專利名稱：1,3－丙二醇發(fā)酵液中菌體、蛋白及色素的脫除方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及微生物發(fā)酵產品分離過程中去除發(fā)酵液中水溶性蛋白的方法，特別涉及到從1，3-丙二醇發(fā)酵液中分離去除菌體、水溶性蛋白及色素的方法。
背景技術：
1，3-丙二醇(1，3-PD)是一種重要的化工原料，在制造聚酯纖維、聚氨酯、熱熔膠、粉末涂料、抗凍劑、包裝材料以及有機合成中間體等方面都有著廣泛的應用，其中制造高性能的聚酯纖維PTT是目前主要的用途。1，3-丙二醇可通過化學法路線和生物法路線生產，采用生物技術生產1，3-丙二醇，以其綠色化學為特征，具有反應條件溫和、操作簡便、副產物少、環(huán)境污染小、可利用再生資源等特點，成為新世紀生物化工研究的熱點之一。
1，3-丙二醇的發(fā)酵液是一個成份非常復雜的混合體系，主要成份包括產物1，3-丙二醇、微生物菌體細胞、有機酸鹽、無機鹽、甘油、水、蛋白質及其它中間代謝產物等，由于產物1，3-丙二醇分子含有兩個羥基，它的親水性較乙醇更強，目前發(fā)酵液中產物的濃度為30～70g/L，要從稀發(fā)酵液中分離回收產品就變得極為困難，產品回收率低，而且分離成本很高。
1，3-丙二醇屬胞外產物，在提取純化之前需要經過預處理，除去發(fā)酵液中的菌體細胞和蛋白，得到澄清發(fā)酵液。由于菌體顆粒細小，發(fā)酵液外觀呈乳狀液形式，除含有顆粒細小的細菌細胞和細胞碎片外，還含有水溶性蛋白質和其它膠狀物以及一些色素物質。這些細菌細胞和細胞碎片以及水溶性蛋白質大分子的存在，會給后續(xù)工藝帶來極大的困難，直接影響脫鹽蒸發(fā)工序，產生堵塞、阻礙蒸發(fā)，導致產品收率的降低。色素物質的存在會使最終產品帶有顏色，影響其外觀及品質。目前細胞及碎片的分離方法主要有過濾方法和離心方法。用傳統(tǒng)的過濾除菌法，效率低、勞動強度大，過濾所形成的黏膠狀濾餅會堵塞濾布，使操作無法順利進行。一種新的過濾方法是利用微濾膜或超濾膜進行錯流過濾，存在的問題是分離能力小、分離時間長，不能將固液相分離完全，易出現膜污染堵塞等。而用離心的方法除去菌體與蛋白，需要高速的離心設備，投資大能耗高，固相中液體滯留量大，產品損失大。
為了能更有效地對1，3-丙二醇發(fā)酵液進行預處理，國內外科技工作者為此做出了不懈的努力，提出了許多工藝方法。清華大學李凡鋒等人公開了一種絮凝預處理方法(微生物學通報，2004.31(3)30～35)，該方法使用天然澄清劑II型B組份作為絮凝劑，對1，3-丙二醇的發(fā)酵液進行預處理，對菌體的絮凝率為95％，但對蛋白的絮凝效果較差，尤其是不能有效地去除發(fā)酵液中存在的水溶性大分子蛋白及色素物質，得到的清液顏色較深。這些水溶性大分子蛋白及色素物質仍會在后序的蒸發(fā)及蒸餾過程產生結焦，形成黑色類焦狀物，阻礙蒸發(fā)的問題沒有得到有效的解決。

發(fā)明內容
為克服現有技術中存在的不足，本發(fā)明提供了一種從1，3-丙二醇發(fā)酵液中去除菌體、蛋白和色素的方法。該方法簡單易行，能夠有效地從1，3-丙二醇發(fā)酵液中去除菌體、水溶性大分子蛋白及其色素物質。
本發(fā)明方法是采用絮凝法和吸附分離法相結合，從1，3-丙二醇發(fā)酵液中去除菌體、蛋白及色素物質，其步驟包括(1)微生物菌體絮凝分離取1，3-丙二醇發(fā)酵液，攪拌下加入絮凝劑，攪拌后，靜置沉降，上層為澄清的清液，下層為菌體絮凝物，上下兩層分批過濾或離心得到絮凝后的發(fā)酵清液。
(2)發(fā)酵液過柱吸附步驟(1)得到的清液流過樹脂柱，發(fā)酵液中水溶性大分子蛋白及其色素物質被吸附到樹脂表面，得到澄清的發(fā)酵液。
本發(fā)明方法中所用的樹脂為交聯苯乙烯系非極性大孔吸附樹脂(如商品型號D3520)，外觀為乳白色不透明球狀顆粒，粒徑范圍0.3～1.25mm，平均孔徑0.3～1.25，比表面480～520m2/g。該樹脂對水溶性蛋白及色素均有良好的選擇性。新購樹脂可能含有分散劑、致孔劑、惰性溶劑等化學殘留，所以使用前最好進行預處理。預處理可以在樹脂裝柱前進行，也可在裝柱后在柱上進行。預處理可以采用現有技術中的常規(guī)方法進行，本發(fā)明中最好采用如下過程(I)用去離子水沖洗樹脂，洗去雜質及樹脂粉末；(II)用1.5～5倍樹脂體積的去離子水浸泡樹脂8～24h，使樹脂顆粒充分擴展；(III)用1.5～5倍樹脂體積的乙醇或丙酮，浸泡樹脂8～24h，用2.5～5倍樹脂體積的乙醇沖洗樹脂，洗至流出液加水不呈白色渾濁為止；(IV)用去離子水沖洗樹脂，洗凈乙醇；(V)用稀HCl溶液，濃度最好2wt％～4wt％，浸泡樹脂層5～12h，而后用去離子水洗至水洗液呈中性。
本發(fā)明所處理的1，3-丙二醇發(fā)酵液中1，3-丙二醇的含量為30～80g/L，通常終止發(fā)酵液的pH值為6.5～7.5。
本發(fā)明方法中，絮凝過程應在較低溫度下進行，以5～35℃為好，最好為10～30℃。攪拌速度選擇為60～180r/min為好，最好為80～150r/min。攪拌時間5～30min為宜，最好8～20min。
本發(fā)明方法中所用的絮凝劑為有機高分子絮凝劑(本發(fā)明中簡稱絮凝劑N)，按照中國專利ZL98121074.0公開的方法制備，它具有如下的網狀結構 其中R1是胺基或帶有羥烷基取代的胺基；R2、R4分別是亞烷基；R3是羰基氧或羥基烷基氧；m＝5～15，n＝10～20。
所用絮凝劑的運動粘度為500～2000mm2/s。
所用絮凝劑的最佳陽離子度為1.5～2.6mmol/g。
該絮凝劑具有較高的陽離子電荷密度，所含電荷能有效地中和菌體和蛋白微粒表面的負電荷，降低Z電位值，使之趨于零，達到脫穩(wěn)、微粒凝聚的目的。絮凝劑的加入量為0.5～5.0g/L發(fā)酵液，最好為1.0～3.5g/L發(fā)酵液。
在室溫下，步驟(1)所得的發(fā)酵清液用泵連續(xù)輸送通過樹脂柱，控制適當流速進行吸附，接收流出液即為去除水性蛋白及色素的澄清的發(fā)酵液。
發(fā)酵液過柱吸附過程要求發(fā)酵液與樹脂要有足夠的接觸時間，以保證能達到良好的吸附效果，使蛋白及色素物質能夠最大限度的被樹脂吸附，所以要控制適當的流速。流速以0.3～2.0ml/min為宜，最好控制在0.6～1.5ml/min。
其中所用樹脂經使用后，吸附能力下降，應進行再生處理。再生方法可以采用現有技術中常用的方法，最好采用如下方法先用去離子水沖洗樹脂，再用2～5倍樹脂體積的乙醇或丙酮洗滌；上述過程重復1～2次，最后用去離子水洗凈樹脂。
本發(fā)明與現有技術相比具有以下優(yōu)點(1)、本發(fā)明方法采用絮凝法與樹脂吸附分離法相結合，不但能有效地除去發(fā)酵液中的菌體，還能有效地除去發(fā)酵液中存在的水溶性蛋白及色素物質，而且去除率較高。(2)、所使用的樹脂對水溶性蛋白及色素的選擇性高，使1，3-丙二醇發(fā)酵液中菌體和蛋白能在同一過程中脫除，而且去除得更為有效徹底，為后續(xù)的脫鹽工序及蒸餾過程創(chuàng)造了良好的條件。(3)、該工藝操作簡便，成本較低，產品損失小，樹脂可反復使用，適合工業(yè)生產。
具體實施例方式
下面通過實施例對本發(fā)明作進一步的詳述。
本實施例所處理的發(fā)酵液是以甘油為底物，采用克雷伯氏菌發(fā)酵而得到的1，3-丙二醇發(fā)酵液。
實施例1本實施例所處理的1，3-丙二醇發(fā)酵液中，1，3-丙二醇的含量為68.5g/L，發(fā)酵終止pH值為6.8。
取1000ml上述發(fā)酵液，在80r/min的速度攪拌下，于20℃加入絮凝劑N0.32g(中國專利ZL98121074.0實施例中絮凝劑3)，該絮凝劑的粘度為1200mm2/s，陽離子度為2.1mmol/g。攪拌10min后靜置沉降。待絮凝完全沉降后分別過濾上層清液和沉降層，得到除菌后的清液。
取D3520(外觀為乳白色不透明球狀顆粒，粒徑范圍0.3～1.25mm，平均孔徑0.3～1.25，比表面480～520m2/g)大孔吸附樹脂，先用去離子水沖洗樹脂，洗去雜質及樹脂粉末后，用2.2倍樹脂體積的去離子水浸泡樹脂10h，再用3倍樹脂體積的乙醇浸泡樹脂20h，用2.8倍樹脂體積的乙醇沖洗樹脂，洗至流出液加水不呈白色渾濁為止，接著用去離子水沖洗樹脂洗去乙醇，用2.5wt％的HCl溶液浸泡樹脂層8h，而后用去離子水洗至水洗液呈中性后裝柱(φ20×200mm，內裝樹脂270g)。
上述絮凝除菌后的清液用計量泵打入樹脂柱進行吸附，流速0.6ml/min，收集流出液即為澄清的1，3-丙二醇發(fā)酵液。相對原發(fā)酵液絮凝除菌率為96.1wt％，蛋白去除率為98.2wt％，色素去除率為81.5wt％。
實施例2本實施例中所用的1，3-丙二醇發(fā)酵液中，1，3-丙二醇含量為57.2g/L，發(fā)酵終止pH值為7.2。
取500ml上述發(fā)酵液，裝入1000ml三口燒瓶或燒杯中，在150r/min的速度攪拌下，于25℃加入絮凝劑N2.2g，絮凝劑性質同實施例1。攪拌20min后，靜置沉降，分別離心分離清液層和絮凝物，合并離心液即得到澄清的發(fā)酵液。
按照實施例1方法過柱操作，流速為2.0ml/min。得到的1，3-丙二醇發(fā)酵液相對原發(fā)酵液，菌體去除率為96.3wt％，蛋白去除率為97.1wt％，色素去除率為77.6wt％。
權利要求
1.一種從1，3-丙二醇發(fā)酵液中去除菌體、水溶性蛋白及色素的方法，步驟包括(1)向1，3-丙二醇發(fā)酵液中加入絮凝劑，攪拌后，靜置沉降，分離得到絮凝后的發(fā)酵清液；(2)步驟(1)得到的發(fā)酵清液流過樹脂柱，其中的水溶性大分子蛋白及色素物質被吸附到樹脂表面，得到澄清的發(fā)酵液。
2.按照權利要求1所述的方法，其特征在于所用的樹脂為交聯苯乙烯系非極性大孔吸附樹脂，粒徑范圍0.3～1.25mm，平均孔徑0.3～1.25，比表面480～520m2/g。
3.按照權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的樹脂使用前經過預處理，過程如下(I)用去離子水沖洗樹脂，洗去雜質及樹脂粉末；(II)用2～3倍樹脂體積的去離子水浸泡樹脂8～24h；(III)用2～3倍樹脂體積的乙醇或丙酮，浸泡樹脂8～24h，用2.5～5倍樹脂體積的乙醇沖洗樹脂，洗至流出液加水不呈白色渾濁為止；(IV)用去離子水沖洗樹脂，洗凈乙醇；(V)用濃度為2wt％～4wt％的HCl溶液，浸泡樹脂層5～12h，而后用去離子水洗至水洗液呈中性。
4.按照權利要求1或2所述的方法，其特征在于所處理的1，3-丙二醇發(fā)酵液中1，3-丙二醇的含量為30～80g/L，終止發(fā)酵液的pH值為6.5～7.5。
5.按照權利要求1所述的方法，其特征在于在所用發(fā)酵清液流過樹脂柱的流速為0.3～2.0ml/min。
6.按照權利要求1所述的方法，其特征在于在所用發(fā)酵清液流過樹脂柱的流速為0.6～1.5ml/min。
7.按照權利要求1所述的方法，其特征在于所用樹脂經使用后，再生處理的方法如下先用去離子水沖洗樹脂，再用2～5倍樹脂體積的乙醇或丙酮洗滌；上述過程重復1～2次，最后用去離子水洗凈樹脂。
8.按照權利要求1所述的方法，其特征在于所用的絮凝劑的結構如下 其中R1是胺基或帶有羥烷基取代的胺基；R2、R4分別是亞烷基；R3是羰基氧或羥基烷基氧；m＝5～15，n＝10～20。
9.按照權利要求8所述的方法，其特征在于所用絮凝劑的運動粘度為500～2000mm2/s，陽離子度為1.5～2.6mmol/g。
10.按照權利要求8所述的方法，其特征在于所用絮凝劑的加入量為0.5～5.0g/L發(fā)酵液。
11.按照權利要求8所述的方法，其特征在于所用絮凝劑的加入量為1.0～3.5g/L發(fā)酵液。
12.按照權利要求1或8所述的方法，其特征在于所述絮凝溫度為5～35℃。
13.按照權利要求1或8所述的方法，其特征在于所述絮凝溫度為10～30℃。
14.按照權利要求1或8所述的方法，其特征在于所述攪拌速度為60～180r/min，攪拌時間為5～30min。
15.按照權利要求1或8所述的方法，其特征在于所述攪拌速度為80～150r/min，攪拌時間為8～20min。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從1，3－丙二醇發(fā)酵液去除菌體、水溶性蛋白及色素的方法。該方法包括向1，3－丙二醇發(fā)酵液中加入絮凝劑，攪拌后，靜置沉降，分離得到絮凝后的發(fā)酵清液；將發(fā)酵清液流過樹脂柱，其中的水溶性大分子蛋白及色素物質被吸附到樹脂表面，得到澄清的發(fā)酵液。本發(fā)明方法采用絮凝法與樹脂吸附分離法相結合，不但能除去發(fā)酵液中的菌體，還能除去發(fā)酵液中存在的水溶性蛋白及色素物質。所使用的樹脂為交聯苯乙烯系非極性大孔吸附樹脂，對水溶性蛋白及色素的選擇性高，使1，3－丙二醇發(fā)酵液中菌體和蛋白能在同一過程中脫除，而且去除得更為有效徹底，為后續(xù)的脫鹽工序及蒸餾過程創(chuàng)造了良好的條件。
文檔編號C07C31/00GK1951890SQ20051004750
公開日2007年4月25日 申請日期2005年10月19日 優(yōu)先權日2005年10月19日
發(fā)明者王崇輝 申請人:中國石油化工股份有限公司, 中國石油化工股份有限公司撫順石油化工研究院