專利名稱：一種新的馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原i、其編碼序列及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及分子免疫學、分子生物學、生物信息學和基因工程等領域，具體地，本發(fā)明涉及一種馬爾尼菲青霉菌(Penicillium marneffei)細胞壁表面抗原I及其編碼序列。本發(fā)明還提供了該細胞壁表面抗原I及其核酸序列的制備方法和應用。
背景技術：
真菌基因組研究始于二十世紀九十年代，第一個完成全基因組測序的真菌是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae，Goffeau et al.1996)。在過去的幾年里，F(xiàn)GI(Fungal Genome Initiative)委員會從150多萬種真菌中，選取了15個在醫(yī)藥和工農業(yè)中具有重要價值的物種進行了基因組學的研究。2003年6月，F(xiàn)GI委員會新增了44個物種，其中包括了馬爾尼菲青霉菌。
馬爾尼菲青霉菌(Penicillium marneffei，PM)是Capponi等首先于1956年在越南從一只中華竹鼠的肝臟分離出來的一種青霉，以其研究所主任Marneffei的名字命名。但此后并沒有引起人們的注意。1973年Disalvo在美國南卡首次發(fā)現(xiàn)人自然感染的病例，患者是一位曾在東南亞旅行過的傳教士。
1964年鄧卓霖在廣西一土生農民身上發(fā)現(xiàn)此菌，但當時全世界都還沒有此病報導，故將其認定為莢膜組織胞漿菌。1984年鄧卓霖在國內首例報導了一例馬爾尼菲青霉病。
從1984年到1987年，廣西醫(yī)科大學病理科收集的19全身播散型病例中，有4例發(fā)現(xiàn)有導致免疫缺陷的疾病，如淋巴瘤，白血病，先天性胸腺發(fā)育不良，SLE(系統(tǒng)性紅斑斕創(chuàng))，TB(結核)等。1999年，鄧卓霖首先發(fā)現(xiàn)了國內第一例合并AIDS的患者。近幾年國內新發(fā)現(xiàn)的病例中，合并AIDS的患者越來越多。泰國至1998年已有1300例合并AIDS的患者。近年來發(fā)現(xiàn)70-80％的AIDS的患者后期感染上馬爾尼菲青霉菌。
馬爾尼菲青霉菌多呈條件致病菌，25℃呈絲狀真菌，為非致病菌；37℃呈酵母形態(tài)，為致病菌。它是一種深部致病真菌。它侵犯人體的單核巨噬系統(tǒng)，破壞人的免疫系統(tǒng)，使人體的免疫力下降。由于它在局部的機械破壞作用，以及代謝產物，毒素等作用，產生炎癥反應，導致濃腫，肉芽腫等改變。并容易破壞血管進入血液循環(huán)，導致敗血癥。進入人體的途徑一般是呼吸道或皮膚。
馬爾尼菲青霉菌是300余種青霉菌中唯一的雙相致病菌(Borneman AR，etal.2000)。隨著AIDS在全世界范圍的蔓延，馬爾尼菲青霉菌引起的急性系統(tǒng)性或播散性感染明顯增加，已成為影響未來公眾健康的潛在機會性致病菌(Ungpakorn R.2000)。馬爾尼菲青霉病病情兇險，若不及時治療，死亡率可高達91.3％(Sirisanthana R，et al.1998)。如果能早期診斷，早期抗真菌治療對此病是有效的(Sirisanthana R，et al.1998)。但因其臨床表現(xiàn)復雜且無特異性，誤診率極高。目前對馬爾尼菲青霉感染診斷主要依靠分離培養(yǎng)及組織病理學檢查。但分離培養(yǎng)耗時長，陽性率低，且易污染造成假陽性結果。組織活檢病理學發(fā)現(xiàn)特征性酵母樣細胞對診斷有重要價值，但極易與莢膜組織胞漿菌及隱球菌感染相混淆。國外學者采用免疫組化方法鑒定馬爾尼菲青霉感染(Arrese E J，et al.1992)，敏感性較低，而且實驗耗時長。Desakorn等(1999)制備熒光標記抗體并采用ELISA方法檢測馬爾尼菲青霉，敏感性高，但由于是多克隆抗體，易出現(xiàn)交叉反應。目前國內尚無一種檢測馬爾尼菲青霉抗原快速、敏感性高、特異性強的方法。
我們經研究發(fā)現(xiàn)了一種新的馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I，用該抗原免疫小鼠成功地制備了對應的單克隆抗體，并經篩選得到了特異性好、親和力高的多株單克隆抗體，同時建立雙抗體夾心ELISA法檢測抗原，應用于臨床快速診斷馬爾尼菲青霉病。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種新的馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I、其編碼序列及該細胞壁表面抗原的應用。
本發(fā)明的上述目的是通過如下技術方案來實現(xiàn)的在本發(fā)明的一個方面，提供了一種來自馬爾尼菲青霉菌(Penicilliummarneffei)的分離的多核苷酸，其含有編碼馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I的多核苷酸序列，所述多核苷酸選自a)與編碼含有SEQ ID NO.2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸有至少70％同源性的多核苷酸，b)編碼含有與SEQ ID NO.2的氨基酸序列至少70％同源性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，c)與a)或b)的多核苷酸互補的多核苷酸，以及d)含有a)、b)或c)的多核苷酸序列的至少15個連續(xù)堿基的多核苷酸。
較佳的，所述的多核苷酸編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.2所示的序列。
或者較佳的，所述的多核苷酸含有(i)如SEQ ID NO.1中核苷酸31-693位的核苷酸序列，或(ii)在遺傳密碼簡并范圍內相應于(i)序列的至少一個序列，或(iii)與互補于(i)或(ii)序列的序列雜交的至少一個序列，和任選地(iv)(i)中中性功能的有義突變。
更佳的，所述的多核苷酸含有SEQ ID NO.1中核苷酸31-693位的核苷酸序列。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種分離的多肽，所述多肽具有與SEQ ID NO.2所示氨基酸序列至少70％同源性的序列或其片段。較佳的，所述多肽是含有SEQID NO.2所示氨基酸序列的多肽。
在本發(fā)明的再一方面，提供了一種載體，所述載體含上述分離出的多核苷酸。
在本發(fā)明的再一方面，提供了一種遺傳工程宿主細胞，所述宿主細胞是用上述載體轉化的宿主細胞。
本發(fā)明還提供了一種生產馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I的多肽的方法，該方法包括如下步驟(I)將編碼馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達調控序列，形成抗原表達載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從核苷酸31-693位的核苷酸序列有至少70％同源性；(II)將步驟(I)中的表達載體轉入宿主細胞，形成馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I重組細胞；(III)在適合表達馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(II)中的重組細胞；(IV)分離出馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I的多肽。
較佳的，上述生產馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I的多肽的方法中，所述核苷酸序列為SEQ ID NO.1中從核苷酸31-693位的核苷酸序列。
本發(fā)明還提供了一種抗體，所述抗體是能與上述馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I特異性結合的抗體。
本發(fā)明還包括一種探針分子，該探針分子通常含有馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I的核苷酸序列的8-100個，較佳地15-50個連續(xù)核苷酸。該探針分子可用于檢測樣品中是否存在編碼馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I的核酸分子。
本發(fā)明還提供了含所述的多肽或其連續(xù)片段的藥物組合物及疫苗組合物。
本發(fā)明還提供了所述的多核苷酸、多肽、抗體及疫苗在制備診斷和治療針對馬爾尼菲青霉菌引起的疾病的藥物及試劑盒中的應用。
本發(fā)明還提供了包含所述的多核苷酸、多肽或抗體或它們的連續(xù)片斷的試劑盒及生物芯片。
本發(fā)明還提供了雙抗體夾心ELISA法檢測所述抗原，應用于臨床快速診斷馬爾尼菲青霉病。
本發(fā)明還包括檢測馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I的核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進行雜交，然后檢測探針是否發(fā)生了結合。較佳地，該樣品是PCR擴增后的產物，其中PCR擴增引物對應于馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I的編碼序列，可位于該編碼序列的兩側或中間。引物長度一般為20-50個核苷酸。
根據本發(fā)明公開的馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I及其基因，可以制備相關疫苗，并可為進一步開發(fā)針對該病菌引起的疾病的藥物提供重要的參考價值，同時，它們也可以作為這類疾病診治的潛在藥物靶點。
具體實施例方式
本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或是RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA，或人工化學合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。單鏈的DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。
在本發(fā)明中，“分離的”多核苷酸是指，該多核苷酸或片斷已從天然狀態(tài)下位于其兩側的序列中分離出來，還指該多核苷酸或片斷已經與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組份分開，而且已經與在細胞中伴隨其的蛋白質分開。
本發(fā)明中，術語“馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I的編碼序列”是指編碼具有馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ IDNO.1中31-693位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQ ID NO.1序列的編碼框31-693位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后產生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO.1中31-693位核苷酸序列同源性低至約70％的簡并序列也能編碼出SEQ ID NO.2所述的序列。該術語還包括在中度嚴緊條件下，更佳地在高度嚴緊條件下，與SEQ ID NO.1中從核苷酸31-693位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。此外，該術語還包括與SEQ ID NO.1中從核苷酸31-693位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
該術語還包括能編碼具有與馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.1中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常位1-90個，較佳地1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數個(通常位60個以內，較佳地為30個以內，更佳地為10個以內，最佳地為5個以內)核苷酸。
在本發(fā)明中，術語“馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I”是指具有馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I蛋白活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。該術語還包括具有與馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I相同功能的、SEQ ID NO.2序列的變異形式。這些變異形式包括(但不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為20個以內，較佳地10個以內，更佳地為5個以內)氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個氨基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I的活性片斷和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I的DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還提供了馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I的可溶性片段。通常，該片段具有馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I多肽序列的至少約10個連續(xù)氨基酸，通常至少約30個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I的類似物。這些類似物與天然多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還可以包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸、磷酸絲氨酸、磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，可選用本領域已知的各種載體，如市售的載體。
在本發(fā)明中，術語“宿主細胞”包括原核細胞和真核細胞。常用的原核宿主細胞的例子包括大腸桿菌等。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞。
另一方面，本發(fā)明還包括對馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I具有特異性的抗體，尤其是單克隆抗體。這里“特異性”是指抗體能結合于馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I或片段。較佳地，指那些能與馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I或片段結合但不識別和結合于其它非相關抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結合并抑制馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I的分子，也包括那些并不影響表面抗原I蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經修飾形式的表面抗原I結合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利NO.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行制備。例如，純化的馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導多克隆抗體的產生。與之相似的，表達馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來制備(見Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I的抗體以及不影響其功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I的片段或功能區(qū)，通過免疫技術獲得，這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I的未修飾形式結合的抗體可以用原核細胞(例如E.Coli)中生產的基因產物來免疫動物而產生；與翻譯后修飾形式結合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細胞(例如酵母或昆蟲細胞)中產生的基因產物來免疫動物而獲得。
本發(fā)明的疫苗可以是預防性的(即預防感染)或治療性的(即在感染后治療疾病)。這些疫苗包含免疫性抗原或免疫原、免疫原性多肽、蛋白或蛋白片段、或核酸(如核糖核酸或脫氧核糖核酸)，通常與″藥學上可接受的載體″組合，這些載體包括本身不誘導產生對接受該組合物的個體有害的抗體的任何載體。合適的載體通常是大的、代謝緩慢的大分子，如蛋白質、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、氨基酸聚合物、氨基酸共聚物、脂質凝集物(如油滴或脂質體)以及無活性的病毒顆粒。這些載體是本領域普通技術人員所熟知的。另外，這些載體可起免疫刺激劑(″佐劑″)作用。另外，抗原或免疫原可以和細菌類毒素(如白喉、破傷風、霍亂、幽門螺桿菌等病原體的類毒素)偶聯(lián)。
包括免疫原性組合物在內的疫苗組合物(如可包括抗原，藥學上可接受的載體以及佐劑)，通常含有稀釋劑，如水，鹽水，甘油，乙醇等。另外，輔助性物質，如潤濕劑或乳化劑、pH緩沖物質等可存在于這類運載體中。此外，包括免疫原性組合物在內的疫苗組合物可含有在藥學上可接受載體中的抗原、多肽、蛋白、蛋白片段或核酸。
更具體地，包括免疫原性組合物在內的疫苗，包含免疫學有效量的免疫原性多肽，以及上述其它所需的組分。“免疫學有效量”指以單劑或連續(xù)劑一部分給予個體的量對治療或預防是有效的。該用量根據所治療個體的健康狀況和生理狀況、所治療個體的類別(如非人靈長類等)、個體免疫系統(tǒng)合成抗體的能力、所需的保護程度、疫苗的配制、治療醫(yī)師對醫(yī)療狀況的評估、及其它的相關因素而定。預計該用量將在相對較寬的范圍內，可通過常規(guī)實驗來確定。
通常，可將疫苗組合物或免疫原性組合物制成可注射劑，例如液體溶液或懸液；還可制成在注射前適合配入溶液或懸液、液體賦形劑的固體形式。該制劑還可乳化或包封在脂質體中，在上述藥學上可接受的載體下增強佐劑效果。
常規(guī)方法是從腸胃外(皮下或肌內)途徑通過注射給予免疫原性組合物。適合其它給藥方式的其它配方包括口服制劑、栓劑和透皮應用。治療劑量可以是單劑方案或多劑方案。疫苗可以結合其它免疫調節(jié)劑一起給予。
作為以蛋白質為基礎的疫苗的一種替代方案是，可以采用DNA疫苗接種。
本發(fā)明的馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I核苷酸序列全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據本發(fā)明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，并用市售的cDNA庫或按已知方法制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列，這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。當然，也可通過先合成多個小片段，然后再進行連接而獲得序列很長的片段。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I基因的克隆1.總RNA分離(Totle RNA isolation)將馬爾尼菲青霉菌，在37℃或25℃培養(yǎng)后，離心棄上清取菌體，加入TRIzolReagents抽提其總RNA(TRIzol Reagents，Gibco，NY，USA)。用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質量。
2.mRNA的分離(mRNA isolation)用帶Oligo d(T)的纖維素柱分離總RNA中的mRNA(Invitrogen，Carlsbad，CA)，定量。
3.cDNA文庫的構建(Construction of cDNA library)以mRNA為模板，反轉錄酶作用下合成雙鏈cDNA。過柱篩選長度＞500bp的片段，用酚-氯仿抽提，乙醇沉淀，無菌水溶解，連接至pDONRTM222(Invitrogen，Carlsbad，CA)載體，以CloneMinerTMcDNA Library Construction Kit(Invitrogen，Carlsbad，CA)進行包裝，電擊轉化，宿主菌使用DH10B(Invitrogen，Carlsbad，CA)細菌。涂板并測定滴度。
4.測序及數據庫建立(Seqenc ing and Database Constructing)挑選0文庫中有外源片段插入的克隆，擴增后抽提質粒(Qiagen，Germany)，用T3和T7作為3’端和5’端的通用引物，采用終止物熒光標記(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377測序儀(Perkin-Elmer，USA)上進行EST大規(guī)模測序。測序結果用FACTURA軟件去除載體序列，傳輸到SUN Ultra 450Server上進行下一步的處理。所有的序列信息再用GCG軟件包(Wisconsingroup，USA)中的BLAST和FASTA軟件搜索已有的數據庫(Genebank+EMBL)，將無同源性或同源性低于95％的序列視為新基因建立數據庫。
5.基因的全長克隆(Cloning of Full-length cDNA)在得到的新基因片段序列信息基礎上，進行cDNA全長克隆，分兩階段進行(1)“電子克隆”(Electronic Cloning)以新基因片段序列作為探針搜尋dbEST數據庫，將重疊序列＞50bp，同源性在98％以上的表達序列標簽(Expressed Sequence Tag，簡稱“EST”)序列認為同一序列(consensus sequence)，取出并用AUTOASSEMBLER軟件進行拼接，部分EST可以延伸探針序列。再用STRIDER軟件分析被延伸的序列是否具有完整的開放閱讀框架(Open Reading Frame，ORF)，用BLAST搜尋Genbank或SwissProt以確定該序列在核苷酸和氨基酸水平上是否與其他物種有同源性，以幫助判別所得到的基因全長完整性如何。通過電子克隆的方法，通常可獲取馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I基因的全長序列。
(2)cDNA末端快速擴增(Rapid Amplification of cDNA Ends，RACE)如果通過“電子克隆”方法仍未得到完整的cDNA全長，則在已有序列的5’或3’端設計引物，在馬爾尼菲青霉菌cDNA文庫中進行長距離PCR反應。然后對PCR產物克隆、測序。用AUTOASSEMBLER及STRIDER軟件分析被延長的序列有無完整的ORF，如無，重復上述過程直至獲得全長。
(3)RT-PCR對于5’和3’端已知的序列，如果中間尚有一段間隙(gap)無法從已有的公共數據庫或自身數據庫獲得，可考慮采用RT-PCR的方法。在序列5’端設計引物，3’端引物采用Oligo-dT，在馬爾尼菲青霉總RNA庫中進行擴增。然后對產物進行克隆、測序。最后拼接并獲得全長。
通過組合使用上述3種方法，獲得了候選的馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I的全長編碼序列，即獲得SEQ ID NO.1所示的序列。
根據得到的全長cDNA序列推導出細胞壁表面抗原I的氨基酸序列，共220個氨基酸，其氨基酸序列詳見SEQ ID NO.2。
實施例2馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I基因的序列信息與同源性分析本發(fā)明新的馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I基因的全長cDNA為859bp，詳細序列見SEQ ID NO.1，其中開放讀框位于31-693位核苷酸。根據全長cDNA推導出馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I的氨基酸序列，共220個氨基酸殘基。詳細序列見SEQ ID NO.2。
將馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I的全長cDNA序列及其編碼蛋白質用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundantGenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR數據庫中進行核苷酸和蛋白質同源性檢索，結果發(fā)現(xiàn)在氨基酸水平上，它與馬爾尼菲青霉甘露糖蛋白1(MP1，SwissProt Accession No.042721)的第1-187位氨基酸殘基僅有32％的相同性和50％的相似性。由上可見，馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I基因與MP1基因在蛋白水平上同源性較低，是一種新的細胞壁抗原基因。
本發(fā)明的馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I除了可作為該家族一員用于進一步的功能研究，還可用于與其他蛋白一起產生融合蛋白，比如與免疫球蛋白一起產生融合蛋白。此外，本發(fā)明的馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I還可以與該家族的其他成員進行融合或交換片段，以產生新的蛋白。例如將本發(fā)明的馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I蛋白的N端與MP1蛋白的N端進行交換，以產生新的活性更高或具有新特性的蛋白。
針對本發(fā)明馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I的抗體，用于篩選該家族的其他成員，或者用于親和純化相關蛋白(如該家族的其他成員)。
實施例3馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I的結構和功能研究將馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I的氨基酸序列在PROSITE數據庫(網址為http//expasy.hcuge.ch/sprot/scnpsitl.html)中檢索基序(motif)，得到以下結果在氨基酸序列中，存在以下功能基序(i)蛋白激酶C磷酸化位點(Protein kinase C phosphorylation site)86-88(ii)酪蛋白激酶II磷酸化位點(Casein kinase II phosphorylationsite)20-23，33-36，45-48，63-66，80-83，91-94，100-103，212-215(iii)N-豆蔻?；稽c(N-myristoylation site)58-63，132-137，200-205(IV)N糖基化位點(N-glycosylation site)43-46而蛋白激酶C磷酸化位點、酪蛋白激酶II磷酸化位點、N-豆蔻酰化位點和N糖基化位點均與翻譯后修飾(post-translational modifications)有關，并且這些位點在藥物開發(fā)過程中起著關鍵作用，可作為治療由馬爾尼菲青霉菌引起的疾病的藥物的作用靶點。
實施例4馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I基因的生長發(fā)育表達譜電子Northern表達譜。按Ton C.等人的方法(Ton C et al.，Biochem BiophysRes Commun 1997 Dec 18；241(2)589-594；Hwang DM，et al.，Circulation1997 Dec 16；96(12)4146-4203)，將馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I cDNA序列在GCG軟件包中的dbEST數據庫中做BLAST檢索，在得到的EST中，概率值＜10e-10、相同性＞95％的EST，可視為該基因在不同生長發(fā)育過程中的轉錄表達本，由此得出表達該基因的生長發(fā)育譜，揭示它在馬爾尼菲青霉菌不同發(fā)育階段中都發(fā)揮著重要作用。
實施例5馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I的制備和提純在該實施例中，將全長的馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I編碼序列或片斷構建入商品化的蛋白質融合表達載體之中，以表達和提純重組蛋白。
(1)原核表達載體的構建，以及轉化大腸桿菌根據馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I的全長編碼序列(SEQ ID NO.1)，設計擴增出完整編碼閱讀框的引物(分別對應于編碼序列5’和3’端的約20個以上核苷酸)，并在正反引物上分別引入限制性內切酶位點(這根據選用的pDESTTM17載體而定)，以便構建表達載體。將馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I基因在保證閱讀框正確的前提下克隆至pDESTTM17載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)。鑒定好的表達載體利用電擊轉化方法轉入大腸桿菌BL21，篩選鑒定得到含有pDESTTM17-細胞壁表面抗原I表達載體的工程菌BL21-pDESTTM17-細胞壁表面抗原I。
(2)表達GST-細胞壁表面抗原I重組蛋白的工程菌的分離鑒定挑取單菌落的BL21-pDESTTM17-細胞壁表面抗原I工程菌于3ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中振搖培養(yǎng)過夜，按1∶100的濃度吸取培養(yǎng)液于新的LB培養(yǎng)基(含100μg/ml氨芐青霉素)中培養(yǎng)約3小時，至OD600達0.5后，加入IPTG至終濃度1mmol/L繼續(xù)于37℃分別培養(yǎng)0，1，2，3小時。取培養(yǎng)時間不同的1ml菌液離心，在細菌沉淀物中加入裂解液(2×SDS上樣緩沖液50μl，蒸餾水45μl，二巰基乙醇5μl)，混懸細菌沉淀，沸水浴中煮5分鐘，10000rpm離心1分鐘，上清加入12％SDS-PAGE膠中電泳。染色后觀察預期分子量大小的蛋白量隨IPTG誘導時間增加而增加的菌株即為表達GST-細胞壁表面抗原I融合蛋白的工程菌。
(3)GST-細胞壁表面抗原I融合蛋白的提取純化按上述方法誘導表達GST-細胞壁表面抗原I融合表達蛋白的工程菌BL21-pDESTTM17-細胞壁表面抗原I。誘導后的細菌離心沉淀，按每400ml菌加入20ml PBS重懸細菌，超聲破碎細菌。破菌完全的超聲液按每毫升加入20微升的量加入PBS飽和的50％谷胱苷肽Sepharose 4B，37℃振搖結合30分鐘，10000rpm離心10分鐘沉淀結合了GST-細胞壁表面抗原I的谷胱苷肽Sepharose4B，棄上清。按每毫升超聲液所得沉淀加入100μl PBS的量清洗兩次，而后按每毫升超聲液所得沉淀加入10μl還原型谷胱苷肽洗脫液，室溫置10分鐘，10000rpm離心10分鐘，上清即為洗脫的融合蛋白。重復洗脫兩次。洗脫的上清保存于-80℃，并進行SDS-PAGE電泳，檢測純化效果。在24kDa處的蛋白質條帶即為馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I蛋白。
實施例6馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I在酵母中進行真核細胞表達1.馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I酵母表達載體的構建及轉化根據馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I的全長編碼序列(SEQ ID NO.1)，設計擴增出完整編碼閱讀框的引物，并在正反引物上分別引入限制性內切酶位點(這可視選用的載體而定)，以便構建表達載體。將馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I的cDNA在保證閱讀框架的前提下克隆至pYES2-DEST52載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)。鑒定好的表達載體利用電擊轉化方法轉入酵母細胞DB3.1中，利用氨芐青霉素篩選鑒定得到含有pYES2-DEST52-細胞壁表面抗原I表達載體的工程菌DB3.1-pYES2-DEST52-細胞壁表面抗原I。
2.表達細胞壁表面抗原I重組蛋白的工程菌的分離鑒定挑取單菌落的DB3.1-pYES2-DEST52-細胞壁表面抗原I工程菌于3ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中振搖培養(yǎng)過夜，按1∶100的濃度吸取培養(yǎng)液于新的YPD培養(yǎng)基(含100μg/ml氨芐青霉素)中培養(yǎng)至OD600達0.5。取1ml菌液離心，在菌體沉淀物中加入裂解液(2×SDS上樣緩沖液50μl，蒸餾水45μl，二巰基乙醇5μl)，混懸菌體沉淀，沸水浴中煮5分鐘，10000rpm離心1分鐘，上清加入12％SDS-PAGE膠中電泳。染色后觀察預期分子量大小的蛋白量的菌株即為表達馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I融合蛋白的工程菌。
收集轉化的細胞進行Western鑒定。將菌體裂解后進行SDS-PAGE電泳，電泳后的膠于Pharmacia的Multiphor II半干電轉移儀中將蛋白質轉印到硝酸纖維膜上，將硝酸纖維膜置于封閉液中封閉1小時，而后于抗馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I的抗體溶液中封閉1小時，TBS液振搖清洗5分鐘共2次，而后將膜置于生物素標記的抗馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I一抗的第二抗體溶液中振搖1小時，TBS清洗，加入親和素-堿性磷酸酶復合物反應30分鐘，TBS清洗2次，加入新鮮配制的顯色液顯色觀察蛋白條帶。
挑取高表達馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I的克隆。
3.馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I的提取純化按上述方法誘導表達細胞壁表面抗原I的工程菌DB3.1-pYES2-DEST52-細胞壁表面抗原I。收集菌體沉淀，菌體沉淀加入PBS重懸菌體，超聲破碎菌體，離心，清洗幾次，進行SDS-PAGE電泳，檢測純化效果。在24kDa處的蛋白質條帶即為馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I。
實施例7抗馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I抗體的制備將實施例5和實施例6中獲得的馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I用層析法進行分離后備用，也可以用SDS-PAGE凝膠電泳法進行分離，將電泳條帶從凝膠中割下，并用等體積的完全Freund’s佐劑乳化。取6-8周齡Balb/C雌鼠，用50-100μg/0.2ml乳化過的蛋白，對小鼠進行腹膜內注射。14天后，用非完全Freund’s佐劑乳化的同樣抗原對小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量再加強免疫一次，3-5天后用于融合。然后制備飼養(yǎng)細胞，再進行細胞融合。
在細胞融合10-15天后，需逐孔進行檢查，一旦發(fā)現(xiàn)旺盛的雜交細胞集落生長，就應用馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I做抗體活性的初步篩選，常用的方法有免疫熒光試驗、發(fā)射免疫試驗(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)。檢查出抗體活性的孔后，立刻進行克隆培養(yǎng)，并分離出抗體。
實施例8馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I基因用于制備生物芯片用獲取的馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I基因的核苷酸序列涉及引物，擴增出全長的馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I基因或該基因的部分片斷，用作生物芯片點樣的樣品。
用英國的BioRobotics自動點膜儀將樣品點在8×12cm尼龍膜上，每一標本點4個點，每點的DNA量約為10ng。陽性對照是重復4次點樣的人β-actin基因，陰性對照是重復4次點樣的λ噬菌體DNA。
含有馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I基因的芯片可用于感染馬爾尼菲青霉菌疾病的診斷和藥物篩選。
實施例9免疫制劑用常規(guī)基因工程方法將馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I基因克隆入融合表達載體，融合表達的受體菌選用大腸桿菌或結核桿菌(卡介苗)。在大腸桿菌中表達的馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I須先將其分離、濃縮、提純，加入福氏佐劑制備成細胞壁表面抗原I免疫原。在卡介苗中表達的細胞壁表面抗原I可直接作為免疫原，即疫苗。
序列表<110>上海人類基因組研究中心<120>一種新的馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I、其編碼序列及其應用<130>NP-1244<160>2<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>859<212>DNA<213>馬爾尼菲青霉菌(Penicillium marneffei)<220>
<221>CDS<222>(31)..(693)<400>1aaataatagt acacctatta actaattacc atg aag ttc tta ccc tct ctc gtc 54Met Lys Phe Leu Pro Ser Leu Val1 5gtc ctc ggt ctt tct acc cag gct ctt gcg agc tct tac gtc gat tat 102Val Leu Gly Leu Ser Thr Gln Ala Leu Ala Ser Ser Tyr Val Asp Tyr10 15 20gtt act aag gac cag cat ggt ctt act gtt tat gag atg gtc ata aat 150Val Thr Lys Asp Gln His Gly Leu Thr Val Tyr Glu Met Val Ile Asn25 30 35 40atc att aac acc act acc tca gac ttc aat acc cgg att cag agt tac 198Ile Ile Asn Thr Thr Thr Ser Asp Phe Asn Thr Arg Ile Gln Ser Tyr45 50 55cag ggt ggt gat ctc agc agc att ctc gaa ggc tgt aat caa gtt acc 246Gln Gly Gly Asp Leu Ser Ser Ile Leu Glu Gly Cys Asn Gln Val Thr60 65 70caa ata atg aag ctt ggg gct acg ata ctc gat cag caa aca acg aaa 294
Gln Ile Met Lys Leu Gly Ala Thr Ile Leu Asp Gln Gln Thr Thr Lys75 80 85ccc ctt acc aat aat gag tgg ctt agc ctc ctc tca cat atg gag aaa 342Pro Leu Thr Asn Asn Glu Trp Leu Ser Leu Leu Ser His Met Glu Lys90 95 100aag ggt ggt tta gaa gat atg ttg aaa atg gct ata aat act ctt atc 390Lys Gly Gly Leu Glu Asp Met Leu Lys Met Ala Ile Asn Thr Leu Ile105 110 115 120ctg aag aag tca ctt att ctt gat tct ggt ttg ggt tct aag ctt ggg 438Leu Lys Lys Ser Leu Ile Leu Asp Ser Gly Leu Gly Ser Lys Leu Gly125 130 135tta gcg ctt tac agt cag cag atg gct tct ata gac ctc ggt gct aag 486Leu Ala Leu Tyr Ser Gln Gln Met Ala Ser Ile Asp Leu Gly Ala Lys140 145 150ttc ttt gag aag acc ccc cca gga aag gtc gaa gat ttc aga gaa cac 534Phe Phe Glu Lys Thr Pro Pro Gly Lys Val Glu Asp Phe Arg Glu His155 160 165tgg ttt aag aac atc atg tgg gtc atc ggg cga ggt gtt gat acc ttt 582Trp Phe Lys Asn Ile Met Trp Val Ile Gly Arg Gly Val Asp Thr Phe170 175 180gat aaa tct acc cat cac gcg aca ata cct acc tta ccc cct aga ggt 630Asp Lys Ser Thr His His Ala Thr Ile Pro Thr Leu Pro Pro Arg Gly185 190 195 200gct atg gcg act agt aat tcg cct gct atc cct act ttt act gat gct 678Ala Met Ala Thr Ser Asn Ser Pro Ala Ile Pro Thr Phe Thr Asp Ala205 210 215gct agt gct aac tag gttagcagtg cgactagccc tacccgctat tcctttctaa 733Ala Ser Ala Asn220ttcaaaggaa ttggttattc ttgatagtct gaatctgtct gatagagttg tttctgctag793gtgtcaagat aattcagtat attatttata aaagaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa853aaaaaa
859<210>2<211>220<212>PRT<213>馬爾尼菲青霉菌(Penicillium marneffei)<400>2Met Lys Phe Leu Pro Ser Leu Val Val Leu Gly Leu Ser Thr Gln Ala1 5 10 15Leu Ala Ser Ser Tyr Val Asp Tyr Val Thr Lys Asp Gln His Gly Leu20 25 30Thr Val Tyr Glu Met Val Ile Asn Ile Ile Asn Thr Thr Thr Ser Asp35 40 45Phe Asn Thr Arg Ile Gln Ser Tyr Gln Gly Gly Asp Leu Ser Ser Ile50 55 60Leu Glu Gly Cys Asn Gln Val Thr Gln Ile Met Lys Leu Gly Ala Thr65 70 75 80Ile Leu Asp Gln Gln Thr Thr Lys Pro Leu Thr Asn Asn Glu Trp Leu85 90 95Ser Leu Leu Ser His Met Glu Lys Lys Gly Gly Leu Glu Asp Met Leu100 105 110Lys Met Ala Ile Asn Thr Leu Ile Leu Lys Lys Ser Leu Ile Leu Asp115 120 125Ser Gly Leu Gly Ser Lys Leu Gly Leu Ala Leu Tyr Ser Gln Gln Met130 135 140
Ala Ser Ile Asp Leu Gly Ala Lys Phe Phe Glu Lys Thr Pro Pro Gly145 150 155 160Lys Val Glu Asp Phe Arg Glu His Trp Phe Lys Asn Ile Met Trp Val165 170 175Ile Gly Arg Gly Val Asp Thr Phe Asp Lys Ser Thr His His Ala Thr180 185 190Ile Pro Thr Leu Pro Pro Arg Gly Ala Met Ala Thr Ser Asn Ser Pro195 200 205Ala Ile Pro Thr Phe Thr Asp Ala Ala Ser Ala Asn210 215 220
權利要求
1.一種來自馬爾尼菲青霉菌(Penicillium marneffei)的分離的多核苷酸，其含有編碼馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I的多核苷酸序列，所述多核苷酸選自a)與編碼含有SEQ ID NO.2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸有至少70％同源性的多核苷酸，b)編碼含有與SEQ ID NO.2的氨基酸序列至少70％同源性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，c)與a)或b)的多核苷酸互補的多核苷酸，以及d)含有a)、b)或c)的多核苷酸序列的至少15個連續(xù)堿基的多核苷酸。
2.如權利要求1所述的一種分離的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.2所示的序列。
3.如權利要求1所述的一種分離的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸含有(i)如SEQ ID NO.1中核苷酸31-693位的核苷酸序列，或(ii)在遺傳密碼簡并范圍內相應于(i)序列的至少一個序列，或(iii)與互補于(i)或(ii)序列的序列雜交的至少一個序列，和任選地(iv)(i)中中性功能的有義突變。
4.如權利要求3所述的一種分離的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸含有SEQ ID NO.1中核苷酸31-693位的核苷酸序列。
5.一種分離的多肽，其特征在于，所述多肽具有與SEQ ID NO.2所示氨基酸序列至少70％同源性的序列或其片段。
6.如權利要求5所述的一種分離的多肽，其特征在于，所述多肽是含有SEQID NO.2所示氨基酸序列的多肽。
7.一種載體，其特征在于，所述載體含有權利要求1所述的分離的多核苷酸。
8.一種遺傳工程宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞是用權利要求7所述載體轉化的宿主細胞。
9.一種生產馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I的多肽的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟(I)將編碼馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達調控序列，形成抗原表達載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從核苷酸31-693位的核苷酸序列有至少70％同源性；(II)將步驟(I)中的表達載體轉入宿主細胞，形成馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I重組細胞；(III)在適合表達馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(II)中的重組細胞；(IV)分離出馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I的多肽。
10.如權利要求9所述的一種產生馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I的多肽的方法，其特征在于，所述核苷酸序列為SEQ ID NO.1中從核苷酸31-693位的核苷酸序列。
11.一種抗體，其特征在于，所述抗體是能與權利要求5或6所述的多肽特異性結合的抗體。
12.一種探針分子，其特征在于，所述的探針分子含有權利要求1所述的多核苷酸中8-100個連續(xù)的核苷酸。
13.權利要求5或6的多肽在制備治療針對馬爾尼菲青霉菌引起的疾病的藥物中的應用。
14.含有權利要求5或6的多肽的藥物組合物。
15.含有權利要求5或6的多肽的疫苗組合物。
16.權利要求5或6的多肽作為診斷試劑和疫苗在防治馬爾尼菲青霉菌引起的疾病中的應用。
17.一種用于診斷和治療針對馬爾尼菲青霉菌引起的疾病的試劑盒，其特征在于所述試劑盒包含權利要求1～4中任一種多核苷酸序列或其連續(xù)片段，或者所述試劑盒包含權利要求5或6的多肽或其連續(xù)片段，或者所述試劑盒包含權利要求11的抗體。
18.一種生物芯片，其特征在于所述生物芯片的載體上含有權利要求1～4中任一種多核苷酸序列或其連續(xù)片段，或者所述生物芯片的載體上含有權利要求5或6的多肽或其連續(xù)片段，或者所述生物芯片的載體上包含權利要求11的抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種在馬爾尼菲青霉菌(Penicillium marneffei)正常細胞壁中表達的新的馬爾尼菲青霉菌細胞壁表面抗原I及其編碼序列，本發(fā)明還提供了該細胞壁表面抗原蛋白及其核酸的制備方法及其應用。用該抗原免疫小鼠成功地制備了對應的單克隆抗體，并經篩選得到了特異性好、親和力高的多株單克隆抗體，同時建立雙抗體夾心ELISA法檢測抗原，可應用于臨床快速診斷馬爾尼菲青霉病。
文檔編號C07K16/28GK1673371SQ200410017120
公開日2005年9月28日 申請日期2004年3月23日 優(yōu)先權日2004年3月23日
發(fā)明者卜云萍, 任雙喜, 湯生榮, 殷世亮, 嚴中華, 李運千, 施煒亮, 武金煒, 錢震, 盧凌峰, 張丕燕, 許彬, 沈歡 申請人:上海人類基因組研究中心