專利名稱：一種融合蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種融合蛋白及其編碼基因與應(yīng)用，特別涉及一種人心肌肌鈣蛋白I和肌鈣蛋白C的融合蛋白及其編碼基因與在人心肌肌鈣蛋白I檢測(cè)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
心肌肌鈣蛋白(cTn，cardiac Troponin)分子呈球形，參與調(diào)節(jié)肌肉收縮活動(dòng)。心肌肌鈣蛋白含三個(gè)亞單位，即心肌肌鈣蛋白C(cTnC，cardiac TroponinC)、心肌肌鈣蛋白I(cTnI，cardiac Troponin I)和心肌肌鈣蛋白T(cTnT，cardiac TroponinT)。cTnC的主要作用是給肌漿中Ca2+提供結(jié)合位點(diǎn)，活化細(xì)肌絲；cTnI是肌動(dòng)蛋白的抑制亞基；cTnT的作用是將整個(gè)肌鈣蛋白分子結(jié)合于原肌凝蛋白。當(dāng)心肌細(xì)胞受損時(shí)，cTn可從細(xì)胞中釋放至血液循環(huán)中，現(xiàn)有方法可從外周血清中檢測(cè)cTnT和cTnI。
早期準(zhǔn)確地評(píng)估可疑的急性心肌損傷主要依賴于對(duì)釋放入血后的心肌細(xì)胞內(nèi)成分的靈敏、特異的定量檢測(cè)，以區(qū)別潛在的需緊急處理的致命事件和無致命威脅的狀況，如急性心梗和非心源性胸痛如消化不良。早期心電圖變化既無特異性也不敏感，因此，臨床醫(yī)生逐漸依靠心肌組織的生化標(biāo)志物為依據(jù)進(jìn)行早期診斷。最初，使用的是肌酸激酶(CK)和MB同功酶(CK-MB)，后來肌紅蛋白(Mb)成為更靈敏的心肌損傷早期標(biāo)志物，但由于受骨骼肌損傷的影響所以特異性較差。近年來cTnI和cTnT因具有較高的心肌特異性，并且心肌損傷后入血較早已成為診斷心肌損傷的確定標(biāo)志物。
cTnI作為診斷心肌損傷的確定標(biāo)志物，具有特異性好，靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。目前美國(guó)國(guó)家藥品和食品管理局(FDA)至少已批準(zhǔn)16種cTnI檢測(cè)試劑(Ravkilde J.Riskstratificationin acute coronary syndrome using cardiac troponin I.Clin Chem，2000，46443-444)，但不同試劑盒對(duì)同一份標(biāo)本的測(cè)定結(jié)果能出現(xiàn)數(shù)十倍的差異。引起差異的主要因素有cTnI在人血清中不穩(wěn)定易被蛋白酶水解；不同試劑所用單克隆抗體針對(duì)cTnI表位不同；cTnI測(cè)定方法學(xué)不同；測(cè)定試劑所配套的校正品中cTnI存在形式不同等(Katrukha AG，Bereznikova AV，F(xiàn)ilatov VL，Esakova TV，Kolosova OV，Pettersson K，Lovgren T，Bulargina TV，Trifonov IR，GratsianskyNA，Pulkki K，Voipio-Pulkki LM，Gusev NB.Degradat ion of cardiac troponinIimplication for reliable immunodetection.ClinChem，1998，44(12)2433-2440.Wu AH，F(xiàn)eng YJ，Moore R，Apple FS，McPherson PH，Buechler KF，Bodor G.Characterization of cardiac troponin subunitrelease into serum after acutemyocardial infarction and comparison of assaysfor troponin T and I.ClinChem1998；441198-1208.Newman DJ，Olabiran Y，Bedzyk WD，et al.Impact ofantibody specificity and calibration material on the measure of agreementbetween methods for cardiac troponin I.Clin Chem，1999，45822-828等)。解決cTnI測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)化以縮小各方法測(cè)定結(jié)果之間的差異是亟待解決的問題。cTnI校正品多為心肌提取物，校正品中cTnI游離和復(fù)合物形式的百分比不相同且穩(wěn)定性不理想，制備結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、分子均一的溯源cTnI參考物質(zhì)是cTnI測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)化的關(guān)鍵。加拿大學(xué)者Liu SG(Liu S，Zhang MY，Gong Q，et al.Recombinant single chaincardiac troponin I-C polypeptidessuperior calibration and controlmaterials for cardiac troponin I immunoassays.Clin Lab，2001；47(1-2)19-27)根據(jù)心肌損傷患者血清中cTnI多以I-C復(fù)合物形式存在，而且cTnI與TnC形成復(fù)合物后不易被蛋白酶水解的特點(diǎn)，通過基因工程的方法用一段可編碼中性氨基酸(多為甘氨酸)多肽的Linker將I-C連接到一起，用于cTnI檢測(cè)系統(tǒng)的校正。他們利用pET21質(zhì)粒在大腸桿菌中表達(dá)得到了兩種含有I和C的融合蛋白ScTnI-C和ScTnI-C-2，其中ScTnI-C含全長(zhǎng)cTnI(共210個(gè)氨基酸殘基)和TnC，但表達(dá)得到的蛋白以包涵體形式存在，需先經(jīng)變性處理后再緩慢復(fù)性使蛋白質(zhì)重新折疊，然后進(jìn)行純化。其中復(fù)性過程較為復(fù)雜，且變性蛋白能否重新正確折疊受到許多因素的影響，難度較大。ScTnI-C-2是cTnI穩(wěn)定片段(第28-110個(gè)氨基酸)與全長(zhǎng)TnC二元復(fù)合物，在表達(dá)菌中能可溶性表達(dá)，蛋白穩(wěn)定性較好，用于cTnI的校正具有較好的效果。但該二元復(fù)合物只能為識(shí)別此區(qū)表位的單抗檢測(cè)試劑做校正品。
為保證實(shí)驗(yàn)室間測(cè)定結(jié)果的可比性，檢驗(yàn)項(xiàng)目的標(biāo)準(zhǔn)化包括方法學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)化和校正物的溯源受到極大的重視，目前cTnI免疫學(xué)測(cè)定的校正品無處溯源，這是因?yàn)槟壳吧袩o公認(rèn)的參考物質(zhì)。理想的cTnI參考物或標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)該成分均一、穩(wěn)定、無基質(zhì)效應(yīng)并至少能被所有試劑中的抗體識(shí)別。然而天然cTnI標(biāo)準(zhǔn)品很不穩(wěn)定，校正品在溶解后必須在很短時(shí)間內(nèi)完成儀器的定標(biāo)，且此種校正品不可重復(fù)使用。有人嘗試單獨(dú)生產(chǎn)I、C亞單位，然后體外使二者結(jié)合以制備穩(wěn)定的cTnI標(biāo)準(zhǔn)物。但在此種情況下，I和C結(jié)合的多少，不僅取決于亞單位各自的濃度，還受Ca2+濃度的影響(QinWei Shi，Mingfu Ling，Xiaochen ZHang，et al.Degredation of cardiactroponin I in serum complicates comparisons of cardiac troponin I assays.ClinChem.1999；45(7)1018-1025.)。Liu SG等將ScTnI-C-2用于一些cTnI測(cè)定系統(tǒng)的校準(zhǔn)取得了較好的效果，但ScTnI-C-2尚存在不能被所有試劑識(shí)別的不足。
因?yàn)閏TnI測(cè)定系統(tǒng)尚無理想的的參考物質(zhì)，所以各測(cè)試系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品無處溯源，阻礙了cTnI測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)程，因此需要生產(chǎn)溯源性好的國(guó)際公認(rèn)的參考物質(zhì)，也同時(shí)為制備cTnI測(cè)定系統(tǒng)校準(zhǔn)品和質(zhì)控品提供理想的選擇材料，解決標(biāo)準(zhǔn)化工作中的難點(diǎn)。
發(fā)明創(chuàng)造內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種人心肌肌鈣蛋白I和肌鈣蛋白C的融合蛋白及其編碼基因。
本發(fā)明所提供的人心肌肌鈣蛋白I和肌鈣蛋白C的融合蛋白，名稱為cTnI-C，是具有序列表中SEQ ID №2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將SEQ ID №2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID№2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白質(zhì)。
序列表中序列2的氨基酸殘基序列是由411個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。
人心肌肌鈣蛋白I和肌鈣蛋白C的融合蛋白編碼基因，名稱為cTnI-C，是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有95％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
序列表中序列1的DNA序列由1236個(gè)堿基組成，該基因的開放閱讀框架為自5’端第1到第1236位堿基；自5’端第13到第30位堿基為編碼6個(gè)組氨酸的序列；自5’端第61到第690位堿基為人心肌肌鈣蛋白I的編碼序列，編碼210個(gè)氨基酸；自5’端第691到第750位堿基為編碼連接肽(Linker)的序列，編碼20個(gè)氨基酸；自5’端第751到第1233位堿基為人心肌肌鈣蛋白C的編碼序列，編碼161個(gè)氨基酸。
含有本發(fā)明基因的表達(dá)載體及細(xì)胞系均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
擴(kuò)增該融合蛋白編碼基因中任一片段的引物對(duì)也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
本發(fā)明人通過基因工程的方法將cTnI和cTnC基因以一段可編碼短肽的Linker序列首尾相連，構(gòu)建了全長(zhǎng)cTnI-C融合蛋白的原核表達(dá)系統(tǒng)，并最終在大腸桿菌中得到了N端帶有組氨酸標(biāo)簽的全長(zhǎng)cTnI-C融合蛋白的穩(wěn)定可溶表達(dá)，搖瓶中表達(dá)量達(dá)11mg/L。該融合蛋白帶有組氨酸標(biāo)簽且可溶性表達(dá)，使純化過程快捷簡(jiǎn)單易行，經(jīng)一步Ni2+-Sepharose柱進(jìn)行親和層析純化達(dá)PAGE純，且能被所有cTnI檢測(cè)試劑識(shí)別，克服了Liu SG等得到的兩種IC融合蛋白純化步驟多且一種不能被所有試劑識(shí)別，一種為包涵體難以純化的不足。實(shí)驗(yàn)證明將本發(fā)明的融合蛋白置于血清基質(zhì)中37℃孵育，48h后含量?jī)H下降8％，好于ScTnI-C-2在血清基質(zhì)中的穩(wěn)定性(48h后含量下降50％)。
本發(fā)明的融合蛋白分子量為46.1kD，等電點(diǎn)為5.41，具有穩(wěn)定性好易純化的優(yōu)點(diǎn)，且能被所有cTnI檢測(cè)試劑識(shí)別，該蛋白含有全長(zhǎng)的cTnI序列，將可能成為cTnI測(cè)定系統(tǒng)的候選參考物質(zhì)，用于各種cTnI試劑中校準(zhǔn)品及質(zhì)控物的量值溯源，也可成為生產(chǎn)cTnI檢測(cè)試劑校準(zhǔn)品及質(zhì)控物的理想選擇，將極大的推進(jìn)cTnI檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)程，并可作為抗原制備抗體用于cTnI檢測(cè)試劑的國(guó)產(chǎn)化工作，具有廣闊的工業(yè)應(yīng)用前景。


圖1為人心肌總RNA瓊脂糖凝膠電泳鑒定圖譜圖2為cTnI和cTnC PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳鑒定圖譜圖3為pPIC9質(zhì)粒的物理圖譜圖4為pET15b質(zhì)粒的物理圖譜圖5為cTnI-C PCR產(chǎn)物鑒定圖譜圖6為cTnI-C在宿主中的表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳圖譜圖7為cTnI-C在宿主中的表達(dá)產(chǎn)物的Western blot圖譜圖8為純化的cTnI-C融合蛋白的電泳圖譜具體實(shí)施方式
實(shí)施例1、cTnI-C的表達(dá)及純化材料1.載體和菌種pPIC9質(zhì)粒(購(gòu)自Invitrogen公司)、pET-15b質(zhì)粒和BL21(DE3)pLysS菌種(購(gòu)自Novagen公司)，Ecoli Top10F’菌種(購(gòu)自Invitrogen公司)。
2.試劑和儀器Snab I內(nèi)切酶(Takara公司)，其他常用內(nèi)切酶(NEB公司)、pfu聚合酶、T4連接酶(Promega公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(GIBCO公司)，兔抗人cTnI多克隆抗體(Santa Cruz公司)，羊抗兔IgG/HRP(Sigma公司)，DNA的合成與序列測(cè)定(北京奧科公司)，Acta-FPLC蛋白純化系統(tǒng)(Amersham Pharmacia公司)。
一、cTnI-C的構(gòu)建1、總RNA提取1)取液氮凍存的新鮮胎兒心肌組織100mg低溫下在研缽中研磨成粉末，加1ml TRIzol試劑混勻，移至一個(gè)無RNA酶的Ep管中。
2)靜置5min后加入氯仿0.2ml，劇烈振搖20sec，靜置3min。
3)4℃，15000rpm離心10min。將部分上清轉(zhuǎn)移到新的微量離心管中，加入異丙醇0.5ml。顛倒混勻，室溫靜置15min。
4)再次4℃離心，15000rpm，15min。
5)去上清，沉淀中加入1ml 75％乙醇，4℃ 15000rpm離心1min。去上清，沉淀于37℃溫箱中干燥。
6)加入20ul DEPC水(焦碳酸二乙酯)溶解。取1ul測(cè)定OD260和OD280吸光度，計(jì)算RNA濃度；取5ul進(jìn)行1％的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，電泳結(jié)果如圖1所示。
2、逆轉(zhuǎn)錄(獲得心肌組織cDNA)1)取步驟1中得到的5ul總RNA，oligo dT(oligo(dT)15引物)1ul，DEPC水4ul混勻后70℃加熱10min，置冰上冷卻。
2)加入10×PCR緩沖液2ul25mM MgCl22ul10mM dNTP1ul0.1M DTT 2ul混勻后置42℃ 5min。
3)加入SuperScript逆轉(zhuǎn)錄酶1ul，42℃逆轉(zhuǎn)錄50min。
4)70℃ 15min滅活酶后置冰上冷卻。
5)加入RNase H 1ul，37℃ 20min。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(cDNA)于-20℃凍存。
3、cTnI、Linker及cTnC基因的制備(1)PCR引物與Linker序列根據(jù)cTnI與cTnC的基因序列和pPIC9的多克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物和Linker序列如下cTnI PCR引物(上下游分別引入Snab I和EcoR I酶切位點(diǎn))上游引物cTnI-UP5’AT TACGTAATGGCGGATGGGAGCAGC 3’下游引物cTnI-DOWN 5’CCGAATTCGCTCTCAAACTTTTTCTTGCGGCC 3’；cTnC PCR引物(上下游分別引入Avr II和Not I酶切位點(diǎn))上游引物cTnC-UP5’CCTAGGATGGATGACATCTACAAGGC 3’下游引物cTnC-DOWN 5’ACGTCTAGACTACTCCACACCCTTCATG 3’；Linker序列正義鏈(5’及3’端分引入EcoR I和Avr II酶切位點(diǎn))，反義鏈(5’及3’端分別引入Avr II和EcoR I酶切位點(diǎn))。序列由奧科公司合成，酶切位點(diǎn)分別以酶切后的粘端方式合成5’--AATTCAGTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGGGGGGGTTCTGGTGGCGGTGGTTCTC------3’3’------GTCACCACCACCACCAAGACCACCCCCCCCAAGACCACCGCCACCAAGAGGATC--5’。
(2)PCR擴(kuò)增及純化PCR擴(kuò)增按以下體系在PE2400 PCR儀上進(jìn)行。
1)cTnI基因的擴(kuò)增擴(kuò)增體系(50ul)H2O37.57uldDTP4ulcTnI-up1ulcTnI-down1ulpfuBffer5ulcDNA1ulpfuase0.43ul]]>PCR擴(kuò)增條件如下 產(chǎn)物經(jīng)1％的瓊脂糖凝膠電泳鑒定為650bp左右(圖2中泳道1)，與預(yù)期一致。
2)cTnC基因的擴(kuò)增方法及條件同步驟1)，產(chǎn)物經(jīng)1％的瓊脂糖凝膠電泳鑒定為500bp左右(圖2中泳道2)，與預(yù)期一致。圖2中，M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1為cTnI PCR產(chǎn)物；2為cTnC PCR產(chǎn)物。
3)PCR產(chǎn)物濃縮純化同時(shí)將擴(kuò)增的4管50ul體系的PCR產(chǎn)物，合至1個(gè)Ep管中加1/10體積的3M NaAc(pH5.2)、3倍體積的無水乙醇，混勻后置-20℃沉淀約30′。15,000rpm離心10′，棄去上清，加1ml75％乙醇，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)以清洗管壁，小心棄去上清，15,000rpm離心5″，吸干上清后置55℃干燥，加20ulTE溶解并定量。
4)雙鏈Linker的制備取Linker正義和反義鏈等摩爾混合，95℃ 5′后緩慢降至室溫使之聚合。
4、利用pPIC9質(zhì)粒連接cTnI-Linker-cTnC基因?qū)⒓兓蟮腸TnI PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和質(zhì)粒pPIC9(其物理圖譜如圖3所示)同時(shí)用Snab I和EcoR I進(jìn)行雙酶切，1％瓊脂糖電泳分離純化，在T4DNA連接酶的作用下將酶切后的cTnI和pPIC9連接，連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌Top10F’中，篩選并酶切鑒定，酶切正確后送奧科公司測(cè)序，測(cè)序正確質(zhì)粒命名為pPIC9+I。具體步驟如下(1)Top10F’感受態(tài)的制備(氯化鈣法)a.用無菌鉑絲接種E.coli Top10F’于裝有LB液體培養(yǎng)基的試管中，于37℃培養(yǎng)過夜；b.取100ul菌液接種于約10ml的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；c.將菌液轉(zhuǎn)移到一個(gè)無菌、冰預(yù)冷的50ml離心管中，冰置5-10分鐘。4℃ 4000rpm離心10′；d.倒出培養(yǎng)液，將管倒置1分鐘使殘留的培養(yǎng)液流盡；e.用10ml冰預(yù)冷的0.1M CaCl2重懸沉淀，放置于冰上，4℃ 4000轉(zhuǎn)/分鐘離心5-10′；f.倒出上清，將管倒置1分鐘使殘留的培養(yǎng)液流盡；g.用2ml冰預(yù)冷的0.1M CaCl2重懸沉淀；h.200ul/支分裝于1.5ml冰上預(yù)冷的EP管中，置4℃保存?zhèn)溆谩?br> (2)連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化a.將連接反應(yīng)產(chǎn)物加入一支分裝好的感受態(tài)細(xì)菌中，輕輕旋轉(zhuǎn)混勻，于冰上轉(zhuǎn)化約30′；b.42℃ 90″熱休克；c.迅速將試管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻1′-2′；d.一管中加入800ul SOC培養(yǎng)基(SOC按如下方法配制在950ml水中加入胰蛋白胨12g，酵母提取物24g，NaCl 0.5g。溶解后，加入250mM KCl 10ml然后加水至1L，高壓蒸汽滅菌20分鐘，降至60℃左右，加入5ml經(jīng)滅菌的2M MgCl2溶液和20ml經(jīng)除菌的1M葡萄糖溶液。)，37℃搖菌培養(yǎng)60′，使細(xì)菌復(fù)蘇；e.取100ul菌液，涂布于LA(LA按如下方法配制90ml水中加入胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，瓊脂粉15g，溶解后，加入水至100ml，高壓蒸汽滅菌20分鐘，降至60℃左右，加入100mg/ml氨芐青霉素100ul，混勻后鋪板)培養(yǎng)皿中；f.倒置培養(yǎng)皿，于37℃培養(yǎng)過夜。
(3)菌落的鑒定(質(zhì)粒提取)a.挑取白色的菌落，接種于裝有3ml LB的玻璃試管中，搖菌過夜；b.取1ml菌液于1.5ml的EP管中；
c.離心，棄去上清；d.再離心，吸取殘留液體；e.加200ul溶液I(50mmol/L葡萄糖、25mmol/L Tris-Cl pH8.0、10mmol/L EDTApH8.0)垂懸沉淀；f.加200ul溶液II(0.2M NaOH、1％SDS)輕輕顛倒混勻；g.加200ul溶液III(5mol/L乙酸鉀60ml、冰乙酸11.5ml、水28.5ml)輕輕顛倒混勻；h.15,000rpm離心10′，將上清轉(zhuǎn)移至加有0.6倍體積異丙醇的1.5ml EP管中，混勻后4℃放置10分鐘；i.15,000rpm離心10′，棄去上清，加入1ml 75％的乙醇清洗管壁；j.離心，棄去上清，于55℃干燥；k.用20ul含RNase的TE溶解；l.用SnabI和EcoRI對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。
用同樣的方法將cTnC PCR產(chǎn)物用AVrII和NotI酶切后插入含cTnI的pPIC9+I質(zhì)粒中。已插入cTnI和cTnC的pPIC9+I+C質(zhì)粒用EcoRI和AVrII雙酶切后與Linker相連，得到含有cTnI-Linker-cTnC基因的質(zhì)粒載體pPIC9-IC，測(cè)序結(jié)果表明人心肌肌鈣蛋白I和肌鈣蛋白C的融合蛋白編碼基因cTnI-C具有序列表中SEQ ID №1的DNA序列；其編碼序列表中的SEQ ID №2的氨基酸序列。
二、cTnI-C的表達(dá)及純化1、原核表達(dá)載體的構(gòu)建(選取pET15b質(zhì)粒構(gòu)建表達(dá)載體)以pPIC9-IC質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增cTnI-C基因，對(duì)得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖5所示，表明加酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基后的長(zhǎng)度約1200bp左右。圖5中，M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1為cTnI-CPCR產(chǎn)物。按常規(guī)方法將其克隆到pET15b(其物理圖譜如圖4所示)的多克隆位點(diǎn)Nde I和BamH I之間，得到原核表達(dá)載體pET15-IC，酶切鑒定正確后測(cè)序。其中，cTnI-C擴(kuò)增引物(上下游分別引入Nde I和BamH I酶切位點(diǎn))為上游5’ATTACGTAATGGCCGATGGTAGCAGC 3’；下游5’TGGATCCCTACTCCACACCCTTCATG 3’。
2、融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)E.coli BL21(DE3)pLysS的轉(zhuǎn)化和融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)將pET15-IC質(zhì)粒轉(zhuǎn)化按照常規(guī)氯化鈣法制備的感受態(tài)表達(dá)菌E.coliBL21(DE3)pLysS中，將復(fù)蘇后的菌液涂布于含抗生素(氨芐青霉素100ug/ml和氯霉素17ug/ml)的LB平板上，37℃培養(yǎng)過夜。挑取菌落轉(zhuǎn)種于含相同抗生素的LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)菌生長(zhǎng)至OD600約為0.6時(shí)，加入終濃度為0.5mmol·L-1的IPTG，在25℃條件下誘導(dǎo)融合蛋白的表達(dá)。誘導(dǎo)5小時(shí)后收集細(xì)菌沉淀超聲破菌，離心收集上清，在Access微粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析儀上用AccuTnI試劑盒檢測(cè)cTnI含量，結(jié)果破菌后上清稀釋40000倍后實(shí)測(cè)結(jié)果為3.73ng/ml，經(jīng)計(jì)算(計(jì)算公式(3.73×稀釋倍數(shù)×1000ml)/破菌后上清液體積ml數(shù))在搖瓶中融合蛋白表達(dá)量可達(dá)11mg/L。同時(shí)對(duì)上清進(jìn)行SDS-PAGE和Western-blot鑒定(以兔抗人cTnI多克隆抗體(Santa Cruz公司)為第一抗體，以羊抗兔IgG/HRP(Sigma公司)為第二抗體采用間接檢測(cè)法進(jìn)行Western印記膜的免疫學(xué)檢測(cè))。SDS-PAGE鑒定結(jié)果如圖6所示，在46kD附近有目的蛋白的表達(dá)，與預(yù)期一致。圖6中，M為低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)，泳道1-7為IPTG誘導(dǎo)1-7小時(shí)后的包含重組質(zhì)粒pET15-IC的宿主菌的裂解上清液(箭頭所指的條帶為目標(biāo)蛋白)，泳道8為沒有經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)的包含質(zhì)粒pET-15b的宿主菌的細(xì)胞裂解上清液，泳道9為經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)的包含質(zhì)粒pET-15b的宿主菌的細(xì)胞裂解上清液。Western-blot鑒定結(jié)果如圖7所示，表明在宿主細(xì)菌的裂解上清液中檢測(cè)到該融合蛋白，且顯示為單一條帶，無降解片段，說明目的蛋白穩(wěn)定性較好。
3、融和蛋白的純化利用Acta-FPLC蛋白純化系統(tǒng)進(jìn)行蛋白的純化利用pET15b作為載體所表達(dá)的融合蛋白在其N端帶有His-tag可與Ni2+特異性結(jié)合，因此使用Ni2+-Sepharose柱對(duì)融合蛋白進(jìn)行親和層析純化，純化后進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果如圖8所示，表明得到PAGE純的cTnI-C融合蛋白，經(jīng)檢測(cè)洗脫液稀釋1000倍后融合蛋白中cTnI的含量為17.1ng/ml。圖8中，M為低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)，1為流穿組分，2為洗脫組分，即目的蛋白所在部分。其中，結(jié)合緩沖液為50mmol/L pH8.0磷酸鈉緩沖液；洗脫緩沖液為含有咪唑的50mmol/L pH6.8磷酸鈉緩沖液，進(jìn)行梯度洗脫；洗脫條件為50mmol/L咪唑5個(gè)柱體積、100mmol/L咪唑5個(gè)柱體積、300mmol/L咪唑10個(gè)柱體積、500mmol/L咪唑5個(gè)柱體積。
實(shí)施例2、融合蛋白cTnI-C的免疫學(xué)活性測(cè)定采用Access微粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析儀和AccuTnI檢測(cè)試劑盒通過雙抗體夾心法進(jìn)行cTnI-C中cTnI的免疫學(xué)活性測(cè)定。其中，兩株抗體都為按常規(guī)方法制備的鼠抗人cTnI單抗，一株包被于順磁顆粒上，一株用堿性磷酸酶標(biāo)記。結(jié)果得到的融合蛋白中的cTnI能被試劑中cTnI單抗識(shí)別，表明cTnI-C中的cTnI具有較好的免疫原性。
序列表<160>2<210>1<211>1236<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60atggccgatg gtagcagcga tgcggctagg gaacctcgcc ctgcaccagc cccaatcaga120cgccgctcct ccaactaccg cgcttatgcc acggagccgc acgccaagaa aaaatctaag180atctccgcct cgagaaaatt gcagctgaag actctgctgc tgcagattgc aaagcaagag240ctggagcgag aggcggagga gcggcgcgga gagaaggggc gcgctctgag cacccgctgc300cagccgctgg agttggccgg gctgggcttc gcggagctgc aggacttgtg ccgacagctc360cacgcccgtg tggacaaggt ggatgaagag agatacgaca tagaggcaaa agtcaccaag420aacatcacgg agattgcaga tctgactcag aagatctttg accttcgagg caagtttaag480cggcccaccc tgcggagagt gaggatctct gcagatgcca tgatgcaggc gctgctgggg540gcccgggcta aggagtccct ggacctgcgg gcccacctca agcaggtgaa gaaggaggac600accgagaagg aaaaccggga ggtgggagac tggcgcaaga acatcgatgc actgagtgga660atggagggcc gcaagaaaaa gtttgagagc gaattcagtg gtggtggtgg ttctggtggg720gggggttctg gtggcggtgg ttctcctagg atggatgaca tctacaaggc tgcggtagag780cagctgacag aagagcagaa aaatgagttc aaggcagcct tcgacatctt cgtgctgggc840gctgaggatg gctgcatcag caccaaggag ctgggcaagg tgatgaggat gctgggccag900aaccccaccc ctgaggagct gcaggagatg atcgatgagg tggacgagga cggcagcggc960acggtggact ttgatgagtt cctggtcatg atggttcggt gcatgaagga cgacagcaaa 1020gggaaatctg aggaggagct gtctgacctc ttccgcatgt ttgacaaaaa tgctgatggc 1080tacatcgacc tggatgagct gaagataatg ctgcaggcta caggcgagac catcacggag 1140
gacgacatcg aggagctcat gaaggacgga gacaagaaca acgacggccg catcgactat 1200gatgagttcc tggagttcat gaagggtgtg gagtag1236<210>2<211>411<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>2Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro1 5 10 15Arg Gly Ser His Met Ala Asp Gly Ser Ser Asp Ala Ala Arg Glu Pro20 25 30Arg Pro Ala Pro Ala Pro Ile Arg Arg Arg Ser Ser Asn Tyr Arg Ala35 40 45Tyr Ala Thr Glu Pro His Ala Lys Lys Lys Ser Lys Ile Ser Ala Ser50 55 60Arg Lys Leu Gln Leu Lys Thr Leu Leu Leu Gln Ile Ala Lys Gln Glu65 70 75 80Leu Glu Arg Glu Ala Glu Glu Arg Arg Gly Glu Lys Gly Arg Ala Leu85 90 95Ser Thr Arg Cys Gln Pro Leu Glu Leu Ala Gly Leu Gly Phe Ala Glu100 105 110Leu Gln Asp Leu Cys Arg Gln Leu His Ala Arg Val Asp Lys Val Asp115 120 125Glu Glu Arg Tyr Asp Ile Glu Ala Lys Val Thr Lys Asn Ile Thr Glu130 135 140Ile Ala Asp Leu Thr Gln Lys Ile Phe Asp Leu Arg Gly Lys Phe Lys145 150 155 160
Arg Pro Thr Leu Arg Arg Val Arg Ile Ser Ala Asp Ala Met Met Gln165 170 175Ala Leu Leu Gly Ala Arg Ala Lys Glu Ser Leu Asp Leu Arg Ala His180 185 190Leu Lys Gln Val Lys Lys Glu Asp Thr Glu Lys Glu Asn Arg Glu Val195 200 205Gly Asp Trp Arg Lys Asn Ile Asp Ala Leu Ser Gly Met Glu Gly Arg210 215 220Lys Lys Lys Phe Glu Ser Glu Phe Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly225 230 235 240Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Arg Met Asp Asp Ile Tyr Lys245 250 255Ala Ala Val Glu Gln Leu Thr Glu Glu Gln Lys Asn Glu Phe Lys Ala260 265 270Ala Phe Asp Ile Phe Val Leu Gly Ala Glu Asp Gly Cys Ile Ser Thr275 280 285Lys Glu Leu Gly Lys Val Met Arg Met Leu Gly Gln Asn Pro Thr Pro290 295 300Glu Glu Leu Gln Glu Met Ile Asp Glu Val Asp Glu Asp Gly Ser Gly305 310 315 320Thr Val Asp Phe Asp Glu Phe Leu Val Met Met Val Arg Cys Met Lys325 330 335Asp Asp Ser Lys Gly Lys Ser Glu Glu Glu Leu Ser Asp Leu Phe Arg340 345 350Met Phe Asp Lys Asn Ala Asp Gly Tyr Ile Asp Leu Asp Glu Leu Lys355 360 365Ile Met Leu Gln Ala Thr Gly Glu Thr Ile Thr Glu Asp Asp Ile Glu370 375 380Glu Leu Met Lys Asp Gly Asp Lys Asn Asn Asp Gly Arg Ile Asp Tyr385 390 395 400Asp Glu Phe Leu Glu Phe Met Lys Gly Val Glu405 410
權(quán)利要求
1.一種人心肌肌鈣蛋白I和肌鈣蛋白C的融合蛋白，是具有序列表中SEQ ID №2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將SEQ ID №2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID №2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述人心肌肌鈣蛋白I和肌鈣蛋白C的融合蛋白是序列表中的SEQ ID №2。
3.一種人心肌肌鈣蛋白I和肌鈣蛋白C的融合蛋白編碼基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有95％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于所述融合蛋白編碼基因是序列表中的SEQ ID №1。
5.含有權(quán)利要求3所述基因的表達(dá)載體。
6.含有權(quán)利要求3所述基因的細(xì)胞系。
7.擴(kuò)增權(quán)利要求3所述基因任一片段的引物對(duì)。
8.權(quán)利要求1所述的人心肌肌鈣蛋白I和肌鈣蛋白C的融合蛋白在人心肌肌鈣蛋白I檢測(cè)中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述人心肌肌鈣蛋白I和肌鈣蛋白C的融合蛋白作為人心肌肌鈣蛋白I檢測(cè)系統(tǒng)中的質(zhì)控品和/或標(biāo)準(zhǔn)品。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述人心肌肌鈣蛋白I和肌鈣蛋白C的融合蛋白用于制備人心肌肌鈣蛋白I抗體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人心肌肌鈣蛋白I和肌鈣蛋白C的融合蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。該融合蛋白是具有序列表中SEQ ID №2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將SEQ ID №2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID №2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的融合蛋白具有穩(wěn)定性好易純化的優(yōu)點(diǎn)，且能被所有cTnI檢測(cè)試劑識(shí)別，將成為cTnI檢測(cè)系統(tǒng)校準(zhǔn)及質(zhì)控的理想選擇，推進(jìn)cTnI檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)程，并可作為抗原制備抗體用于cTnI檢測(cè)試劑的國(guó)產(chǎn)化工作，具有廣闊的工業(yè)應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C07K19/00GK1680450SQ20041002997
公開日2005年10月12日 申請(qǐng)日期2004年4月8日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月8日
發(fā)明者徐國(guó)賓, 閆存玲, 夏鐵安 申請(qǐng)人:北京大學(xué)第一醫(yī)院