專(zhuān)利名稱(chēng)：一種在基片上固定化和伸展核酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及如下幾方面一種使核酸固定化并伸展在硅基片上的方法，按照此方法制備的核酸和基片，本方法的用途，以及這種核酸和基片的用途。
背景技術(shù)：
A.使DNA伸展和固定化在疏水性基片上Bensimon等(1994，1995)最初建立了一種稱(chēng)為“分子梳理”的方法，用于高分辨率基因組研究。此方法高度依賴(lài)于基片的疏水性和溶液的pH。不同類(lèi)型的疏水性基片都適合于分子梳理，包括聚合物如聚苯乙烯(PS)，聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)和聚碳酸酯，以及用疏水性硅烷處理過(guò)的玻璃。最近的發(fā)展包括使用可嵌入DNA的帶有取代基的疏水性聚合物(Nakao等(2002)，Nano Lett.2，475)。此外還已證明，仿制的例如PS可控制DNA在基片上的定位(Klein等(2001)，應(yīng)用物理學(xué)通訊.78，2396)。
在分子梳理過(guò)程中，通過(guò)“移動(dòng)的彎月面”機(jī)制使DNA發(fā)生伸展。雖然對(duì)于使DNA連接于疏水性表面的機(jī)制還不確定，但是據(jù)信涉及DNA末端的變性過(guò)程，變性暴露出疏水性堿基，并使它們能夠與表面相互作用。這種相互作用是強(qiáng)有力的，足以防止在伸展過(guò)程中，以及在隨后的處理中，例如暴露于DNA-結(jié)合分子的溶液，使DNA發(fā)生移動(dòng)。
分子梳理通?？蓪?dǎo)致雙鏈DNA分子伸長(zhǎng)超過(guò)它們的B-型分子輪廓長(zhǎng)度的大約50％。這種過(guò)度的伸展可能導(dǎo)致其二級(jí)結(jié)構(gòu)從B-型轉(zhuǎn)變?yōu)镾-型，或者還可能導(dǎo)致鏈分離。在這二種情況下，過(guò)度伸展都可以影響被梳理的DNA與DNA-結(jié)合蛋白質(zhì)相互作用的能力。Gueroui等(2002)最近建立了一種簡(jiǎn)便的方法，通過(guò)使用1-十二烷醇降低空氣-水界面的表面張力，來(lái)避免在梳理過(guò)程中DNA過(guò)度伸展。
除了分子梳理法之外，還建立了幾種其它的方法用于伸展單一的DNA分子。這些方法包括借助于旋涂(spin-coating)，液體流動(dòng)，電場(chǎng)，以及在蒸發(fā)液滴中的對(duì)流作用力使分子拉長(zhǎng)。
分子梳理法及其相關(guān)方法的主要應(yīng)用是DNA分析，包括基因組測(cè)序和遺傳疾病篩選。通常依賴(lài)于熒光標(biāo)記對(duì)伸展的和固定化的DNA進(jìn)行分析，并借助于光學(xué)顯微鏡檢測(cè)(包括掃描近場(chǎng)光學(xué)顯微鏡(SNOM)，或者使用零-模式波導(dǎo))，但是還使用了幾種新方法如原子力顯微鏡(AFM)，掃描隧道顯微鏡(STM)，以及掃描電化學(xué)顯微鏡(SECM)。分子梳理法及其相關(guān)方法的其它應(yīng)用包括DNA歸檔保存和金屬?lài)娡俊?br> B.氫-端接的硅在半導(dǎo)體工業(yè)，用含水HF蝕刻是產(chǎn)生沒(méi)有污染的，并對(duì)后續(xù)化學(xué)處理穩(wěn)定的硅表面的關(guān)鍵步驟。用HF處理可除去天然的或受熱生長(zhǎng)的氧化層，遺留下以氫化硅(Si-H)基團(tuán)端接的表面。產(chǎn)生于單晶硅晶片表面的確切特性取決于晶體的取向以及蝕刻的條件。以稀釋的(1-2％)HF水溶液處理Si(100)可產(chǎn)生二氫化物端接的(＝SiH2)表面，而以含水NH4F處理Si(111)可產(chǎn)生單氫化物端接的(＝SiH)表面。后者成階梯形，但此臺(tái)階具有原子級(jí)平整面(Higashi等，1990)。
由于S-H結(jié)合的非極性特點(diǎn)，這二種表面都是疏水性的。
H-端接的Si(100)表面與其Si(111)相比較穩(wěn)定性較差，因?yàn)樵冢絊iH2基團(tuán)中的二個(gè)H原子很靠近，足以在它們之間引起很強(qiáng)的靜電排斥力。這就使二氫端接的表面對(duì)與H2O(OH-)的化學(xué)反應(yīng)更加敏感，并形成臺(tái)階或缺陷。而且，某些F-端接基團(tuán)通常也是在HF處理的過(guò)程中形成，這些基團(tuán)容易被水解。Mrita和Tokunoto(1995)曾發(fā)現(xiàn)，通過(guò)加入HCl降低HF溶液的pH可抑制水解，但是，形成的表面仍然是階梯形。Luo等(1997)曾報(bào)道用HF∶H2O 1∶50的溶液處理p-型Si(100)基片一分鐘，形成了非常光滑和無(wú)特征的表面(表面粗糙度在0.1nm的范圍內(nèi))，而Cerofolini等(2003)曾報(bào)道，相似的處理形成了具有原子級(jí)平整面的階梯，寬度大約100nm，由成對(duì)的扭結(jié)分隔。因此，據(jù)本領(lǐng)域現(xiàn)有的知識(shí)還不清楚是否可以在Si(100)上產(chǎn)生平整的H-端接表面，以及在室溫條件下這種表面的穩(wěn)定性如何。
核酸技術(shù)和硅技術(shù)已被有機(jī)地結(jié)合在一起，并且也是繼續(xù)深入研究的努力目標(biāo)。雖然已經(jīng)存在幾種以硅為基礎(chǔ)的“DNA”芯片，但是都不能提供既平整又有導(dǎo)電性的DNA-結(jié)合表面。這種基片使之有可能通過(guò)單分子技術(shù)的組合(例如STM，AFM，SNOM和SECM)，以及通過(guò)電分析對(duì)DNA進(jìn)行檢測(cè)和分析。而且，對(duì)于以DNA為基礎(chǔ)的納米級(jí)電子儀器，它們將是適合的平臺(tái)。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是，提供一種制作Si-表面的方法，這種表面比迄今已知的其它表面平整，可用于核酸分析。本發(fā)明還有一個(gè)目標(biāo)是提供一種方法，能夠?qū)⒑怂嶙鳛閱为?dú)的分子固定化和伸展在一種基片的表面。此外本發(fā)明還有一個(gè)目標(biāo)是，提供一種制作可用于隨后固定化核酸的平整基片的方法，這種基片還可以是導(dǎo)電性的。
借助于一種將核酸固定化和伸展在基片上的方法，實(shí)現(xiàn)了所有的這些目標(biāo)，此方法包括如下步驟a)提供一種硅基片，b)在所述硅基片的表面施加氟化銨或氟化氫溶液，c)使氟化銨或氟化氫溶液在所述硅基片表面保留一段規(guī)定的時(shí)間，d)在所述表面施加核酸溶液，e)借助于選自如下的方法使核酸固定化并伸展分子梳理，旋涂，施加液流，施加電場(chǎng)，對(duì)所述核酸溶液的蒸發(fā)液滴施加對(duì)流作用力，以及上述方法的任何組合形式。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述硅基片來(lái)自摻雜或未摻雜硅的單晶體，其中優(yōu)選地是所述硅的單晶體具有(100)或(111)表面取向。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述硅基片在表面具有氧化硅層，其中所述氧化硅層優(yōu)選地是天然的或熱生長(zhǎng)的。
所述氧化物層優(yōu)選地具有1nm-15μm的厚度。
在另一實(shí)施方案中，所述硅基片以金屬電極排成圖案，其中此金屬電極優(yōu)選地由包括金的材料制成。
在一個(gè)實(shí)施方案中，氟化銨溶液是NH4F(氟化銨)的水溶液，優(yōu)選的濃度是0.1-11M氟化銨，更優(yōu)選的是0.5-5M，更加優(yōu)選的是2M。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述NH4F水溶液還補(bǔ)充含有NH4OH，其濃度足以將此水溶液的pH調(diào)整至9-10。
在一個(gè)實(shí)施方案中，氟化氫溶液是HF(氟化氫)的水溶液，優(yōu)選地具有0.06-6M的濃度，更優(yōu)選的是0.2-2M，更加優(yōu)選的是0.6M。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述HF水溶液還補(bǔ)充含有HCl，其濃度是0.01-10M，優(yōu)選地是0.03-3M，更優(yōu)選地是0.3M(HCl的最后濃度)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述氟化銨或氟化氫溶液保留在硅基片表面的規(guī)定持續(xù)時(shí)間是0.1-60分鐘，優(yōu)選地是0.1-30分鐘，更優(yōu)選地是0.1-20分鐘，而最優(yōu)選地是0.1-10分鐘。最佳時(shí)間取決于氧化物層的厚度，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易確定。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸是DNA，優(yōu)選地是雙鏈或單鏈的DNA，RNA或PNA，核酸單獨(dú)存在，或者與一種或幾種蛋白質(zhì)復(fù)合，另外其特征在于，所述核酸溶液是核酸的水溶液。
在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟d)和e)同時(shí)進(jìn)行.
在另一實(shí)施方案中，在步驟d)之后進(jìn)行步驟e)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，在表面活性劑存在下進(jìn)行步驟e)。
所述表面活性劑選自長(zhǎng)鏈醇，優(yōu)選1-辛醇，1-癸醇，或1-十二烷醇。
優(yōu)選地是在步驟d)之前從所述硅基片表面除去所述氟化銨溶液或氟化氫溶液。
借助于在硅基片上的核酸可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目標(biāo)，這種核酸是按照本發(fā)明的方法準(zhǔn)備的。
借助于一種硅基片也可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目標(biāo)，在此硅基片的一個(gè)表面具有被固定化和被伸展的核酸，所述基片是按照本發(fā)明的方法準(zhǔn)備的。
而且，借助于本發(fā)明核酸和本發(fā)明基片的組合也可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目標(biāo)。
此外，通過(guò)將本發(fā)明的核酸，本發(fā)明的硅基片，以及/或者本發(fā)明的核酸和硅基片的組合用于核酸分析，也可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目標(biāo)，特別是測(cè)序、轉(zhuǎn)錄研究以及篩查基因的多態(tài)性和/或基因失常，其中優(yōu)選地是借助于光學(xué)顯微鏡進(jìn)行核酸分析，包括熒光顯微鏡，掃描近場(chǎng)光學(xué)顯微鏡(SNOM)，使用零模式波導(dǎo)，原子力顯微鏡(AFM)，掃描隧道顯微鏡(STM)，以及掃描電化學(xué)顯微鏡(SECM)。
通過(guò)將本發(fā)明的方法用于光學(xué)顯微鏡也可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目，包括熒光顯微鏡，掃描近場(chǎng)光學(xué)顯微鏡(SNOM)，使用零模式波導(dǎo)，原子力顯微鏡(AFM)，掃描隧道顯微鏡(STM)，以及掃描電化學(xué)顯微鏡(SECM)。
在此使用的名詞“(100)表面取向”和“(111)表面取向”用于標(biāo)明單晶硅內(nèi)的特征取向，這種取向是本領(lǐng)域周知的。
名詞“硅基片”意指其中主要成分是天然硅的任何一種基片。
本發(fā)明者設(shè)計(jì)了一種方法，此方法與本領(lǐng)域現(xiàn)有的方法相比較具有本發(fā)明的如下有利特征簡(jiǎn)便.此種基片容易制備，除了用氟化銨或氟化氫，特別是優(yōu)選的NH4F或HF水溶液處理之外，不需要用于結(jié)合核酸的任何化學(xué)試劑。也不需要對(duì)核酸作任何化學(xué)修飾。
基片平整.大多數(shù)用于核酸固定化的基片都粗糙，不能通過(guò)掃描探針或掃描近場(chǎng)光學(xué)技術(shù)形成高分辨率圖象。按照本發(fā)明的方法可以制作平整的基片。在此使用的名詞，平整的基片，規(guī)定通常應(yīng)具有的平均表面粗糙度為在整個(gè)1-5μm2的面積0.1nm或更小((100)表面取向)，或者在一個(gè)臺(tái)階上0.1nm或更小((111)表面取向)。
不存在有機(jī)層.預(yù)期此核酸將來(lái)的應(yīng)用包括把它作為模板，用于以納米微粒催化劑促進(jìn)其納米微絲的取向生長(zhǎng)。其生長(zhǎng)條件很可能需要高溫，因此避免使用有機(jī)膜如聚苯乙烯，聚丙烯酸甲酯和/或聚碳酸酯，將是有益的。
導(dǎo)電性.摻雜的Si具有充分的導(dǎo)電性，足以用作電分析電極和用作STM分析的基片。還可以把它用于對(duì)以核酸為基礎(chǔ)的納米電子儀器進(jìn)行電動(dòng)控制。目前用于核酸固定化的導(dǎo)電性基片都需要作特殊的表面修飾處理。
在按照本發(fā)明方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，使用了如下工藝參數(shù)基片Si(100)或Si(111)，摻雜的(n-型或p-型)或未摻雜的，表面具有天然的或熱生長(zhǎng)的氧化物層。
HF或NH4F處理Si(100)HF水溶液(0.6M
)，可含有HCl(0.01-10M)，在0-100℃處理0.1-10分鐘。
Si(111)NH4F水溶液(2M
)，可含有NH4OH(0.01-10M)，在0-100℃處理0.1-10分鐘。
核酸DNA(雙鏈或單鏈的)，RNA，PNA，核酸-蛋白質(zhì)復(fù)合物，以1ng/L-1g/L的濃度溶解于水溶液中(pH 4-10)。
對(duì)基片施加核酸的方法
在4-80℃持續(xù)1秒鐘-1小時(shí)，優(yōu)選地同時(shí)使核酸分子伸長(zhǎng)(通過(guò)旋涂，分子梳理，液體流動(dòng)，電場(chǎng)和對(duì)流作用力等)，在有表面活性劑如長(zhǎng)鏈醇存在時(shí)可防止過(guò)度伸展，優(yōu)選的長(zhǎng)鏈醇為1-辛醇，1-癸醇，或1-十二烷醇。


圖1顯示按照本發(fā)明的方法制備的H-端接Si(100)的AFM圖象。其表面是平整的，具有類(lèi)似于以天然氧化物端接的原始Si基片的粗糙度。
圖2是按照下面的實(shí)施例固定化在H-端接Si(100)上的小牛胸腺DNA的AFM圖象，顯示出在其表面有許多伸展的DNA分子。
圖3顯示圖2中圖象的高度分布。這些高度指示出，DNA分子主要以單獨(dú)的和成對(duì)的分子形式存在。
圖4顯示在云母上大約30nm厚度的聚苯乙烯膜的AFM圖象。表面粗糙度比圖1中H-端接Si(100)基片的粗糙度大4-5倍。
圖5顯示在云母上，固定在大約30nm厚度聚苯乙烯上的小牛胸腺DNA的AFM圖象，其中是借助于分子梳理法使核酸固定。
圖6顯示圖5中圖象的高度分布。這些高度指示出，DNA分子主要以成束和結(jié)合的分子形式存在。
下面將通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，此實(shí)施例僅為了說(shuō)明，沒(méi)有限制的目的。
具體實(shí)施例方式
將DNA溶解于含有0.010M磷酸鈉，pH 7.0的緩沖水溶液中(DNA為I型，鈉鹽，“高度聚合的”，來(lái)自小牛胸腺，Sigma產(chǎn)品號(hào)D-1501)。此DNA的濃度為10mg/L。用水將濃縮的(48wt％)HF水溶液稀釋至1wt％。從微電子級(jí)n-型Si(100)芯片切取基片(5mm×5mm)，此芯片在其磨光的表面覆蓋了約2nm的天然氧化物層。在用氧等離子體清潔此基片((3mbar)壓力，持續(xù)10分鐘)之后，將它在1wt％HF中浸泡1分鐘，然后用壓縮空氣干燥(見(jiàn)圖1如此制備的Si-基片AFM圖象)。將50μL DNA溶液施加于所形成的H-端接的Si基片，保持1分鐘然后旋涂。將此基片以4000rpm轉(zhuǎn)速離心1分鐘，然后用幾滴水淋洗，再在空氣中干燥，同時(shí)旋轉(zhuǎn)。所述樣品的AFM圖象(圖2和3)顯示出在平整表面上被伸展的單個(gè)DNA分子(高度小于1nm)。與此顯著不同，在云母上的聚苯乙烯膜比它粗糙4-5倍，并且，通過(guò)DNA的高度鑒別表明，固定化在它上面的核酸主要是成束地存在(見(jiàn)圖4-6) 。
在此說(shuō)明書(shū)、權(quán)利要求書(shū)、以及/或者在附圖中公開(kāi)的本發(fā)明的特征，既可能單獨(dú)地，也可能以它們的任何組合形式，成為以不同的方式實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的素材。
權(quán)利要求
1.一種在基片上固定化和伸展核酸的方法，包括如下步驟a)提供一種硅基片，b)在所述硅基片的表面施加氟化銨或氟化氫溶液，c)使氟化銨或氟化氫溶液在所述硅基片表面保留一段規(guī)定的時(shí)間，d)在所述表面施加核酸溶液，e)借助于選自如下的方法使核酸固定化并伸展分子梳理，旋涂，施加液流，施加電場(chǎng)，對(duì)所述核酸溶液的蒸發(fā)液滴施加對(duì)流作用力，以及上述方法的任何組合形式。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，所述硅基片來(lái)自摻雜或未摻雜硅的單晶體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其特征在于，所述硅的單晶體具有(100)或(111)表面取向。
4.根據(jù)上述權(quán)利要求任何之一的方法，其特征在于，所述硅基片在表面具有氧化硅層。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其特征在于，所述氧化硅層是天然的或熱生長(zhǎng)的。
6.根據(jù)權(quán)利要求4-5中任何之一的方法，其特征在于，所述氧化硅層具有1nm-15μm的厚度。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任何之一的方法，其特征在于，所述硅基片以金屬電極排成圖案。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其特征在于，所述金屬電極由包括金的材料制成。
9.根據(jù)上述權(quán)利要求中任何之一的方法，其特征在于，所述氟化銨溶液是NH4F的水溶液。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任何之一的方法，其特征在于，所述氟化氫溶液是氟化氫的水溶液。
11.根據(jù)上述權(quán)利要求中任何之一的方法，其特征在于，所述氟化銨或氟化氫溶液保留在硅基片表面的規(guī)定持續(xù)時(shí)間是0.1-60分鐘，優(yōu)選地是0.1-30分鐘，更優(yōu)選地是0.1-20分鐘，而最優(yōu)選地是0.1-10分鐘。
12.根據(jù)上述權(quán)利要求中任何之一的方法，其特征在于，所述核酸是DNA，優(yōu)選地是雙鏈或單鏈的DNA，RNA或PNA，核酸單獨(dú)存在，或者與一種或幾種蛋白質(zhì)復(fù)合，另外其特征在于，所述核酸溶液是核酸的水溶液。
13.根據(jù)上述權(quán)利要求中任何之一的方法，其特征在于，步驟d)和e)同時(shí)進(jìn)行。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任何之一的方法，其特征在于，在步驟d)之后進(jìn)行步驟e)。
15.根據(jù)上述權(quán)利要求中任何之一的方法，其特征在于，在表面活性劑存在下進(jìn)行步驟e)。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其特征在于，所述表面活性劑選自長(zhǎng)鏈醇，優(yōu)選1-辛醇，1-癸醇，或1-十二烷醇。
17.根據(jù)上述權(quán)利要求中任何之一的方法，其特征在于，在步驟d)之前從所述硅基片表面除去所述氟化銨溶液或氟化氫溶液。
18.一種在硅基片上的核酸，所述核酸是按照上述權(quán)利要求中任何之一的方法準(zhǔn)備的。
19.一種硅基片，在它的一個(gè)表面上具有被固定化和伸展的核酸，所述基片是按照上述權(quán)利要求中任何之一的方法準(zhǔn)備的。
20.一種權(quán)利要求18的核酸和權(quán)利要求19的硅基片的組合。
21.權(quán)利要求18的核酸，權(quán)利要求19的硅基片，以及/或者權(quán)利要求20的所述核酸和硅基片的組合的用途，用于核酸的分析，特別是測(cè)序、轉(zhuǎn)錄研究以及篩查基因的多態(tài)性和/或基因失常。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的用途，其特征在于，借助于光學(xué)顯微鏡進(jìn)行核酸分析，包括熒光顯微鏡，掃描近場(chǎng)光學(xué)顯微鏡(SNOM)，使用零模式波導(dǎo)，原子力顯微鏡(AFM)，掃描隧道顯微鏡(STM)，以及掃描電化學(xué)顯微鏡(SECM)。
23.權(quán)利要求1-17中任何之一的方法用于光學(xué)顯微鏡的用途，包括熒光顯微鏡，掃描近場(chǎng)光學(xué)顯微鏡(SNOM)，使用零模式波導(dǎo)，原子力顯微鏡(AFM)，掃描隧道顯微鏡(STM)，以及掃描電化學(xué)顯微鏡(SECM)。
全文摘要
本發(fā)明涉及如下幾方面一種使核酸固定化并伸展在硅基片上的方法，按照此方法制備的核酸和基片，本方法的用途，以及這種核酸和基片的用途。
文檔編號(hào)C07H21/00GK1609211SQ200410078779
公開(kāi)日2005年4月27日 申請(qǐng)日期2004年9月17日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月18日
發(fā)明者W·E·福特, J·維澤爾斯, 章夫安田 申請(qǐng)人:索尼國(guó)際(歐洲)股份有限公司