專利名稱：高純度10－羥基喜樹堿的化學(xué)半合成工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬化工和醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種以20(s)-喜樹堿為原料半合成10-羥基喜樹堿的生產(chǎn)工藝。
背景技術(shù)：
喜樹堿(Camptothecin，CPT)，淡黃色針狀結(jié)晶，分子式C20H16N2O4，分子量348.3，結(jié)構(gòu)式見下圖 喜樹堿喜樹堿是1966年由美國學(xué)者Wall等人從我國特有樹種喜樹(Camptotheca acuminata)中提取得到的生物堿，具有獨特的抗癌療效，但毒副作用較大，限制了喜樹堿的臨床應(yīng)用。因此，既保持喜樹堿的抗癌活性又具有較低毒性的喜樹堿衍生物一直以來就是人們關(guān)注的熱點。
10-羥基喜樹堿(10-Hydroxycamptothecin，HCPT)，黃色棱柱狀結(jié)晶，分子式C20H16N2O5，分子量364.3，結(jié)構(gòu)式見下圖 10-羥基喜樹堿10-羥基喜樹堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)與喜樹堿相似，僅是10位上的氫被羥基取代，是喜樹堿的天然衍生物。經(jīng)臨床試驗證明，在治療腫瘤方面比喜樹堿具有更好的療效和較小的毒副作用。如今，10-羥基喜樹堿在許多國家已獲得廣泛臨床使用，此外，它還是已獲FDA(美國食品及藥物管理局)批準臨床應(yīng)用的喜樹堿類抗腫瘤藥物CPT-11(Rinotecan，用于治療直腸和結(jié)腸癌)和TPT(Topotecan，用于治療卵巢癌)的半合成前體化合物。
目前，10-羥基喜樹堿的制備方法主要有三種由喜樹中提取，以喜樹堿為原料經(jīng)過生物轉(zhuǎn)化法或者化學(xué)半合成制備10-羥基喜樹堿。
祖元剛的發(fā)明專利“10-羥基喜樹堿高效生產(chǎn)方法”(申請?zhí)朇N 03111557.8)，涉及到從喜樹種芽提取10-羥基喜樹堿的方法。技術(shù)方案是喜樹種子經(jīng)負壓空化混旋破壁、消毒，去除雜質(zhì)，水培發(fā)芽，種芽與提取溶劑混合，勻漿固液萃取、過濾，負壓空化混旋固液萃取，過濾，濃縮，負壓空化混旋液液萃取，重結(jié)晶或硅膠柱層析，得10-羥基喜樹堿。此發(fā)明雖在專利“生產(chǎn)10-羥基喜樹堿和喜樹堿原料得加工方法”(申請?zhí)朇N02132410.7)和“促進喜樹種子芽內(nèi)10-羥基喜樹堿生產(chǎn)得方法”(申請?zhí)朇N02132922.2)的基礎(chǔ)上有較大改進，應(yīng)用了負壓空化混旋破壁，勻漿萃取，負壓空化混旋固液和液液萃取技術(shù)，但受限于天然10-羥基喜樹堿在植物體內(nèi)的極低含量，僅為十萬分之一，采用提取法工業(yè)生產(chǎn)10-羥基喜樹堿會對喜樹資源造成很大的破壞。此外，該工藝還存在著提取、分離工藝比較復(fù)雜，產(chǎn)品得率較低等缺點。
由于喜樹堿在喜樹中的含量比10-羥基喜樹堿高許多，加之喜樹堿的提取工藝已取得較大改進，天然喜樹堿的價格易于為人們接受，因此以喜樹堿為原料制備10-羥基喜樹堿在工業(yè)上是可行的。
朱關(guān)平的發(fā)明專利“用生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)10-羥基喜樹堿的方法”(申請?zhí)朇N85100520A)，涉及用生物轉(zhuǎn)化的方法，將喜樹堿轉(zhuǎn)化為10-羥基喜樹堿。技術(shù)方案是以喜樹堿為原料，通過黃曲霉菌株T-419生物轉(zhuǎn)化，發(fā)酵液經(jīng)填充大孔樹脂提取，再將濃縮物于乙酸乙酯和甲醇中迥流。該方案采用黃曲霉T-419菌株，提高了生物轉(zhuǎn)化率，具有一定的經(jīng)濟效益和發(fā)展?jié)摿?，但該工藝還不夠成熟，存在著轉(zhuǎn)化率較低，菌株培養(yǎng)技術(shù)要求高，分離步驟多等缺點。
相對于生物轉(zhuǎn)化法，化學(xué)半合成方法簡單，易于操作，在工業(yè)上應(yīng)用的比較廣泛。專利(US 4473692)介紹了一種以喜樹堿為原料，經(jīng)過N-氧化和光化學(xué)重排反應(yīng)合成10-羥基喜樹堿，具體路線如下
但是，該工藝仍然存在著一些不足，限制了其工業(yè)應(yīng)用，如未考慮溶劑的回收問題，造成溶劑的大量浪費和環(huán)境污染；第二步反應(yīng)影響因素多，產(chǎn)物得率不穩(wěn)定，而且會生成一個難以與10-羥基喜樹堿分離的副產(chǎn)物(見圖3化合物c)，大大增加了分離的難度和成本。因此，研究一種更為清潔、高效的10-羥基喜樹堿化學(xué)半合成工藝具有很大的經(jīng)濟和環(huán)境效益。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種溶劑可回收利用，反應(yīng)副產(chǎn)物少，產(chǎn)品易分離、得率高、純度高，生產(chǎn)成本低的10-羥基喜樹堿的化學(xué)半合成工藝。
本發(fā)明提出的10-羥基喜樹堿化學(xué)半合成工藝，是以N-氧化和光化學(xué)重排兩步法半合成工藝為基礎(chǔ)，對其存在問題進行優(yōu)化改進而成。具體而言，以20(S)-喜樹堿為原料，在濃度為50-80％的冰乙酸水溶液中通過雙氧水氧化得到中間產(chǎn)物1-氧喜樹堿；再在二噁烷、乙腈酸性體系下紫外燈照射20-50分鐘，使1-氧喜樹堿發(fā)生光化學(xué)重排轉(zhuǎn)化為10-羥基喜樹堿。反應(yīng)得到的10-羥基喜樹堿粗品，經(jīng)過硅膠柱層析，得純度在98.5％以上的10-羥基喜樹堿純品。其中每一步反應(yīng)和分離所用到的試劑均可通過一定的處理后回收利用。與原有工藝相比，使用冰乙酸水溶液(乙酸濃度50～80％)代替原來的36％乙酸，用二噁烷、乙腈體系代替原來的二噁烷、乙腈和水體系，這樣，不僅解決了溶液的回收問題，同時又降低了產(chǎn)物的分離難度，簡化了分離程序，提高了生產(chǎn)效率，使10-羥基喜樹堿的生產(chǎn)工藝更加成熟穩(wěn)定。
具體步驟為(1)N-氧化將喜樹堿溶解于冰乙酸水溶液中，在35-45℃時滴加30％的雙氧水，在65-75℃溫度下攪拌反應(yīng)150-200分鐘。減壓濃縮蒸去乙酸，將殘余液倒入冰水沉淀，在冰箱里靜置，再過濾，烘干。其中，乙酸水溶液的體積濃度為50-80％，喜樹堿與冰乙酸水溶液的重量比為1∶100-5∶100，雙氧水與冰乙酸水溶液的體積比為1∶3-1∶7。
(2)光化學(xué)重排將上述得到的產(chǎn)品加入到二噁烷、乙腈混合溶液中，滴加濃硫酸后在高壓汞燈光照20-35分鐘。減壓濃縮，將殘余液倒入冰水中沉淀，過濾，烘干。其中，二噁烷與乙腈的體積比為4∶6-6∶4，濃硫酸的加入量為二噁烷、乙腈混合液體積的0.1-0.5％。
(3)硅膠層析柱分離常壓玻璃硅膠層析柱，以硅膠填充。色譜柱高度為30～700mm，色譜柱直徑30～180cm，硅膠粒徑為100～300目，樣品和硅膠的質(zhì)量比為1∶50～1∶100。洗脫劑采用甲醇、乙酸乙酯、乙腈之一種與氯仿的混合溶液。干法上樣后，用甲醇或乙酸乙酯或乙腈和氯仿的混合溶液淋洗，收集餾分。檢測后合并相似的餾分，將10-羥基喜樹堿含量超過98.5％的合并液經(jīng)減壓濃縮蒸干，真空干燥后即得到產(chǎn)品；將低于該含量的合并液，經(jīng)減壓濃縮在濃縮液中結(jié)晶，即有固體析出，把濃縮液放到冰箱靜置10小時以上，再過濾、真空干燥后也可得到含量98.5％以上的產(chǎn)品。將所有的濾液蒸干，得到的固體可以和第二步反應(yīng)粗品一起上樣重新分離。
上述工藝中，所用的洗脫劑，甲醇和氯仿的體積比為5∶95～10∶90，乙酸乙酯和氯仿的體積比為30∶70-40∶60，乙腈和氯仿的體積比為3∶97～5∶95。
上述工藝中，蒸餾收集的乙酸溶液通過酸堿滴定確定濃度，再調(diào)整至所需濃度后直接用于下一次反應(yīng)。蒸餾收集的二噁烷和乙腈通過比重法調(diào)整至所需體積比后直接用于下一次反應(yīng)。收集的洗脫劑通過比重法調(diào)整至所需的體積比后直接用于下一次分離。
利用本發(fā)明生產(chǎn)10-羥基喜樹堿，相比原有的化學(xué)半合成工藝，具有以下優(yōu)點1、反應(yīng)溶劑和洗脫液均可回收多次使用，不會降低產(chǎn)物的得率和純度，既有利于減少對環(huán)境的污染，又節(jié)省了大量試劑，降低成本。
2、第一步反應(yīng)采用高濃度的冰乙酸水溶液，相對于36％乙酸來說，相同條件下可使喜樹堿的用量大大增加，提高了生產(chǎn)效率。
3、第二步反應(yīng)在二噁烷、乙腈兩組分溶劑體系中進行，僅有少量副產(chǎn)物，通過硅膠柱層析分離即可得到高純度10-羥基喜樹堿，同時兩組分溶劑使回收利用變得可行。
4、98.5％以上的10-羥基喜樹堿總得率超過35％，而市場上高純度10-羥基喜樹堿價格是喜樹堿的10多倍，可以大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，經(jīng)濟效益非?？捎^。
所用的主要設(shè)備1)分析型高效液相色譜。美國惠普公司的Agilent 1100系列液相色譜，包括溶劑箱、四元梯度泵、真空脫氣機、標準微量自動進樣器、恒溫柱溫箱、可變波長檢測器(VWD)。賽洋1.2G臺式計算機(Agilent ChemStation 4.09.01色譜工作站)。日本SHISEIDO公司CAPCELL PAK C18分析色譜柱(4.6mm I.D.×250mm，5μm)。柱溫35℃；使用HPLC級甲醇-水(體積比50∶50)的流動相；流速為1.0ml/min；喜樹堿的檢測波長是254nm，10-羥基喜樹堿的檢測波長是266nm；進樣量10μl，柱壓101～103bar。
2)LC/MS(液質(zhì)聯(lián)用)。Thermo Finnigan公司的LCQ ADVANTAGE MSSYSTERM，包括TSP高效液相色譜系統(tǒng)和LCQ ADVANTAGE質(zhì)譜檢測儀，Xcalibur1.0.01，MetaChem公司的Taxsi1-3柱(4.6mm I.D.×250mm，5μm)。質(zhì)譜分析條件為電噴霧化學(xué)解離(ESI)和大氣壓化學(xué)電離(APCI)，ESI殼氣為70單位，輔助氣為15單位，源電壓為6KV，加熱毛細管溫度為250℃，蒸發(fā)器溫度為465℃。APCI殼氣為65單位，輔助氣為20單位，源電壓為4.5KV，加熱毛細管溫度為350℃。
3)FTIR(傅立葉紅外光譜檢測)。NICOLET Avatar 360型FT-IR儀，ESP軟件，Digital PII電子計算機控制。
4)核磁共振設(shè)備。Bruker DM 500Hz，DMSO內(nèi)標。
其他儀器有上海申生科技有限公司R501型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；河南省鞏義市英峪豫華儀器廠SHZ-C型循環(huán)水式多用真空泵；德國Sartorius BP211D型精密電子天平；上海市實驗儀器總廠ZK-82A型真空干燥箱；法國Millipore公司的Milli-Q水純化系統(tǒng)；上海司樂儀器廠85-1型磁力攪拌器；GGZ直管形紫外線高壓汞燈。


圖1為喜樹堿、1-氧喜樹堿、10-羥基喜樹堿的質(zhì)譜圖。其中，(I)喜樹堿的質(zhì)譜圖；(II)1-氧喜樹堿的質(zhì)譜圖；(III)10-羥基喜樹堿的質(zhì)譜圖；圖2為實施例1中序號為I～V的反應(yīng)產(chǎn)物的HPLC圖譜。其中，(a)1-氧喜樹堿。
圖3為實施例2中序號為I～IV的反應(yīng)產(chǎn)物的HPLC圖譜。其中，(a)1-氧喜樹堿；(b)10-羥基喜樹堿；(c)反應(yīng)副產(chǎn)物(僅I中存在，保留時間與b十分接近)；(d)喜樹堿；未標物質(zhì)為不影響分離的其他副產(chǎn)物。
圖4為實施例3中編號為I～VI餾分的HPLC圖譜。其中，(a)1-氧喜樹堿；(b)10-羥基喜樹堿；(c)喜樹堿；(d)光照反應(yīng)副產(chǎn)物；未標明物質(zhì)為其他副產(chǎn)物，含量很少。
圖5為10-羥基喜樹堿的紅外光譜圖。
圖6為10-羥基喜樹堿的13C NMR圖譜。
圖7為10-羥基喜樹堿的1H NMR圖譜。
具體實施例方式
實施例1將喜樹堿(10、15或20g)分別在30℃下溶解于1000ml溶液中(36％醋酸；或冰乙酸∶水＝70∶30，V∶V；或是回收后已經(jīng)調(diào)整的溶液)。在40℃時緩慢滴加30％雙氧水200ml，迅速升溫至70℃，攪拌狀態(tài)下反應(yīng)3h。減壓濃縮蒸去乙酸(約殘余50ml)，將殘余液倒入500ml冰水沉淀，在冰箱里靜置12h。過濾，放入真空干燥器烘干，稱重。各個反應(yīng)的產(chǎn)物得率、HPLC純度見表1。
減壓濃縮收集到的乙酸水溶液通過酸堿滴定(0.5M NaOH作標準溶液，酚酞指示劑)測出乙酸濃度，然后添加適量的乙酸或水，調(diào)整乙酸濃度后用于下一次反應(yīng)。
喜樹堿和1-氧喜樹堿的質(zhì)譜鑒定見圖1，反應(yīng)產(chǎn)物的HPLC分析結(jié)果見圖2。
表1實例1各反應(yīng)產(chǎn)物中1-氧喜樹堿的得率和HPLC純度

實施例2將實施例1中得到的黃色產(chǎn)品2.50g加入到裝有2500ml二噁烷、乙腈或者水混合溶液的石英杯中，攪拌溶解，滴加濃H2SO45ml，高壓汞燈(燈管與杯壁距離2～5cm)光照30min，得到棕黃色溶液。減壓濃縮至有固體出現(xiàn)，將殘余液倒入4500ml冰水中沉淀12h。過濾，真空烘干，稱重。10-羥基喜樹堿的質(zhì)譜鑒定見圖1，各個反應(yīng)產(chǎn)物的得率、HPLC純度見表2，對應(yīng)產(chǎn)物的HPLC分析圖譜見圖3。
體積比50∶50的二噁烷和乙腈溶液的比重為0.875，減壓濃縮收集到的溶劑可添加適量的二噁烷或乙腈直至比重調(diào)整到0.875，即可用于下一次反應(yīng)。
表2實例2各反應(yīng)產(chǎn)物中10-羥基喜樹堿的得率和HPLC純度

實施例3取2500g干燥硅膠(200～300目)，裝入φ150×700mm的玻璃層析柱中，填料高度為20cm。稱取實施例2中得到的10-羥基喜樹堿粗品48.49g，采用干法上樣，以5％的甲醇-氯仿溶液淋洗，用500ml的試劑瓶收集淋洗液，依次編號為1～298。對這些餾分先進行TLC檢測，大致確定各物質(zhì)的出峰順序和分布范圍。檢測后發(fā)現(xiàn)未反應(yīng)的1-氧喜樹堿和喜樹堿以及反應(yīng)副產(chǎn)物先被淋洗下來，然后是10-羥基喜樹堿，而編號大于30的餾分以10-羥基喜樹堿為主。為了說明各物質(zhì)在餾分中的含量變化趨勢，將編號9～15、16～18、19～23、24～25、26～31、32～35的餾分分別合并，標以I、II、III、IV、V、VI。將合并液減壓濃縮后，把濃縮液放入冰箱靜置12h，抽濾，烘干。分別取適量固體進行HPLC檢測，結(jié)果見圖4。
編號為36～298的餾分，每十瓶合并，各取10ml合并液進行HPLC檢測，將10-羥基喜樹堿含量超過98.5％的合并液減壓濃縮蒸干，真空干燥后即得到產(chǎn)品；將低于該含量的合并液減壓濃縮至剛好有固體析出，把濃縮液放到冰箱靜置12h，過濾，真空干燥后也可得到含量98.5％以上的產(chǎn)品。而濾液蒸干后得到的固體可以和第二步反應(yīng)粗品一起上樣重新分離。
5％甲醇-氯仿溶液的比重為1.430，減壓濃縮收集到的溶劑可添加適量的甲醇或氯仿將比重調(diào)整到.430，即可循環(huán)使用。
權(quán)利要求
1.一種高純度10-羥基喜樹堿的化學(xué)半合成工藝，其特征在于以20(S)-喜樹堿為原料，在濃度為50-80％的冰乙酸水溶液中通過雙氧水氧化得到中間產(chǎn)物1-氧喜樹堿；再在二噁烷、乙腈酸性體系下用紫外燈照射20-35分鐘，使1-氧喜樹堿發(fā)生光化學(xué)重排轉(zhuǎn)化為10-羥基喜樹堿；反應(yīng)得到的10-羥基喜樹堿粗品，經(jīng)過硅膠柱層析，得純度在98.5％以上的10-羥基喜樹堿純品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化學(xué)半合成工藝，其特征在于喜樹堿原料與冰乙酸水溶液的重量比為1∶100-5∶100，雙氧水與冰乙酸水溶液的體積比為1∶3-1∶7。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化學(xué)半合成工藝，其特征在于光化學(xué)反應(yīng)混合溶劑二噁烷和乙腈的體積比4∶6-6∶4。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化學(xué)半合成工藝，其特征在于硅膠柱層析中，10-羥基喜樹堿粗品與膠硅的質(zhì)量比為1∶50-1∶100。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的化學(xué)半合成工藝，其特征在于硅膠色譜柱分離10-羥基喜樹堿所用洗脫劑為甲醇、乙酸乙酯、乙腈之一種和氯仿的混合溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的化學(xué)半合成工藝，其特征在于甲醇和氯仿的體積比為5∶95～10∶90，乙酸乙酯和氯仿的體積比為30∶70-40∶60，乙腈和氯仿的體積比為3∶97～5∶95。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化學(xué)半合成工藝，其特征在于硅膠柱層析中，10-羥基喜樹堿含量超過98.5％的餾分合并，經(jīng)減壓蒸餾、干燥后得到98.5％以上的純品；低于該含量的餾分合并，經(jīng)減壓濃縮、在濃縮液中結(jié)晶后，也得到98.5％以上的純品。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化學(xué)半合成工藝，其特征在于蒸餾收集的乙酸溶液通過酸堿滴定確定濃度，再調(diào)整至所需濃度后直接用于下一次反應(yīng)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化學(xué)半合成工藝，其特征在于蒸餾收集的二噁烷和乙腈通過比重法調(diào)整至所需體積比后直接用于下一次反應(yīng)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化學(xué)半合成工藝，其特征在于收集的洗脫劑通過比重法調(diào)整至所需的體積比后直接用于下一次分離。
全文摘要
本發(fā)明為一種高純度10－羥基喜樹堿的化學(xué)半合成工藝，它以20(s)－喜樹堿為原料，經(jīng)過優(yōu)化的N－氧化和光化學(xué)重排反應(yīng)，產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱層析，即得到高純度的10－羥基喜樹堿。本工藝操作條件簡便，反應(yīng)試劑可回收利用，生產(chǎn)成本低，10－羥基喜樹堿產(chǎn)品收率高，產(chǎn)物易分離，純度達98.5％，符合國家藥檢標準。
文檔編號C07D491/00GK1583751SQ200410024909
公開日2005年2月23日 申請日期2004年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月3日
發(fā)明者陳建民, 陸華, 吳蓓莉, 陳明興 申請人:上海中城生物工程有限公司