人卵透明帶蛋白4中的表位肽及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了人卵透明帶蛋白4中的表位肽及其應(yīng)用。具體地，本發(fā)明人提供了一種來(lái)自人卵透明帶蛋白-4(人ZP4蛋白227位-463位)的分離的抗原短肽，所述短肽的結(jié)構(gòu)如式I所示：X1-X-X2(式I)，并滿足以下特征：(a)式I中X為6-7個(gè)氨基酸的核心片段；(b)式I中X1、X2的氨基酸個(gè)數(shù)總和≤2個(gè)；(c)所述的核心片段的序列選自SEQ?ID?NO.:1-6；和(d)所述的短肽具有與抗人ZP4C抗體結(jié)合的活性；其中，“-”表示肽鍵或肽接頭。本發(fā)明表位肽可組合應(yīng)用于檢測(cè)樣品中抗人ZP4蛋白各抗體的存在或含量，從而可高特異性高靈敏度地診斷ZP自身免疫引起的婦女不孕癥，此外，本發(fā)明表位肽還可用于制備具有安全有效優(yōu)點(diǎn)的重組人ZP多表位肽避孕疫苗。
【專利說(shuō)明】人卵透明帶蛋白4中的表位肽及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程和免疫學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地，涉及一組人卵透明帶蛋白4中的表位肽及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】[0002]ZP蛋白(人卵透明帶蛋白)，包括組成蛋白之一的ZP4蛋白，在精卵受精過(guò)程中也起者重要的作用，是精子第二受體。在正常婦女血清中抗ZP抗體一般為陰性，而抗ZP抗體的存在會(huì)結(jié)合ZP蛋白，使精子的運(yùn)動(dòng)能力下降，影響精子穿過(guò)宮頸粘液及上行，并影響精子和ZP蛋白的結(jié)合，從而阻止精卵結(jié)合并導(dǎo)致不孕。在發(fā)生ZP自身免疫的不孕癥婦女中，血清中存在抗ZP蛋白抗體，但由于ZP蛋白抗原的不可獲得性，現(xiàn)有一般檢測(cè)抗原多用與人ZP具交叉反應(yīng)性的豬ZP蛋白，故目前對(duì)抗人ZP抗體的檢測(cè)存在較高的假陽(yáng)性率。
[0003]而在轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，建立特異、靈敏的疾病診斷方法一直是重要研究方向之一。在一般用18或20聚長(zhǎng)表位肽抗原的酶聯(lián)免疫測(cè)定法(ELISA)診斷自身免疫疾病以及諸如流感病毒感染的場(chǎng)合，往往出現(xiàn)30%左右的假陽(yáng)性率，從而影響臨床診斷的準(zhǔn)確性和所建立診斷方法的廣泛應(yīng)用。
[0004]造成此種場(chǎng)合高假陽(yáng)性率的原因很簡(jiǎn)單，即:由于已清楚線性表位由3-8個(gè)氨基酸殘基組成，18或20聚或更長(zhǎng)的合成肽(太短不易作為抗原包被ELISA檢測(cè)板)中顯然有可能存在N個(gè)不被知曉的表位，以及由于病毒和細(xì)菌自然感染(如流感病毒感染等)和自身免疫疾病等諸多原因?qū)е氯梭w內(nèi)通常存在成千上萬(wàn)種但抗體滴度不高的抗體，因此這兩個(gè)因素在以上患者血清稀釋度不可能高(一般1:20-1:100)的情況下，極易產(chǎn)生非特異性交叉反應(yīng)，從而導(dǎo)致高假陽(yáng)性率檢測(cè)結(jié)果。
[0005]另外,基于一旦發(fā)生人ZP自身免疫疾病,暴露在ZP蛋白表面的抗原表位都會(huì)產(chǎn)生它們的抗體這一認(rèn)知，因此解碼靶蛋白的線性抗原表位組顯得尤為重要，因?yàn)槿绱司湍苤獣匀薢P可誘發(fā)多少和哪些ZP表位抗體，進(jìn)而據(jù)此構(gòu)建可替代天然ZP蛋白(由ZP1-ZP4四個(gè)蛋白組成)重組多表位肽抗原，以解決ZP抗體檢測(cè)的抗原來(lái)源和檢測(cè)ZP抗體的特異性和靈敏度等問(wèn)題，也包括為研制安全可逆和有效的人ZP避孕疫苗提供盡可能多的線性抗原表位肽。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明提供了一組可聯(lián)合應(yīng)用于檢測(cè)抗人ZP4蛋白抗體，從而診斷婦女ZP自身免疫不孕病因的ZP4蛋白小分子表位肽，本發(fā)明還提供了該組表位肽在制備避孕疫苗中的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明第一方面，提供了一種來(lái)自人卵透明帶蛋白-4(人ZP4蛋白)227位-463位的分離的短肽，所述短肽的結(jié)構(gòu)如式I所示:
[0008]X1-X-X2
[0009]式I，[0010]并滿足以下特征:
[0011](a)式I中X為6-7個(gè)氨基酸的核心片段；
[0012](b)式I中X1、X2為無(wú)、I或2個(gè)氨基酸，且Xl和X2氨基酸個(gè)數(shù)總和≤2 ；
[0013](c)所述的核心片段的序列選自SEQ ID N0.: 1-6 ;和
[0014](d)所述的短肽具有與抗人ZP4C抗體結(jié)合的活性；
[0015]其中，表示肽鍵或肽接頭。
[0016]在另一優(yōu)選例中，所述的短肽選自如SEQ ID N0.:7_18所示的短肽。
[0017]本發(fā)明第二方面，提供了一種多肽，所述多肽是經(jīng)本發(fā)明第一方面所述的短肽經(jīng)過(guò)1-3個(gè)氨基酸的添加、1-2個(gè)缺失并仍含有所述核心片段X，且具有與抗人ZP4C抗體結(jié)合活性的多肽。
[0018]本發(fā)明的第三方面，提供了一種分離的肽集合，所述的肽集合由選自下組的肽或多肽構(gòu)成:(i) 一種或多種選自本發(fā)明第一方面所述的短肽；和/或(ii) 一種或多種選自本發(fā)明第一方面所述的多肽。
[0019]在另一優(yōu)選例中，⑴中所述短肽與(ii)中所述多肽的核心片段X的序列可以相同或不相同。
[0020]在另一優(yōu)選例中，⑴中所述各短肽的核心片段X的序列可以相同或不相同。
[0021]在另一優(yōu)選例中，(ii)中所述各多肽的核心片段X的序列可以相同或不相同。
[0022]在另一優(yōu)選例中，所述的肽集合還包括除SEQ ID N0.: 1_6以外的分離的人ZP4蛋白線性表位肽。
[0023]本發(fā)明第四方面，提供了本發(fā)明第三方面所述肽集合的用途，用于制備檢測(cè)抗人ZP4蛋白抗體的試劑或試劑盒，其中，所述的試劑或試劑盒用于診斷是否由ZP自身免疫導(dǎo)致的婦女不孕。
[0024]在另一優(yōu)選例中，所述的試劑點(diǎn)樣于試劑盒檢測(cè)板中。
[0025]在另一優(yōu)選例中，所述的試劑包括肽集合或偶聯(lián)于載體蛋白的肽集合。
[0026]在另一優(yōu)選例中，所述的載體蛋白包括GST蛋白。
[0027]在另一優(yōu)選例中，所述的檢測(cè)包括酶聯(lián)免疫反應(yīng)法(ELISA法)檢測(cè)。
[0028]在另一優(yōu)選例中，所述可檢測(cè)標(biāo)記可選用本領(lǐng)域常規(guī)的各種可檢測(cè)標(biāo)記物，如生色團(tuán)、化學(xué)發(fā)光基團(tuán)、熒光團(tuán)、同位素或酶等。
[0029]本發(fā)明第五方面，提供了本發(fā)明第三方面所述的肽集合、本發(fā)明第一方面所述的短肽或本發(fā)明第二方面所述的多肽的用途，用于制備避孕疫苗組合物。
[0030]本發(fā)明第六方面，提供了一種避孕疫苗組合物，所述的避孕含有安全有效量的本發(fā)明第二方面所述的肽集合、本發(fā)明第一方面所述的短肽或本發(fā)明第二方面所述的多肽，以及藥學(xué)上可接受的載體。
[0031]本發(fā)明第七方面，提供了一種避孕方法，向所需的對(duì)象施用安全有效量的本發(fā)明第六方面所述的避孕疫苗組合物。
[0032]應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在
此不再一一贅述?！緦＠綀D】

【附圖說(shuō)明】
[0033]圖1A顯示了人ZP4C系列18肽融合蛋白表達(dá)的SDS-PAGE分析，22-49代表電泳樣品P22-P49融合蛋白所在的各泳道；圖1B顯示了用兔抗人ZP4C抗血清的免疫印跡鑒定，箭頭分別指示印跡反應(yīng)性 18 肽(P23-P25、P30-34、P39-40、P42-43、P46 和 P49)。
[0034]圖2-圖7顯示了用人ZP4C抗血清的ZP4-1~ZP4-6表位系列8肽免疫印跡鑒定，印跡膜上(圖2-圖7的A圖)的各泳道代表反應(yīng)性蛋白的電泳樣品八肽融合蛋白，箭頭分別指示反應(yīng)性8肽；圖2-圖7的B圖分別顯示了列表共有序列分析，陰影部分指示反應(yīng)性8妝中共有氣基酸殘基。
[0035]圖8顯示了人ZP4C蛋白片段的線性抗原表位掃描作圖鑒定的技術(shù)路線。
【具體實(shí)施方式】
[0036]本發(fā)明人通過(guò)廣泛而深入的研究，運(yùn)用改良生物合成肽的方法，首次鑒定了另一組位于人卵透明帶蛋白4片段(ZP4C)上的六個(gè)小分子表位肽，這組表位肽作為最小基序肽，能夠特異地與抗ZP4蛋白抗體結(jié)合，可用于篩選測(cè)定樣品中抗人ZP4六個(gè)表位抗體，從而可用于診斷婦女ZP自身免疫導(dǎo)致的不孕癥。此外，本發(fā)明表位肽還可以用于制備抗生育疫苗的組合物，從而達(dá)到人口生育控 制的效果。
[0037]人ZP4
[0038]人ZP由ZP1-ZP4四個(gè)蛋白組成，其中人ZP4已被確定為人精子第二受體，是參與精卵結(jié)合生殖事件中的重要蛋白之一。人ZP4基因Genbank登錄號(hào)為:NM_021186.3，它編碼540個(gè)氨基酸殘基(人ZP4蛋白登錄號(hào)為Q12836.1)，其成熟蛋白，即去除N端信號(hào)肽和C端跨膜區(qū)的蛋白由58位到463位氨基酸殘基組成。
[0039]人ZP4C蛋白片段
[0040]解碼靶蛋白的線性B細(xì)胞表位組(簡(jiǎn)稱線性表位)的首要條件，是必須獲得用于線性表位掃描作圖的兔抗多克隆抗體或抗血清，因?yàn)閶D女每月排卵數(shù)極為有限，因此純化獲得天然ZP抗原幾乎不可能。隨著基因工程技術(shù)的日益成熟，一個(gè)替代方法就是通過(guò)真核或原核生物系統(tǒng)表達(dá)重組靶蛋白，然后純化之用作免疫原。
[0041]由于成熟人ZP4分子量過(guò)大，不適合原核表達(dá)系統(tǒng)，因此本發(fā)明采用將靶蛋白分段表達(dá)的策略，即將人ZP4蛋白拆分成相互重疊8個(gè)殘基的ZP4N(由58位-234位殘基組成)和ZP4C (由227位-463位殘基組成)兩個(gè)大片段。結(jié)果人ZP4C蛋白在大腸桿菌中獲得高表達(dá)，從而為其純化和制備兔多克隆抗體奠定了基礎(chǔ)。
[0042]線性B細(xì)胞表位
[0043]一般而言，絕大多數(shù)蛋白都具有抗原性，即在哺乳動(dòng)物體內(nèi)誘發(fā)針對(duì)特異抗原的線性(非構(gòu)象型)B細(xì)胞表位和構(gòu)象型表位抗體，或誘發(fā)輔助性T細(xì)胞或細(xì)胞毒性T細(xì)胞分泌特定的細(xì)胞因子應(yīng)答。相對(duì)檢測(cè)抗原和抗體有效疫苗研制用途，目前研究最多的是用化學(xué)合成肽法和噬菌體展示文庫(kù)等技術(shù)鑒定靶蛋白中氨基酸序列連續(xù)的線性表位。
[0044]兔抗重組人ZP4抗血清
[0045]本發(fā)明線性表位的鑒定可采用變性蛋白作為制備特異兔多克隆抗血清的抗原。
[0046]一種優(yōu)選的用兔抗人ZP4抗血清鑒定靶蛋白表位肽的流程見圖8。
[0047]作為由重組人ZP4蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗人ZP4多克隆抗體，制備過(guò)程如下:[0048]利用兔抗人ZP4抗血清檢測(cè)ZP4抗原表位的原理，本發(fā)明構(gòu)建了大量重疊肽，從而篩選并鑒定了能與抗人ZP4抗血清相結(jié)合的各表位最小基序序列。本發(fā)明原理的技術(shù)路線如下及圖8。
[0049]1，用常規(guī)PCR方法從人ZP4cDNA克隆中擴(kuò)增出編碼ZP4成熟蛋白C端大片段(去除C端跨膜區(qū)的殘基227-463，簡(jiǎn)稱為ZP4C227—463)的cDNA，然后重組插入pSY621表達(dá)質(zhì)粒[沈蕓，應(yīng)康，徐萬(wàn)祥，謝毅:大腸桿菌高效表達(dá)載體PSY621的構(gòu)建.復(fù)旦學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)2000 ；39 (3): 313 - 317]，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后進(jìn)行熱誘導(dǎo)表達(dá)，在用MA-1662單抗的蛋白印跡鑒定后，用純化表達(dá)的重組人ZP4C蛋白主動(dòng)免疫三只雄性新西蘭白兔，最后獲得兔抗重組人ZP4C蛋白抗血清。
[0050]2，采用8/18肽pXXGST-Ι融合表達(dá)載體。[0051]分別構(gòu)建一組跨越人ZP4C全長(zhǎng)度相互重疊10個(gè)殘基的28個(gè)系列18肽(以GST188蛋白為融合表達(dá)載體。具體操作步驟:外送合成所設(shè)計(jì)的系列18肽并含兩端BamHI和Sal I粘性末端的編碼DNA正負(fù)鏈片段；DNA正負(fù)鏈片段配對(duì)退火后重組插入表達(dá)質(zhì)粒；轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)宿主菌；挑選重組克隆測(cè)序驗(yàn)證插入片段DNA序列；以及熱誘導(dǎo)表達(dá)目的GST188-18肽融合蛋白)。
[0052]3.用兔抗重組人ZP4蛋白抗血清進(jìn)行第一輪識(shí)別18肽的蛋白印跡鑒定，即將分別含人ZP4C的28個(gè)18肽(如編號(hào)P22-P49，人ZP4N的系列18肽編號(hào)P1-P21)融合蛋白的各誘導(dǎo)菌總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析，繼而電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，最后用抗人ZP4C抗血清完成免疫印跡鑒定。
[0053]3，按前述系列18肽融合蛋白構(gòu)建表達(dá)步驟，進(jìn)一步表達(dá)GST188為載體跨越9個(gè)反應(yīng)性18肽長(zhǎng)度相互重疊7個(gè)殘基的系列8肽融合蛋白(編號(hào)P94-P204，用于人ZP4C表位最小基序的系列8肽編號(hào)為P50-P93)，繼而實(shí)施第二輪可被抗人ZP4C抗血清識(shí)別的精細(xì)表位免疫印跡鑒定(步驟同第一輪18肽鑒定)。
[0054]表位肽
[0055]在本案發(fā)明人建立“改良生物合成肽法”(Xu WX, et al.Minimal motif mappingof a known epitope on human zona pellucida protein—lusing peptide biosynthesisstrategy.J Reprod Immunol, 2009;81:9 - 16;Xu WX,et al.Xu ffan-xiang, HeYaping, Wang Jian, Tang Ha1-ping, Shi Hu1-juan, Sun Xiao-xi, Ji Chao-neng, GuShao-hua and Yi Xie, Mapping of minimal motifs of B-cell epitopes on human zonapellucida glycopotein-3.Clin Dev Immunol, 2012; 2012:831010.)之前，無(wú)法用抗重組蛋白多抗鑒定小于或等于8個(gè)殘基多肽的抗體識(shí)別表位最小基序，因此，嚴(yán)格地說(shuō)，未經(jīng)過(guò)表位最小基序鑒定的肽不能稱為表位或表位肽，只能稱之為“抗原性肽”。換言之，在靶蛋白表位掃描作圖鑒定中，只有經(jīng)過(guò)表位最小基序鑒定的肽序列，才能稱作“表位”或“表位肽”。
[0056]在本發(fā)明中，“本發(fā)明表位肽”、“本發(fā)明多肽”、“本發(fā)明活性片段”、可互換使用，指符合式I結(jié)構(gòu)式的短肽或含有核心序列X的表位多肽的統(tǒng)稱。
[0057]術(shù)語(yǔ)“符合式I結(jié)構(gòu)式的表位短肽”、“本發(fā)明短肽”可互換使用，指符合下式且所示的短肽滿足以下特征的短肽:
[0058]X1-X-X2 ；
[0059]式I[0060]并滿足以下特征:
[0061](a)式I中X為6-7個(gè)氨基酸的核心片段；
[0062](b)式I中X1、X2為無(wú)、I或2個(gè)氨基酸，且Xl和X2氨基酸個(gè)數(shù)總和≤2 ；
[0063](c)所述的核心片段的序列選自SEQ ID N0.: 1-6 ;和
[0064](d)所述的短肽具有與抗人ZP4C抗體結(jié)合的活性；
[0065]其中，“”表示肽鍵或肽接頭。
[0066]在本發(fā)明中，一種優(yōu)選的符合式I結(jié)構(gòu)式的短肽序列如SEQ ID N0.:7-18所示。
[0067]術(shù)語(yǔ)“基序肽”、“表位肽”、“核心片段”可互換使用，均指ZP4蛋白上可為抗ZP4C
抗體識(shí)別結(jié)合的最小6-7個(gè)氨基酸的核心精細(xì)片段，即式I中的X。
[0068]術(shù)語(yǔ)“含有核心序列X的多肽”、“本發(fā)明多肽”可互換使用。應(yīng)理解，所述術(shù)語(yǔ)還
包括符合式I的短肽以及含有核心序列X的多肽的衍生物，指符合式I結(jié)構(gòu)式的短肽在經(jīng)
過(guò)1-3個(gè)氨基酸添加、1-2個(gè)缺失并仍含有所述核心片段X的序列，且具有與抗人ZP4C抗體
結(jié)合活性的多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行氨基酸替換而產(chǎn)生。
[0069]表1
[0070]
【權(quán)利要求】
1.一種來(lái)自人卵透明帶蛋白-4(人ZP4蛋白)227位-463位的分離的短肽，其特征在于，所述短肽的結(jié)構(gòu)如式I所示:
X1-X-X2
式I, 并滿足以下特征: (a)式I中X為6-7個(gè)氨基酸的核心片段； (b)式I中X1、X2為無(wú)、I或2個(gè)氨基酸，且Xl和X2氨基酸個(gè)數(shù)總和<2 ; (c)所述的核心片段的序列選自SEQID N0.:1-6 ;和 (d)所述的短肽具有與抗人ZP4C抗體結(jié)合的活性； 其中，表示肽鍵或肽接頭。
2.如權(quán)利要求1所述的短肽，其特征在于，所述的短肽選自如SEQID N0.:7_18所示的短肽。
3.一種具有權(quán)利要求1所述核心片段的分離的多肽，其特征在于，所述多肽是經(jīng)權(quán)利要求I所述的短肽經(jīng)過(guò)1-3個(gè)氨基酸的添加、1-2個(gè)缺失并仍含有所述核心片段X，且具有與抗人ZP4C抗體結(jié)合活性的多肽。
4.一種分離的肽集合，其特征在于，所述的肽集合由選自下組的肽或多肽構(gòu)成:(i) 一種或多種選自權(quán)利要求1所述的短肽；和/或(ii) 一種或多種選自權(quán)利要求3所述的多肽。
5.如權(quán)利要求4所述的肽集合，其特征在于，⑴中所述短肽與(ii)中所述多肽的核心片段X的序列可以相同或不相同。
6.如權(quán)利要求4所述的肽集合，其特征在于，所述的肽集合還包括除SEQID N0.: 1-6以外的分離的人ZP4蛋白線性表位肽。
7.權(quán)利要求4或6所述肽集合的用途，其特征在于，用于制備檢測(cè)抗人ZP4蛋白抗體的試劑或試劑盒，其中，所述的試劑或試劑盒用于診斷是否由ZP自身免疫導(dǎo)致的婦女不孕。
8.權(quán)利要求4或6所述肽集合、權(quán)利要求1所述的短肽、或權(quán)利要求3所述的多肽的用途，其特征在于，用于制備避孕疫苗組合物。
9.一種避孕疫苗組合物，其特征在于，所述的避孕含有安全有效量的權(quán)利要求4或6所述的肽集合、權(quán)利要求1所述的短肽、或權(quán)利要求3所述的多肽，以及藥學(xué)上可接受的載體。
10.一種避孕方法，其特征在于，向所需的對(duì)象施用安全有效量的權(quán)利要求9所述的避孕疫苗組合物。
【文檔編號(hào)】C07K7/06GK103524601SQ201310451354
【公開日】2014年1月22日 申請(qǐng)日期:2013年9月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月27日
【發(fā)明者】徐萬(wàn)祥, 顧少華, 賽提旭·古普塔, 王健, 唐海平, 季朝能, 何亞萍, 謝毅 申請(qǐng)人:上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所, 復(fù)旦大學(xué)