專利名稱：Sars感染的可顯像動物模型的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及冠狀病毒感染模型。更具體地，它涉及感染了熒光蛋白標(biāo)記的冠狀病毒的動物。
背景技術(shù)：
最近，嚴重急性呼吸綜合征(SARS)在全世界的爆發(fā)導(dǎo)致了大量死亡和旅游計劃的中斷，也使數(shù)千人處于檢疫狀態(tài)。在很短的時間里，利用從六個國家的患者身上獲得的臨床樣本，已經(jīng)確定感染是由冠狀病毒引起的。例如可參見Ksiazek，T.G.，et al.，New England J.Med.(2003)3481947-1958。
冠狀病毒家族成員包含大約30kb的正義RNA基因組，在許多不同物種中能引起呼吸道或腸道感染。例如可參見de Haan，C.A.M.，et al.，Virology(2002)296177-189?？苫诳乖瓦z傳標(biāo)準(zhǔn)將它們分成三組。冠狀病毒的共同特征是具有編碼復(fù)制酶和結(jié)構(gòu)功能蛋白的必需基因。在這些基因中分散著組內(nèi)相似，組間不同的組特異性開放讀碼框(ORFs)。
主要必需基因(ORF)占基因組的大約2/3，位于基因組的5′端。這個基因是復(fù)制酶基因，它編碼兩個大的前體，切割該前體物質(zhì)可得到參與RNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物。其他共同的必需基因編碼四種基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)蛋白N，M，E和S。核衣殼蛋白(N)包裝病毒RNA，形成病毒粒子的核心。這種核衣殼核心結(jié)構(gòu)被含有最豐富膜蛋白(M)的脂質(zhì)被膜包圍。小被膜蛋白(E)和棘突蛋白(S)與M蛋白相連。S蛋白形成參與病毒-細胞融合和細胞-細胞融合的病毒外包膜突起。這些基因位于病毒基因組的3′端。這些組特異性基因的性質(zhì)(identity)和位置會變化，它們的所有功能還沒有確定。小鼠肝炎病毒(MHV)所屬的第2組病毒具有兩個組特異性基因，基因2a以及位于ORF lb與S基因之間的血凝素-酯酶(HE)ORF。另外的兩個組2-特異性基因，基因4和基因5a位于S和E基因之間。
MHV具有大約31kb的單鏈正義RNA基因組。參見Kim，K.H.，et aL，J.Virol.(1995)692313-2321。MHV基因組RNA的5′端包含長72-77個核苷酸的引導(dǎo)序列。引導(dǎo)序列的下游是各自被基因間序列的特殊短伸展序列分開的MHV特異性基因。MHV感染的細胞會產(chǎn)生七種主要的病毒特異性亞基因組mRNA。冠狀病毒mRNA呈多順反子結(jié)構(gòu)，但產(chǎn)生單順反子蛋白。在嵌套式結(jié)構(gòu)中，冠狀病毒的mRNAs共享3′端，其中每一個mRNA以逐漸增多的方式比它3′端的相鄰基因長一個基因，而且只有每一個mRNA的5′端的大部分基因被翻譯。依據(jù)這些亞基因組mRNAs的大小，按由大到小的次序?qū)⑵涿麨?到7。mRNA序列在其5′端與引導(dǎo)序列融合。
在DBT細胞中將MHV毒株JHM連續(xù)不稀釋傳代可產(chǎn)生缺陷的干擾(DI)RNAs的病毒，這代病毒被分成兩種類型。一種需要輔助病毒感染才能復(fù)制。另一種DI型包含大小接近病毒基因組，沒有輔助病毒感染時自身能復(fù)制并能被包裝進MHV顆粒的DIssA。在DIssA復(fù)制細胞中，幾乎所有MHV mRNA的合成都被強烈抑制，但mRNA7及其產(chǎn)物，以及N蛋白的合成卻不被抑制。對DIssA的RNase TI寡核苷酸指紋分析顯示DIssA的基因1和基因7基本完整，但基因2一基因6存在多個缺失。mRNA 7是從DIssA的模板RNA，而不是從輔助病毒的模板RNA合成的，基因1的產(chǎn)物和N蛋白對于MHV RNA的合成而言是足夠的。
因此如果能標(biāo)記DI型DIssA，監(jiān)測復(fù)制就足夠了。這就是本發(fā)明所描述的方法。
使用熒光蛋白作為熒光標(biāo)記物已經(jīng)有很多年。最初分離的蛋白發(fā)射綠色波長，因此被稱為綠色熒光蛋白(GFP)。因此雖然已經(jīng)制備出包括紅色熒光蛋白(RFP)，藍色熒光蛋白(BFP)和黃色(YFP)熒光蛋白的其他各種顏色的蛋白，但總體上綠色熒光蛋白已經(jīng)成為這種熒光蛋白的種類標(biāo)記(genericlabel)。例如，美國專利6,232,523；6,235,967；6,235,968和6,251,384中討論了這些蛋白的性能，在此引入所有文獻作為參考。這些專利描述了利用各種顏色的熒光蛋白監(jiān)測轉(zhuǎn)基因嚙齒類動物內(nèi)的腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的情況，其中轉(zhuǎn)基因嚙齒類動物是方便的腫瘤模型。另外，在美國申請09/812,710中這些熒光蛋白被用來監(jiān)測啟動子介導(dǎo)的表達，在美國系列號10/192,740中被用來監(jiān)測細菌感染，在美國臨時申請60/425,776中被用來監(jiān)測細胞分選。美國臨時申請60/404,005和60/427,604公開了利用不同顏色的熒光蛋白標(biāo)記細胞核和細胞漿的情況。美國臨時申請60/445,583描述了所有組織都被標(biāo)記，因此具有相同顏色的一致性熒光的小鼠。在此引入所有這些文獻作為參考。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了動物模型，其中用熒光標(biāo)記的冠狀病毒來感染易感動物受試者，優(yōu)選嚙齒類動物或兔子，其中通過監(jiān)測熒光來隨診感染即冠狀病毒復(fù)制的進展。在一個優(yōu)選實施方案中，動物是含有發(fā)第一顏色熒光的組織的轉(zhuǎn)基因動物，在第一顏色熒光的映襯下，容易看見正在復(fù)制的冠狀病毒的熒光。利用這一模型，通過直接觀察治療和未治療的情況下或者接種疫苗和未接種疫苗的情況下感染的進展，可以確定疫苗和藥物的效果。下面利用來自MHV的DIssA特異性序列作為模型來說明本發(fā)明。
因此，一方面，本發(fā)明涉及標(biāo)記有熒光蛋白，例如GFP或RFP的冠狀病毒。另一方面，本發(fā)明涉及感染了標(biāo)記的病毒的動物。另一方面，本發(fā)明涉及利用本發(fā)明的動物模型來監(jiān)測感染進程，評價抗病毒藥物和疫苗效果的方法。
實施發(fā)明的方式上述引入作用參考的美國專利和專利申請中描述了本發(fā)明中有用的工具。這些文獻中已經(jīng)描述了全身顯像(Whole body imaging)，本發(fā)明所用熒光蛋白的性質(zhì)以及標(biāo)記整個動物的方法。
已經(jīng)公開的方法適用于冠狀病毒家族中各組的冠狀病毒。雖然在說明性實例中，病毒是用RFP標(biāo)記的，并且在所有組織都表達GFP的裸小鼠的背景下觀察所述病毒，但選擇這些具體顏色和使用標(biāo)記動物作為受試者都不是必需的。
重組冠狀病毒公開的發(fā)明中使用了經(jīng)改造表達標(biāo)記物，諸如熒光蛋白的重組冠狀病毒。通過用上述重組冠狀病毒感染模型生物體，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以利用重組病毒來研究宿主動物體內(nèi)病毒復(fù)制的進展。而且，這種重組冠狀病毒模型系統(tǒng)可以用作鑒定減慢或抑制冠狀病毒復(fù)制的抗病毒物質(zhì)的測定方法。
Cornelis，et al的工作證實能重組改造冠狀病毒，使其表達外源基因，而不嚴重影響病毒復(fù)制。Cornelis，et al.，J.Virol.(2003)77(21)11312-11323，在此將全文引入作為參考。這項研究的結(jié)果表明外源基因在病毒基因組中的位置可能影響重組病毒載體的病毒復(fù)制。特別是Cornelis和他的同事觀察到當(dāng)外源基因被插入到靠近病毒基因組的3′端時，外源基因的表達水平增加。因此，在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中也將熒光蛋白編碼序列安置在朝(toward)病毒基因組3′端的位置。
Cornelis和他的同事在他們的研究中使用的是小鼠冠狀病毒模型。本領(lǐng)域已經(jīng)公知這種病毒的序列。至少一種人SARS病毒的突變體已經(jīng)被測序。Marra，M.A.et al.，″The Genome sequence of the SARS-associatedcoronavirus″Science 300(5624)，1399-1404(2003)。以登陸號NC 004718公眾可以獲得該序列。在這里，表1中的SEQ ID NOXX提供了這種SARS突變體的基因組序列。
表1
(SEQ ID NOXX)1 atattaggtt tttacctacc caggaaaagc caaccaacct cgatctcttg tagatctgtt61 ctctaaacga actttaaaat ctgtgtagct gtcgctcggc tgcatgccta gtgcacctac121 gcagtataaa caataataaa ttttactgtc gttgacaaga aacgagtaac tcgtccctct181 tctgcagact gcttacggtt tcgtccgtgt tgcagtcgat catcagcata cctaggtttc241 gtccgggtgt gaccgaaagg taagatggag agccttgttc ttggtgtcaa cgagaaaaca301 cacgtccaac tcagtttgcc tgtccttcag gttagagacg tgctagtgcg tggcttcggg361 gactctgtgg aagaggccct atcggaggca cgtgaacacc tcaaaaatgg cacttgtggt421 ctagtagagc tggaaaaagg cgtactgccc cagcttgaac agccctatgt gttcattaaa481 cgttctgatg ccttaagcac caatcacggc cacaaggtcg ttgagctggt tgcagaaatg541 gacggcattc agtacggtcg tagcggtata acactgggag tactcgtgcc acatgtgggc601 gaaaccccaa ttgcataccg caatgttctt cttcgtaaga acggtaataa gggagccggt661 ggtcatagct atggcatcga tctaaagtct tatgacttag gtgacgagct tggcactgat721 cccattgaag attatgaaca aaactggaac actaagcatg gcagtggtgc actccgtgaa781 ctcactcgtg agctcaatgg aggtgcagtc actcgctatg tcgacaacaa tttctgtggc841 ccagatgggt accctcttga ttgcatcaaa gattttctcg cacgcgcggg caagtcaatg901 tgcactcttt ccgaacaact tgattacatc gagtcgaaga gaggtgtcta ctgctgccgt961 gaccatgagc atgaaattgc ctggttcact gagcgctctg ataagagcta cgagcaccag1021 acacccttcg aaattaagag tgccaagaaa tttgacactt tcaaagggga atgcccaaag1081 tttgtgtttc ctcttaactc aaaagtcaaa gtcattcaac cacgtgttga aaagaaaaag1141 actgagggtt tcatggggcg tatacgctct gtgtaccctg ttgcatctcc acaggagtgt1201 aacaatatgc acttgtctac cttgatgaaa tgtaatcatt gcgatgaagt ttcatggcag1261 acgtgcgact ttctgaaagc cacttgtgaa cattgtggca ctgaaaattt agttattgaa1321 ggacctacta catgtgggta cctacctact aatgctgtag tgaaaatgcc atgtcctgcc1381 tgtcaagacc cagagattgg acctgagcat agtgttgcag attatcacaa ccactcaaac1441 attgaaactc gactccgcaa gggaggtagg actagatgtt ttggaggctg tgtgtttgcc1501 tatgttggct gctataataa gcgtgcctac tgggttcctc gtgctagtgc tgatattggc1561 tcaggccata ctggcattac tggtgacaat gtggagacct tgaatgagga tctccttgag1621 atactgagtc gtgaacgtgt taacattaac attgttggcg attttcattt gaatgaagag1681 gttgccatca ttttggcatc tttctctgct tctacaagtg cctttattga cactataaag1741 agtcttgatt acaagtcttt caaaaccatt gttgagtcct gcggtaacta taaagttacc1801 aagggaaagc ccgtaaaagg tgcttggaac attggacaac agagatcagt tttaacacca1861 ctgtgtggtt ttccctcaca ggctgctggt gttatcagat caatttttgc gcgcacactt1921 gatgcagcaa accactcaat tcctgatttg caaagagcag ctgtcaccat acttgatggt1981 atttctgaac agtcattacg tcttgtcgac gccatggttt atacttcaga cctgctcacc2041 aacagtgtca ttattatggc atatgtaact ggtggtcttg tacaacagac ttctcagtgg2101 ttgtctaatc ttttgggcac tactgttgaa aaactcaggc ctatctttga atggattgag2161 gcgaaactta gtgcaggagt tgaatttctc aaggatgctt gggagattct caaatttctc2221 attacaggtg tttttgacat cgtcaagggt caaatacagg ttgcttcaga taacatcaag2281 gattgtgtaa aatgcttcat tgatgttgtt aacaaggcac tcgaaatgtg cattgatcaa2341 gtcactatcg ctggcgcaaa gttgcgatca ctcaacttag gtgaagtctt catcgctcaa2401 agcaagggac tttaccgtca gtgtatacgt ggcaaggagc agctgcaact actcatgcct2461 cttaaggcac caaaagaagt aacctttctt gaaggtgatt cacatgacac agtacttacc2521 tctgaggagg ttgttctcaa gaacggtgaa ctcgaagcac tcgagacgcc cgttgatagc2581 ttcacaaatg gagctatcgt tggcacacca gtctgtgtaa atggcctcat gctcttagag2641 attaaggaca aagaacaata ctgcgcattg tctcctggtt tactggctac aaacaatgtc2701 tttcgcttaa aagggggtgc accaattaaa ggtgtaacct ttggagaaga tactgtttgg2761 gaagttcaag gttacaagaa tgtgagaatc acatttgagc ttgatgaacg tgttgacaaa2821 gtgcttaatg aaaagtgctc tgtctacact gttgaatccg gtaccgaagt tactgagttt2881 gcatgtgttg tagcagaggc tgttgtgaag actttacaac cagtttctga tctccttacc2941 aacatgggta ttgatcttga tgagtggagt gtagctacat tctacttatt tgatgatgct3001 ggtgaagaaa acttttcatc acgtatgtat tgttcctttt accctccaga tgaggaagaa3061 gaggacgatg cagagtgtga ggaagaagaa attgatgaaa cctgtgaaca tgagtacggt3121 acagaggatg attatcaagg tctccctctg gaatttggtg cctcagctga aacagttcga3181 gttgaggaag aagaagagga agactggctg gatgatacta ctgagcaatc agagattgag3241 ccagaaccag aacctacacc tgaagaacca gttaatcagt ttactggtta tttaaaactt3301 actgacaatg ttgccattaa atgtgttgac atcgttaagg aggcacaaag tgctaatcct3361 atggtgattg taaatgctgc taacatacac ctgaaacatg gtggtggtgt agcaggtgca3421 ctcaacaagg caaccaatgg tgccatgcaa aaggagagtg atgattacat taagctaaat3481 ggccctctta cagtaggagg gtcttgtttg ctttctggac ataatcttgc taagaagtgt3541 ctgcatgttg ttggacctaa cctaaatgca ggtgaggaca tccagcttct taaggcagca3601 tatgaaaatt tcaattcaca ggacatctta cttgcaccat tgttgtcagc aggcatattt3661 ggtgctaaac cacttcagtc tttacaagtg tgcgtgcaga cggttcgtac acaggtttat3721 attgcagtca atgacaaagc tctttatgag caggttgtca tggattatct tgataacctg3781 aagcctagag tggaagcacc taaacaagag gagccaccaa acacagaaga ttccaaaact
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模型公開的發(fā)明中使用了經(jīng)改造表達標(biāo)記物，例如熒光蛋白的重組冠狀病毒。通過用上述重組冠狀病毒感染模型生物體，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能利用重組病毒來研究宿主動物體內(nèi)病毒復(fù)制的進展。而且這種重組冠狀病毒模型系統(tǒng)可以作為鑒定減慢或抑制冠狀病毒復(fù)制的抗病毒物質(zhì)的測定方法。
本發(fā)明的各方面使用的標(biāo)記物都是熒光蛋白。這一類中編碼種子(seminal)蛋白的天然基因一綠色熒光蛋白(GFP)是從生物發(fā)光水母Aequoreavictoria中克隆得到的(Morin，J.，etal.，J.CellPhysiol(1972)77313-318)。這個基因的可得性使利用GFP作為基因表達標(biāo)志物成為可能。原始GFP本身是分子量為27kD的、283個氨基酸的蛋白質(zhì)。它不需要來自其天然來源的其他蛋白質(zhì)，也不需要僅可得自天然來源中的底物或輔助因子就能發(fā)出熒光(Prasher，D.C.，et al.，Gene(1992)111229-233；Yang，F(xiàn).，et al.，NatureBiotechnol(1996)141252-1256；Cody，C.W.，et al.，Biochemistry(1993)321212-1218.)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)原始GFP的突變體在增強表達，改進激發(fā)和熒光方面有用，因此已經(jīng)獲得各種顏色，包括紅色和藍色的“GFP”。GFP-S65T(其中65位的絲氨酸被蘇氨酸替代)在本發(fā)明的方法中特別有用，它具有490nm處的單一激發(fā)蜂。(Heim，R.，et al，Nature(1995)373663-664)；美國專利5,625,048。Delagrade，S.，et al，Biotechnology(1995)13151-154；Cormack，B.，et al.，Gene(1996)17333-38和Cramer，A.，et al，NatureBiotechnol(1996)14315-319中也公開了其他的突變體。美國專利5,625,048中也公開了另外的突變體。通過適當(dāng)?shù)男揎椏梢愿淖僄FP發(fā)射光的光譜。因此雖然在本申請中經(jīng)常使用術(shù)語“GFP”，但該定義中所包含的蛋白質(zhì)的外觀表現(xiàn)不一定是綠色的。多種形式也包括在“GFP”這一定義中的GFP顯示出綠色以外的顏色，這些GFP在本發(fā)明的方法和材料中是有用的。另外，已經(jīng)公知可從其他生物體，例如sea pansy，Renilla reniformis中分離出屬于“GFP”這一定義的綠色熒光蛋白。可以用任何方便合適形式的天然和突變GFP來修飾本發(fā)明中有用的感染性病原體。
為了避免引起混淆，我們將使用“熒光蛋白”這一簡單的術(shù)語；一般而言，它指各種生物體，例如Renilla和Aequorea產(chǎn)生的熒光蛋白，以及這些天然熒光蛋白的修的飾形式，其能發(fā)出各種可見顏色熒光如紅色，黃色，鈷熒光，分別稱為紅色熒光蛋白(RFP)，黃色熒光蛋白(YFP)和鈷熒光蛋白(CFP)。一般情況下術(shù)語“熒光蛋白”，“GFP”或“RFp”可以互換使用。
因為熒光蛋白有多種顏色，因此可同時進行一種以上單一顏色的顯像。例如可以給生物體施用分別表達特征性熒光的兩種不同的感染性病原體或三種不同的感染性病原體，評價所建議治療的差異性效果。另外，單個感染性病原體可以用一種顏色以及另一種不同顏色組成型標(biāo)記，以產(chǎn)生與細胞內(nèi)或分泌的基因產(chǎn)物的融合物。因此可以將編碼熒光蛋白的核苷酸序列插入待研究的基因座中，或作為與待研究蛋白的融合蛋白插入載體中，其中所述熒光蛋白的顏色與用于標(biāo)記生物體本身的熒光蛋白的顏色不同。將利用雙色顯像來顯現(xiàn)模型中病毒對具體位置諸如肺的靶向作用。而且可以用單一的顏色分別標(biāo)記一種或多種感染性病原體，用另一種顏色標(biāo)記目的基因，用第三種顏色標(biāo)記宿主模型組織。例如，將通過全身顯像來顯現(xiàn)表達熒光的冠狀病毒模型中的病毒復(fù)制。
本發(fā)明公開的方法可用于監(jiān)測上述重組冠狀病毒的復(fù)制以及各種抗病毒物質(zhì)諸如化學(xué)治療藥物和抗病毒疫苗對冠狀病毒復(fù)制的影響。
本發(fā)明的方法中使用了經(jīng)修飾以表達編碼熒光蛋白的核苷酸序列的感染性病原體，其中優(yōu)選所述熒光蛋白的熒光強度足夠強，這樣不需要任何侵入性技術(shù)就能夠看見受試者體內(nèi)的熒光。因為能實現(xiàn)實時觀察，所以優(yōu)選全身顯像。例如也可以使用內(nèi)鏡技術(shù)，如果需要也可以切除組織或器官直接觀察或進行組織化學(xué)觀察。
可以通過直接修飾的方式將編碼熒光蛋白的核苷酸序列引入到感染性病原體中，例如可修飾病毒基因組使熒光蛋白編碼序列位于病毒內(nèi)源控制序列控制之下的合適位置，或者利用合適的表達載體將其導(dǎo)入微生物系統(tǒng)中。
接下來給受試者施用合適的經(jīng)修飾的感染性病原體，如果需要，可模擬病原體的感染路徑來施用該病原體，或者采用任意路徑來施用該病原體。可以通過注射，管飼法，口服，氣溶膠吸入到呼吸系統(tǒng)，栓劑，與黏膜表面接觸或本領(lǐng)域公知的任何合適的導(dǎo)入感染性病原體的方式來施用。
雖然可以使用內(nèi)窺鏡，也可以切除個體組織，但通過熒光顯像來觀察完整動物體內(nèi)感染性病原體的遷移和被感染的細胞特別方便。這種方法允許實時觀察，特別是在模型系統(tǒng)中評價潛在的抗感染藥物和實驗設(shè)計時，能夠在連續(xù)的基礎(chǔ)上監(jiān)測感染的進展。因此，與未接受藥物或?qū)嶒炘O(shè)計的對照組相比，在接受了待測藥物或?qū)嶒炘O(shè)計的受試動物體內(nèi)直接觀察到對感染的抑制表明了候選藥物的有效性和用于治療的潛能。在接受感染治療的受試者中，實施熒光顯像允許以連續(xù)方式將修改或不修改實驗設(shè)計的合理性告知那些治療計劃的設(shè)計者。在一個實施例中，為了篩選有效抗病毒藥劑，將表達熒光標(biāo)記的病毒蛋白的重組冠狀病毒注射到小鼠模型中來追蹤病毒復(fù)制。病毒感染位點發(fā)出強熒光，用帶有CCD相機和GFP濾光片的燈箱(light box)中的藍光激發(fā)后很容易看見。
可以作為模型使用的合適的脊椎動物受試者優(yōu)選哺乳動物受試者，最優(yōu)選方便的實驗室動物，如兔子，大鼠，小鼠等等。為了與人類受試者更相似，也可以使用靈長類動物?？梢允褂萌魏魏线m的脊椎受試動物，選擇哪種脊椎動物主要依據(jù)便利性和與最終目的系統(tǒng)的相似性。最終，脊椎動物受試者可以是人。
下面的實施例用來例證說明本發(fā)明，而不限制本發(fā)明。
實施例1A.背景描述了腫瘤-宿主相互作用的雙色熒光顯像模型，該模型基于生長在GFP轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)并表達RFP的腫瘤，使得腫瘤-間質(zhì)相互作用的雙色顯現(xiàn)稱為可能，所述腫瘤-間質(zhì)相互作用包括腫瘤血管生成和腫瘤中淋巴細胞的浸潤。利用在雞β-肌動蛋白啟動子和巨細胞病毒增強子控制下表達GFP的轉(zhuǎn)基因小鼠作為宿主(Okabe，M.，et al.，F(xiàn)EBS Lett(1997)407315-319)。在藍色激發(fā)光下，這種轉(zhuǎn)基因系的所有組織都發(fā)出綠色熒光。可用pLNCX2-DsRed-2-RFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)表達RFP的小鼠黑色素細胞B16F0(B16F0-RFP)。B16F0-RFP腫瘤和表達GFP的宿主細胞可同時清晰顯像。高分辨率的雙色顯像能分辨腫瘤細胞，宿主組織至單細胞水平。包括成纖維細胞，腫瘤浸潤型淋巴細胞，樹突狀細胞，表達GFP的血管和毛細血管的宿主細胞與表達RFP的腫瘤細胞很容易相區(qū)別。這種雙色熒光顯像系統(tǒng)應(yīng)該能促進為了理解腫瘤生長和腫瘤血管發(fā)生中，腫瘤和宿主的相互作用而進行的研究。雙色嵌和系統(tǒng)也提供了一種為了治療和診斷/分析目的，分析和分離腫瘤浸潤型淋巴細胞和其他與腫瘤作用的宿主基質(zhì)細胞的強有力的工具。在本發(fā)明的雙色可顯像RFP-MHV-GFP宿主感染模型中利用了這種模型原理。
B.方法病毒和細胞接下來是de Haan，et al.，Virol.(2002)296177-189中的方法。使用了MHV-A59溫度敏感(ts)突變株LA16，噬斑克隆的(plaque-cloned)MHV-JHM和不稀釋傳代培養(yǎng)原始噬斑克隆的(plaque-cloned)MHV-JHM(JHM19th)19代獲得的病毒樣品。用小鼠DBT細胞來進行RNA轉(zhuǎn)染和病毒繁殖。
接下來的部分是Kim，K.H.，J.ViroL(1995)692313-2321中的方法。
病毒特異性細胞內(nèi)RNA的制備和Northern(RNA)印跡從被病毒感染的細胞中提取病毒特異性的RNAs。將1.5mg細胞內(nèi)RNA變性，用含有甲醛的1％的瓊脂糖凝膠進行電泳。分離的RNA被吸附轉(zhuǎn)移到尼龍濾膜上。將濾膜上的RNA與對MHV RNA多個區(qū)域特異的32P標(biāo)記的探針雜交。
RNA轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)染用XbaI消化使質(zhì)粒線性化，在體外用T7RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄。用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法進行RNA轉(zhuǎn)染。
分離含有DIssA特異性序列的克隆為了擴增DIssA相關(guān)的亞基因組RNA，首先利用寡核苷酸1116(5′-CTGAAACTCTTTTCCCT-3′)(SEQ IDNOXX)作為引物，從細胞內(nèi)RNA合成cDNA，所述寡核苷酸1116在mRNA7的5′端的250-267位核苷酸處與正鏈MHV mRNA 7相結(jié)合。接著將MHV特異性cDNA與能結(jié)合MHV RNA反前導(dǎo)序列的寡核苷酸78(5′-AGCTTTACGTACCCTCTCTACTATAAAACTCTTGTAGTTT-3′)(SEQID NOXX)，在PCR緩沖液(0.05M KCI，0.01M Tris鹽酸[pH 8.3]，0.0025MMgCI2，0.01％明膠，三磷酸脫氧核糖核苷各0.17mM，5U Taq聚合酶[Promega])中，在93.8℃、30s，37.8℃、45s，72.8℃、100s的條件下保溫25個循環(huán)。利用瓊脂糖凝膠電泳分離出DIssA亞基因組RNA，并將其與探針雜交，其中探針來自MHV基因組RNA 3′端的1.5-1.7kb一致。這種探針能夠與所有MHV mRNAs雜交。從凝膠中洗脫DIssA亞基因組RNA特異性RT-PCR產(chǎn)物，并將其克隆到TA克隆載體(Invitrogen)中。利用用于Southern印跡分析的探針，通過菌落雜交分離出含有DIssA特異性序列的克隆。為了擴增DIssA RNA，首先利用寡核苷酸1116作為引物，從凝膠純化的DIssA RNA合成cDNA。接著在上述的PCR條件下，將DIssA特異性cDNA與寡核苷酸10121(5′-GAAGGGTTGTATGTGTTG-3′)(SEQ ID NOXX)在PCR緩沖液中一起保溫，所述寡核苷酸10121能在基因2的5′端的核苷酸798-815處與負鏈MHV RNA結(jié)合。從制備型凝膠中洗脫DIssA特異性RT-PCR產(chǎn)物，并將其克隆到TA克隆載體中。利用在MHV基因2-1處雜交的探針，通過菌落雜交分離出含有DIssA特異性序列的克隆。
構(gòu)建與RFP相連的小鼠肝炎全長cDNADIssA是天然存在的自我復(fù)制型DI RNA，具有接近上述完整MHV基因1和基因7。我們將在細菌人工染色體(BAC)pBeloBACII中側(cè)接MHV cDNA的基因1和基因7，以及RFP基因，在其5′端是CMV早期立即啟動子，3′端連接poly(A)尾，并依次緊跟著肝炎δ病毒核酶，牛GH終點和多腺苷酸化序列pBAC-MHV-RFP(參見Almazan，F(xiàn).，et al.，PNAS(2000)975516-5521)。
轉(zhuǎn)染和從cDNA克隆中收集感染性病毒在這個過程中使用了Almazan，F(xiàn).，et al.，PNAS(2000)975516-5521中的方法。小鼠DBT細胞用pBAC-MHV-RFP轉(zhuǎn)染。保溫兩天后，收集細胞上清液并在新鮮DBT細胞上傳代六次。通過噬斑效價(plaque tritation)和RT-PCR來分析細胞上清液中存在的病毒。
RFP表達載體(參見，Yang，M.，Proc.NatL Acad.Sci.USA(2002)993824-3829)。從CLONTECH Laboratories，Inc.(Palo Alto，CA)購買pLNCX2載體。pLNCX2載體含有新霉素抗性基因，在真核細胞中可進行抗生素選擇。在Egl II和Not I位點將紅色熒光蛋白(RFP)(DsRed2，CLONTECH Laboratories，Inc.，Palo Alto，CA)插入到pLNCX2載體中。
RFP載體制備(參見，Yang，M.，Proc.Nail.Acad.Sci.USA(2002)993824-3829)。為了進行逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)，從CLONTECH Laboratories購買了NIH3T3衍生的包裝細胞系PT67，其表達10 Al病毒被膜。在補充了10％熱滅活胎牛血清(FBS)(Gemini Bio-products，Calabasas，CA)的DME(IrvineScientific，Santa Ana，CA)中培養(yǎng)PT67細胞。為了制備載體，將70％滿底的包裝細胞(PT67)與DOTAPTM試劑(Boehringer Mannheim)的沉淀混合物，飽和量的pLEIN-GFP或pLNCX2-DsRed-2-RFP質(zhì)粒一起保溫18小時。此時補充新鮮培養(yǎng)基。在轉(zhuǎn)染后48小時用熒光顯微鏡觀察細胞。為進行選擇，在500μg/ml-2000μg/ml的濃度漸增的G418存在的條件下培養(yǎng)細胞7天。
病毒-宿主相互作用的雙色顯像用重組冠狀病毒感染GFP轉(zhuǎn)基因小鼠后，將新鮮組織切成～1mm3的片。觀察前，用胰蛋白酶/EDTA 37℃消化組織10分鐘。用胰蛋白酶消化后，將組織放在預(yù)先洗干凈的載玻片(FisherScientific，Pittsburgh，PA)上，蓋上蓋玻片(Fisher Scientific)。通過推蓋玻片來擠壓組織，使其變得足夠薄，從而能在載玻片上顯示完整的脈管系統(tǒng)。在熒光顯微鏡下很容易觀察到被冠狀病毒感染的發(fā)出GFP熒光的宿主細胞?？梢杂没诩す獾南到y(tǒng)對嵌和系統(tǒng)進行全身雙色顯像(whole-bodydual-color imaging)(見下文)。采用標(biāo)準(zhǔn)的免疫組織化學(xué)技術(shù)鑒定被RFP-MHV感染的所有宿主細胞類型可以證實所有的熒光結(jié)果。
熒光顯像(參見，Yang，M.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2002)993824-3829)。利用配備50W汞燈能量供應(yīng)的Leica熒光立體顯微鏡LZ12型來進行開始的低分辨率顯像。為了使GFP和RFP熒光同時顯像，用D425/60A帶通濾波器和470DCXR分色鏡來產(chǎn)生激發(fā)光。用長通濾波器(long pass filter)GG475(Chroma Technology，Brattleboro，VT)收集發(fā)射的熒光。在燈箱(light box)(Lightools Research，Encinitas，CA)中進行宏觀顯像。通過使用狹縫纖維光學(xué)的干涉濾光片(440+/-20nm)，在燈箱中激發(fā)GFP和RFP腫瘤發(fā)熒光。用520nm長通濾波器(long pass filter)觀察熒光。來自顯微鏡和燈箱的圖像用Hamamatsu C58103-芯片冷色(cool color)CCR相機(Hamamatsu Photonics Systems，Bridgewater，NJ)捕獲。可以用SpectralPhysics模型3941-M1BB雙重光子激光，Photon Technology Intl.模型GL-3300氮激光和Photon Technology Intl.模型GL-302染料激光來進行基于激光的顯像。處理圖像的對比度和亮度，用Image Pro Plus 4.0軟件(MediaCybernetics，Silver Springs，Maryland)分析圖像。直接將1024×724像素的高分辨率圖像捕獲在IBM PC上，或連續(xù)通過圖像輸出捕獲在高分辨率SonyVCR模型SLV-R1000(Sony Corp.，Tokyo Japan)上。
多光子共聚焦顯微鏡(Wang，W.，etal.，Cancer Research(2002)6278-6288)。也可以在GFP熒光的最佳波長960nm，和Radiance 2000多光子系統(tǒng)(Bio-Rad，Hercules，CA)一起使用雙重光子激光(Spectra-Physics model3941-M1BB)。用Bio-Rad′s Lasersharp 2000軟件收集圖像。激發(fā)僅限于被觀察的光學(xué)切面。熒光基團的激發(fā)不出現(xiàn)在非焦點平面的960nm波長處。Spectral Physics模型3941-M1BB雙重光子激光儀的輔助裝置——Millenia，Tsunami TiSapphire激光儀具有長波長光學(xué)(超過1,000nm)用于RFP多光子顯像。用Image Pro Plus 4.0軟件處理圖像。
光譜分辨率光譜顯像是指產(chǎn)生每一個像素中都含有高分辨率光譜的圖像，它“不混雜”病毒的RFP信號與GFP標(biāo)記的宿主的信號。用冷單色(cooled monochrome)相機(Roper Scientific CCD thermo-cooled數(shù)字照相機)和位于常規(guī)低倍鏡頭前的液晶可調(diào)濾波器(CRI，Inc.，Woburn，MA)替代通常的彩色照相機可改良標(biāo)準(zhǔn)的GFP小鼠顯像系統(tǒng)(長通發(fā)射濾波器)。通常，在500-650mm的范圍內(nèi)每10nm獲取一系列圖像，并將圖像在內(nèi)存中自動組合成光譜“堆”。利用預(yù)先確定的GFP或RFP以及自體熒光光譜，通過基于線性組合化學(xué)計量學(xué)的算法，可以將圖像分解成不同的圖像，得到只包含自體熒光信號或只包含GFP或RFP信號、在基本呈黑色的背景下可見的圖像。應(yīng)用光譜自體熒光消減，靈敏度由于信噪比的改進而增強。GFP或RFP標(biāo)記的腫瘤模型所提供的優(yōu)點，可通過使用波長選擇性顯像技術(shù)和對深部器官諸如肺的腫瘤的圖像的分析(個人交流，Richard Levenson，CRI，Inc.，Woburn，MA)能進一步增強，其中所述腫瘤模型允許非侵入性、高選擇性顯像。
顯像的深度本申請的一個目標(biāo)就是在外部顯現(xiàn)單個細胞或內(nèi)部器官的病毒感染的細胞的顯微集落。這種功率(power)的顯像需要減少激發(fā)光和發(fā)射光的散射。用多光子或單光子激光在活體動物內(nèi)可穿透更深。也可以和多光子激光一起聯(lián)合使用共聚焦顯微鏡。大約為470nm的相對較長的激發(fā)光波長(GFP雙光子為960nm和RFP雙光子為大約1,220nm)不會損傷組織。多光子共聚焦系統(tǒng)將大大限制輻照區(qū)域，進一步保護宿主組織。皮瓣也能大大減少散射，而我們已經(jīng)顯示其能夠進行外部單細胞顯像。用長波長Ds-Red-2-RFP也能減少散射。
C.結(jié)果利用多種藥物方案對感染小鼠進行治療，在存在和不存在藥物時，對病毒復(fù)制進行評價。能夠成功減少病毒復(fù)制的藥物被鑒定為可作為成功的候選治療物質(zhì)。
類似地，接受待測試免疫程序的小鼠在免疫后用感染水平的MHV冠狀病毒攻擊。然后評價暴露于病毒后受試者抵抗感染的能力。
權(quán)利要求
1.標(biāo)記的冠狀病毒蛋白或其片段，其與熒光蛋白偶聯(lián)。
2.權(quán)利要求1所述的標(biāo)記的冠狀病毒蛋白，其中所述蛋白是結(jié)構(gòu)蛋白或非結(jié)構(gòu)蛋白。
3.權(quán)利要求2所述的標(biāo)記的冠狀病毒蛋白，其中所述結(jié)構(gòu)蛋白選自核衣殼磷蛋白，棘突糖蛋白，膜糖蛋白，小被膜蛋白或血凝素-酯酶糖蛋白組成的組。
4.權(quán)利要求2所述的標(biāo)記的冠狀病毒蛋白，其中所述結(jié)構(gòu)蛋白是SARS棘突糖蛋白(SEQ ID NO)。
5.權(quán)利要求2所述的標(biāo)記的冠狀病毒蛋白，其中所述結(jié)構(gòu)蛋白是SARS小被膜蛋白(SEQ ID NO)。
6.權(quán)利要求2所述的標(biāo)記的冠狀病毒蛋白，其中所述結(jié)構(gòu)蛋白是SARS基質(zhì)蛋白(SEQ ID NO)。
7.權(quán)利要求1所述的標(biāo)記的冠狀病毒蛋白，其中所述熒光蛋白是綠色或紅色蛋白。
8.感染的可顯像動物模型，包含編碼權(quán)利要求1-7任一項所述標(biāo)記的冠狀病毒蛋白的冠狀病毒。
9.權(quán)利要求8所述的可顯像動物模型，其是熒光蛋白表達型宿主。
10.權(quán)利要求9所述的可顯像動物模型，其中所述動物模型包括表達綠色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠。
11.一種篩選抗病毒藥物的方法，包括提供實驗組動物和對照組動物，其中每一組的動物包含權(quán)利要求8-10任一項所述的動物模型；對實驗組施用候選抗病毒藥物；監(jiān)測實驗組和對照組產(chǎn)生的熒光發(fā)射；將實驗組產(chǎn)生的熒光發(fā)射與對照組進行比較；以及選擇能減少實驗組中的熒光的候選抗病毒藥物，所述減少是相對于對照組的減少。
12.一種篩選有效的抗病毒疫苗的方法，包括提供實驗組和對照組動物，其中每一組的動物包含權(quán)利要求8-10任一項所述的動物模型；對實驗組施用候選抗病毒疫苗；監(jiān)測實驗組和對照組產(chǎn)生的熒光發(fā)射；將實驗組產(chǎn)生的熒光發(fā)射與對照組進行比較；以及，選擇能減少實驗組中的熒光的候選抗病毒疫苗，所述減少是相對于對照組的減少。
全文摘要
本發(fā)明描述了冠狀病毒感染的可顯像動物模型。
文檔編號C07H21/04GK1829732SQ200480021811
公開日2006年9月6日 申請日期2004年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月27日
發(fā)明者楊萌, 徐明旭 申請人:抗癌公司