專利名稱：視神經(jīng)脊髓炎的標(biāo)記的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般性地涉及神經(jīng)系統(tǒng)疾病，更具體地，涉及用于視神經(jīng)脊髓炎(neuromyelitis optica)、復(fù)發(fā)性脊髓炎(relapsing myelitis)或視神經(jīng)炎(optic neuritis)、和亞洲視神經(jīng)脊髓形式的(Asian opticospinal form ofmultiple sclerosis(MS))的自體抗體標(biāo)記。
背景視神經(jīng)脊髓炎(NMO)是一種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，在西方國(guó)家已知為Devic′s綜合癥，在亞洲已知為視神經(jīng)脊髓多發(fā)性硬化(opticospinal multiplesclerosis)。據(jù)認(rèn)為NMO是多發(fā)性硬化(MS)的一種嚴(yán)重的變種，占亞洲人MS病例的30％。在北美，非高加索人(non-Caucasians)表現(xiàn)出比典型MS患者頻率更高的NMO患者頻率。NMO的這種典型的炎癥型神經(jīng)脫髓鞘損害選擇性和重復(fù)性地影響視神經(jīng)和脊髓，因此引起失明和癱瘓。
發(fā)明概述在視神經(jīng)脊髓炎(NMO)和亞洲視神經(jīng)脊髓形式的多發(fā)性硬化病患者的血清和腦脊髓液中鑒定出了一種特異標(biāo)記。NMO-特異性抗體的存在可以用于區(qū)別NMO和MS，還可以在尚沒有滿足任何臨床標(biāo)準(zhǔn)的疾病早期用于診斷NMO，從而使得早開始對(duì)NMO進(jìn)行適宜的免疫抑制或免疫調(diào)節(jié)治療。
一方面，本發(fā)明提供檢測(cè)個(gè)體的生物樣品中NMO-特異自體抗體的存在或不存在的方法。所述方法包括將生物樣品與NMO抗原性多肽或其片段相接觸，此處所述NMO抗原性多肽為水通道蛋白-4(aquaporin-4)或與星形膠質(zhì)細(xì)胞肌營(yíng)養(yǎng)蛋白復(fù)合體相互作用的蛋白；和檢測(cè)NMO抗原性多肽與生物樣品中NMO-特異性自體抗體的結(jié)合的存在或不存在。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述NMO抗原性多肽是一種重組表達(dá)的NMO抗原性多肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述NMO特異性多肽是在一種固體組織中，所述固體組織選自于由下列組織組成的組腦、脊髓、視神經(jīng)、腎、或胃。
例如，生物樣品中NMO-特異自體抗體的存在可以與個(gè)體的視力損害、衰弱、麻木、痙攣或異?；蛱弁锤杏X、和/或膀胱和/或腸失控相關(guān)。另外，NMO-特異自體抗體的存在通常與個(gè)體的NMO相關(guān)。典型的生物樣品選自于由血液、血清、血漿、和腦脊髓液組成的組。
另一方面，本發(fā)明提供檢測(cè)個(gè)體的生物樣品中NMO抗原性多肽的存在或不存在的方法。所述方法包括將生物樣品與一種抗NMO抗原抗體相接觸，此處的NMO抗原為水通道蛋白-4；和檢測(cè)抗NMO抗原抗體與生物樣品的結(jié)合，其中的結(jié)合是生物樣品中存在NMO抗原性多肽的指示。一般地，生物樣品中NMO抗原性多肽的存在是個(gè)體中NMO的指示。所述個(gè)體可能部分或完全失明。典型的生物樣品包括血液、血清、血漿、和腦脊髓液、腦組織活檢、和脊髓組織活檢。
另一方面，本發(fā)明提供一種制品，其包括NMO抗原性多肽和應(yīng)用所述NMO抗原性多肽檢測(cè)個(gè)體中抗NMO抗原自體抗體的用法說明。所述NMO抗原性多肽是水通道蛋白-4。所述制品可以用于在個(gè)體中診斷NMO。在一種實(shí)施方案，所述制品可以進(jìn)一步包括一種單克隆抗體，其具有對(duì)NMO抗原性多肽特異接合的親和力。
另一方面，本發(fā)明提供對(duì)患有NMO的個(gè)體的治療方法。所述方法包括從個(gè)體抽出體液，其中的體液包含一種或多種與水通道蛋白-4結(jié)合的自體抗體；從體液中移出主要部分的所述自體抗體；和將所述體液返回受治療者。
另一方面，本發(fā)明提供通過給個(gè)體施用一種NMO抗原性多肽治療患有NMO的個(gè)體的治療方法。所述NMO抗原性多肽是水通道蛋白-4。一般地，施用是通過如口服、靜脈注射、和腸胃外施用的方法進(jìn)行。
另一方面，本發(fā)明提供通過給個(gè)體施用一種編碼NMO抗原性多肽的核酸治療患有NMO的個(gè)體的治療方法。所述NMO抗原性多肽是水通道蛋白-4。
除非另外定義，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域內(nèi)普通技術(shù)工人常規(guī)理解相同的意思。盡管方法和材料與此處所述的方法和材料相似或等同，可以用于實(shí)踐或測(cè)試本發(fā)明，下文仍對(duì)合適的方法和材料進(jìn)行描述。另外，所述材料、方法和實(shí)例僅為舉例說明，不是有意限制。此處提到的所有出版物、專利申請(qǐng)、專利和其它參考在此全部加入作為參考。一旦出現(xiàn)沖突，以本發(fā)明的包括定義在內(nèi)的說明書為準(zhǔn)。
本發(fā)明一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案的詳情在下述附圖和描述中闡明。其它本發(fā)明的特征、目的和優(yōu)點(diǎn)將從附圖和發(fā)明詳述，以及權(quán)利要求中清楚地看出。
附圖簡(jiǎn)述

圖1是一個(gè)評(píng)分表，其用于評(píng)估與個(gè)體血清接觸的組織密度和免疫組織化學(xué)染色模式。
圖2是人水通道蛋白-4核酸的限制性圖譜。
在各種附圖中的相同的參考符號(hào)表示相同的要素。
發(fā)明詳述從視神經(jīng)脊髓炎(NMO)和亞洲視神經(jīng)脊髓性多發(fā)性硬化病(Asianopticospinal MS)(本申請(qǐng)中用NMO同義地指NMO和亞洲視神經(jīng)脊髓性多發(fā)性硬化病)患者的血清和腦脊髓液中鑒定出一種特異的IgG自體抗體標(biāo)記。另外，這種自體抗體可以在患有廣譜炎癥疾病的患者中發(fā)現(xiàn)，其中所述廣譜炎癥疾病包括迄今不被認(rèn)為與NMO有關(guān)的脊髓、視神經(jīng)、和更罕見地，腦干或腦的其它區(qū)域的炎癥疾病。
NMO-特異性抗體的存在可以用于在尚沒有滿足任何臨床標(biāo)準(zhǔn)的疾病早期用于診斷NMO，從而使得早開始對(duì)NMO進(jìn)行適當(dāng)?shù)拿庖咭种苹蛎庖哒{(diào)節(jié)治療，并且其還可以進(jìn)一步用于區(qū)別NMO和MS。檢測(cè)NMO-特異性抗體還能提供一種可以計(jì)量的生物標(biāo)記，用于監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展和對(duì)治療的反應(yīng)。免疫染色的模式還能用于對(duì)與NMO相關(guān)的疾病進(jìn)行分類，所述疾病包括各種多發(fā)性硬化病、分離的視神經(jīng)炎、特定的脊髓病和全身性紅斑狼瘡和斯耶格倫綜合征(Sjogren′s syndrome)的“視神經(jīng)-脊髓”伴隨癥。另外，與NMO相關(guān)的抗體的識(shí)別提供一種有價(jià)值的IgG工具，用于開發(fā)動(dòng)物模型(例如，通過NMO-特異抗體的被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)，或者使用NMO抗原性多肽或編碼此類抗原性多肽的DNA疫苗的主動(dòng)免疫)，以研究NMO損傷的發(fā)病機(jī)理和測(cè)試對(duì)NMO的潛在的新治療。
NMO抗原性多肽和NMO-特異性抗體本發(fā)明提供使用NMO抗原性多肽檢測(cè)個(gè)體中NMO-特異性自體抗體的方法。本發(fā)明所述方法可能應(yīng)用的個(gè)體典型地表現(xiàn)出視力損傷和/或麻刺感、麻木、衰弱、四肢痙攣、膀胱和/或腸失控、或其它不明原因的神經(jīng)癥狀。本發(fā)明的方法基于個(gè)體的異常神經(jīng)癥狀和NMO-特異性自體抗體的存在之間的聯(lián)系。
NMO抗原性多肽包括一個(gè)或多個(gè)抗原表位位點(diǎn)。本發(fā)明還提供NMO抗原性多肽的抗原表位，其與T細(xì)胞的激活和抑制有關(guān)。計(jì)算機(jī)運(yùn)算可以用于預(yù)測(cè)結(jié)合的抗原表位，例如，MHC-I和MHC-II結(jié)合的抗原表位。例如，參見World Wide Web上的bimas.dcrt.nih.gov80/molbio/hla bind/(Parker，J.Immunol.，152163(1994)；Southwood等，J.Immunol.，1603363(1998))。上下文中所述的術(shù)語“典型的(characteristic)”意為所述抗原表位位點(diǎn)允許對(duì)血清中NMO-特異性抗體進(jìn)行合理可靠的免疫檢測(cè)。通常地，所述抗原表位位點(diǎn)需要具有與其它緊密相關(guān)的抗原(如其它多肽家族成員)截然不同的抗原性。一種典型的抗原片段可能包括，例如，膜結(jié)合蛋白的細(xì)胞外域。
所述NMO抗原性多肽可以從表達(dá)核酸的細(xì)胞(如轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞)中獲得，或者，該多肽可以是合成的。一種編碼NMO抗原性多肽或其片段的DNA分子自身可以是天然的或用通過常規(guī)技術(shù)從人體組織中獲得的天然基因合成的。
所述NMO抗原性多肽可以以一種基本上純的形式獲得。關(guān)于多肽，“純化”是指多肽在混合成分中構(gòu)成主要成分，例如，50重量％或更多，60重量％或更多，70重量％或更多，80重量％或更多，90重量％或更多，或95重量％或更多。純化的多肽典型地通過從產(chǎn)生多肽的生物體純化獲得，盡管化學(xué)合成也是可行的。多肽可以用常規(guī)蛋白純化方法純化，包括親和層析或免疫吸附親和層析柱。
本發(fā)明的NMO抗原性多肽可以以修飾或不修飾形式用于NMO-特異性自體抗體的檢測(cè)。多肽常常通過將所述多肽與提供可檢測(cè)信號(hào)的第二種物質(zhì)共價(jià)或非共價(jià)地結(jié)合進(jìn)行標(biāo)記。多種標(biāo)記和共軛連接技術(shù)在本領(lǐng)域內(nèi)已知，并在科學(xué)和專利文獻(xiàn)中廣泛報(bào)道。一些標(biāo)記包括放射性同位素、酶、底物、輔因子、抑制劑、熒光劑、化學(xué)發(fā)光劑、磁性粒子，等等。
按照上述制備的NMO抗原性多肽可以用在多種免疫學(xué)技術(shù)中以檢測(cè)如來自血清和腦脊髓液的生物樣品中的NMO-特異性自體抗體。依據(jù)樣品的本質(zhì)，可以應(yīng)用免疫測(cè)定和免疫細(xì)胞化學(xué)染色技術(shù)兩者之一或全部。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、Western印跡、和放射性免疫測(cè)定是本領(lǐng)域的常規(guī)方法，可以用于檢測(cè)NMO-特異性自體抗體在血清中的存在。
本發(fā)明進(jìn)一步提供包含一種或多種NMO抗原性多肽的試劑盒。所述試劑盒可以進(jìn)一步包含提供可檢測(cè)信號(hào)第二種物質(zhì)。典型地，一種試劑盒還包括對(duì)使用所述NMO抗原性多肽和/或?qū)嵺`本發(fā)明所述方法(即，檢測(cè)生物樣品中的NMO-特異性自體抗體)的用法指導(dǎo)。
本發(fā)明還提供一種在來自個(gè)體的生物樣品中檢測(cè)NMO抗原性多肽的方法。所述方法描述NMO抗原性多肽異常表達(dá)水平或模式的存在，隨后產(chǎn)生的NMO-特異性自體抗體，和在個(gè)體中導(dǎo)致的NMO三者之間的關(guān)聯(lián)。所述檢測(cè)最廣泛地應(yīng)用于那些表現(xiàn)出如失明的神經(jīng)癥狀的患者，和那些懷疑患有MS或NMO的患者。多肽的檢測(cè)典型地通過使用抗體進(jìn)行，此處為抗NMO抗原抗體，以區(qū)別所述動(dòng)物或重組產(chǎn)生的抗體和由個(gè)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的NMO-特異性自體抗體。本發(fā)明還提供一種抗體，包括對(duì)NMO抗原性多肽具有特異結(jié)合親和力的單克隆抗體。
一旦獲得足夠量的NMO抗原性多肽，可以通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的技術(shù)生產(chǎn)對(duì)NMO抗原性多肽具有特異結(jié)合親和力的單克隆或多克隆抗NMO抗原抗體。此處所用的對(duì)NMO抗原性多肽具有“特異結(jié)合親和力”的抗NMO抗原抗體定義為那些與NMO抗原性多肽結(jié)合但不與其它多肽結(jié)合的抗體，例如，多肽家族的其它成員。此處所用的“抗NMO抗原抗體”引用任意種類的全部抗體，即，IgG，IgA，IgM，IgE，或其它已知的種類，還包括具有必要的特異結(jié)合親和力的所有抗體的一部分或片段(如Fab或(Fab)2片段)，改造的單鏈Fv分子，或嵌合分子，如包含對(duì)一種抗體(如鼠源的)的結(jié)合特異性和另一種抗體(如人源的)保留部分的抗體。
本發(fā)明的抗NMO抗原抗體可以以修飾或無修飾形式用于NMO抗原性多肽的檢測(cè)?？筃MO抗原抗體可以直接或間接地標(biāo)記，并且在科學(xué)和專利文獻(xiàn)中已知并廣泛報(bào)道過多種標(biāo)記和共軛結(jié)合技術(shù)，其中標(biāo)記包括放射性同位素、酶、底物、輔因子、抑制劑、熒光劑、化學(xué)發(fā)光劑和磁性粒子。
如上述制備的抗NMO抗原抗體可以在多種免疫技術(shù)中應(yīng)用，以檢測(cè)樣品中的NMO抗原性多肽。此處所用的“生物樣品”通常為來自個(gè)體的樣品。生物樣品的非限制實(shí)例包括血液、血清、血漿、或腦脊髓液。另外，可以用固體組織，例如脊髓或腦組織活檢。抗體在蛋白結(jié)合檢驗(yàn)中的應(yīng)用已經(jīng)被很好地確立。依據(jù)樣品的本質(zhì)，可以應(yīng)用免疫測(cè)定(如放射性免疫測(cè)定)和/或免疫組織化學(xué)/免疫細(xì)胞化學(xué)染色技術(shù)。液相免疫測(cè)定(如競(jìng)爭(zhēng)抑制放射性免疫測(cè)定)或固相免疫測(cè)定(如抗原捕獲或Western印跡分析)也可以用于檢測(cè)生物樣品中的NMO抗原性多肽。另外，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)常在本領(lǐng)域?qū)嵭?，并且可以用于檢測(cè)生物樣品中NMO抗原性多肽的存在。
科學(xué)和專利文獻(xiàn)中已經(jīng)描述了許多競(jìng)爭(zhēng)性和非競(jìng)爭(zhēng)性的蛋白-結(jié)合測(cè)定，并且大量的此類測(cè)定商購(gòu)可獲得。一種所述的競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定的實(shí)例，檢測(cè)在如血清的生物樣品中NMO抗原性多肽的存在，包括將NMO抗原性多肽(標(biāo)記或未標(biāo)記)與抗NMO抗原抗體(標(biāo)記或未標(biāo)記)和生物樣品相接觸。所述NMO抗原性多肽可以，例如，附著到固體表面上。使用已知量的NMO抗原性多肽和標(biāo)記的抗NMO抗原抗體以產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合曲線，就可以確定生物樣品中NMO抗原性多肽的相對(duì)量。
本發(fā)明進(jìn)一步提供的是包含對(duì)NMO抗原性多肽或其片段具有結(jié)合親合力的抗NMO抗原抗體的試劑盒。所述試劑盒還可以包括NMO抗原性多肽或其片段，以用作結(jié)合對(duì)照或產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)的定量曲線。試劑盒進(jìn)一步包括提供可檢測(cè)標(biāo)記的第二種物質(zhì)。試劑盒典型地包含使用抗NMO抗原抗體和/或?qū)嵭斜景l(fā)明方法(即檢測(cè)生物樣品中的NMO抗原性多肽)的操作說明。
本發(fā)明還提供的是對(duì)共軛結(jié)合到可檢測(cè)標(biāo)記上的NMO抗原性多肽具有特異結(jié)合親和力的抗NMO抗原抗體。合適的可檢測(cè)標(biāo)記包括，但不局限于，酶、放射性同位素、染料和生物素。本發(fā)明還提供共軛結(jié)合到成像劑上的NMO抗原性多肽具有特異結(jié)合親和力的抗NMO抗原抗體。合適的成像劑包括，但不局限于，放射性同位素，如32P、99Tc、111In和131I。
治療NMO的方法本發(fā)明進(jìn)一步提供的治療患有NMO的個(gè)體的方法。NMO的治療需要調(diào)節(jié)個(gè)體因NMO-特異性免疫機(jī)制導(dǎo)致的神經(jīng)癥狀。治療患有NMO的個(gè)體的方法包括，但不限于，單采血液成分術(shù)和基于T細(xì)胞的免疫治療。
本領(lǐng)域已知單采血液成分術(shù)(即，從個(gè)體抽取血液，從血液中移除成分，然后將剩下的血液，或缺乏一種或多種成分的血液輸回個(gè)體)的方法和體外系統(tǒng)(參見，例如，U.S.專利Nos.4,708,713；5,258,503；5,386,734；和6,409,696)。本發(fā)明提供一種從個(gè)體的體液中分離NMO-特異性自體抗體的方法。所述方法包括抽取受試者體液；從所述液體中分離主要部分的NMO-特異性自體抗體；然后將體液輸回給受試者。分離的抗體可以是任何種類，如IgG(如IgGI、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgD、IgA、或IgE抗體。
如此處所用，“主要部分(subtantial portion)”意指將分離前體液中存在的NMO-特異性自體抗體分離出至少20％(如，至少20％；30％；40％；50％；60％；65％；70％；75％；80％；85％；90％；93％；95％；96％；97％；98％；99％；99.5％；99.8％；或甚至100％)。所述體液可以是血漿或其它體液，如，淋巴液或腦脊髓液。按照本發(fā)明的方法，耗盡患有NMO的個(gè)體的NMO-特異性自體抗體將導(dǎo)致癥狀的減輕。
分離出NMO-特異性自體抗體通常通過將體液與NMO抗原性多肽接觸來實(shí)現(xiàn)。NMO抗原性多肽可以結(jié)合到固體支持物上。此類固體支持物可以是，但不限于，膜、纖維、圓珠、或細(xì)粒，并且可以用不溶解于水的，優(yōu)選多孔的、生物相容的材料，例如，如瓊脂糖、糖苷的有機(jī)聚合體，和聚丙烯酰胺，或無機(jī)多孔材料，如多孔玻璃或多孔硅膠。此類材料適于或可以適合NMO抗原性多肽的附著。
當(dāng)體液為血液時(shí)，血漿和/或白細(xì)胞可以與紅細(xì)胞分離(如紅血球)，并且可以將伴隨或不伴隨白細(xì)胞的紅細(xì)胞輸回個(gè)體。通常，將帶有人造血漿而非其最初的血漿的血細(xì)胞輸回給個(gè)體。“代替液體”(如生理鹽水)可以在分離出所述液體后施用給個(gè)體。可選地，NMO-特異性自體抗體可以在單采血液成分過程中選擇性地從血漿中分離出來，并且血細(xì)胞可以與耗盡NMO-特異性自體抗體的血漿相混合，然后作為混合物重新灌注回個(gè)體中。
所述系統(tǒng)可以是連續(xù)的系統(tǒng)，在其中，例如，將血液從經(jīng)過衍生有NMO抗原性多肽的固體支持物的血管(如動(dòng)脈或靜脈)中泵出，并直接泵回給個(gè)受試者。當(dāng)在非連續(xù)系統(tǒng)中時(shí)，在血漿流經(jīng)固體支持物之前，將血細(xì)胞從血漿中分離出來。
T細(xì)胞受體治療的方法在本領(lǐng)域內(nèi)已知。參見，例如，U.S.專利No.5,614,192；Matsumoto等，2000，J.Immunol.，1642248-54；和Mackay，2000，British Med.J.，32193-6。具有對(duì)NMO抗原-受體表達(dá)的抗原的特異結(jié)合親合力的單克隆或多克隆抗體，或其它能夠減少并維持NMO-特異性自體抗體的生產(chǎn)的T細(xì)胞群標(biāo)記，可以用于耗盡或抑制一種或多種病原T細(xì)胞。T細(xì)胞受體的CDR3光譜類型可以用于鑒定自體免疫疾病相關(guān)的T細(xì)胞受體(Matsumoto等，如前所述；Jambou等，2003，J.Clin.Invest.，112254-74)。另外，在個(gè)體中，T細(xì)胞的激活可以通過施用細(xì)胞素或具有對(duì)細(xì)胞素特異結(jié)合親和力的抗體進(jìn)行抑制。例如，為減少Th1型免疫應(yīng)答，可以給個(gè)體施用如白細(xì)胞介素(IL)-4、IL-10或IL-13的細(xì)胞素或?qū)θ鏘L-12或干擾素(IFN)-γ的細(xì)胞素特異的抗體。相似地，為抑制Th2型免疫應(yīng)答，可以給個(gè)體施用如IL-12或IFN-γ的細(xì)胞素或?qū)L-4、IL-10、或IL-13特異的抗體。
另外，本發(fā)明的治療方法包括給個(gè)體施用有效量的藥物組合物(如NMO抗原性多肽，或核酸如反義寡核苷酸，或編碼NMO抗原性多肽的核酸)。有效量是指能夠偏離個(gè)體的NMO抗原性多肽介導(dǎo)的免疫應(yīng)答由此調(diào)節(jié)個(gè)體的神經(jīng)疾病的NMO抗原性多肽的量。如此處所用，“調(diào)節(jié)”神經(jīng)疾病可以是指減少一種或多種癥狀的嚴(yán)重性，消除所有癥狀，或其間任何水平的癥狀。
“反義寡核苷酸”是一種可以特異性雜交到靶核酸上的寡核苷酸，并且通過反義寡核苷酸對(duì)靶核酸表達(dá)的調(diào)節(jié)通常稱為“反義技術(shù)”。此處所用的關(guān)于反義技術(shù)的術(shù)語“雜交”是指靶核酸與反義寡核苷酸的互補(bǔ)區(qū)域的氫鍵鍵合，其可以為Watson-Crick、Hoogsteen、或反Hoogsteen氫鍵鍵合?！疤禺愋噪s交”用來指互補(bǔ)或精確匹對(duì)的充分程度，以致在反義寡核苷酸和靶核酸之間發(fā)生穩(wěn)定和特異的鍵合。在本領(lǐng)域內(nèi)知道反義寡核苷酸的序列不必與其特異性雜交的靶核酸序列100％地互補(bǔ)。
所述反義寡核苷酸與其靶核酸的特異性雜交可以干擾靶核酸的正常功能。對(duì)于靶DNA核酸，反義技術(shù)可能干擾復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。對(duì)于靶RNA核酸，反義技術(shù)可能干擾如所述RNA到蛋白翻譯位點(diǎn)的轉(zhuǎn)運(yùn)，剪切RNA以產(chǎn)生一種或多種mRNA，RNA的催化活性，和RNA的蛋白翻譯。在編碼NMO抗原性多肽的核酸的情況下，所述對(duì)靶核酸功能的干擾的全面作用是對(duì)與NMO相關(guān)的疾病癥狀的調(diào)節(jié)。在本發(fā)明的上下文中，反義技術(shù)可以用于減少編碼NMO抗原性多肽的基因的表達(dá)(如，由于對(duì)轉(zhuǎn)錄的抑制)和/或減少NMO抗原性多肽的細(xì)胞水平(如，由于對(duì)翻譯的抑制)。
反義寡核苷酸的優(yōu)選的靶位點(diǎn)已經(jīng)包含環(huán)繞所述靶基因的可譯框(ORF)的翻譯起始或終止密碼子的區(qū)域。另外，在反義技術(shù)中，所述可譯框已經(jīng)被有效地靶向，5′和3′不翻譯區(qū)也一樣。并且，反義寡核苷酸已經(jīng)被成功地導(dǎo)向內(nèi)含子區(qū)域和內(nèi)含子-外顯子連接區(qū)域。此外，可以應(yīng)用多條反義寡核苷酸，其每一條特異地雜交到靶基因的不同區(qū)域。
本發(fā)明方法中應(yīng)用的反義寡核苷酸(如siRNA)長(zhǎng)度通常從約10到約50個(gè)核苷(如長(zhǎng)度為12到40，14到30，或15到25個(gè)核苷)，但是只要所述反義寡核苷酸能夠調(diào)節(jié)與NMO相關(guān)的癥狀，其也可以長(zhǎng)些或者短些。如此處所用，反義寡核苷酸包括由天然發(fā)生的核苷堿基、糖和共價(jià)核苷間(骨架)聯(lián)接組成的寡核苷酸，以及包含修飾的骨架(如取代糖部分)或非天然的核苷間聯(lián)接的寡核苷酸。反義寡核苷酸還包括如肽核酸(PNAs)的寡核苷酸類似物或嵌合寡核苷酸。并且，本發(fā)明的反義寡核苷酸可以通過化學(xué)聯(lián)接到一個(gè)或多個(gè)提高所述寡核苷酸的活性、細(xì)胞分配或細(xì)胞吸收的糖部分或共軛物上進(jìn)行修飾。參見，例如，美國(guó)專利Nos.5,218,105和5,214,136。
可以評(píng)估反義寡核苷酸對(duì)NMO抗原性多肽的表達(dá)和/或生產(chǎn)的抑制能力，例如，通過測(cè)量治療前和治療后個(gè)體中mRNA或蛋白的水平。測(cè)量組織中或生物樣品中mRNA或蛋白水平的方法在本領(lǐng)域內(nèi)廣為人知。
通過給個(gè)體施用一種適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)編碼NMO抗原性多肽的核酸的載體，NMO抗原性多肽還可以在體內(nèi)運(yùn)送。運(yùn)送編碼生物有用蛋白(如NMO抗原性多肽)的核酸到個(gè)體的載體在本領(lǐng)域內(nèi)已知。目前基于病毒的核酸運(yùn)送載體典型地源于動(dòng)物病毒，如腺病毒、腺相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、牛痘病毒、皰疹病毒、和牛乳頭瘤病毒。用于核酸運(yùn)送的載體通常被進(jìn)行遺傳修飾以便改變或移除所述病毒的天然向性和病原性。還可以對(duì)病毒的基因組進(jìn)行修飾，以增加它的傳染性和適應(yīng)核酸的包裝，例如編碼生物有用蛋白的核酸的包裝。另外，非病毒載體和應(yīng)用所述載體進(jìn)行核酸運(yùn)送的方法為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所知。
如此處所用，“施用”意指將本發(fā)明的組合物(如，NMO抗原性多肽，特異性雜交到編碼NMO抗原性多肽的核酸的一部分上的反義寡核苷酸，或編碼NMO抗原性多肽的核酸)運(yùn)送到患者的方法。所述方法廣為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，其包括，但不限于，口服、鼻內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌肉、腹膜內(nèi)、皮下、鞘內(nèi)、皮內(nèi)、或局部施用。施用的途徑可能取決于各種因素，如治療目的。本發(fā)明的組合物可以連續(xù)或間歇地施用。配制和隨后施用治療組合物的方法廣為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所知。參見，例如，Remington，2000，The Science and Practice of Pharmacy，20th Ed.，Gennaro和Gennaro，eds.，Lippincott，Williams和Wilkins。施用的劑量將取決與許多因素，包括施用和配制的模式。典型地，單劑量的數(shù)量是有效減少個(gè)體中NMO抗原性多肽或NMO-特異性自體抗體水平而沒有惡化疾病癥狀的數(shù)量。
另外，本發(fā)明范圍內(nèi)的NMO抗原性多肽可以包含用于體內(nèi)施用給個(gè)體的藥用載體，其包括，但不限于，無菌水或非水溶液、懸浮液、和乳劑。非水溶劑的實(shí)例包括，但不限于，丙二醇、聚乙二醇、植物油、和可注射的有機(jī)酯。水相載體包括水、醇、鹽、和緩沖的溶液。藥用載體還可以包括生理學(xué)可用水載體(如，生理鹽水或人造腦脊髓液)或其它已知的適合于具體施用途徑的載體。其它的化合物可以與NMO抗原性多肽包含在一起，如類固醇、黏液溶解劑、消炎劑、免疫抑制劑、擴(kuò)張劑、血管收縮藥、或其組合。防腐劑、調(diào)味劑、和其它添加劑，如，例如，抗細(xì)菌劑、抗氧化劑、螯合劑、惰性氣體等也可以加入其中。
運(yùn)送組合物到大腦的方法在本領(lǐng)域內(nèi)已知。例如，可以通過附著一個(gè)識(shí)別腦特異性或神經(jīng)特異性受體的配基(如抗體或抗體片段)對(duì)本發(fā)明的組合物進(jìn)行修飾。另外，提高分子轉(zhuǎn)運(yùn)通過血-腦屏障的方法已知，并且其利用被動(dòng)擴(kuò)散(如，應(yīng)用電磁場(chǎng)、氧化一氮供體或癸酸鈉)或受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞作用(如將病毒顆粒附著到，例如，抗鐵傳遞蛋白抗體或腐胺上)。攜帶編碼NMO抗原性多肽的核酸的病毒載體的表達(dá)還可以通過腦特異性或神經(jīng)特異性啟動(dòng)子和/或轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件(參見，例如，美國(guó)專利Nos.5,976,872或6,066,726)。一種用于編碼NMO抗原性多肽的核酸的星形膠質(zhì)細(xì)胞成足過程特異表達(dá)的特別有用的啟動(dòng)子是細(xì)胞原纖維酸性蛋白(GFAP)，其為星形膠質(zhì)細(xì)胞分化的標(biāo)記。
本發(fā)明還提供的是在患者中表達(dá)NMO抗原性多肽的細(xì)胞成像的方法。所述方法包括給患者施用有效量的對(duì)NMO抗原性多肽具有特異性結(jié)合親合力的抗NMO抗原抗體，以結(jié)合到釋放自細(xì)胞或細(xì)胞中可及的NMO抗原性多肽上，其中NMO抗原性多肽用成像劑標(biāo)記，例如，32P、99Tc、111In或131I，并且檢測(cè)形成的任何復(fù)合體。如廣為本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所知，合適量的抗NMO抗原抗體是有效使細(xì)胞成像的任意量，例如，約0.1mCi到約50.0mCi。另外，所述抗NMO抗原抗體的有效量可以是約0.01mg到約100mg。合適的施用成像劑的方法如上所述，并且可以按上述被靶向(如到大腦)。成像的方法取決于所應(yīng)用的試劑，并且廣為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所知。
本發(fā)明還提供的是一種計(jì)數(shù)或分離個(gè)體中NMO抗原性多肽-特異的T淋巴細(xì)胞的方法。所述方法可以用于，例如，監(jiān)控個(gè)體的免疫應(yīng)答或用于使用NMO抗原性多肽特異的細(xì)胞毒T細(xì)胞的免疫治療。所述方法包括將包含淋巴細(xì)胞的生物樣品與可溶性四聚體I類或II類主要組織相容性復(fù)合體(MHC)相接觸，所述要組織相容性復(fù)合體(MHC)具有同樣的NMO抗原性多肽片段。如抗生物素蛋白和生物素的連接分子用于生產(chǎn)NMO抗原性多肽-MHC四聚體復(fù)合物，其隨后可以用指示分子標(biāo)記，以便將那些識(shí)別NMO抗原性多肽-MHC四聚體復(fù)合物的T細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)或分離出來(如，應(yīng)用FACS分析)。參見，例如，Schwartz，1998，New England J Med.，3391076-8，及其參考文獻(xiàn)。
核酸和構(gòu)建體此處公開的實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明NMO抗原性多肽是水通道蛋白-4。術(shù)語“水通道蛋白-4”指水通道蛋白家族的一個(gè)成員。水通道蛋白家族具有10個(gè)已知成員。水通道蛋白-4在與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的毛細(xì)管接觸的星型膠質(zhì)細(xì)胞成足化過程膜上表達(dá)，還在腎末梢收集小管和胃上皮細(xì)胞的基底外側(cè)膜上表達(dá)。編碼人水通道蛋白-4多肽的核苷酸序列的實(shí)例在GenBank入藏登記號(hào)U63622和U63623中顯示。典型的人水通道蛋白-4多肽的預(yù)測(cè)的氨基酸序列在GenBank入藏登記號(hào)Nos.AAG17964，AAB26957，AAB26958，和I39178中顯示。其它生物體(如Mus musculus，Bos Taurus，Rattusnorvegicus，和Ovis aries)編碼水通道蛋白-4的核酸和氨基酸序列可以通過使用“水通道蛋白-4”為搜索詞搜索GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)(在環(huán)球網(wǎng)上網(wǎng)址為ncbi.nlm.nih.gov)找到。
如此處所用，核酸是指RNA或DNA。關(guān)于核酸，此處所用的“分離的(isolated)”是指(i)編碼部分或全部的人水通道蛋白-4的核酸序列，但是沒有通常位于人類基因組中編碼水通道蛋白-4的核酸序列一側(cè)或兩側(cè)的編碼序列；或(ii)整合到載體中或生物體基因組DNA中的核酸，其使得獲得的分子與任何天然發(fā)生的載體或基因組DNA沒有同一性。
另一方面，本發(fā)明包括人水通道蛋白-4核酸和多肽的片段。如此處所用，片段是指與相應(yīng)于小于全部的水通道蛋白-4序列的核酸或多肽。核酸片段可以包括那些長(zhǎng)度約100個(gè)核苷酸的片段，和GenBank入藏登記號(hào)為U63622或U63623的長(zhǎng)度為幾百個(gè)核苷酸的片段；或GenBank入藏登記號(hào)為U63622或U63623的長(zhǎng)度為約10-50個(gè)核苷酸的片段。本發(fā)明提供的片段包括，例如，GenBank入藏登記號(hào)為U63622或U63623的核苷酸166-266，283-306，404-1104，575-925，648-698，712-747，和891-906。所述片段可以，例如，編碼水通道蛋白-4抗原性多肽片段，或具有作為雜交探針和擴(kuò)增引物的用途。
圖2顯示人水通道蛋白-4核酸序列中的各種限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的相對(duì)位置，其通過實(shí)例的方式定義位點(diǎn)，所述位點(diǎn)通過各種連接可以用于產(chǎn)生有用的核酸片段。給出人水通道蛋白-4多肽的核苷酸序列，基本上任意核酸片段可以通過已知方法產(chǎn)生(如，限制性內(nèi)切酶消化，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))并且，如果需要，可以表達(dá)以產(chǎn)生對(duì)應(yīng)的多肽片段。可選地，人水通道蛋白-4多肽可以被剪切(如蛋白水解酶水解地)以直接產(chǎn)生多肽片段。
人水通道蛋白-4核酸或核酸片段可以具有GenBank入藏登記號(hào)為U63622或U63623顯示的序列衍生來的序列。例如，一種核酸序列具有與GenBank入藏登記號(hào)為U63622或U63623顯示的核苷酸序列至少80％的序列同一性。在一些實(shí)施方案中，所述核酸序列具有與GenBank入藏登記號(hào)為U63622或U63623顯示的核苷酸序列至少85％的序列同一性，90％的序列同一性，95％的序列同一性，或至少99％的序列同一性。參見，例如，GenBank入藏登記號(hào)BC022286，NM004028，和NM-001650的水通道蛋白-4不同核酸序列。
序列同一性百分?jǐn)?shù)通過下述方法計(jì)算確定比對(duì)核酸或多肽序列中匹配的位點(diǎn)數(shù)目，用匹配的位點(diǎn)數(shù)目分別除以比對(duì)的核苷酸或氨基酸總數(shù)，然后乘以100。匹配的位點(diǎn)是指相同的核苷酸或氨基酸發(fā)生在比對(duì)序列中的相同位點(diǎn)的位點(diǎn)。比對(duì)核苷酸或氨基酸的總數(shù)是指與第二序列比對(duì)必需的水通道蛋白-4核苷酸或氨基酸的最小數(shù)目，并且其不包括與如那些融合到水通道蛋白-4上的非水通道蛋白-4序列的比對(duì)(如強(qiáng)迫的比對(duì))。比對(duì)核苷酸或氨基酸的總數(shù)可以對(duì)應(yīng)全部水通道蛋白-4序列或可以對(duì)應(yīng)此處定義的水通道蛋白-4序列全長(zhǎng)的片段。
序列可以應(yīng)用Altschul等(1997，Nucleic Acids Res.，253389-3402)所述的并入到BLAST(基本的局部比對(duì)搜索工具)程序的運(yùn)算法則進(jìn)行比對(duì)，其中BLAST程序在環(huán)球網(wǎng)上可用，網(wǎng)址為ncbi.nlm.nih.gov。BLAST搜索或比對(duì)可以通過應(yīng)用Altschul等的運(yùn)算法則進(jìn)行，以確定水通道蛋白-4核酸分子和任意其它序列或其部分序列之間的序列同一性百分比。BLASTN是用于比對(duì)和比較核酸序列之間的同一性的程序，而BLASTP是用于比對(duì)和比較氨基酸序列之間的同一性的程序。當(dāng)應(yīng)用BLAST程序來計(jì)算水通道蛋白-4與其它序列之間的同一性百分?jǐn)?shù)時(shí)，應(yīng)用每一程序的缺省參數(shù)。
編碼人水通道蛋白-4多肽的核酸可以獲得于，例如，從人細(xì)胞系制備的cDNA文庫(kù)，或通過其它方法獲得，包括，但不限于，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。PCR是指一種擴(kuò)增靶核酸的程序或技術(shù)。PCR可以用于從DNA和RNA擴(kuò)增特異的序列，包括來自全基因組的DNA或全細(xì)胞的RNA。各種PCR方法例如在PCR PrimerA Laboratory Manual，Dieffenbach和Dveksler，Eds.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1995.中有描述。一般地，應(yīng)用目的區(qū)域的兩端或之外的序列信息來設(shè)計(jì)寡核苷酸引物，其在序列上與要擴(kuò)增模板的對(duì)應(yīng)鏈相同或相似。
人水通道蛋白-4核酸可以通過如各種雜交技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。核酸分子間的雜交在Sambrook等(1989，Molecular CloningA Laboratory Manual，2ndEd.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，紐約；7.37-7.57，9.47-9.57，11.7-11.8，和11.45-11.57節(jié))中有詳細(xì)討論。
對(duì)于少于約100個(gè)核苷酸的寡核苷酸探針，Sambrook等在11.45-11.46節(jié)公開適宜的Southern印跡條件。在長(zhǎng)度少于100個(gè)核苷酸的序列和第二序列之間的Tm可以應(yīng)用Sambrook等在11.46節(jié)提供的公式計(jì)算。Sambrook等還討論了應(yīng)用多于約100個(gè)核苷酸的寡核苷酸探針的Southern印跡的預(yù)雜交和雜交條件(參見9.47-9.52節(jié))。使用多于100個(gè)核苷酸的寡核苷酸的雜交通常在低于Tm 15-25℃的溫度進(jìn)行。在長(zhǎng)度長(zhǎng)于100個(gè)核苷酸的序列和第二序列之間的Tm可以應(yīng)用Sambrook等在9.50-9.51節(jié)提供的公式計(jì)算。另外，Sambrook等推薦應(yīng)用9.54節(jié)指示的條件來洗滌已用長(zhǎng)于約100個(gè)核苷酸的寡核苷酸探測(cè)了的Southern印跡。
預(yù)雜交和雜交含有核酸的膜的條件，以及洗滌含有核酸的膜以去除剩余的和非特異性結(jié)合的探針的條件，在雜交的嚴(yán)謹(jǐn)性中起著重要作用。所述雜交可以在合適的中等的或高度嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件下進(jìn)行。例如，所述條件在Sambrook等的11.45-11.46節(jié)中描述。例如，洗滌條件可以通過減少洗滌溶液的鹽濃度和/或提高洗滌進(jìn)行的溫度而更加嚴(yán)謹(jǐn)。另外，對(duì)雜交數(shù)量的解釋可能受到下列因素的影響，例如，標(biāo)記的寡核苷酸探針的特異活性、在探針雜交的模板核酸上探針結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)目、和放射自顯影或其它檢測(cè)介質(zhì)的曝光量。
本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，盡管任意數(shù)目的雜交和洗滌條件可以用于檢查探針核酸分子與固定的靶核酸的雜交，更重要的是檢查在同樣的雜交、洗滌、和曝光條件下探針與靶核酸的雜交。優(yōu)選地，所述靶核酸位于同一張膜上。
如果與第一個(gè)靶核酸的雜交比與第二個(gè)靶核酸的雜交至少?gòu)?qiáng)5倍(如，至少6倍，7倍，8倍，9倍，10倍，20倍，50倍，或100倍)，就認(rèn)為核酸分子雜交到第一個(gè)靶核酸上，而不雜交到第二個(gè)靶核酸上。雜交的數(shù)量可以直接在膜上或從放射自顯影上進(jìn)行定量，通過應(yīng)用如感光成像儀(PhosphorImager)或顯像密度計(jì)(Densitometer)(Molecular Dynamics，Sunnyvale，加州)進(jìn)行。
本發(fā)明還包括這樣的載體，其包含人水通道蛋白-4核酸(參見，例如，GenBank入藏登記號(hào)U63622和U63623)或其補(bǔ)體，水通道蛋白-4核酸片段或其補(bǔ)體，和那些與水通道蛋白-4核酸或其產(chǎn)生的片段(或其補(bǔ)體)具有至少80％序列同一性的核酸。
適于用于本發(fā)明的克隆載體可以商購(gòu)，并被那些普通技術(shù)人員常規(guī)應(yīng)用。本發(fā)明的載體還包括表達(dá)必需的元件，其有效地與人水通道蛋白-4核酸序列連接。“表達(dá)必需的元件”包括啟動(dòng)子序列，并且還可能包括如增強(qiáng)子序列的調(diào)控元件，調(diào)節(jié)人水通道蛋白-4核酸序列表達(dá)的響應(yīng)元件或可誘導(dǎo)元件。如此處所用，“有效地連接”指在人水通道蛋白-4核酸序列相關(guān)的構(gòu)建體中布置啟動(dòng)子和/或其它調(diào)控元件，通過這種方式來引導(dǎo)或調(diào)控水通道蛋白-4核酸的表達(dá)。所述構(gòu)建體可以商購(gòu)(如表達(dá)載體)和/或用本領(lǐng)域常規(guī)的重組DNA技術(shù)生產(chǎn)。表達(dá)系統(tǒng)的選擇取決于幾個(gè)因素，包括但不限于，復(fù)制效率、選擇性、可誘導(dǎo)性、靶向性、必要的表達(dá)水平、回收容易度和宿主進(jìn)行翻譯后修飾的能力。
如此處所用，術(shù)語“宿主”或“宿主細(xì)胞”意指不但包括如大腸桿菌(E.coli)的原核生物，還包括如酵母、昆蟲、植物和動(dòng)物細(xì)胞的真核生物。動(dòng)物細(xì)胞包括，例如，COS細(xì)胞和HeLa細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以被轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染DNA分子(如載體)，通過應(yīng)用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員常規(guī)所知的任何技術(shù)，如磷酸鈣或醋酸鋰沉淀，電穿孔，脂質(zhì)轉(zhuǎn)染和粒子轟擊。包含本發(fā)明載體的宿主細(xì)胞可以用于下述目的如繁殖載體、生產(chǎn)人水通道蛋白-4核酸(如DNA、RNA、反義RNA)、或者表達(dá)人水通道蛋白-4多肽或其片段。
本法明的另一方面，提供生產(chǎn)水通道蛋白-4多肽的方法。生產(chǎn)水通道蛋白-4多肽的方法包括，但不限于，在允許水通道蛋白-4表達(dá)的條件下培養(yǎng)包含水通道蛋白-4表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，和回收水通道蛋白-4多肽。培養(yǎng)細(xì)菌和回收表達(dá)的多肽的方法廣為本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所知。
另外，本發(fā)明的核酸可以通過如Southern或Northern印跡(即雜交)、PCR、或原位雜交分析進(jìn)行檢測(cè)。水通道蛋白-4蛋白典型地通過轉(zhuǎn)染細(xì)胞系中的免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)，或通過十二烷基磺酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳，緊接著進(jìn)行考馬斯蘭染色或應(yīng)用具有對(duì)人水通道蛋白-4多肽特異結(jié)合親合力的抗體(單克隆或多克隆)的Western印跡分析，進(jìn)行檢測(cè)。
本發(fā)明還在下述實(shí)例中描述，其沒有限制權(quán)利要求所述的本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例實(shí)施例1-血漿預(yù)吸收為將非特異性染色減到最少，每一個(gè)患者的血漿用肝抗原進(jìn)行預(yù)吸收，通過將40mg商業(yè)豚鼠組織粉(Sigma Chemical Co.，St.Louis，密蘇里州)與10μL稀釋在590μL的含有1％牛血清蛋白的磷酸緩沖鹽(PBS)中的血清混合以實(shí)現(xiàn)。室溫下溫和地混合1小時(shí)后，不溶的殘?jiān)ㄟ^離心(20,800xg，10分鐘)去除。然后立即加入新鮮的肝粉(40mg)到血清的上層清液中，并且重復(fù)本步驟2次，一共3次連貫的吸收。
實(shí)施例2-底物制備將3種常規(guī)哺乳動(dòng)物組織(如鼠腦(小腦和中腦)、胃和腎)的冷凍復(fù)合塊在8孔顯微鏡載玻片的單孔上進(jìn)行冷凍切片(4μ厚度)。這些載玻片作為常規(guī)產(chǎn)品購(gòu)買(購(gòu)于MeDiCa，Encinitas，加州)，并在含有干燥劑的密封袋中保存于-70℃。在打開使用前，在室溫下平衡每一個(gè)密封袋。將冷卻的去垢劑(含1％CHAPS的PBS)涂在每一張切片上并在4分鐘后吸走。在冷凍的PBS(每一次洗滌在搖床上持續(xù)5分鐘)中洗滌3次后，涂上冷凍的10％磷酸緩沖的福爾馬林，并在4分鐘后吸走。3次在冷凍的PBS中多于5分鐘的洗滌后，涂上含有10％的正常山羊血清的PBS(室溫)，并在60分鐘后吸走。
實(shí)施例3-免疫染色將吸收的、稀釋的患者和對(duì)照血清(40μL體積)分別涂到含有上述處理的組織切片的孔上。室溫下40分鐘后，每一個(gè)孔用冷卻的PBS徹底地洗滌。然后在合適的稀釋應(yīng)用一種商業(yè)熒光染料-共軛的對(duì)人IgG特異的IgG(如，熒光標(biāo)記的山羊抗人IgG，Southern Biotechnology Assoc.，Inc.，伯明翰，阿拉巴馬州)。室溫下35分鐘后，用冷卻的PBS徹底洗滌孔，并用玻璃條狀蓋板(#1厚度)在含有抗褪色劑的封固劑作用下將每一塊載玻片蓋好。通過熒光顯微鏡(20X目鏡)評(píng)估與IgG結(jié)合的組織的典型的NMO模式。
在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中，NMO抗原定位在小腦皮層、中腦和脊髓的毛細(xì)管的管腔壁上；在視神經(jīng)中，NMO抗原與軸突柱間的毛細(xì)管區(qū)的軟膜和星型膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)程相關(guān)。在CNS組織的最佳治療切片中，免疫熒光共焦顯微鏡表明NMO抗原是血腦屏障的組成部分。在延伸到白質(zhì)和灰質(zhì)中微脈管的魏爾嘯-羅賓隙(Virchow-Robin space)的星型膠質(zhì)細(xì)胞-軟膜連接處的神經(jīng)膠質(zhì)界膜中，免疫反應(yīng)性是固有的。使用親和純化的具有確定特異性的抗體的雙免疫染色顯示出NMO抗原與水通道蛋白4共定位，其中水通道蛋白4是血腦屏障的一種汞不敏感的水通道蛋白組分。在脾或肝實(shí)質(zhì)切片中檢測(cè)不出NMO抗原，但是，同水通道蛋白4一樣，它明顯地與腎遠(yuǎn)曲收集小管的基底外側(cè)膜和胃深黏膜上皮相關(guān)。
通過在競(jìng)爭(zhēng)性抑制免疫熒光檢測(cè)中應(yīng)用限制稀釋的NMO-IgG，演示了粗制膜級(jí)分(crude membrane fraction)的免疫反應(yīng)性，其中粗制膜級(jí)分從通過差速離心移除組織碎片和核團(tuán)后的勻漿的大鼠腦中制備。所述級(jí)分有效地終止NMO-IgG免疫熒光模式。胞質(zhì)級(jí)分不吸收NMO-IgG的反應(yīng)性。粗制膜級(jí)分的免疫反應(yīng)性抵抗非離子去污劑CHAPS 2％的溶液的萃取。這一觀察結(jié)果導(dǎo)致了這樣的發(fā)現(xiàn)在磷酸緩沖的10％的福爾馬林固定4分鐘之前或之后，用1％CHAPS處理組織切片4分鐘，保持了組織形態(tài)學(xué)并且在70％的臨床診斷的NMO患者血清中增強(qiáng)了NMO表位對(duì)IgG的可接近性。
盡管不受任何具體理論的限制，NMO抗原對(duì)去污劑萃取的抵抗力是與水通道蛋白4的細(xì)胞質(zhì)C末端到支架銜接蛋白α-肌養(yǎng)蛋白結(jié)合蛋白的PDZ區(qū)域的預(yù)定范圍一致的，其中α-肌養(yǎng)蛋白結(jié)合蛋白是肌養(yǎng)蛋白復(fù)合體的組分(Neely等，PNAS 9814108，2001)。血腦屏障的肌養(yǎng)蛋白復(fù)合體的其它組分還可以是NMO自體抗體的相關(guān)靶點(diǎn)(Neely等，如前所述)。
實(shí)施例4-解釋免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表1顯示在每一種指示組織中評(píng)估的典型特征。
表1

每一特征的染色強(qiáng)度在正式的記分表中(圖1)用下述記分體系進(jìn)行分級(jí)陰性-或±/-弱陽性，可能是不確定的(equivocal)±確定的陽性，強(qiáng)±/+，+或2+陽性結(jié)果要求最少賦值一個(gè)‘±’給腎的遠(yuǎn)曲收集小管和小腦或中腦軟膜或微脈管。
記錄任何核、細(xì)胞質(zhì)、膜的或細(xì)胞外基質(zhì)染色的存在和強(qiáng)度，其中所述染色可能潛在地干擾NMO-IgG解釋。特別是，對(duì)每一個(gè)檢查的組織切片，記錄表2所示的任何組織的染色。
表2

實(shí)施例5-臨床應(yīng)用對(duì)來自于分類為“確定的(definite)”NMO，MS的亞洲視神經(jīng)形式，或通過臨床、成像和脊髓液標(biāo)準(zhǔn)的診斷的典型MS的患者，和對(duì)照患者的血清進(jìn)行自體抗體分析，其中自體抗體可以選擇性地與CNS組織結(jié)合。此處所述式樣表明血清陽性分析結(jié)果對(duì)于區(qū)分NMO和多發(fā)性硬化病(MS)的典型形式的價(jià)值。血清(在測(cè)試中編號(hào))來自于用嚴(yán)謹(jǐn)度的各種等級(jí)診斷標(biāo)準(zhǔn)確定的NMO患者(n＝45)，典型的MS患者(n＝19)，認(rèn)為高風(fēng)險(xiǎn)患MNO的患者(縱向延伸的脊髓炎的雙邊視神經(jīng)炎或單邊或復(fù)發(fā)性發(fā)作；與陰性腦相關(guān)的核磁共振成像(MRI)，即，沒有達(dá)到“確定的”NMO分類的嚴(yán)謹(jǐn)標(biāo)準(zhǔn))(n＝35)，和最終診斷為MS而最初表現(xiàn)為視神經(jīng)炎或脊髓炎的患者(n＝22)。用鼠腦、胃和腎的標(biāo)準(zhǔn)組合底物進(jìn)行間接的免疫熒光；血清用如上述實(shí)施例1所述的肝提取物進(jìn)行預(yù)吸收。
在45名NMO患者中，33名患者(73％)的IgG產(chǎn)生與眾不同的染色模式(″NMO-IgG″)，其與貫穿小腦皮層和中腦的微脈管相關(guān)，與軟膜和軟膜下“篩孔”(在中腦中顯著)相關(guān)。在腸黏膜、腎、或肝中看不到所述微血管模式，并且在任何對(duì)照疾病組中沒有記錄到NMO-IgG。來自35名具有得NMO高風(fēng)險(xiǎn)的患者中的16名患者(46％)的血清產(chǎn)生與眾不同的NMO-IgG染色模式。診斷為典型的MS的19名患者沒有人具有可檢測(cè)到的NMO-IgG染色模式，但是表現(xiàn)出視神經(jīng)炎/脊髓炎的22名患者中有2名(9％)具有所述NMO-IgG。
另外，在遞交到Mayo Clinic′s Neuroimmunology Laboratory進(jìn)行基于服務(wù)性的不知情副腫瘤性自體抗體測(cè)試的85,000名患者的血清中，偶然地從14名患者中鑒定出了NMO-IgG。他們的后續(xù)病史記錄表明3人達(dá)到了NMO診斷的臨床標(biāo)準(zhǔn)，9人分類為高風(fēng)險(xiǎn)性得NMO(7人具有縱向延伸脊髓炎和2人具有復(fù)發(fā)性視神經(jīng)炎)，1人具有新脊髓病發(fā)作，和1人具有未分類的類固醇-應(yīng)答的CNS炎癥疾病。
所述結(jié)果表明NMO-IgG自體抗體是NMO的第一特異的生物標(biāo)記，并能夠區(qū)分NMO和MS。
實(shí)施例6-Western印跡一種包含重組大鼠水通道蛋白4(C末端殘基249-323；Alamone Labs，Jerusalem，以色列)的GST融合蛋白在10％的聚丙烯酰胺凝膠中電泳，電泳緩沖液是含有巰基乙醇的標(biāo)準(zhǔn)Laemmli SDS緩沖液，并且使用NMO患者的和作為陽性對(duì)照的免疫兔的血清進(jìn)行Western印跡，以確定患者的IgG是否將與38kDa的GST-水通道蛋白4融合蛋白結(jié)合。所述印跡與人血清接觸(1∶50稀釋)，其中包括4名NMO患者，3名正常人，1名對(duì)照脊髓病患者，2名典型的MS患者，和3名具有混合的神經(jīng)精神病的患者。來自4名NMO患者的血清和免疫兔的血清結(jié)合到8kDa的水通道蛋白4融合蛋白，然而來自對(duì)照患者或表現(xiàn)出其它疾病的患者的血清中沒有一例與之結(jié)合。
其它實(shí)施方案應(yīng)該明白盡管本發(fā)明與其詳細(xì)表述結(jié)合進(jìn)行描述，在前描述是用來例證但不限制本發(fā)明的范圍，其由附加權(quán)利要求的范圍所確定。其它方面、優(yōu)點(diǎn)、和修飾在下述權(quán)利要求的范圍中。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)來自個(gè)體的生物樣品中NMO-特異性自體抗體的存在或不存在的方法，其包括步驟將所述生物樣品與NMO抗原性多肽或其片段接觸，其中所述NMO抗原性多肽是水通道蛋白4；和檢測(cè)所述NMO抗原性多肽與所述生物樣品中的所述NMO-特異性自體抗體結(jié)合的存在或不存在。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述NMO-特異性自體抗體在所述生物樣品中的存在是與所述個(gè)體中的視力損傷、衰弱、麻木、痙攣或異?；蛱弁锤?、和/或膀胱和/或腸失控相關(guān)的。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述NMO-特異性自體抗體的存在與所述個(gè)體中的NMO相關(guān)。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述NMO抗原性多肽是重組表達(dá)的NMO抗原性多肽。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述NMO-特異性多肽是在選自于由腦、脊髓、視神經(jīng)、腎、或胃組成的組的固體組織中。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述生物樣品選自于由血液、血清、血漿、和腦脊髓液組成的組。
7.一種檢測(cè)來自個(gè)體的生物樣品中NMO抗原性多肽的存在或不存在的方法，其包括步驟將所述生物樣品與抗NMO抗原抗體接觸，其中所述NMO抗原是水通道蛋白4；和檢測(cè)所述抗NMO抗原抗體與所述生物樣品的結(jié)合，其中結(jié)合是所述生物樣品中存在所述NMO抗原性多肽的指示。
8.權(quán)利要求7的方法，其中NMO抗原性多肽在所述生物樣品中的存在是所述個(gè)體中NMO的指示。
9.權(quán)利要求7的方法，其中所述個(gè)體部分或完全失明。
10.權(quán)利要求7的方法，其中所述生物樣品選自于由血液、血清、血漿、腦脊髓液、腦組織活檢和脊髓組織活檢組成的組。
11.一種制品，其包括NMO抗原性多肽和應(yīng)用所述NMO抗原性多肽以檢測(cè)個(gè)體中抗NMO抗原自體抗體的用法說明，其中所述NMO抗原性多肽是水通道蛋白4。
12.權(quán)利要求11的制品，其中所述的制品用于在所述個(gè)體中診斷NMO。
13.權(quán)利要求11的制品，進(jìn)一步包括對(duì)NMO抗原性多肽具有特異性結(jié)合親和力的單克隆抗體。
14.一種治療患有NMO的個(gè)體的方法，所述方法包括從個(gè)體中抽取體液，其中的體液包含一種或多種與水通道蛋白4結(jié)合的自體抗體；從體液中去除主要部分的自體抗體；和將所述體液輸回受測(cè)試者。
15.一種治療患有NMO的個(gè)體的方法，所述方法包括給所述個(gè)體施用NMO抗原性多肽，其中所述NMO抗原性多肽是水通道蛋白4。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述施用是通過選自于由下列方法組成的組的方法口服、靜脈注射、和經(jīng)腸胃外。
17.一種治療患有NMO的個(gè)體的方法，所述方法包括給所述個(gè)體施用一種編碼NMO抗原性多肽的核酸，其中所述NMO抗原性多肽是水通道蛋白4。
全文摘要
本發(fā)明提供用于診斷和治療視神經(jīng)脊髓炎及相關(guān)疾病的方法和材料。
文檔編號(hào)C07K16/28GK1910456SQ200480040851
公開日2007年2月7日 申請(qǐng)日期2004年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月25日
發(fā)明者V·A·列農(nóng), T·J·克里澤爾 申請(qǐng)人:馬約醫(yī)學(xué)教育與研究基金會(huì)