專利名稱：超敏化學(xué)發(fā)光酶免法測(cè)定人腫瘤可溶性蛋白sp185的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用超敏化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫吸附法定量測(cè)定人Her-2/Neu癌基因可溶性產(chǎn)物sp185Her-2的含量。
背景技術(shù)：
美國(guó)Oncogene Science公司專利(細(xì)胞溶胞產(chǎn)物中檢測(cè)neu p185)純化并確認(rèn)了檢測(cè)產(chǎn)物為分子量97kDa-115kDa的人neu基因表達(dá)的胞外區(qū)蛋白。
專利文獻(xiàn)-Carney(Oncogen Science，Inc)細(xì)胞溶胞產(chǎn)物中檢測(cè)neu p185(Detection of neup185 in cell lysates)、美國(guó)、分類號(hào)(435/7.23；435/7.1；435/7.7；435/7.92；436/64；436/813；530/388.8；530/388.85)、申請(qǐng)日(1994年3月30日)、申請(qǐng)公布日(1997年2月18日)、申請(qǐng)?zhí)?220962)、專利號(hào)(5,604,107)。
奧地利Bender MedSystems GmbH的BMS207CE sp185Her-2應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法定量測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液、人血清、血漿、羊水或其他體液中Her-2/Neu癌基因可溶性產(chǎn)物sp185Her-2。測(cè)試原理抗sp185Her-2單克隆抗體包埋微孔。樣本或標(biāo)準(zhǔn)品中sp185Her-2結(jié)合在包埋抗體上；加入辣根過氧化酶(HRP)聯(lián)結(jié)的單克隆抗sp185Her-2抗體，它和已被第一抗體捕獲的sp185Her-2結(jié)合。孵育后洗除未結(jié)合的抗sp185Her-2酶聯(lián)結(jié)抗體，加入辣根過氧化酶底物。有色產(chǎn)物形成和樣本中sp185Her-2含量成正比。加酸終止反應(yīng)，在450nm處測(cè)吸光度。從有7個(gè)sp185Her-2標(biāo)準(zhǔn)品制成的標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得樣本中sp185Her-2含量。
該法曾應(yīng)用于測(cè)定人血清中Her-2/Neu癌基因可溶性產(chǎn)物sp185Her-2，實(shí)時(shí)觀察乳腺癌患者術(shù)后sp185Her-2含量的變化，有助于預(yù)后的臨床評(píng)估(見以下參考文獻(xiàn))。
Klein B，Levin I，Kfir B，Marinski R，Rakowski E，Shapira J，等。乳腺癌患者可溶性c-erbB-2(P185)和預(yù)后的關(guān)系。腫瘤報(bào)告1995；2759-61。[Klein B，Levin I，Kfir B，Marinski R，Rakowski E，Shapira J，et al.Soluble c-erbB-2(P185)in breast cancerpatients in relation to prognosis.Oncol Rep 1995；2759-61.]Visco V，Bei R，Moriconi E，Gianni W，Kraus MH，Muraro R.乳腺癌患者可溶性受體外轄區(qū)ErbB2的免疫反應(yīng)。美國(guó)病理雜志2000；1561417-24。[immune response in breastcancer patients with soluble receptor ectodomain.Am J Pathol 2000；1561417-24.]中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)專利(人腫瘤抗原p185#+[HER-2]的檢測(cè)方法及腫瘤診斷用途)應(yīng)用雙抗體夾心ELISA檢測(cè)可溶性p185#+[HER-2]抗原。
專利文獻(xiàn)-中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)人腫瘤抗原p185#+[HER-2]的檢測(cè)方法及腫瘤診斷用途，中國(guó)，公開(公告)號(hào)(1397803)、公開(公告)日(2003.02.19)、主分類號(hào)(G01N33/531)、分類號(hào)(G01N33/531；G01N33/574；G01N33/96；C07K1/14)、申請(qǐng)(專利)號(hào)(01113787.8)、申請(qǐng)日(2001.07.13)中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)專利其ELISA檢測(cè)原理和方法和Bender MedSystems完全一致。二者均沒有象美國(guó)Oncogene Science公司專利那樣確認(rèn)檢測(cè)產(chǎn)物的理化屬性，單克隆抗體識(shí)別的可溶性p185[HER-2]抗原分子量大小未知，因而和美國(guó)Oncogene Science公司專利無沖突。
美國(guó)Oncogene Science公司專利、奧地利Bender MedSystems GmbH的BMS207CE sp185Her-2和中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)專利均采用可見光底物測(cè)定辣根過氧化酶活性。超敏化學(xué)發(fā)光底物測(cè)定辣根過氧化酶活性可大大提高測(cè)試敏感性、降低試劑尤其是單抗用量，作為新一代ELISA適合在臨床上推廣使用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明和Bender MedSystems GmbH BMS207CE sp185Her-2一樣采用固相雙位點(diǎn)夾心式酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)，使用其包埋單克隆抗體、辣根過氧化酶標(biāo)記單克隆抗體和人Her-2/Neu癌基因可溶性蛋白sp185Her-2作為標(biāo)準(zhǔn)品。為了降低成本，本發(fā)明在反應(yīng)微孔面積和辣根過氧化酶底物的選擇上大力創(chuàng)新。
1.采納小容量微孔板小容量微孔表面積為常規(guī)微孔的一半。小容量微孔提高了表面積/容量比率，縮短了溶液中分子擴(kuò)散到表面的時(shí)間，從而加快了分子在表面的吸收率。在不影響反應(yīng)敏感性的前提下，包埋小容量微孔僅需包埋常規(guī)微孔30％的抗體量。除此之外，還節(jié)省了50％其他反應(yīng)試劑。
2.選擇超敏化學(xué)發(fā)光底物測(cè)定辣根過氧化酶活性Bender MedSystems GmbH BMS207CEsp185Her-2使用四甲基聯(lián)苯胺(3，3’，5，5’-Tetramethylbenzidine，TMB)作為辣根過氧化酶的底物。其酶聯(lián)免疫吸附法的敏感性依賴于TMB的檢測(cè)下限(2,000,000×10-21摩爾辣根過氧化酶)。除此之外，由于可見光測(cè)量的物化限制(Lambert & Beer定律)，其有效檢測(cè)范圍僅在100×之內(nèi)。本發(fā)明屏棄TMB，選擇超敏化學(xué)發(fā)光底物測(cè)定辣根過氧化酶活性?；瘜W(xué)發(fā)光的定量測(cè)定僅限于光倍增管(Photo-multiplier)的分辨力。通常化學(xué)發(fā)光儀的有效檢測(cè)范圍在10-2×1011相對(duì)光單位/秒(relative light units/second，RLU/S)。因此，使用超敏化學(xué)發(fā)光底物和化學(xué)發(fā)光儀可加寬檢測(cè)線性范圍(10,000×)，提高反應(yīng)敏感性，使檢測(cè)下限達(dá)2,000×10-21摩爾辣根過氧化酶。在不影響反應(yīng)敏感性的前提下，本發(fā)明使用超敏化學(xué)發(fā)光底物和化學(xué)發(fā)光儀節(jié)省了試劑使用量，達(dá)到了降低試劑成本的初宗。
具體實(shí)施例方式
一、試劑的準(zhǔn)備1.小容量微孔板的準(zhǔn)備1)包埋最終抗sp185Her-2單克隆抗體的濃度＜2.5μg/ml磷酸鹽緩沖液(PBS)；每孔加＜100μl包埋液，2-8℃過夜。洗滌液(含0.01-0.1％Tween20 PBS)洗板一次。
2)阻斷用反應(yīng)液(含0.5-3％小牛血清白蛋白BSA、0.01-0.1％Tween20 PBS)阻斷微孔表面非特異性結(jié)合位點(diǎn)。然后，洗板二次。
2.標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)備最高sp185Her-2標(biāo)準(zhǔn)蛋白的濃度≤10ng/ml反應(yīng)液，將此1∶3稀釋6次以制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。
3.辣根過氧化酶聯(lián)結(jié)的單克隆抗sp185Her-2抗體的準(zhǔn)備用反應(yīng)液＜1∶7,500稀釋辣根過氧化酶聯(lián)結(jié)的單克隆抗sp185Her-2抗體。
二、測(cè)試步驟
1.sp185Her-2標(biāo)準(zhǔn)蛋白的稀釋加50μl反應(yīng)液至所有標(biāo)準(zhǔn)孔，但A1留空。加入75μl sp185Her-2標(biāo)準(zhǔn)蛋白至A1。轉(zhuǎn)移25μl到B1?；靹駼1后再轉(zhuǎn)移25μl到C1。重復(fù)此步驟4次，形成最高不超過10ng/ml sp185Her-2標(biāo)準(zhǔn)蛋白的1∶3稀釋梯度。G1孔中丟棄25μl。(sp185Her-2標(biāo)準(zhǔn)蛋白稀釋示意圖見說明書附圖-

圖1)2.加50μl反應(yīng)液至空白孔。
3.加入＜50μl稀釋的辣根過氧化酶聯(lián)結(jié)的單克隆抗sp185Her-2抗體至所有含sp185Her-2標(biāo)準(zhǔn)蛋白的孔中，包括空白孔。
4.室溫18-25℃孵育＞2小時(shí)。
5.配制超敏化學(xué)發(fā)光底物溶液。1∶1混勻發(fā)光原/增強(qiáng)劑和過氧化物溶液。
6.洗板三次。
7.加入＜100μl配制好的超敏化學(xué)發(fā)光底物溶液至所有含sp185Her-2標(biāo)準(zhǔn)蛋白的孔中，包括空白孔。1-5分鐘后用96孔化學(xué)發(fā)光儀在大約425nm處測(cè)定相對(duì)光單位。
三、結(jié)果計(jì)算sp185Her-2超敏化學(xué)發(fā)光ELISA檢測(cè)結(jié)果見說明書附圖-表1sp185Her-2超敏化學(xué)發(fā)光ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線見說明書附圖-圖2檢測(cè)線性范圍0-10ng/ml(R2＝0.9999)最低檢測(cè)限度40.15pg/ml。
權(quán)利要求
1.一種用超敏化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫吸附法定量測(cè)定人Her-2/Neu癌基因可溶性產(chǎn)物sp185Her-2的方法，其特征是采用固相雙位點(diǎn)夾心式酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)，用抗sp185Her-2單克隆抗體包埋小容量微孔后，樣本中sp185Her-2結(jié)合在包埋抗體上；加入辣根過氧化酶(HRP)聯(lián)結(jié)的單克隆抗sp185Her-2抗體后，它和已被第一抗體捕獲的sp185Her-2結(jié)合；孵育后洗除未結(jié)合的抗sp185Her-2酶聯(lián)結(jié)抗體；加入辣根過氧化酶超敏化學(xué)發(fā)光底物后；通過化學(xué)發(fā)光儀測(cè)定425nm處發(fā)光量來定量樣本中sp185Her-2濃度。
2.一種在權(quán)利要求1下采用小容量96微孔酶標(biāo)板，其特征是在不影響反應(yīng)敏感性的前提下，減少了包埋抗體和其他反應(yīng)試劑的使用量，加快了反應(yīng)速度。
3.一種在權(quán)利要求1下采用超敏化學(xué)發(fā)光底物和化學(xué)發(fā)光儀，其特征是加寬了檢測(cè)線性范圍，使檢測(cè)限度下移，提高了反應(yīng)敏感性，減少了試劑的使用量。
全文摘要
本發(fā)明一種用超敏化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫吸附定量測(cè)定人Her－2/Neu癌基因可溶性產(chǎn)物sp18文檔編號(hào)G01N33/543GK1731188SQ20051005665
公開日2006年2月8日 申請(qǐng)日期2005年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月14日
發(fā)明者蔡楓 申請(qǐng)人:浙江亞克藥業(yè)有限公司, 蔡楓