專利名稱：含硫原花色素寡聚物的組合物及其制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含硫原花色素寡聚物及其組合物、它們的制造方法和用途。更具體地說，本發(fā)明提供了將植物中原花色素的分子量降低至使其成為容易被生物體腸道吸收的程度而制造原花色素寡聚物的方法，并提供了以該方法得到的含硫原花色素寡聚物作為有效成分的健康食品和藥品的組合物，其用于治療和預(yù)防由活性氧類物質(zhì)的生成所引起的各種生活習(xí)慣疾病和腦疾病。
背景技術(shù)：
隨著飲食生活的改變使脂肪攝取過多、環(huán)境的改變、臭氧層的破壞使紫外線暴露量增多、環(huán)境污染物的增多等，高脂血癥、高膽固醇血癥、高血壓、糖尿病、癌癥等所謂的生活習(xí)慣疾病逐漸增加，過敏癥、癡呆癥等腦疾病的患者也逐漸增加。今后，伴隨高齡化社會(huì)的發(fā)展，癡呆、阿爾茨海默綜合征等疾病的患者恐怕也將會(huì)增加，這些疾病的主要原因被指出都與體內(nèi)生成的活性氧類物質(zhì)有關(guān)(Bioorganic & MedicinalChemistry，10(2002)，2497-2509)。但是，由于完全抑制和控制活性氧類物質(zhì)生成的技術(shù)尚未開發(fā)，所以目前針對(duì)生活習(xí)慣疾病和腦疾病等的有效確實(shí)的預(yù)防治療技術(shù)沒有充分建立起來。
近年來，存在于植物中的具有生理活性的天然物質(zhì)，特別是多酚類化合物受到關(guān)注。多酚類物質(zhì)通常存在于茶葉、蔬菜、水果、草本植物類等中，可望成為能夠作為食品或者嗜好品長期攝取的無副作用的治療預(yù)防劑。
已知多酚化合物是植物的二次代謝產(chǎn)物，普遍而且大量地存在于植物界中，顯示出各種生理活性，過去在藥學(xué)、植物化學(xué)等領(lǐng)域以及近年來在健康食品領(lǐng)域都受到矚目。例如，已知茶葉中的多酚類，特別是兒茶素類，具有抗菌、抗病毒、抗突變、抗氧化、降血壓、降血脂、抗齲齒、抗過敏、改善腸道菌群和除臭等廣泛的生理活性。
在多酚之中，原花色素類是在植物中普遍含有的一類多酚類物質(zhì)。原花色素類必須由腸道吸收至生物體內(nèi)才能顯示出上述的各種生理活性。但是，原花色素類的分子量很大，通常在數(shù)千乃至數(shù)萬的數(shù)量級(jí)。這樣的大分子物質(zhì)很難通過腸道吸收，往往即使攝取了也很難被生物體吸收利用。
本發(fā)明者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)由蕎麥種子提取出來的多酚類物質(zhì)具有改善脂質(zhì)代謝、改善腦功能等作用，并獲得專利(特開平10-218786號(hào)公報(bào))，其有效成分是原花色素的多聚體，不能充分被生物體吸收。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明將不易通過腸道被生物體吸收的原花色素化合物改變?yōu)槿菀孜盏男问?，充分發(fā)揮了原花色素化合物所顯示出來的各種生理活性從而提高了生物體的抗氧化活性，提供了對(duì)治療和預(yù)防以活性氧類物質(zhì)為原因所引起的生活習(xí)慣疾病和腦疾病的有用的醫(yī)藥品和健康食品等。
本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，將含有原花色素類的植物或其提取物與含有SH基的化合物反應(yīng)而得到的低分子量的含硫原花色素寡聚物，易于經(jīng)腸道被生物體吸收，通過口服而發(fā)揮多種生理活性，從而完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明涉及作為藥品和健康食品有用的以下的含硫原花色素寡聚物及其組合物，以及它們的制造方法。
1.一種含有含硫原花色素寡聚物作為主要成分的組合物，其中所述寡聚物是通過使含有原花色素類的植物或其提取物與含有SH基的化合物反應(yīng)制得的反應(yīng)溶液進(jìn)行濃縮和干燥而得到。
2.根據(jù)上述1所述的含硫原花色素寡聚物的組合物，其中所述寡聚物是原花色素的二聚體到五聚體。
3.根據(jù)上述1所述的含硫原花色素寡聚物的組合物，其中所述含有原花色素類的植物是從蔬菜水果類、茶類、草本植物及香料類、木材及樹皮類之中選擇的一種或以上。
4.根據(jù)上述1所述的含硫原花色素寡聚物的組合物，其中所述含有SH基的化合物是從半胱氨酸、胱氨酸、谷胱甘肽、含有SH基的肽和它們的鹽類之中選擇的至少一種。
5.根據(jù)上述1～4中任一項(xiàng)所述的組合物，其是用于治療和/或預(yù)防生活習(xí)慣疾病的醫(yī)藥組合物。
6.根據(jù)上述1～4中任一項(xiàng)所述的組合物，其是用于預(yù)防衰老的醫(yī)藥組合物。
7.根據(jù)上述1～4中任一項(xiàng)所述的組合物，其是用于改善和/或預(yù)防生活習(xí)慣疾病的健康食品組合物。
8.根據(jù)上述1～4中任一項(xiàng)所述的組合物，其是用于預(yù)防衰老的健康食品組合物。
9.一種含硫原花色素寡聚物，其是通過使含有原花色素類的植物或其提取物與含有SH基的化合物反應(yīng)制得的含有含硫原花色素寡聚物的成分進(jìn)行分餾而得到。
10.根據(jù)上述9所述的含硫原花色素寡聚物，其中所述寡聚物是含硫原花色素的二聚體到五聚體。
11.含硫原花色素寡聚物組合物的制造方法，其特征在于，在酸性條件下使含有原花色素類的植物或其提取物與含有SH基的化合物反應(yīng)，將所得的反應(yīng)溶液濃縮和干燥。
12.含硫原花色素寡聚物的制造方法，其特征在于，在酸性條件下使含有原花色素類的植物或其提取物與含有SH基的化合物反應(yīng)，將所得的反應(yīng)溶液進(jìn)行濃縮和分餾處理。
13.根據(jù)上述11或12所述的制造方法，其中所述含有原花色素類的植物是從蔬菜水果類、茶類、草本植物及香料類、木材及樹皮類之中選擇的一種或以上。
14.根據(jù)上述11或12所述的制造方法，其中所述含有SH基的化合物是從半胱氨酸、胱氨酸、谷胱甘肽、含有SH基的肽和它們的鹽類之中選擇的至少一種。
15.根據(jù)上述11或12所述的制造方法，其中使用無機(jī)酸、有機(jī)酸或它們兩者得到所述酸性條件。
16.根據(jù)上述15所述的制造方法，其中使用鹽酸、硫酸、硝酸、醋酸、檸檬酸、抗壞血酸、蘋果酸之中選擇的至少一種。
17.由下述式(4)所示的原花色素化合物。
18.由下述式(5)所示的原花色素化合物。

19.由下述式(6)所示的原花色素化合物。
20.由下述式(7)所示的原花色素化合物。
21.由下述式(8)所示的原花色素化合物。


圖1所示為根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例1，分別給藥了含硫原花色素寡聚物組合物(分餾前的粉末；物質(zhì)1)和其原料(葡萄籽多酚提取物；比較物質(zhì)1)的小鼠血清中的LPO濃度。(A)是低劑量給藥組，(B)是高劑量給藥組。
圖2所示為根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例1，分別給予含硫原花色素寡聚物組合物(物質(zhì)1)和其原料(比較物質(zhì)1)的小鼠肝臟(A)、腎臟(B)和腦(C)中的LPO濃度。
圖3所示為分別給藥了實(shí)施例1中的本發(fā)明組合物(物質(zhì)1)和實(shí)施例1的原料(比較物質(zhì)1)的人血清LPO濃度，其中(A)是LPO濃度初期值正常者；(B)是LPO濃度初期值異常者。
圖4所示為分別給藥了實(shí)施例1中的本發(fā)明組合物(物質(zhì)1)和實(shí)施例1的原料(比較物質(zhì)1)的人血清SOD活性濃度，其中(A)是SOD濃度初期值正常者；(B)是SOD濃度初期值異常者。
圖5所示為實(shí)施例1中的本發(fā)明物質(zhì)1和比較物質(zhì)1對(duì)β淀粉狀蛋白引起PC-12細(xì)胞死亡的抑制效果。
圖6的(A)和(B)所示的照片和圖表是實(shí)施例1中的本發(fā)明物質(zhì)1和比較物質(zhì)1對(duì)β淀粉狀蛋白降低線粒體膜電位的抑制效果。
圖7的(A)和(B)所示的照片和圖表是本發(fā)明物質(zhì)1和比較物質(zhì)1對(duì)β淀粉狀蛋白引起的PC-12細(xì)胞內(nèi)活性氧蓄積的降低效果。
圖8所示為本發(fā)明物質(zhì)1和比較物質(zhì)1的細(xì)胞內(nèi)抗氧化活性效果。
圖9所示為本發(fā)明物質(zhì)1和比較物質(zhì)1對(duì)β淀粉狀蛋白引起的細(xì)胞膜過氧化的抑制效果。
圖10所示為本發(fā)明物質(zhì)1和比較物質(zhì)1在STZ誘發(fā)糖尿病小鼠中降低空腹血糖值的效果。
圖11所示為本發(fā)明物質(zhì)1和比較物質(zhì)1在STZ誘發(fā)糖尿病小鼠中降低尿糖值的效果。
圖12所示為本發(fā)明物質(zhì)1和比較物質(zhì)1在STZ誘發(fā)糖尿病小鼠中降低尿蛋白值的效果。
圖13所示為本發(fā)明物質(zhì)1和比較物質(zhì)1在STZ誘發(fā)糖尿病小鼠中降低血中LPO值的效果。
圖14所示為本發(fā)明物質(zhì)1和比較物質(zhì)1在STZ誘發(fā)糖尿病小鼠中升高血中TEAC值(抗氧化能力)的效果。
圖15所示為本發(fā)明物質(zhì)1在溴酸鉀誘發(fā)大鼠急性腎功能障礙模型中升高血液多酚濃度的效果。
圖16所示為本發(fā)明物質(zhì)1在溴酸鉀誘發(fā)大鼠急性腎功能障礙模型中升高血中TEAC值(抗氧化能力)的效果。
圖17所示為本發(fā)明物質(zhì)1在溴酸鉀誘發(fā)大鼠急性腎功能障礙模型中抑制血液過氧化脂質(zhì)濃度升高的效果。
圖18所示為本發(fā)明物質(zhì)1在溴酸鉀誘發(fā)大鼠急性腎功能障礙模型中抑制尿素氮升高的效果。
圖19所示為本發(fā)明物質(zhì)1在溴酸鉀誘發(fā)大鼠急性腎功能障礙模型中抑制血肌酸酐升高的效果。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的含硫寡聚物通常是原花色素的二聚體到五聚體，分子量通常為1500或以下。
含有原花色素類的植物或其提取物與含有SH基的化合物的反應(yīng)優(yōu)選在酸性條件下進(jìn)行。使用從鹽酸、硫酸、硝酸等無機(jī)酸，或者醋酸、檸檬酸、抗壞血酸、蘋果酸等有機(jī)酸之中選擇的合適的酸，濃度為0.1N～1.0N左右，優(yōu)選為0.5N。
在本說明書中的“原花色素”是指兒茶素多聚體，具體來講，是指兒茶素、表兒茶素、表沒食子兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、沒食子兒茶素和沒食子兒茶素沒食子酸酯。
含有原花色素的植物包括廣泛而種類繁多的植物，包括柿子、梨、葡萄、草莓、香蕉、鱷梨、越桔、藕、蕎麥等水果蔬菜類，和綠茶、紅茶、烏龍茶等一般的茶類，草本植物和香料、木材和松樹皮等。上述這些含有原花色素的植物或其提取物(包括榨汁、果汁、蔬菜汁)是適用的。
作為本發(fā)明所使用的含有SH基的化合物，可以列舉出半胱氨酸、胱氨酸、谷胱甘肽、含有SH基的肽和它們的鹽類等，此外還有洋蔥和大蒜等含硫的天然物質(zhì)。也可以使用硫醇類，當(dāng)考慮到本發(fā)明的含硫原花色素寡聚物要應(yīng)用于食品和醫(yī)藥品，所以優(yōu)選使用允許用于食品和醫(yī)藥品的含SH基化合物。
含原花色素類的植物或其提取物與含有SH基的化合物的反應(yīng)在室溫～80℃下進(jìn)行，優(yōu)選在40～60℃下，反應(yīng)持續(xù)數(shù)小時(shí)到一周，優(yōu)選為24～48小時(shí)。
反應(yīng)溶劑使用水、甲醇、乙醇等一種或多種的混合物，若考慮到要應(yīng)用于食品和醫(yī)藥品，則優(yōu)選使用水和乙醇。
反應(yīng)結(jié)束后將殘?jiān)^濾，濾液濃縮后以常規(guī)方法純化(或稱為提純、精制)。
即，可以通過對(duì)抽提出的提取物進(jìn)行膜處理(超濾、反透析等)或者應(yīng)用吸附劑而達(dá)到對(duì)濃縮液的純化。吸附劑使用苯乙烯-二乙烯基苯類吸附劑、甲基丙烯酸類吸附劑、親水性乙烯基聚合物、改性的右旋糖酐凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、反相類硅膠、離子交換樹脂等。在應(yīng)用這些吸附劑時(shí)，所吸附的級(jí)分(后文統(tǒng)稱吸附級(jí)分)含有與含SH基反應(yīng)了的分子量降低的多酚化合物(含硫原花色素寡聚物)。以乙醇水溶液、乙醇、丙酮等對(duì)該吸附級(jí)分洗提，可以得到不同分子量的級(jí)分。
此方法得到的含硫原花色素寡聚物通過正相HPLC和NMR測(cè)定，確定為以下通式(9)所示的原花色素的二聚體到五聚體。
通式中的n是0或者1～3的整數(shù)，R1代表氫原子或者下式所示的沒食子?；琑2和R3分別獨(dú)立地代表氫原子或者羥基，R4代表半胱氨酸、胱氨酸、谷胱甘肽或者是含有SH基的肽殘基。
由于含硫原花色素寡聚物是分子量在1500或以下的小分子，所以易于經(jīng)腸道被生物體吸收，如后述的試驗(yàn)所證實(shí)，其具有很強(qiáng)的DPPH基消減作用(即去除作用)、增加SOD樣活性的作用、抑制P450類脂質(zhì)過氧化的作用、保護(hù)FNT氧化應(yīng)激的作用、對(duì)抗β淀粉狀蛋白誘導(dǎo)的氧化細(xì)胞死亡的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用、對(duì)鏈脲菌素(STZ)誘發(fā)糖尿病的預(yù)防作用等，與其他的多酚物質(zhì)相比有更高的抗氧化能力。而且，在對(duì)人體的抗氧化指標(biāo)的監(jiān)測(cè)試驗(yàn)中，也得到了證明其抗氧化效果的數(shù)據(jù)。
所以，以本發(fā)明的原花色素寡聚物為有效成分的組合物不僅有抑制生物體過氧化脂質(zhì)生成的作用，還具有對(duì)以活性氧生成引起氧化損傷為原因的疾病的療效，因此具有對(duì)因過氧化脂質(zhì)或者活性氧生成所引起的各臟器機(jī)能障礙和衰老的預(yù)防作用，對(duì)上述原因所引起的各種疾病具有治療和預(yù)防作用。而且，該組合物也被認(rèn)為對(duì)抑制、預(yù)防和治療因?yàn)槟X衰老所引起的癡呆等腦功能障礙有效。同時(shí)，由于腦功能的改善，所以可望具有提高學(xué)習(xí)能力、減少注意力分散、消除失眠癥和鎮(zhèn)靜的作用。所以，以本發(fā)明的原花色素寡聚物為有效成分的組合物，可以用作醫(yī)藥組合物和健康食品組合物。
以本發(fā)明的含硫原花色素寡聚物為有效成分的組合物沒有任何毒性，可以非常安全地使用。該組合物可以口服或者非口服，口服時(shí)的劑量要根據(jù)年齡、體重、治療目的和服用方法的不同而變化，通常，成人每人每次在100～2000mg的范圍內(nèi)。本發(fā)明的組合物口服給藥時(shí)一般使用片劑、丸劑、膠囊、粉劑、顆粒、糖漿等，非口服給藥時(shí)使用注射劑、擦劑等。造粒、片劑化或制成糖漿的時(shí)候，可以根據(jù)需要使用適當(dāng)?shù)妮o助材料(淀粉、糊精、甜味劑、色素、香料等)。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方案以下是通過列舉本發(fā)明的含硫原花色素寡聚物的實(shí)施例和試驗(yàn)例來具體說明本發(fā)明，但本發(fā)明并非只局限于此范圍內(nèi)。
實(shí)施例1葡萄籽來源的含硫原花色素寡聚物的制造(1)葡萄籽多酚的抽提8kg干燥的葡萄籽在室溫下于80％甲醇(30L)抽提3天，將殘?jiān)^濾，濾液通過減壓濃縮而得到濃縮液，通過以下的條件進(jìn)行純化。
全部溶液裝入DIAION HP-20(三菱化學(xué))200mmφ×30cm(約25L)中，用100L水洗滌。用50L甲醇洗提，得到的物質(zhì)通過減壓濃縮和凍干，回收到456g粉末狀組合物。
(2)與半胱氨酸的降低分子量的反應(yīng)用上述(1)的方法得到的葡萄籽多酚400g，與L-半胱氨酸(和光純藥工業(yè)(株)生產(chǎn))400g，抗壞血酸(純正化學(xué)(株)生產(chǎn))4g，檸檬酸(和光純藥工業(yè)(株)生產(chǎn))0.8kg和水4L混合，在40℃反應(yīng)48小時(shí)。將反應(yīng)溶液裝入以直徑200mm、高800mm的DIAION HP-20(三菱化學(xué)(株)生產(chǎn))為載體而充填的柱子(容量約25L)上，用100L水將非吸附級(jí)分洗去之后，以40％ 醇50L洗提，回收洗提的級(jí)分，通過減壓濃縮、凍干，得到易溶于水、甲醇、乙醇的紅褐色粉末(產(chǎn)量408g)。使用以Sephadex LH-20(Pharmacia Co.，Ltd.生產(chǎn))為載體而充填的柱子(直徑50mm，高500mm，容積約1L)，用乙醇—水混合溶液將該粉末分餾，應(yīng)用野中等的方法(Chem.Pharm.Bull.，34(2)，633-642(1986))分析分餾(分級(jí))物質(zhì)的寡聚物組成，其組成如下半胱氨酸結(jié)合的表兒茶素單體級(jí)分 19％半胱氨酸結(jié)合的表兒茶素二聚體級(jí)分21％半胱氨酸結(jié)合的表兒茶素三聚體級(jí)分11％半胱氨酸結(jié)合的表兒茶素四聚體～六聚體級(jí)分16％(3)半胱氨酸結(jié)合的表兒茶素單體以使用茚三酮—醋酸試劑的噴霧在加熱下而呈現(xiàn)桃褐色的斑點(diǎn)作為對(duì)象，使用Sephadex LH-20凝膠做柱色譜層析(水—甲醇—丙酮)，將得到的半胱氨酸結(jié)合的表兒茶素單體級(jí)分進(jìn)行純化，分離得到下述分子式(1)～(3)所示的化合物(以下簡稱為化合物1～3)。

分子式(1)的化合物(化合物1)通過HR-FAB-MS(High ResolutionFast Atom Bombardment Mass Spectroscopy高分辨率快速原子轟擊質(zhì)譜)測(cè)定的分子離子峰[M+H]+(m/z)為410.0925，與分子式C18H20O8NS相應(yīng)的計(jì)算值410.0910和3.6ppm(10ppm以內(nèi))的誤差一致。所以，推定化合物1具有分子式C18H19O8NS，認(rèn)為其化學(xué)構(gòu)造是兒茶素或表兒茶素與L-半胱氨酸的硫原子結(jié)合。而且，化合物1用1H-NMR(氫核磁共振波譜，參照表1)測(cè)定時(shí)，在兒茶素或表兒茶素共同的芳香環(huán)上的5個(gè)質(zhì)子信號(hào)以外，還觀察到具有氧原子或硫原子基團(tuán)的信號(hào)群δ5.09(br.s)、δ4.07(m)和δ3.86(d，J＝2Hz)，各為一個(gè)質(zhì)子。前者提示具有表兒茶素的立體構(gòu)型。δ3.86(d，J＝2Hz)的質(zhì)子信號(hào)來自4α排列，相當(dāng)于硫原子排列于4β的硫解產(chǎn)物的信號(hào)。此外，δ4.13(1H，dd，J＝9，4Hz)、δ2.95(1H，dd，J＝15，9Hz)和δ3.43(1H，dd，J＝15，4Hz)確認(rèn)是ABX型的信號(hào)群，提示亞甲基與半胱氨酸的甲川基鄰接。以這些信息為基礎(chǔ)，推定化合物1的化學(xué)結(jié)構(gòu)為分子式(1)所示的4β-(S-L-半胱氨?；?-(-)-表兒茶素。在化合物1的13C-NMR(碳-13核磁共振波譜，參照表2)(DEPT法)中也觀察到的包含各碳原子級(jí)數(shù)在內(nèi)的共18個(gè)碳原子信號(hào)，支持了這一結(jié)構(gòu)。
分子式(2)的化合物(化合物2)應(yīng)用1H-NMR(參照表1)，觀察到具有氧原子或硫原子基團(tuán)的信號(hào)群δ4.86(1H，d，J＝9，6Hz)、δ4.22(1H，dd，J＝9.6，4.3Hz)和δ4.23(1H，d，J＝4.3Hz)，各為一個(gè)質(zhì)子。前兩者分別來自兒茶素的2β、3β排列，δ4.23(1H，d，J＝4.3Hz)來自4α排列，相當(dāng)于硫原子排列于4β的硫解產(chǎn)物的信號(hào)。所以，認(rèn)為化合物1和化合物2只在三維立體結(jié)構(gòu)上存在差異，推定化合物2的化學(xué)構(gòu)造為分子式(2)所示的4β-(S-L-半胱氨酰基)-(+)-兒茶素。
分子式(3)的化合物(化合物3)通過HR-FAB-MS測(cè)定的分子離子峰[M+H]+(m/z)為426.0844，與比化合物1多一個(gè)氧原子的分子式C18H20O9NS相應(yīng)的計(jì)算值426.0859和3.5ppm的誤差一致。而且，除了在1H-NMR(參照表1)的測(cè)定中，在芳香環(huán)區(qū)域的δ6.57(2H，s)2′和6′位的氫被確定為等價(jià)信號(hào)以外，化合物3與化合物1是對(duì)應(yīng)和相類似的。根據(jù)表2所示的13C-NMR信號(hào)來源加以分析，推定化合物3的結(jié)構(gòu)為分子式(3)所示的4β-(S-L-半胱氨酰基)-(-)-表沒食子兒茶素。
表1化合物1、2和3的1H-NMR信號(hào)來源(δ單位ppm)

注)化合物1是在丙酮-d6-D2O中測(cè)定的，化合物2和3是在CD3OD中分別測(cè)定的。
表2化合物1和3的13C-NMR信號(hào)來源(δ單位ppm)

注1)化合物1和3是在丙酮-d6-D2O和CD3OD中分別測(cè)定的注2)同一欄內(nèi)的右上角標(biāo)有a)、b)的值能互相交換
(4)半胱氨酸結(jié)合的表兒茶素二聚體用同樣的方法純化半胱氨酸結(jié)合的表兒茶素二聚體級(jí)分以分離出下述分子式(4)所示的化合物(以下有時(shí)簡稱為化合物4)。
化合物4在FAB-MS的測(cè)定中，顯示其分子的離子峰[M+H]+(m/z)為698，認(rèn)為是比化合物1多一個(gè)兒茶素單元的結(jié)構(gòu)。盡管在TCL和HPLC中均顯示單一行為，但是化合物4的1H-NMR顯示了在寬的信號(hào)群中混雜有較尖銳信號(hào)的波譜。根據(jù)該特點(diǎn)的1H-NMR信號(hào)分布，認(rèn)為縮合的結(jié)合位置在4→6或4→8之間，是具有較強(qiáng)旋轉(zhuǎn)障礙的后者。認(rèn)為4→8的直接結(jié)合使各個(gè)苯并吡喃來源的信號(hào)群變寬。即，δ4.22、δ4.54和δ4.96(各自分別為1H，br.m，C-3，-4，和-2)來源自上方的單元，相對(duì)更強(qiáng)的δ3.83和δ3.90(各自分別為1H，s，c-4′和-3′)、5，20(1H，br.m，C-2′)來源自與硫原子結(jié)合的單元(下方)。對(duì)分子模型的考察也提示下方的單元與上方的相比無旋轉(zhuǎn)障礙。在δ5.92的芳香環(huán)區(qū)域，來源于C-6、-8和-6′的3個(gè)質(zhì)子信號(hào)認(rèn)為是包絡(luò)(envelope)。從δ6.60到δ7.09認(rèn)為是來源于兩個(gè)單元B環(huán)上的質(zhì)子群，其中結(jié)合常數(shù)8.3Hz的強(qiáng)雙重線(doublet)信號(hào)來源于無旋轉(zhuǎn)障礙的下端單元的5位。推測(cè)剩下的信號(hào)δ2.95、δ3.44(各自為1H，br.m，cys-C-3)、δ4.14(1H，dd，J＝9，4Hz，cys-C-2)分別來自半胱氨酸殘基?；衔?的13C-NMR(參照表3)觀察到與化合物1相當(dāng)?shù)男盘?hào)群，支持了分子式(4)所示的化合物4的結(jié)構(gòu)。所以，推定化合物4的結(jié)構(gòu)是4β(S-L-半胱氨?；?-(-)-表兒茶素-(4β→8)-(-)-表兒茶素。
表3化合物4的13C-NMR信號(hào)來源(δ單位ppm)

注1)各樣品在acetone-d6-D2O中測(cè)定。
注2)右上角標(biāo)有a)、b)和c)的化學(xué)轉(zhuǎn)換值可以互相交換。
(5)半胱氨酸結(jié)合的表兒茶素三聚體同樣地純化半胱氨酸結(jié)合的表兒茶素三聚體級(jí)分粉末，分離出以下分子式(5)所示的化合物(以下有時(shí)簡稱為化合物5)。
化合物5在HR-FAB-MS的測(cè)定中，顯示分子的離子峰[M-H]+(m/z)為984.1956，與分子式C48H42O20NS相應(yīng)的計(jì)算值984.2011和5.5ppm的誤差一致。所以，推定化合物5具有分子式C48H43O20NS，認(rèn)為其化學(xué)結(jié)構(gòu)是兒茶素或者表兒茶素構(gòu)成的3分子縮合體與L-半胱氨酸結(jié)合的。而且，化合物5的1H-NMR信號(hào)整體很寬，提示3個(gè)單元都以4→8結(jié)合直線狀縮合，L-半胱氨酸與下方的單元結(jié)合。作為芳香環(huán)上的信號(hào)在δ5.98觀察到的單線態(tài)，來源于A環(huán)6-H、8-H，A′環(huán)6-H，A″環(huán)-6-H。在較低磁場(chǎng)下觀察到的信號(hào)群(δ6.04，s；δ6.91，7.01，s；δ7.11，s)，高度比約為3∶2∶1∶3，是來源自B環(huán)、B′環(huán)和B″環(huán)上產(chǎn)生的2-H的信號(hào)，δ6.91和δ7.01(2∶1)信號(hào)被認(rèn)為為中間位置的B′-2-H因?yàn)槭艿叫D(zhuǎn)障礙而出現(xiàn)分裂產(chǎn)生的。以這些信息為基礎(chǔ)，推定化合物5的平面結(jié)構(gòu)暫定為分子式(5)。
實(shí)施例2葡萄籽來源的含硫原花色素寡聚物的生產(chǎn)使用與實(shí)施例1相同的原料和條件抽提葡萄籽多酚，使用與實(shí)施例1相同的條件純化。純化物用以下條件與谷光甘肽反應(yīng)，降低分子量。
即，將得到的葡萄籽多酚1.0g、谷光甘肽(和光純藥工業(yè)(株)生產(chǎn))3.0g、抗壞血酸(純正化學(xué)(株)生產(chǎn))0.5g、1N鹽酸50.0ml混合，40℃反應(yīng)48小時(shí)。該反應(yīng)液通過DIAION HP-20(三菱化學(xué)(株)生產(chǎn))、MCIgel CHP-20(三菱化學(xué)(株)生產(chǎn))、Sephadex LH-20(PharmaciaCo.，Ltd.生產(chǎn))等進(jìn)行純化、減壓濃縮、凍干，得到紅褐色的粉末(產(chǎn)量120mg)。
1)谷光甘肽結(jié)合的單體以聚苯乙烯凝膠、Sephadex LH-20凝膠、以及ODS類硅膠作為載體，以水和甲醇的混合液作為流動(dòng)相，對(duì)得到的紅褐色粉末反復(fù)進(jìn)行柱色譜層析，得到分子式(6)所示的化合物(化合物6)。
化合物6通過HR-ESI-MS(High Resolution Electro-Spray IonizationMass Spectroscopy高分辨率電灑法質(zhì)譜)測(cè)定顯示其分子的離子峰[M+H]+(m/z)為596.1550，與分子式C25H30O12N3S相應(yīng)的計(jì)算值596.1551和0.17ppm的誤差一致。所以，認(rèn)為化合物6的化學(xué)結(jié)構(gòu)是兒茶素或者表兒茶素與來源于谷光甘肽的L-半胱氨酸的硫原子結(jié)合。在化合物6的1H-NMR測(cè)定中，除了兒茶素或表兒茶素在共同的芳香環(huán)上的5個(gè)質(zhì)子信號(hào)群(δ5.84，5.96，6.91(各自分別為1H，8-，6-，2′-H)；δ6.73-6.78(2H，m，5′，6′-H))以外，還確認(rèn)具有氧原子或硫原子基團(tuán)的信號(hào)群δ3.90，3.91，5.15(各自分別為1H，3-，4-，5-H)，推測(cè)是與化合物1相同、在表兒茶素的4位硫原子在4β結(jié)合的結(jié)構(gòu)。此外，觀察到半胱氨酸部分(δ3.63(1H，br.t，J＝9，4Hz，cys-2-H)，3.72，3.80(各自為1H，d，J＝17.6Hz，cys-3-H2))、谷氨酸部分(δ1.72(2H，m，glu-4-H2)，1.78(2H，m，glu-3-H2))，3.05(1H，br.d，J＝5.4Hz，glu-2-H))和甘氨酸部分(δ3.20(2H，s，gly-2-H2))相應(yīng)的信號(hào)群。該結(jié)構(gòu)也通過化合物6的13C-NMR中測(cè)定(參照表4)觀察到25個(gè)碳的信號(hào)而得到支持。
所以，推定化合物6的結(jié)構(gòu)是來自谷光甘肽分子的半胱氨酸部分的硫原子與表兒茶素的4β結(jié)合，如分子式(6)所示的4β-(谷光甘肽?；?-(-)-表兒茶素。
表4化合物6的13C-NMR信號(hào)來源(δ單位ppm)

注1)樣品是溶解在CD3OD中測(cè)定的。
注2)右上角標(biāo)有*的化學(xué)轉(zhuǎn)換值可以互相交換實(shí)施例3松樹來源的含硫原花色素寡聚物的生產(chǎn)(1)松樹皮多酚的抽提400g冷杉樹皮在室溫下于1.5L的80％甲醇抽提3天，將殘?jiān)^濾，濾液通過減壓濃縮得到濃縮液，通過以下的條件進(jìn)行純化。
全部溶液裝入DIAION HP-20(三菱(株)化學(xué)制)50mmφ×30cm(約600mL)中，用2500mL水洗滌。用1200mL甲醇洗提，得到的物質(zhì)通過減壓濃縮和凍干，回收到18.4g粉末狀組合物。
(2)與半胱氨酸的降低分子量的反應(yīng)上述(1)的方法得到的松樹皮多酚1.0g，與L-半胱氨酸(和光純藥工業(yè)(株)生產(chǎn))1.7g，抗壞血酸(純正化學(xué)(株)生產(chǎn))0.25g和1N鹽酸20.0mL混合，在40℃反應(yīng)48小時(shí)。將反應(yīng)溶液裝入以直徑25mm，高150mm的DIAION HP-20(三菱(株)化學(xué)制)為載體而充填的柱子(容積約100mL)中，用400mL水將非吸附級(jí)分洗去之后，用甲醇400mL洗提，回收洗提的級(jí)分，通過減壓濃縮、凍干，得到紅褐色粉末(產(chǎn)量0.95g)。
原花色素在試管內(nèi)(體外)顯示出很強(qiáng)的抗氧化活性，但是口服攝取未必能夠在體內(nèi)發(fā)揮充分的效果?？紤]其原因是，大分子的原花色素很難經(jīng)腸道吸收。對(duì)此，本發(fā)明用含有SH基的物質(zhì)降低其分子量而得到的含硫原花色素寡聚物，不但在體外顯示出與大分子原花色素相同的抗氧化活性，而且在體內(nèi)顯示出比大分子原花色素更優(yōu)越的抗氧化活性。
實(shí)施例4楊梅來源的含硫原花色素寡聚物的制造(1)楊梅多酚的抽提400g楊梅樹皮在室溫下于1.5L 80％的甲醇抽提3天，將殘?jiān)^濾，濾液通過減壓濃縮得到濃縮液，用于以下條件的純化。
全部濃縮液裝入DIAION HP-20(三菱化學(xué)(株)制)50mmφ×30cm(約600mL)中，用2500mL水洗滌后，用1200mL甲醇洗提，回收得到的物質(zhì)，通過減壓濃縮和凍干，回收到38.0g粉末狀的組合物。
(2)與半胱氨酸的降低分子量的反應(yīng)用上述(1)的方法得到的楊梅樹皮多酚1.0g，與L-半胱氨酸(和光純藥(株)生產(chǎn))1.7g，抗壞血酸(純正化學(xué)(株)生產(chǎn))0.25g和1N鹽酸20.0mL混合，在40℃反應(yīng)48小時(shí)。將反應(yīng)溶液裝入DIAIONHP-20(三菱化學(xué)(株)制)25mmφ×150mm(約100mL)內(nèi)，用400mL水將非吸附級(jí)分洗去之后，用甲醇400mL洗提，回收洗提的級(jí)分，通過減壓濃縮、凍干，得到紅褐色粉末0.95g。
(3)關(guān)于楊梅樹皮多酚與L-半胱氨酸的結(jié)合體1)L-半胱氨酸結(jié)合的表沒食子兒茶素沒食子酸酯單體以聚苯乙烯凝膠、Sephadex LH-20凝膠、ODS硅膠作為載體，以水、甲醇、丙酮的任意混合液作為流動(dòng)相，對(duì)上述(2)所得到的紅褐色粉末反復(fù)進(jìn)行柱色譜法純化，分離得到表兒茶素沒食子酸酯(epicatechin gallate)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechingallate)、(4β→8)表沒食子兒茶素沒食子酸酯以及上述化合物3，此外還有以下分子式(7)和(8)所示的化合物(化合物7和化合物8)。

化合物7通過ESI-MS測(cè)定，顯示其分子的離子峰[M-H]+(m/z)為575。此外，1H-NMR(參照表5)的測(cè)定結(jié)果顯示與化合物1和化合物3類似，但是可觀察到向低磁場(chǎng)移動(dòng)約1.3ppm的3-βH(1H，5.29，s)、且在芳香環(huán)區(qū)域的A環(huán)上的6、8位、以及6.68和6.69各為兩個(gè)質(zhì)子的兩組很尖銳的等價(jià)的單線態(tài)信號(hào)(來自1，3，4，5位已被取代的苯環(huán)上的2和6位的氫)。這些信號(hào)提示其為表沒食子兒茶素的沒食子酸酯。
綜合這些信息和表6所示的13C-NMR信號(hào)群的來源，推定化合物7的結(jié)構(gòu)為分子式(7)所示的4β-(S-L-半胱氨酰基)-(-)-表兒茶素沒食子酸酯。
2)L-半胱氨酸結(jié)合的表沒食子兒茶素沒食子酸酯二聚體化合物8通過HR-ESI-MS測(cè)定，顯示其分子的離子峰[M-H]+(m/z)為1032.1517，與分子式C25H30O12N3S相應(yīng)的計(jì)算值1032.1503和1.4ppm的誤差一致。所以，認(rèn)為其化學(xué)結(jié)構(gòu)是比化合物7多一個(gè)表兒茶素沒食子酸酯單元?；衔?的1H-NMR與化合物4相同，顯示在較寬的信號(hào)群中混有較尖銳的信號(hào)的波譜，認(rèn)為其為4→8縮合型。1H-和13C-NMR的信號(hào)群來源與化合物4相同(分別見表5和表6)，推定化合物8的結(jié)構(gòu)是分子式(8)所示的4β-(S-L-半胱氨?；?-(-)-表兒茶素沒食子酸酯-(4β→8)-(-)-表兒茶素沒食子酸酯。
表5化合物7和化合物8的1H-NMR信號(hào)來源(δ單位ppm)

注)化合物7和化合物8分別在25℃和40℃，在丙酮-d6-D2O中測(cè)定表6化合物7和化合物8的13C-NMR信號(hào)來源(δ單位ppm)

注1)化合物1在丙酮-d6-D2O中測(cè)定，化合物3在CD3OD中測(cè)定。
注2)右上角標(biāo)有a)和b)的化學(xué)轉(zhuǎn)換值可以互相交換試驗(yàn)例1DPPH基消減作用針對(duì)實(shí)施例1的分餾(分級(jí))前的粉末(物質(zhì)1)、將物質(zhì)1分餾得到的單體級(jí)分(物質(zhì)2)、將物質(zhì)1分餾得到的三聚體級(jí)分(物質(zhì)3)、將物質(zhì)1分餾得到的四聚體～六聚體級(jí)分(物質(zhì)4)、實(shí)施例1的原料(葡萄籽多酚提取物)(比較物質(zhì)1)和市售的兒茶素(和光純藥(株)生產(chǎn))(比較物質(zhì)2)，用以下方法測(cè)定1，1-二苯基-2-苦基偕腙肼(DPPH)基的消減作用。
在96孔的微型板內(nèi)加入100μL的DPPH溶液(60μM乙醇溶液)，分別加入試驗(yàn)試樣的乙醇溶液100μL和作為對(duì)照的乙醇100μL，輕微混合后在室溫放置30min，之后測(cè)定520nm的吸光度值，用以下公式計(jì)算出DPPH基消減能力。通過逐漸稀釋的試驗(yàn)試樣的DPPH基消減能力和濃度計(jì)算出50％有效濃度(EC50)。
DPPH基消減能力(％)＝[(1-(試驗(yàn)試樣的吸光度)/(對(duì)照的吸光度)]×100根據(jù)各試驗(yàn)試樣不同濃度的DPPH基消減能力，計(jì)算出50％有效濃度。結(jié)果如表7所示。
在低濃度時(shí)，物質(zhì)4的DPPH基消減作用相對(duì)較高。其他的試樣顯示了同樣的活性，在高濃度時(shí)，各試樣均顯示了較高的活性。
表7

試驗(yàn)例2超氧物歧化酶(SOD)樣活性針對(duì)與試驗(yàn)例1相同的物質(zhì)1～4和比較物質(zhì)1～2，使用血液SOD檢測(cè)試劑盒(SOD Test Wako和光純藥(株)生產(chǎn))測(cè)定SOD樣活性。應(yīng)用下式計(jì)算SOD樣活性，根據(jù)試驗(yàn)試樣濃度與SOD樣活性的關(guān)系計(jì)算出50％有效濃度(EC50)。
SOD樣活性(％)＝[(1-(試驗(yàn)試樣的吸光度)/(對(duì)照的吸光度))×100根據(jù)各試樣不同濃度的SOD樣活性計(jì)算EC50，結(jié)果如表8所示。物質(zhì)2～4的各分餾級(jí)分都顯示了與比較物質(zhì)1～2相比更高的SOD樣活性。
表8

試驗(yàn)例3對(duì)亞急性FeNTA誘導(dǎo)多器官衰竭模型的作用使用FeNTA(硝酸鐵(Fe(NO3)3和次氮基三醋酸鈉(NTA3Na)的混合物)進(jìn)行試驗(yàn)，已知其被生物體攝取后將產(chǎn)生大量的活性氧，誘發(fā)多器官衰竭的體內(nèi)氧化模型。
即，硝酸鐵九水合物(關(guān)東化學(xué)(株)生產(chǎn))240mg溶解于40ml冷水中，次氮基三醋酸鈉一水合物390mg溶解于40ml冷水中，將二者在冰冷條件下混合，用1N的鹽酸調(diào)節(jié)pH值為7.5，定容到100ml，以配制成FeNTA溶液。調(diào)制后10分鐘之內(nèi)，將相當(dāng)于每kg體重22.5mg Fe的FeNTA溶液每隔一天在腹腔內(nèi)給藥于7周齡的雄性ddY系小鼠(平均體重30g)。每天分別強(qiáng)制口服相當(dāng)于每kg體重25mg(低劑量組)和每kg體重50mg(高劑量組)物質(zhì)1和比較物質(zhì)1。讓對(duì)照組攝取自來水，設(shè)置了不使用FeNTA的陰性對(duì)照組和使用FeNTA的陽性對(duì)照組。自由攝取飲水和食物。從給藥開始第7、14、21、28天采血，測(cè)定血清中的過氧化脂質(zhì)(LPO)濃度。從給藥開始第28天解剖，取肝臟、腎臟、腦，測(cè)定各臟器的組織勻漿液的LPO濃度。
(1)血清中的LPO濃度如圖1(A)和(B)所示。在低劑量組，物質(zhì)1第21天的血清中的LPO濃度與比較物質(zhì)1和陽性對(duì)照組相比顯著降低(圖1(A))。在高劑量組，物質(zhì)1從給藥開始到第28天也都顯著降低(圖1(B))。雖然比較物質(zhì)在第21天也顯示了低值，但是本發(fā)明物質(zhì)顯示了更強(qiáng)的效果。
(2)各臟器中的LPO濃度肝臟、腎臟和腦中的LPO濃度如圖2(A)～(C)所示。
肝臟在給藥FeNTA后，LPO濃度沒有明顯升高，各給藥組也沒有變化。腎臟和腦在給藥FeNTA后，組織勻漿液中的LPO濃度升高。物質(zhì)1和比較物質(zhì)1給藥后，LPO濃度降低。腎臟和腦都是在物質(zhì)1的高劑量組顯示了最低值。特別是腦，雖然比較物質(zhì)1給藥后也顯示了低值，但是物質(zhì)1高劑量組與其他組相比顯示了顯著更低的值。
給予FeNTA后使血清中的LPO濃度升高。物質(zhì)1和比較物質(zhì)1相比，在低用量和短期內(nèi)發(fā)揮了效果。由此得出，物質(zhì)1由于已經(jīng)降低了分子量，口服后容易經(jīng)腸道吸收，所以在低用量和短期內(nèi)發(fā)揮了功效。特別是明確了物質(zhì)1在腎臟和腦發(fā)揮很強(qiáng)的抗氧化活性。
試驗(yàn)例4人體監(jiān)測(cè)試驗(yàn)[試驗(yàn)方法]健康男女34人(平均年齡41.2歲，男性21人，女性13人)如表9所示分為兩組，28天內(nèi)每天分別給藥500mg物質(zhì)1和比較物質(zhì)1。給藥開始前和給藥28天后采血，測(cè)定血清中的LPO濃度和SOD樣活性。
表9
給藥前后的LPO濃度和SOD樣活性如圖3和圖4所示。圖3(A)所示為初期值正常者的LPO濃度，圖3(B)所示為初期值異常者的LPO濃度，圖4(A)所示為初期值正常者的SOD樣活性，圖4(B)所示為初期值異常者的SOD樣活性的結(jié)果。
比較物質(zhì)1和物質(zhì)1給藥28天后，可觀察到LPO濃度降低、SOD樣活性升高的傾向。在初期值異常的受檢者中，LPO濃度的初期值比較高的人(LPO濃度為8.0或以上)和SOD樣活性比較低的人(SOD樣活性為12.0或以下)在物質(zhì)1給藥組可觀察到LPO濃度有統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的降低(圖3(B))。同樣，SOD樣活性也在物質(zhì)1給藥組觀察到有統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的升高(圖4(B))。由此可以確認(rèn)，物質(zhì)1比等量的比較物質(zhì)1對(duì)改善生物體的氧化狀態(tài)更加有效。
試驗(yàn)例5保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞不受β-淀粉狀蛋白誘導(dǎo)的氧化細(xì)胞死亡的效果由神經(jīng)再生異常引起的阿爾茨海默綜合征以β-淀粉狀蛋白蓄積而形成老年斑為特征。β-淀粉狀蛋白是由于產(chǎn)生活性氧類物質(zhì)而對(duì)神經(jīng)細(xì)胞有細(xì)胞毒性，從而在阿爾茨海默綜合征的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用的物質(zhì)。檢測(cè)了降低了分子量的多酚(下文有時(shí)略稱為GSM)保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞在神經(jīng)細(xì)胞毒性試驗(yàn)中廣泛使用的PC-12細(xì)胞不受調(diào)亡誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷活性的作用。
于含有10％熱滅活的馬血清和5％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，10％的二氧化碳?xì)夥障屡囵B(yǎng)PC-12細(xì)胞。事先調(diào)整細(xì)胞濃度為4×104細(xì)胞/300μL，培養(yǎng)24小時(shí)后，在不含血清的N-2培養(yǎng)基中加入GSM或者葡萄籽多酚(下文有時(shí)略稱為GSP)1、1.5、5、10μg/mL濃度，培養(yǎng)于48孔的微型板。
(1)細(xì)胞存活試驗(yàn)處理后，以終濃度為1mg/mL的MTT溶液處理細(xì)胞，以緩沖液溶解深藍(lán)色的產(chǎn)物甲臢(formazan)，測(cè)定540～595nm的吸光度值。結(jié)果顯示為與未處理的對(duì)照細(xì)胞的吸光度值的比值(％)。
MTT試驗(yàn)證明，GSM抑制了依賴于濃度的β-淀粉狀蛋白引起的PC-12細(xì)胞死亡。特別是在1和1.5μg/mL的低濃度區(qū)域，該效果比GSP更強(qiáng)(圖5)。
(2)線粒體膜電位測(cè)定試驗(yàn)使用脂溶性陽離子探針TMRE測(cè)定線粒體膜電位。在GSM或GSP存在或不存在下以25μM的β-淀粉狀蛋白處理PC-12細(xì)胞(1×104cell/mL)之后，以磷酸鹽緩沖生理鹽水清洗，37℃下用TMRE(150nM)處理30分鐘。以激發(fā)波長488nm、發(fā)光波長590nm的熒光檢測(cè)出依存于線粒體膜電位并蓄積在線粒體內(nèi)的TMRE。
在細(xì)胞死亡的癥狀之前，線粒體首先發(fā)生膜的完整性改變。該變化同時(shí)發(fā)生于線粒體的內(nèi)膜和外膜，最終引起細(xì)胞色素C等可溶性跨膜蛋白質(zhì)的釋放，導(dǎo)致膜電位的釋放和膜通透性的變化。PC-12細(xì)胞暴露于β-淀粉狀蛋白后線粒體的跨膜電位急劇下降，應(yīng)用TMRE使膜電位依存的細(xì)胞色素顯紅色熒光(圖6(A))。GSM預(yù)處理顯著減少了β-淀粉狀蛋白引起的跨膜電位降低，該效果比GSP強(qiáng)(圖6(A)和(B))。
(3)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)活性氧類物質(zhì)的蓄積為了觀察活性氧類物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的蓄積，應(yīng)用了熒光探針DCF-DA(2′，7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯)。在GSM或GSP存在或不存在下以25μM的β-淀粉狀蛋白處理PC-12細(xì)胞(1×106cell/3mL)之后，以克雷布斯—林格液清洗，加入10μM的DCF-DA。在37℃培養(yǎng)15分鐘后用激光共聚焦顯微鏡觀察，使用激發(fā)波長為488nm、發(fā)射波長為530nm的氬激光。
為了闡明β-淀粉狀蛋白引起PC-12細(xì)胞死亡的氧化應(yīng)激，應(yīng)用了能夠透過細(xì)胞膜的DCF-DA來檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧類物質(zhì)的蓄積。在細(xì)胞內(nèi)，DCF-DA被細(xì)胞的酯酶活性水解為DCF，并與過氧化物反應(yīng)生成熒光物質(zhì)。β-淀粉狀蛋白處理的PC-12細(xì)胞因被DCF所染色而顯示出來(圖7(A))。GSM減少了β-淀粉狀蛋白引起的細(xì)胞內(nèi)活性氧類物質(zhì)的蓄積，該效果也比GSP強(qiáng)(圖7(A)和(B))。
(4)細(xì)胞內(nèi)谷光甘肽濃度細(xì)胞內(nèi)谷光甘肽濃度采用市售的試劑盒(BIOXYTECH GSH-400OXIS Research公司生產(chǎn)，美國)來測(cè)定。收集在GSM或GSP存在或不存在下培養(yǎng)的以β-淀粉狀蛋白處理過的PC-12細(xì)胞，在偏磷酸溶液內(nèi)勻漿化，在離心分離的上清液中加入色原體鹽酸溶液，攪拌后加入30％氫氧化鈉溶液，在25℃孵育10分鐘。然后測(cè)定離心分離的澄清上清液的400nm吸光度值。應(yīng)用BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)含量，與未處理的對(duì)照物比較蛋白質(zhì)每單位重量相應(yīng)的谷光甘肽濃度。
β-淀粉狀蛋白引起的細(xì)胞死亡與氧化損傷有關(guān)。在β-淀粉狀蛋白處理過的細(xì)胞中，細(xì)胞內(nèi)的谷光甘肽濃度降低。在GSP處理過的細(xì)胞中，細(xì)胞內(nèi)谷光甘肽濃度恢復(fù)到了正常水平，GSM的處理顯示了比正常水平高的細(xì)胞內(nèi)谷光甘肽濃度，顯示了在細(xì)胞內(nèi)更強(qiáng)的抗氧化活性(圖8)。
(5)過氧化脂質(zhì)濃度過氧化脂質(zhì)濃度采用市售的試劑盒(BIOXYTECH LPO-586OXISResearch公司生產(chǎn)，美國)來測(cè)定。收集在GSM或GSP存在或不存在下培養(yǎng)的以β-淀粉狀蛋白處理過的PC-12細(xì)胞，在含有0.5mM丁基化羥基甲苯的20mM三鹽酸鹽緩沖液中勻漿化，用10.3mM的N-甲基-2-苯基吲哚的乙腈溶液稀釋混合離心分離的上清液。加入37％的鹽酸，在45℃孵育60分鐘。冷卻后，離心分離，測(cè)定澄清上清液的590nm吸光度值。應(yīng)用BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)含量，與未處理的對(duì)照物比較蛋白質(zhì)每單位重量相應(yīng)的過氧化脂質(zhì)濃度。
過氧化脂質(zhì)生成的丙二酰二醛(MDA)顯示了β-淀粉狀蛋白處理引起的細(xì)胞膜過氧化。GSM或GSP預(yù)處理抑制了β-淀粉狀蛋白引起的脂質(zhì)過氧化，GSM的該效果較強(qiáng)，將過氧化脂質(zhì)抑制到了未處理的對(duì)照水平以下(圖9)。
在神經(jīng)細(xì)胞的模型細(xì)胞株P(guān)C-12細(xì)胞中，GSM因減少了神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)活性氧類物質(zhì)的蓄積而抑制了β-淀粉狀蛋白毒性引起的神經(jīng)細(xì)胞死亡。該效果比GSP強(qiáng)。β-淀粉狀蛋白毒性引起的神經(jīng)細(xì)胞死亡與細(xì)胞的氧化損傷有關(guān)，GSM抑制了細(xì)胞的氧化損傷，該效果比GSP強(qiáng)。
GSM的抗氧化作用抑制了與阿爾茨海默綜合征的發(fā)病和發(fā)展密切相關(guān)的β-淀粉狀蛋白所引起的神經(jīng)細(xì)胞死亡，所以，提示GSM能夠抑制阿爾茨海默綜合征的發(fā)病和發(fā)展。
試驗(yàn)例6對(duì)鏈脲菌素(STZ)誘發(fā)糖尿病的預(yù)防效果為了探討物質(zhì)1對(duì)STZ誘發(fā)糖尿病小鼠的預(yù)防效果，使用了STZ小劑量多次(multiple low doseMLD)給藥誘發(fā)的相當(dāng)于糖尿病初期的疾病模型。
測(cè)定Jladdy小鼠(雄性，7周齡)的體重、血糖值和血中LPO值，使各組均等地分為以下組。
(1)陰性對(duì)照組STZ(-)(n＝5，1籠)，(2)陽性對(duì)照組STZ(+)(n＝5，3籠)，(3)物質(zhì)1組STZ(+)+物質(zhì)1(n＝10，2籠)，(4)比較物質(zhì)1組STZ(+)+比較物質(zhì)1(n＝10，2籠)。
STZ以20mg/kg的用量連續(xù)在腹腔內(nèi)給藥4天(此步驟做2輪)后，以40mg/kg的用量連續(xù)在腹腔內(nèi)給藥4天。將物質(zhì)1或比較物質(zhì)1各以0.06％的量混合在飼料中，使該飼料被自由攝取(根據(jù)每天的飼料攝取量，每天的物質(zhì)1或比較物質(zhì)1的攝取量大約為100mg/kg)。另外，給藥時(shí)間是從STZ給藥的5天前到第65天。
給藥期間采集血液和尿液，測(cè)定了血糖、尿糖、尿蛋白、血尿素氮(BUN)、血中LPO/TEAC(Trolox等價(jià)抗氧化能力)。測(cè)定結(jié)果如圖10～14所示。
(1)空腹血糖值如圖10所示，對(duì)于糖尿病，在空腹時(shí)血糖值顯示高值，在STZ給藥后第35天、49天和66天，陽性對(duì)照組的血糖值明顯高于陰性對(duì)照組，確認(rèn)了通過STZ小劑量多次給藥制成了輕度糖尿病模型。物質(zhì)1組和比較物質(zhì)1組的血糖值比陽性對(duì)照明顯降低，物質(zhì)1和比較物質(zhì)1相比顯示了更強(qiáng)的降血糖效果。
(2)尿糖值對(duì)于糖尿病，排泄到尿液的糖量增加。STZ處理使排泄至尿液的糖量大幅增加，能夠確認(rèn)小鼠已經(jīng)誘發(fā)了糖尿病。如圖11所示，可觀察到物質(zhì)1組和比較物質(zhì)1組對(duì)STZ增加尿糖值有改善效果，在第49天，與陽性對(duì)照組相比分別都有明顯的差異。而且，物質(zhì)1和比較物質(zhì)1相比顯示了若干更低的值。
(3)尿蛋白值對(duì)于糖尿病，排泄到尿液的蛋白質(zhì)量增加。如圖12所示，物質(zhì)1和比較物質(zhì)1能夠抑制STZ引起的尿蛋白漏出到尿中，STZ給藥后第49天，兩物質(zhì)和陽性對(duì)照組相比都明顯降低了蛋白量。而且預(yù)測(cè)，和比較物質(zhì)1相比，物質(zhì)1從本疾病模型的早期開始就可表現(xiàn)出所起的作用。
(4)抗氧化指標(biāo)(4-1)血中LPO值如圖13所示，物質(zhì)1組與陽性對(duì)照組和比較物質(zhì)1組相比，觀察到血中LPO值較低的傾向。
(4-2)血中TEAC值TEAC(Trolox等價(jià)抗氧化能力)法是將某化合物的抗氧化活性換算為α-維生素E的衍生物Trolox的抗氧化能力的相對(duì)評(píng)價(jià)抗氧化強(qiáng)度的方法，通常作為抗氧化指標(biāo)被廣泛使用。如圖14所示，血液的抗氧化活性在第49天和第66天中，比較物質(zhì)1和陽性對(duì)照都顯示了大致相同程度的抗氧化能力，與此相對(duì)，物質(zhì)1給藥組顯示了較高的值，抗氧化能力最高。
STZ小劑量多次給藥模型能夠誘發(fā)小鼠的輕度糖尿病，和高劑量單次給藥模型相比血糖值個(gè)體差異較少，所以認(rèn)為是用于研究糖尿病預(yù)防效果的更加方便的模型。物質(zhì)1能夠抑制本糖尿病模型中和疾病發(fā)展相伴的血糖值和尿糖值的升高，提示其具有預(yù)防糖尿病的效果。
在STZ所引起的糖尿病中，在胰腺的β細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生了特異的基團(tuán)，該基團(tuán)使β細(xì)胞受到損傷致死，從而誘發(fā)了糖尿病。推測(cè)由于物質(zhì)1和比較物質(zhì)1是在STZ給藥5天前開始給藥的，所以能夠事先提高體內(nèi)的抗氧化活性，減輕了STZ引起的β細(xì)胞損傷。
血中LPO和TEAC結(jié)果說明物質(zhì)1明顯升高了血液的抗氧化能力。一氧化碳或活性氧等基團(tuán)與胰島素依賴性糖尿病的胰島的破壞有關(guān)是眾所周知的事實(shí)，通過人體試驗(yàn)已經(jīng)逐漸明確，只要抑制這些自由基對(duì)細(xì)胞的損傷就可以改善糖尿病。所以，提示物質(zhì)1可謂是糖尿病的預(yù)備軍，對(duì)健康人有預(yù)防效果，對(duì)早期糖尿病患者有抑制疾病發(fā)展的效果。
試驗(yàn)例7溴酸鉀誘發(fā)大鼠急性腎功能障礙模型的比較試驗(yàn)為了闡明物質(zhì)1和其他的抗氧化多酚物質(zhì)相比有多大程度的抗氧化能力，進(jìn)行了溴酸鉀誘發(fā)大鼠急性腎功能障礙模型的比較試驗(yàn)。
Wistar大鼠(雄性，12周齡)分組如下。
陰性對(duì)照組溴酸鉀(-)(n＝5)，陽性對(duì)照組溴酸鉀(+)(n＝5)，物質(zhì)1組(葡萄籽來源)溴酸鉀(+)+物質(zhì)1(n＝5)，物質(zhì)5組(松樹皮來源)溴酸鉀(+)+物質(zhì)5(n＝5)，比較物質(zhì)2組(兒茶素)溴酸鉀(+)+比較物質(zhì)2(n＝5)，比較物質(zhì)3組(銀杏葉提取物)溴酸鉀(+)+比較物質(zhì)3(n＝5)，比較物質(zhì)4組(松樹皮提取物)溴酸鉀(+)+比較物質(zhì)4(n＝5)，
比較物質(zhì)5組(可可提取物)溴酸鉀(+)+比較物質(zhì)5(n＝5)。
溴酸鉀以65mg/kg體重進(jìn)行腹腔內(nèi)單次給藥。物質(zhì)1、物質(zhì)5和各比較物質(zhì)是從溴酸鉀給藥開始(第0天)的一周前(第-7天)開始到第二天以10mg/kg體重的用量每天一次口服。在溴酸鉀給藥當(dāng)天，在溴酸鉀給藥的30分鐘前或后進(jìn)行所述物質(zhì)給藥。在第-7天、第0天和第2天經(jīng)頸靜脈采血，測(cè)定血液的多酚濃度、過氧化脂質(zhì)濃度、TEAC、尿素氮和肌酸酐。
由于物質(zhì)1和各比較物質(zhì)是通過抗氧化作用而在溴酸鉀誘發(fā)的大鼠急性腎功能障礙中發(fā)揮作用的，所以檢測(cè)了作為抗氧化指標(biāo)的血液多酚濃度、血液抗氧化能力(TEAC)、血液過氧化脂質(zhì)濃度，和作為腎功能障礙疾病指標(biāo)的血液尿素氮濃度、血液肌酸酐濃度。該測(cè)定結(jié)果如圖15～19所示。
(1)抗氧化指標(biāo)(1-1)血液多酚濃度如圖15所示，溴酸鉀給藥前各組的血液多酚濃度的初期值都是一定的，而在物質(zhì)1和各比較物質(zhì)在給藥7天以后溴酸鉀給藥第0天，物質(zhì)1組顯示了最高的值，其次是比較物質(zhì)2組。物質(zhì)1的給藥升高了血液多酚濃度，確認(rèn)其升高率明顯高于各比較物質(zhì)。
(1-2)血液抗氧化能力(TEAC)如圖16所示，物質(zhì)1和各比較物質(zhì)的一周預(yù)先給藥使血液抗氧化能力表現(xiàn)出升高的傾向，和各比較物質(zhì)相比，物質(zhì)1的給藥顯著提高了抗氧化能力。
(1-3)血液過氧化脂質(zhì)濃度物質(zhì)1和各比較物質(zhì)的一周預(yù)先給藥抑制了溴酸鉀給藥引起的血液過氧化脂質(zhì)濃度的升高。如圖17所示，該效果在物質(zhì)1組最高，和各比較物質(zhì)給藥組相比顯示了明顯的低值。
(2)疾病指標(biāo)
(2-1)血液尿素氮濃度如圖18所示，溴酸鉀給藥后血液尿素氮濃度和未處理的相比明顯升高。物質(zhì)1和各比較物質(zhì)的給藥抑制了溴酸鉀給藥引起的血液尿素氮濃度的升高。和各比較物質(zhì)相比，物質(zhì)1的給藥對(duì)抑制血液尿素氮濃度的升高是顯著的。
(2-2)血液肌酸酐濃度如圖19所示，溴酸鉀給藥后血液肌酸酐濃度和未處理的相比明顯升高。物質(zhì)1和各比較物質(zhì)的給藥抑制了溴酸鉀給藥引起的血液肌酸酐濃度的升高。和各比較物質(zhì)相比，物質(zhì)1給藥顯著抑制了血液肌酸酐濃度的升高。
比較物質(zhì)3、比較物質(zhì)4和比較物質(zhì)5是富含原花色素多聚體(大分子)的物質(zhì)，雖然在試管內(nèi)(體外)顯示很高的抗氧化活性，但是被生物體攝取時(shí)，低分子化的物質(zhì)1顯示了更高的抗氧化活性。雖然比較物質(zhì)2是單體(兒茶素)，但是仍然是物質(zhì)1的活性更高，從血液中的多酚含量來看，也證明物質(zhì)1由于降低了分子量而易于被生物體吸收，在生物體內(nèi)也顯示了很高的抗氧化活性。物質(zhì)1的預(yù)先給藥能夠升高血液的抗氧化能力，發(fā)揮抗氧化活性。其結(jié)果是抑制了溴酸鉀給藥引起的血液過氧化脂質(zhì)濃度的升高，抑制了腎功能障礙，抑制了尿素氮、肌酸酐向血液的滲漏。該效果顯著高于各比較物質(zhì)，明確了和迄今已知的以大分子多酚為主體的多酚物質(zhì)和單體(兒茶素)相比，在被生物體吸收時(shí)其抗氧化性能更加優(yōu)越。
通過單次給藥毒性試驗(yàn)來評(píng)價(jià)安全性。即，物質(zhì)1以每kg體重為2.5、5.0、7.5、10.0g的給藥量，分別對(duì)8、7、3、18只ddY系小鼠(9周齡，雄性)強(qiáng)制口服。給藥后觀察行為變化、死亡的情況，計(jì)算出LC50。其結(jié)果，物質(zhì)1的50％致死濃度(LC50)是5.0g/kg體重(95％置信區(qū)間3.5～6.4g/kg體重)。而且，未觀察到給藥后的行為異常，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)的解剖觀察也未見異常。所以，確認(rèn)物質(zhì)1作為食品是安全性極高的物質(zhì)。
在上述的試驗(yàn)例4(人體監(jiān)測(cè)試驗(yàn))中，以問卷的方式收集了被檢者的評(píng)論。其中，與睡眠相關(guān)的內(nèi)容如表10所示，關(guān)于疲勞感、頭腦清晰、胃功能，通過5個(gè)階段的評(píng)價(jià)得出的結(jié)果如表11所示。
表10

表11

(數(shù)值越大代表狀態(tài)越良好，括號(hào)內(nèi)是給藥前的數(shù)值)
權(quán)利要求
1.一種含有含硫原花色素寡聚物作為主要成分的組合物，其中所述寡聚物是通過使含有原花色素類的植物或其提取物與含有SH基的化合物反應(yīng)制得的反應(yīng)溶液進(jìn)行濃縮和干燥而得到。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含硫原花色素寡聚物組合物，其中所述寡聚物是原花色素的二聚體到五聚體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含硫原花色素寡聚物組合物，其中所述含有原花色素類的植物是從蔬菜水果類、茶類、草本植物及香料類、木材及樹皮類之中選擇的一種或以上。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含硫原花色素寡聚物組合物，其中所述含有SH基的化合物是從半胱氨酸、胱氨酸、谷胱甘肽、含有SH基的肽和它們的鹽類之中選擇的至少一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1～4中任一項(xiàng)所述的組合物，其是用于治療和/或預(yù)防生活習(xí)慣疾病的醫(yī)藥組合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1～4中任一項(xiàng)所述的組合物，其是用于預(yù)防衰老的醫(yī)藥組合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求1～4中任一項(xiàng)所述的組合物，其是用于改善和/或預(yù)防生活習(xí)慣疾病的健康食品組合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1～4中任一項(xiàng)所述的組合物，其是用于預(yù)防衰老的健康食品組合物。
9.一種含硫原花色素寡聚物，其是將權(quán)利要求1所述的通過使含有原花色素類的植物或其提取物與含有SH基的化合物反應(yīng)制得的含有含硫原花色素寡聚物的成分進(jìn)行分餾而得到的。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的含硫原花色素寡聚物，其中所述寡聚物是含硫原花色素的二聚體到五聚體。
11.一種含硫原花色素寡聚物組合物的制造方法，其特征在于，在酸性條件下使含有原花色素類的植物或其提取物與含有SH基的化合物反應(yīng)，將所得的反應(yīng)溶液濃縮和干燥。
12.一種含硫原花色素寡聚物的制造方法，其特征在于，在酸性條件下使含有原花色素類的植物或其提取物與含有SH基的化合物反應(yīng)，將所得的反應(yīng)溶液進(jìn)行濃縮和分餾處理。
13.根據(jù)權(quán)利要求11或12所述的制造方法，其中所述含有原花色素的植物是從蔬菜水果類、茶類、草本植物及香料類、木材及樹皮類之中選擇的一種或以上。
14.根據(jù)權(quán)利要求11或12所述的制造方法，其中所述的含有SH基的化合物是從半胱氨酸、胱氨酸、谷胱甘肽、含有SH基的肽和它們的鹽類之中選擇的至少一種。
15.根據(jù)權(quán)利要求11或12所述的制造方法，其中使用無機(jī)酸、有機(jī)酸或它們兩者得到所述酸性條件。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的制造方法，其中使用從鹽酸、硫酸、硝酸、醋酸、檸檬酸、抗壞血酸、蘋果酸之中選擇的至少一種。
17.由下述式(4)所示的原花色素化合物。
18.由下述式(5)所示的原花色素化合物。
19.由下述式(6)所示的原花色素化合物。
20.由下述式(7)所示的原花色素化合物。
21.由下述式(8)所示的原花色素化合物。
全文摘要
本發(fā)明提供一種制造含硫原花色素寡聚物的方法，其是將植物中原花色素類的分子量降低至成為容易被生物體的腸道吸收的程度，并提供以該方法得到的含硫原花色素寡聚物作為有效成分的健康食品組合物和醫(yī)藥品組合物，其用于治療和預(yù)防由于活性氧的生成等原因所產(chǎn)生的各種生活習(xí)慣疾病和腦疾病、以及用于預(yù)防衰老。
文檔編號(hào)C07D311/62GK1697834SQ20048000049
公開日2005年11月16日 申請(qǐng)日期2004年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月26日
發(fā)明者野中源一郎, 孫步祥, 袁嵐, 中川喬, 藤井創(chuàng), 徐榮俊 申請(qǐng)人:阿明諾化學(xué)株式會(huì)社, 鳥犀圓制藥株式會(huì)社