其截留率95％-98％；再將剩下的含有蛋白酶的離解液，采用醋酸纖維HFA-200膜，將蛋白酶截流分離出來，回收該蛋白酶重復(fù)循環(huán)使用；(6)分離濃縮的膠原蛋白再經(jīng)冷凍干燥，即采用慢速凍結(jié)方式，升華階段的真空度在10-30Pa，冷阱溫度在-50±0.1℃，得到白色纖維狀固體或淺黃色固體粉末。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述海蜇膠原蛋白的制備方法，其特征在于所述的(1)步采用的大型海蜇原料包括根口水母科(Rhizostomalidae)的海蜇屬的海蜇(Rhopilemaesculentum Kishinouye)；黃斑海蜇(Rhopilema hispidum)和葉腕水母科(Lobonematidae)的葉腕水母屬(Lobonema)的葉腕海蜇(Lobonma Smithi)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述海蜇膠原蛋白的制備方法，其特征在于所述的(2)步原料的預(yù)處理中采用的堿性溶液為氫氧化鈉溶液，碳酸鈉溶液，碳酸氫鈉溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述海蜇膠原蛋白的制備方法，其特征在于所述的(4)步解離中膠層所采用的蛋白酶或為酸性蛋白酶，或堿性蛋白酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述海蜇膠原蛋白的制備方法，其特征在于所述的(4)步解離中膠層之后，還可將濃縮的濕膠原蛋白，再經(jīng)膠原酶深度水解，該膠原酶的用量0.1-2.0％，解離溫度20-40℃，解離時間10-48h，得到水解多肽，即得到含30個左右的氨基酸殘基的結(jié)構(gòu)膠原多肽，該多肽分子長度為30-50納米，分子量3000-20000道爾頓。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述海蜇膠原蛋白的制備方法，其特征在于所述的(5)步超濾分離濃縮中所采用超濾膜，或采用聚合物膜Diaflo(XM30)，或采用聚芳醚砜膜，或采用中空纖維素膜，或采用非對稱超濾UF膜，或采用非對稱超濾FS膜，或采用非對稱超濾HF膜，或采用非對稱超濾T膜。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種海蜇膠原蛋白。其是從海蜇的中膠層提取的，該膠原蛋白為白色纖維狀固體或淺黃色固體粉末，堆密度為0.110－0.645g/ml，該膠原蛋白在酸性溶液中完全溶解，呈澄清透明溶液；該膠原蛋白的單鏈分子量在10－30萬道爾頓，糖含量為2.5－5％，氨基酸含量為80－95％mg/100mg；其中，天門冬氨酸占7.9－8.3％，谷氨酸占10.0－12.9％，蘇氨酸占3.5－4.0％，纈氨酸占3.5－3.9％，異亮氨酸占2.2－2.5％，賴氨酸占3.4－3.8％，羥賴氨酸占2.0－2.7％。該海蜇膠原蛋白的制備方法是(1)使用鹽漬海蜇或新鮮海蜇；(2)原料的預(yù)處理；(3)分離中膠層；(4)解離中膠層；(5)超濾分離濃縮；得到分子量在10－30萬道爾頓的膠原蛋白，其截留率95％－98％；該方法可以有效回收蛋白酶，使反應(yīng)體系循環(huán)利用，得到的膠原蛋白產(chǎn)品純度高。
文檔編號C07K1/14GK1803836SQ200610042188
公開日2006年7月19日 申請日期2006年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月13日
發(fā)明者石紅旗 申請人:國家海洋局第一海洋研究所