專利名稱：一種豬卵透明帶－3β蛋白的合成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地說是一種豬卵透明帶-3β蛋白的合成方法。
背景技術(shù)：
在全世界人口急劇增加的今天，避孕的研究正越來越受到人們的重視。以免疫方式抑制受精而非破壞早期胚胎發(fā)育的避孕方式比較符合人道主義精神，因此對相關(guān)的免疫避孕疫苗的開發(fā)具有重要的意義。哺乳動物透明帶是哺乳動物卵母細胞外的一層半透明的酸性糖蛋白膜，在誘發(fā)精子頂體反應(yīng)、精卵識別、結(jié)合、穿透后阻止多精入卵的過程中起著重要作用。在哺乳動物細胞透明帶的研究中，對小鼠和豬的透明帶的研究最為深入，而豬透明帶(pig Zona pellucida，pZP)對異種哺乳動物有很強的免疫原性，其抗體與人透明帶有交叉反應(yīng)并具有阻斷人精卵相互反應(yīng)的能力，因而可以發(fā)展成為避孕疫苗及其相關(guān)生物制品。
豬卵母細胞外包繞著一層非細胞性半透明被膜，它是由生物化學(xué)和免疫學(xué)性質(zhì)截然不同的3種糖蛋白組成，分別是相對蛋白分子質(zhì)量79kDa的pZP1、59kDa的pZP3α和46kDa的pZP3β。通常認為pZP3α上含有精子接觸的主要受體，然而進一步的研究發(fā)現(xiàn)，pZP3β能輔助pZP3α形成高分子量的復(fù)合物使產(chǎn)生非常高親和性的精卵結(jié)合，其效果遠遠高于pZP3α的單獨作用，因此pZP3β與精卵反應(yīng)有重要的關(guān)系。另外，由于抗pZP3β抗體能在體外與人ZP發(fā)生交叉反應(yīng)，從而抑制人精卵結(jié)合，故它也一直被看作是研制抗受精避孕疫苗的一個潛在抗原。因此獲得大量的pZP3β對于制備相關(guān)避孕疫苗及診斷不育癥試劑盒的開發(fā)是相當(dāng)必要的，而目前獲得pZP3β的方法主要是采用生化提取技術(shù)直接從豬卵巢中提取，這種方法工藝復(fù)雜、成本昂貴、且不適于大量生產(chǎn)。
pZP3β的DNA已于1994年被克隆(Jerrrey D.Harris等，TheJournal of sequencing and mapping，Vol.4，PP.361-393)，有研究人員也針對該基因進行了原核系統(tǒng)的融合表達，但從目前公開的報道看，在原核系統(tǒng)中對其進行表達的表達率都很低，而且采用的表達系統(tǒng)只能用于試驗室研究(徐萬祥等，生物工程學(xué)報，Vol.17，16-19，2001)，對后期的開發(fā)有局限性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種工藝簡單、成本低、適用于大規(guī)模生產(chǎn)豬卵透明帶-3β蛋白的方法。
本發(fā)明首先是在不改變天然豬卵透明帶-3β蛋白的氨基酸序列的情況下，對天然豬卵透明帶-3β基因的翻譯起始區(qū)前十個密碼子進行偏好性的修改。前10個密碼子未修改前為CCG CAG CCC GTC TGGCAG GAC GAA GGC CAG。經(jīng)過修改后，前10個密碼子的堿基改變?yōu)镃CG CAACCGGTGTGG CAAGATGAA GGC CAG；修改前G+C含量為73.32％，經(jīng)過綜合考慮密碼子偏好性和對其G+C含量的適當(dāng)降低，修改后的G+C含量降為63.32％。然后，以此設(shè)計引物，并引入適當(dāng)?shù)拿盖形稽c，則上游引物為5’＜ CCG CAACCGGTGTGG CAAGATGAA GGC CAG＞3’，酶切下游引物5’＜ TTA TCA CGA GGT GGG GGA GGA GGT GGA＞3；其中 代表酶切位點的堿基序列。
然后以含有天然未修改的膜外型豬卵透明帶-3β基因的質(zhì)粒pZ57為模板，以合成的上下游引物進行PCR擴增，反應(yīng)條件為首先94℃5min，再94℃30sec、58℃45sec、72℃45sec共30個循環(huán)，再72℃10min。獲得的PCR產(chǎn)物進行1％瓊脂糖電泳分離后，對目的片段切膠回收，采用常規(guī)的可方便購買到的DNA凝膠回收試劑盒提取純化，收集純化后的目的片段。
目標(biāo)載體pET-3c采用NdeI和BamHI雙酶切，PCR擴增的pZP3β基因片段也用NdeI和BamHI雙酶切，分別純化后用T4DNA連接酶16℃1h～16h連接。
將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布LB-AMP平板，37℃培養(yǎng)過夜，隨機挑取3-5個菌落小規(guī)模提取質(zhì)粒，酶切鑒定，再將有酶切片段的重組子進行PCR擴增鑒定，進一步確定pZP3β目的基因片段已克隆到pET-3c載體中，形成重組質(zhì)粒pET-ZP3β。
將重組質(zhì)粒pET-ZP3β轉(zhuǎn)化入宿主菌BL21(DE3)pLYSs，涂布LB-AMP平板，37℃培養(yǎng)過夜，隨機挑取1個菌落，于含有AMP和氯霉素的5mlLB液體培養(yǎng)基中擴增培養(yǎng)，至OD值約為0.6時，加人IPTG誘導(dǎo)表達pZP3β非融合目的蛋白，誘導(dǎo)3h后收集菌體，加入蛋白裂解液進行SDS-PAGE表達分析。
完成表達產(chǎn)物的SDS-PAGE后，將凝膠進行電轉(zhuǎn)移，以將所有蛋白條帶轉(zhuǎn)印到醋酸纖維膜上，采用-抗pZP3β抗體的兔抗豬IgGs和二抗羊抗兔IgG進行免疫印記分析。
本發(fā)明對pZP3β的DNA序列首先去信號肽和跨膜區(qū)使之成為膜外型的非融合基因，在不改變氨基酸序列的情況下進行了適當(dāng)位點的點突變，克隆到適合工業(yè)化生產(chǎn)的表達載體中，再轉(zhuǎn)化到適當(dāng)?shù)墓こ叹羞M行表達。通過這一系列的調(diào)整，結(jié)果表明只有這種修改后的基因序列才能在原核表達系統(tǒng)中能得到理想的非融合膜外型豬卵透明帶-3β蛋白的表達。用該方法來生產(chǎn)豬卵透明帶-3β蛋白具有工藝簡單、成本低、適用于大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點。


圖1是重組質(zhì)粒pET-ZP3β中目的片段的測序結(jié)果圖；圖2是重組質(zhì)粒pET-ZP3β的酶切鑒定和PCR鑒定電泳圖；圖3是pZP3β蛋白的誘導(dǎo)表達電泳圖；圖4是pZP3β蛋白的免疫印記分析電泳圖。
具體實施例方式
實施例1
(1)引物合成引物由上海博亞生物工程公司合成。
ZPF5’＜ CCG CAACCGGTGTGG CAAGATGAAGGC CAG＞3’ZPR5’＜ TTA TCA CGA GGT GGG GGA GGA GGTGGA＞3(2)pZP3β目的基因片段的PCR擴增以pZ57為模板，以合成的上下游引物進行PCR擴增，反應(yīng)條件為首先94℃5min，再94℃30sec、58℃45sec、72℃45sec共30個循環(huán)，再72℃10min。切膠回收，收集目的片段pZP3β。
(3)重組質(zhì)粒pET-ZP3β的構(gòu)建pET-3c用NdeI和BamHI雙酶切，PCR擴增的pZP3β基因片段也用NdeI和BamHI雙酶切，分別純化后用T4DNA連接酶16℃30min連接。
(4)重組質(zhì)粒pET-ZP3β的酶切鑒定和PCR鑒定將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布LB-AMP平板，37℃培養(yǎng)過夜，隨機挑取3-5個菌落小規(guī)模提取質(zhì)粒，酶切鑒定，再將有酶切片段的重組子進行PCR擴增鑒定，進一步確定pZP3β目的基因片段已克隆到pET-3c載體中，形成重組質(zhì)粒pET-ZP3β。
見圖1，重組質(zhì)粒pET-ZP3β經(jīng)上海博亞生物工程有限公司測序鑒定，結(jié)果證明，其核苷酸序列于預(yù)期的一致。
見圖2，經(jīng)DNA電泳結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒pET-ZP3β經(jīng)雙酶切得到一近1000bp左右的片段，而且通過引物進行PCR的鑒定也表明擴增得到一段近1000bp左右的片段，說明目的基因已克隆入表達載體中。
標(biāo)記如下1λDNA/HindIII；2pET-3C；；3pET-ZP3β；4pET-ZP3β/Nde I+BamH I；5pET-ZP3β的PCR鑒定(PCR ofpET-ZP3β)；6Φ174/HicII；7pET-3C/Nde I+BamH I(5)重組質(zhì)粒pET-ZP3β轉(zhuǎn)化入宿主菌BL21(DE3)pLYSs及其誘導(dǎo)表達pZP3β將重組質(zhì)粒pET-ZP3β轉(zhuǎn)化入宿主菌BL21(DE3)pLYSs，涂布LB-AMP平板，37℃培養(yǎng)過夜，隨機挑取1個菌落，于含有AMP和氯霉素的5mlLB液體培養(yǎng)基中擴增培養(yǎng)，至OD值約為0.6時，加入IPTG誘導(dǎo)表達pZP3β非融合目的蛋白，誘導(dǎo)3h后收集菌體，加入蛋白裂解液進行SDS-PAGE表達分析。
見圖3，SDS-PAGE蛋白電泳結(jié)果顯示，誘導(dǎo)后的菌體蛋白電泳條帶與為誘導(dǎo)的菌體電泳條帶相比，在42Kb處可見一清晰的條帶，為表達的pZP3β非融合目的蛋白，與理論預(yù)計相一致。
標(biāo)記如下1、蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量(Marker)；2、誘導(dǎo)后的重組工程菌(induced)；3、誘導(dǎo)前的重組工程菌(uninduced)。
(6)重組pZP3β蛋白表達產(chǎn)物的免疫印記分析完成表達產(chǎn)物的SDS-PAGE后，將凝膠進行電轉(zhuǎn)移，以將所有蛋白條帶轉(zhuǎn)印到醋酸纖維膜上，采用一抗pZP3β抗體的兔抗豬IgGs和二抗羊抗兔IgG進行免疫印記分析。
見圖4，經(jīng)Westen-blot的分析，在42Kb處有一特異的印跡，說明能與抗pZP3β抗體特異結(jié)合，是預(yù)期的目的蛋白。
標(biāo)記如下1、蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量(Marker)；2、誘導(dǎo)后的重組工程菌(induced)；3、誘導(dǎo)前的重組工程菌(uninduced)。
權(quán)利要求
1.一種合成豬卵透明帶-3β蛋白的方法，其特征在于采用基因工程方法合成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的合成豬卵透明帶-3β蛋白的方法，其特征在于所述的基因工程方法包括如下步驟(1)以5’＜CATATG CCG CAA CCG GTG TGG CAA GAT GAA GGCCAG＞3’和5’＜GGATCC TTA TCA CGA GGT GGG GGA GGA GGTGGA＞3’為引物，質(zhì)粒pZ57為模板，PCR擴增豬卵透明帶-3β基因；(2)PCR擴增的pZP3β基因片段與目標(biāo)載體pET-3c用NdeI和BamHI雙酶切，然后用連接酶連接成重組質(zhì)粒pET-ZP3β；(3)重組質(zhì)粒pET-ZP3β轉(zhuǎn)化入宿主菌BL21(DE3)pLYSs并用刺激因子誘導(dǎo)其表達pZP3β。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的合成豬卵透明帶-3β蛋白的方法，其特征在于步驟(1)所述的PCR擴增的反應(yīng)條件為首先94℃5min，再94℃30sec、58℃45sec、72℃45sec共30個循環(huán)，再72℃10min。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的合成豬卵透明帶-3β蛋白的方法，其特征在于步驟(2)所述的連接酶為T4DNA連接酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的合成豬卵透明帶-3β蛋白的方法，其特征在于步驟(2)所述的用連接酶連接的反應(yīng)條件為16℃1h～16h。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的合成豬卵透明帶-3β蛋白的方法，其特征在于步驟(3)所述的刺激因子為IPTG。
全文摘要
一種豬卵透明帶－3β蛋白的合成方法。豬卵透明帶－3β蛋白與精卵反應(yīng)有重要關(guān)系?？筽ZP3β抗體能在體外與人卵透明帶發(fā)生交叉反應(yīng)，從而抑制人精卵結(jié)合，故其一直被看作是研制抗受精避孕疫苗的一個潛在抗原。因此獲得大量的pZP3β對于制備相關(guān)避孕疫苗及診斷不育癥試劑盒的開發(fā)是相當(dāng)必要的。而目前獲得pZP3β的方法主要是采用生化提取技術(shù)直接從豬卵巢中提取，該種方法工藝復(fù)雜、成本昂貴、且不適于大量生產(chǎn)。本發(fā)明提供了一種工藝簡單、成本低、適用于大規(guī)模生產(chǎn)豬卵透明帶－3β蛋白的方法。
文檔編號C07K14/47GK1789281SQ20041007739
公開日2006年6月21日 申請日期2004年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月17日
發(fā)明者朱偉杰, 謝秋玲, 陳小佳, 孫奮勇, 李菁, 洪岸 申請人:暨南大學(xué)