專利名稱：：乳腺癌移植瘤自發(fā)轉(zhuǎn)移模型及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體是一種乳腺癌移植瘤自發(fā)轉(zhuǎn)移模型及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：人類疾病的動(dòng)物模型是生物醫(yī)學(xué)科學(xué)研究中所建立的具有人類疾病模擬性表現(xiàn)的動(dòng)物疾病材料。惡性腫瘤是一類嚴(yán)重威脅人類健康的多發(fā)病和常見病，其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，治療效果亦不盡人意。而腫瘤模型，作為實(shí)驗(yàn)假說和臨床假說的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，可為研究惡性腫瘤的病因?qū)W、發(fā)展過程和治療提供特有的條件。乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，而轉(zhuǎn)移是乳腺癌患者死亡的主要原因。乳腺癌轉(zhuǎn)移模型是篩選乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因、探討腫瘤轉(zhuǎn)移分子機(jī)制和評(píng)價(jià)抑制轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)性治療療效的重要工具。乳腺癌轉(zhuǎn)移模型主要包括自發(fā)性轉(zhuǎn)移模型、誘發(fā)性轉(zhuǎn)移模型、轉(zhuǎn)基因治療轉(zhuǎn)移模型和移植性轉(zhuǎn)移模型。移植性轉(zhuǎn)移模型以其操作簡單，重復(fù)性好和生物學(xué)性穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)應(yīng)用最為廣泛。乳腺癌移植性模型按建立方法可分為實(shí)驗(yàn)性轉(zhuǎn)移模型和自發(fā)性轉(zhuǎn)移模型。今年來對移植轉(zhuǎn)移模型轉(zhuǎn)移灶的檢測有了較大進(jìn)展，采用活體動(dòng)物成像技術(shù)不但能在腫瘤發(fā)生早期探測到各組織器官內(nèi)的微小轉(zhuǎn)移灶，還可以動(dòng)態(tài)檢測腫瘤細(xì)胞在動(dòng)物體內(nèi)的轉(zhuǎn)移狀態(tài)。活體動(dòng)物體內(nèi)光學(xué)成像(OpticalinvivoImaging)主要采用生物發(fā)光(bioluminescence)與熒光(fluorescence)兩種技術(shù)。生物發(fā)光是用熒光素酶(Luciferase)基因標(biāo)記細(xì)胞或DNA，而熒光技術(shù)則采用熒光報(bào)告基團(tuán)(GFP、RFP，Cyt及dyes等)進(jìn)行標(biāo)記。利用一套非常靈敏的光學(xué)檢測儀器，讓研究人員能夠直接監(jiān)控活體生物體內(nèi)的細(xì)胞活動(dòng)和基因行為。通過這個(gè)系統(tǒng)，可以觀測活體動(dòng)物體內(nèi)腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移、感染性疾病發(fā)展過程、特定基因的表達(dá)等生物學(xué)過程。傳統(tǒng)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法需要在不同的時(shí)間點(diǎn)宰殺實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以獲得數(shù)據(jù)，得到多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。相比之下，可見光體內(nèi)成像通過對同一組實(shí)驗(yàn)對象在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行記錄，跟蹤同一觀察目標(biāo)(標(biāo)記細(xì)胞及基因)的移動(dòng)及變化，所得的數(shù)據(jù)更加真實(shí)可信。另外，這一技術(shù)對腫瘤微小轉(zhuǎn)移灶的檢測靈敏度極高，不涉及放射性物質(zhì)和方法，非常安全。因其操作極其簡單、所得結(jié)果直觀、靈敏度高等特點(diǎn)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明是為了解決抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物的篩選問題，而提供一種乳腺癌移植瘤自發(fā)轉(zhuǎn)移模型及其應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案如下—種乳腺癌移植瘤自發(fā)轉(zhuǎn)移模型，該模型為自發(fā)轉(zhuǎn)移的乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231亞株，含有表達(dá)熒光報(bào)告基團(tuán)的紅色熒光蛋白。所述乳腺癌移植瘤自發(fā)轉(zhuǎn)移模型的制備方法，是按以下步驟制備的a.將表達(dá)熒光報(bào)告基團(tuán)的紅色熒光蛋白的乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231移植到nod/3SCID小鼠體內(nèi)；b.應(yīng)用活體動(dòng)物體內(nèi)光學(xué)成像系統(tǒng)檢測小鼠體內(nèi)紅色熒光信號(hào)，判斷原位移植瘤及轉(zhuǎn)移瘤形成情況；c.摘除待評(píng)估的組織，進(jìn)行病理檢測，驗(yàn)證轉(zhuǎn)移瘤的形成；d.從組織中分離出轉(zhuǎn)移灶，體外克隆自發(fā)轉(zhuǎn)移瘤株細(xì)胞。所述乳腺癌移植瘤自發(fā)轉(zhuǎn)移模型在篩選抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物中的應(yīng)用。所述乳腺癌移植瘤自發(fā)轉(zhuǎn)移模型篩選抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物的方法，a.將表達(dá)紅色熒光蛋白的自發(fā)轉(zhuǎn)移的乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231亞株移植到nod/SCID小鼠體內(nèi)；b.將候選藥物及空白藥物對照分別施用于上述小鼠中；c.應(yīng)用活體動(dòng)物體內(nèi)光學(xué)成像系統(tǒng)檢測小鼠體內(nèi)紅色熒光蛋白的熒光信號(hào)，判斷施藥組和對照組原位移植瘤及轉(zhuǎn)移瘤的形成情況的差異；d.摘除施藥組和對照組待評(píng)估的組織，進(jìn)行病理檢測，驗(yàn)證轉(zhuǎn)移瘤的形成差異。這樣設(shè)計(jì)的本發(fā)明，是將活體動(dòng)物體內(nèi)光學(xué)成像系統(tǒng)及小鼠乳腺癌移植瘤自發(fā)轉(zhuǎn)移模型聯(lián)合應(yīng)用，為開發(fā)新的抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物提供一種有效、可行的技術(shù)方法，圖1小鼠乳腺癌移植瘤自發(fā)轉(zhuǎn)移模型；圖2癌立息(Avolix)抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說明。實(shí)施例1:小鼠乳腺癌移植瘤自發(fā)轉(zhuǎn)移模型的建立—、材料和方法1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物nod/SCID小鼠購自北京維通利華公司，鼠齡為46周，雌性。飼養(yǎng)條件在恒溫(2528°C)恒濕(45%50%)，SPF條件免疫缺陷動(dòng)物室內(nèi)?；\具、墊料，飲水和食料均經(jīng)高壓滅菌供動(dòng)物自由攝入。2.人乳腺癌細(xì)胞系表達(dá)紅色熒光蛋白(RFP)的人乳腺癌細(xì)胞系RFP-MDA-MB-231為天津腫瘤醫(yī)院所藏，MDA-MB-231細(xì)胞自行構(gòu)建，常規(guī)傳代培養(yǎng)，收集細(xì)胞，接種于nod/SCID鼠乳腺脂肪墊皮下每點(diǎn)1X107個(gè)/0.lml細(xì)胞，生成瘤塊后用于原位種植的瘤源，或者鼠尾靜脈注射1X106個(gè)/ml細(xì)胞。3.應(yīng)用活體動(dòng)物體內(nèi)光學(xué)成像系統(tǒng)(美國精諾真IVIS戀200Series)連續(xù)觀察檢測小鼠體內(nèi)RFP熒光信號(hào)，判斷原位移植瘤及轉(zhuǎn)移瘤的形成情況，摘除待評(píng)估的一個(gè)或多個(gè)組織，進(jìn)行病理檢測，進(jìn)一步驗(yàn)證轉(zhuǎn)移瘤的形成。4.移植傳代從組織中分離出轉(zhuǎn)移灶，體外克隆原代培養(yǎng)高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株。將人乳腺癌細(xì)胞(RFP-MDA-MB-231)肺轉(zhuǎn)移致瘤灶剪碎，紗網(wǎng)研磨成單細(xì)胞，體外37。C培養(yǎng)箱培養(yǎng)。將上述細(xì)胞常規(guī)傳代培養(yǎng)，收集細(xì)胞，再接種于SCID鼠乳腺脂肪墊皮下，每點(diǎn)1X107個(gè)/ml細(xì)胞或者尾靜脈注射1X106個(gè)/ml細(xì)胞。5.應(yīng)用活體動(dòng)物體內(nèi)光學(xué)成像系統(tǒng)(同上)再連續(xù)觀察檢測小鼠體內(nèi)RFP熒光信號(hào)，判斷原位移植瘤及轉(zhuǎn)移瘤的形成情況，摘除待評(píng)估的一個(gè)或多個(gè)組織，進(jìn)行病理檢測，進(jìn)一步驗(yàn)證轉(zhuǎn)移瘤的形成。如此反復(fù)10個(gè)循環(huán)。得到穩(wěn)定的轉(zhuǎn)移瘤株細(xì)胞。6.檢測項(xiàng)目(1)病理學(xué)檢測將摘除待評(píng)估的一個(gè)或多個(gè)組織經(jīng)10%中性甲醛固定，石蠟切片，常規(guī)蘇木素一伊紅(HE)染色，進(jìn)行病理學(xué)觀察腫瘤傳代過程中的轉(zhuǎn)移特點(diǎn)。(2)透射電鏡觀察常規(guī)方法制備標(biāo)本，使用JE0LSC-100電子顯微鏡進(jìn)行透射電鏡觀察，并比較原代與晚代的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化及與轉(zhuǎn)移的關(guān)系特點(diǎn)。(3)DNA倍體分析取移植瘤塊，研磨成單細(xì)胞后乙醇固定12h，PI(Coulter產(chǎn)品)染色后，以人外周血淋巴細(xì)胞做對照，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布，并根據(jù)下列公式計(jì)算出DNA倍體數(shù)。二、結(jié)果1.各代移植瘤生長特性及轉(zhuǎn)移的觀察原代移植瘤的荷瘤小鼠的移植瘤呈圓形或橢圓形，表面多數(shù)無完整的包膜形成，腫瘤周圍毛細(xì)血管豐富，早期質(zhì)地較硬，晚期時(shí)移植瘤中央發(fā)黑，瘤體中心壞死。取其肺轉(zhuǎn)移癌灶，仍以原代移植的方法作傳代、篩選，現(xiàn)已傳至18代。隨著其肺轉(zhuǎn)移灶癌細(xì)胞在SCID鼠體內(nèi)不斷篩選，其移植瘤潛伏期、腫瘤生長周期及肺轉(zhuǎn)移率都在不斷變化。如表1所示，腫瘤移植成功率平均在90%以上，原代的移植瘤平均潛伏期為(20士5)d，8代以后潛伏期逐漸減少為(15士2)d，10代以后為(12士2)d，且趨于穩(wěn)定，見表1。表1各代小鼠移植瘤觀察表<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>2.形態(tài)學(xué)檢查(1)移植瘤形態(tài)學(xué)特征光鏡觀察鏡下可見癌細(xì)胞排列成小條索，小團(tuán)塊狀，在間質(zhì)中呈浸潤性生長，癌細(xì)胞體積大，胞漿豐富，核大深染，核仁清楚，各代無明顯差別。電鏡觀察晚代與原代相比，細(xì)胞核嚴(yán)重變形，可見核仁及深入的核內(nèi)餡，核異染色質(zhì)凝集成團(tuán)，有大型核仁占核面積1/2強(qiáng)，類圓型，核內(nèi)窗孔大部分消失。胞漿細(xì)胞器分布不均一，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)均圓泡化，線粒體數(shù)目少，大小不一，有未成熟小型的線粒體。3.體內(nèi)光學(xué)成像如圖1所示，在小鼠的乳腺原位皮下及肺中均可監(jiān)測到腫瘤細(xì)胞的熒光顯像。實(shí)施例2:應(yīng)用乳腺癌移植瘤自發(fā)轉(zhuǎn)移模型篩選抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物的方法。1.將實(shí)施例1所述表達(dá)RFP的高轉(zhuǎn)移人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231瘤株細(xì)胞，接種于SCID鼠乳腺脂肪墊皮下每點(diǎn)1X107個(gè)/ml細(xì)胞，或者尾靜脈注射。2.接種后3天給予候選的抗腫瘤轉(zhuǎn)移的化合物，并給予空白對照。3.應(yīng)用活體動(dòng)物體內(nèi)光學(xué)成像系統(tǒng)連續(xù)觀察檢測小鼠體內(nèi)RFP熒光信號(hào)，判斷原位移植瘤及轉(zhuǎn)移瘤的形成情況，摘除待評(píng)估的一個(gè)或多個(gè)組織，進(jìn)行病理檢測，進(jìn)一步驗(yàn)證是否存在轉(zhuǎn)移瘤。通過活體成像系統(tǒng)能夠準(zhǔn)確觀察藥物抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用的效果，即小鼠體內(nèi)其他臟器是否有RFP熒光信號(hào)存在。實(shí)施例3:活體動(dòng)物體內(nèi)光學(xué)成像系統(tǒng)監(jiān)測Avolix抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用—、材料和方法1.將實(shí)施例1、2所述表達(dá)RFP的高轉(zhuǎn)移人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231瘤株細(xì)胞，接種于SCID鼠乳腺脂肪墊皮下每點(diǎn)1X107個(gè)/ml細(xì)胞，或者尾靜脈注射。2.接種后3天給予不同配伍組合的癌立息(Avolix)，給藥方案如下第一組癌立息30ng/kg;第二組對照鹽水加DMSO;第三組Avolix30ng/kg加紫杉醇(Taxol)15ng/kg;第四組Taxoll5ng/kg加DMSO;第五組Avolix50ng/kg加Taxol10ng/kg3.應(yīng)用活體動(dòng)物體內(nèi)光學(xué)成像系統(tǒng)(同上)連續(xù)觀察檢測小鼠體內(nèi)RFP熒光信號(hào)，并測量直徑，摘除待評(píng)估的一個(gè)或多個(gè)組織，進(jìn)行病理檢測，進(jìn)一步確證轉(zhuǎn)移瘤的存在。二、結(jié)果如圖2所見，單用癌立息對轉(zhuǎn)移瘤的生長具有明顯的抑制作用，聯(lián)合使用紫杉醇效果更為明顯，說明癌立息能夠明顯地協(xié)同紫杉醇的抑瘤作用。權(quán)利要求一種乳腺癌移植瘤自發(fā)轉(zhuǎn)移模型，其特征在于該模型為自發(fā)轉(zhuǎn)移的乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231亞株，含有表達(dá)熒光報(bào)告基團(tuán)的紅色熒光蛋白。2.權(quán)利要求1所述乳腺癌移植瘤自發(fā)轉(zhuǎn)移模型的制備方法，是按以下步驟制備的a.將表達(dá)熒光報(bào)告基團(tuán)的紅色熒光蛋白的乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231移植到nod/SCID小鼠體內(nèi)；b.應(yīng)用活體動(dòng)物體內(nèi)光學(xué)成像系統(tǒng)檢測小鼠體內(nèi)紅色熒光信號(hào)，判斷原位移植瘤及轉(zhuǎn)移瘤形成情況；c.摘除待評(píng)估的組織，進(jìn)行病理檢測，驗(yàn)證轉(zhuǎn)移瘤的形成；d.從組織中分離出轉(zhuǎn)移灶，體外克隆自發(fā)轉(zhuǎn)移瘤株細(xì)胞。3.權(quán)利要求1所述乳腺癌移植瘤自發(fā)轉(zhuǎn)移模型在篩選抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物中的應(yīng)用。4.權(quán)利要求1所述乳腺癌移植瘤自發(fā)轉(zhuǎn)移模型篩選抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物的方法，其特征在于a.將表達(dá)紅色熒光蛋白的自發(fā)轉(zhuǎn)移的乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231亞株移植到nod/SCID小鼠體內(nèi)；b.將候選藥物及空白藥物對照分別施用于上述小鼠中；c.應(yīng)用活體動(dòng)物體內(nèi)光學(xué)成像系統(tǒng)檢測小鼠體內(nèi)紅色熒光蛋白的熒光信號(hào)，判斷施藥組和對照組原位移植瘤及轉(zhuǎn)移瘤的形成情況的差異；d.摘除施藥組和對照組待評(píng)估的組織，進(jìn)行病理檢測，驗(yàn)證轉(zhuǎn)移瘤的形成差異。全文摘要本發(fā)明公開了一種乳腺癌移植瘤自發(fā)轉(zhuǎn)移模型及其應(yīng)用，屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。該乳腺癌移植瘤自發(fā)轉(zhuǎn)移模型為自發(fā)轉(zhuǎn)移的乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231亞株，其顯著特點(diǎn)為能夠表達(dá)紅色熒光蛋白，注入小鼠體內(nèi)能夠自發(fā)形成轉(zhuǎn)移瘤病灶，利用活體動(dòng)物體內(nèi)光學(xué)成像系統(tǒng)可以檢測其分布。將該模型與活體動(dòng)物體內(nèi)光學(xué)成像系統(tǒng)相結(jié)合，能夠應(yīng)用于抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物的篩選，為開發(fā)新的抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物提供一種有效的技術(shù)方法。文檔編號(hào)A61K49/00GK101748098SQ20081015393公開日2010年6月23日申請日期2008年12月11日優(yōu)先權(quán)日2008年12月11日發(fā)明者張寧,楊毅,牛瑞芳,郝希山申請人:天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院