專利名稱：可室溫貯存的免疫球蛋白靜脈注射制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種免疫球蛋白靜脈注射制劑，更具體地說，是一種可室溫貯存的免疫球蛋白靜脈注射液體制劑。
背景技術(shù)：
在作為血漿蛋白成份的γ-球蛋白中，一種包含IgG的免疫球蛋白制劑已經(jīng)被用來預(yù)防和治療各種傳染病。這種球蛋白的溶液形式是不穩(wěn)定的。人們知道免疫球蛋白聚集的后果，也就是說，在分離操作過程中，免疫球蛋白形成多聚體或二聚體的變性后果是，其表現(xiàn)出補(bǔ)體結(jié)合能力即抗補(bǔ)體活性的顯著增加，導(dǎo)致a)人體靜脈給藥后血清中補(bǔ)體濃度降低，或b)嚴(yán)重的副作用例如過敏性休克。因此，免疫球蛋白沒有被制成液體制劑，而是制成無水制劑尤其是冷凍干燥劑型。然而，無水制劑伴隨的問題是它不能方便地給藥，因?yàn)樵谧⑸浠蝾愃剖褂脮r(shí)需先在蒸餾水中溶解。
另一方面，與無水制劑相比，液體制劑在注射或類似使用時(shí)不用在蒸餾水中溶解，能方便地給藥。然而，正如上面所描述的，它伴隨的缺陷是免疫球蛋白的穩(wěn)定性很差。因此，人們一直試圖研制出能用于靜脈給藥的并且穩(wěn)定的免疫球蛋白液體組合物。
例如在JP-A-63-192724(這里使用的術(shù)語“JP-A”表示一個(gè)“尚未審查的已公開的JP申請(qǐng)”(美國專利4,876,088，EP278422))中公開了一種能用于靜脈注射的免疫球蛋白液體組合物，所述的組合物甚至在溶液形式時(shí)也很穩(wěn)定，具有低的傳導(dǎo)度，pH值是5.5±0.2，含有山梨糖醇作為穩(wěn)定劑。
JPA-58-43914(美國專利4,396,608和4,499,073，EP73371)中公開，為了獲得一種基本上不含有免疫球蛋白聚集物，且血清免疫球蛋白單體含量超過90％的免疫球蛋白組合物，將一種血清免疫球蛋白溶液被調(diào)節(jié)到離子強(qiáng)度不到0.001，pH值為3.5-5.0。
JP-A-9-124507(EP76447)公開了一種為了降低免疫球蛋白抗補(bǔ)體活性，在pH為3.5-5.0條件下降低免疫球蛋白溶液離子強(qiáng)度的步驟，此步驟為病毒滅活步驟后用三-(正丁基)磷酸酯處理免疫球蛋白。
JP-A-7-238036(EP702960)公開了改善免疫球蛋白的穩(wěn)定性的方法，可通過酸處理或貯存在室溫中抑制免疫球蛋白的聚集，也就是說，不僅抑制免疫球蛋白多聚體，還抑制免疫球蛋白二聚體的增多。
JP-W-59-501546(這里使用的術(shù)語“JP-W”表示一個(gè)尚未審查的已公開的日本國際專利申請(qǐng)，WO 84-891)公開了將pH為5-5.6并有0.05-2W/V％聚乙二醇(PEG)存在的免疫球蛋白制劑進(jìn)行超濾處理的方法。
然而，即使考慮到上面公開的各種步驟的效果，但仍存在進(jìn)一步改善免疫球蛋白制劑的室溫貯存穩(wěn)定性的余地，尤其是免疫球蛋白溶液的室溫貯存穩(wěn)定性。
JP-A-63-8340(美國專利4,762,714和4,948,877，EP240856)中公開了一種制備其中基本上不含有獲得性病毒的血清免疫球蛋白制劑的方法，通過在pH約為5.4或更低些條件下用冷的乙醇分級(jí)分離方法包括從人血漿中得到血清免疫球蛋白，將血清免疫球蛋白在pH為4.25或更低些條件下貯存至少3天，或在pH為6.8或更低些和溫度至少45℃條件下貯存以便基本上不含有傳染性還原病毒。然而，上面描述的發(fā)明的目的是滅活還原病毒。它沒有報(bào)道因此獲得的免疫球蛋白制劑改善了免疫球蛋白聚集問題方面。
WO 95-3826公開了一種免疫球蛋白制劑，其中含有0.1g/L或更低的非離子表面活性劑作為維持溶液狀態(tài)的穩(wěn)定劑，并基本上不含有白蛋白。然而，由于此專利中公開的檢測(cè)方法的靈敏度不高，當(dāng)污染白蛋白含量為1％或更少時(shí)用WO 95-3826的方法不能被檢測(cè)到。
JP-A-63-183539(美國專利5,132,406，EP246579)公開了一種制備免疫球蛋白靜脈注射制劑的方法，其中包括熱處理步驟，用4-10％PEG進(jìn)行分級(jí)分離處理回收上清液的步驟，和用10-15％PEG進(jìn)行分級(jí)分離處理回收沉淀部分的步驟。
正如上面所描述的，免疫球蛋白本質(zhì)上是一種不穩(wěn)定的蛋白，因此其液體組合物制備時(shí)的穩(wěn)定性是人們最關(guān)心的問題之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是克服上面描述的問題并提供一種即使在溶液劑型下也具有好的貯存穩(wěn)定性的免疫球蛋白制劑。
本發(fā)明的這個(gè)以及其它目的已經(jīng)通過下述方法達(dá)到了(1)一種制備免疫球蛋白靜脈注射制劑的方法，包含以下步驟
用4-10W/V％，分子量1000-10000的PEG在pH值為4.5-6.5，離子濃度為0.0001-0.1M，溫度0-4℃的條件下分級(jí)分離一種含有免疫球蛋白的水溶液，回收含有免疫球蛋白的上清液餾份；在pH為3.5-5.0條件下濃縮上清液餾份；(2)根據(jù)上面的步驟(1)制備免疫球蛋白靜脈注射制劑的方法，其中進(jìn)一步包括至少一個(gè)，優(yōu)選全部下面的步驟，病毒滅活處理步驟，陰離子交換處理回收沒被吸收餾份的步驟，用平均孔徑為1-100nm的多孔膜進(jìn)行過濾處理的步驟，用硅膠接觸處理，回收沒被吸收餾份的步驟；(3)根據(jù)上面的步驟(1)或(2)制備的免疫球蛋白靜脈注射制劑，尤其是含有未經(jīng)化學(xué)修飾的完全以分子形式存在的免疫球蛋白，pH值為5-6，導(dǎo)電性為1mmho或更低的(在8℃測(cè)定的)免疫球蛋白液體靜脈注射制劑，這種制劑制備后可以室溫貯存至少1年，在貯存過程中能使抗補(bǔ)體活性維持在20單位或20單位以下并且免疫球蛋白的二聚體含量在7％或7％以下。
具體實(shí)施例方式
(1)原料含有免疫球蛋白的餾份被用作原料。此餾份不是特別限制為僅從人血清中得到的，并且含有免疫球蛋白。這種含有免疫球蛋白的餾份的特定例子包括使用Cohn的乙醇分離方法(E.J.Cohn et al.，J.Am.Chem.Soc.，68,459(1946))得到的餾份II+III和餾份II，和含有與其等同的免疫球蛋白餾份的糊狀物。原料中可能含有雜質(zhì)，例如人血型抗體、激肽釋放酶、激肽釋放酶原、IgM和IgG聚合物等。
(2)方法(a)用聚乙二醇(PEG)處理將含有免疫球蛋白的餾份用低濃度的PEG處理，上清液回收。
先將原料懸浮在合適的水溶劑中。在此，使用至少是所述餾份的2倍，優(yōu)選5倍所述餾份體積的水溶劑。水溶劑含有氯化鈉，磷酸鈉，磷酸鉀，乙酸，醋酸鈉，檸檬酸，檸檬酸鈉等。
另外，含有免疫球蛋白的水溶劑的pH范圍優(yōu)選4.5-6.5之間，離子濃度范圍優(yōu)選0.0001-0.1M之間。
得到的懸浮液用PEG處理，使用的PEG分子量為1000-10000，優(yōu)選2000-6000。可將懸浮液進(jìn)行處理，例如，可以通過在攪拌狀態(tài)下將懸浮液和PEG混合，通常在0-4℃經(jīng)過30分鐘到6小時(shí)完成處理過程。推薦的處理?xiàng)l件是蛋白濃度是1-20W/V％，優(yōu)選5-15W/V％；PEG濃度是4-10W/V％，優(yōu)選4-8W/V％；pH值是4.5-6.5，優(yōu)選5-6；離子濃度是0.0001-0.1M，優(yōu)選0.0001-0.01M。
將混合物離心，例如以6000-8000rpm離心10-30分鐘，回收上清液。
(b)在酸性pH條件下濃縮處理在此步驟中，將上面(a)處理中獲得的上清液餾份在pH值為3.5-5.0(優(yōu)選4-4.5)條件下濃縮。特別地，濃縮處理是使用一種超濾膜，此超濾膜的截留分子量約為100,000。濃縮處理可以在1-10kg/m2壓力條件下進(jìn)行。
(c)陰離子交換劑處理本步驟包括將一種含有免疫球蛋白的餾份溶解到一種含水溶劑中，將溶液與一種陰離子交換劑混合，回收沒被吸附的餾份。用陰離子交換劑處理尤其能有效地除去IgM和/或IgG的聚合物。
使用的陰離子交換劑含有結(jié)合到一種不溶性載體上的陰離子交換基團(tuán)。陰離子交換劑包括二乙氨乙基(DEAE)型、季氨乙基(QAE)型等，使用的不溶性載體包括瓊脂糖、纖維素、右旋糖酐、聚丙烯酰胺等，離子交換劑能用現(xiàn)有技術(shù)中的方法結(jié)合到這些載體上。
將一種含有免疫球蛋白的沉淀物溶解在合適的水溶液中，水溶液pH值為5-7，優(yōu)選5.5-7，具有低的離子濃度，優(yōu)選0.0001-0.1M。水溶液中可含有步驟(a)中提到的溶質(zhì)。得到的溶液中蛋白濃度優(yōu)選1-15W/V％，更加優(yōu)選3-10W/V％。
將免疫球蛋白溶液與一種陰離子交換劑混合，陰離子交換劑已在水溶液中(同上面使用的一樣)達(dá)到平衡，既可以分批也可以在連續(xù)進(jìn)行。例如，分批處理中，可以將免疫球蛋白溶液與陰離子交換劑以約10-100ml∶1ml的比例混合，在0-4℃條件下攪拌0.5-2小時(shí)，將混合物以6000-8000rpm離心10-30分鐘，回收上清液。連續(xù)處理可以將免疫球蛋白溶液以10-100ml∶1ml陰離子交換劑的比例通過一種陰離子交換柱，回收沒被吸附的餾份。
在本發(fā)明中，上面的步驟(c)可以在必要時(shí)省去。然而，當(dāng)IgM或IgG的聚合物作為雜質(zhì)存在時(shí)，步驟(c)是優(yōu)選的。
(d)用多孔膜處理依據(jù)本發(fā)明的免疫球蛋白制劑包括一種其中細(xì)小顆粒已經(jīng)被除去的制劑，這些細(xì)小顆粒能作為核形成不溶性異質(zhì)。除去這些細(xì)小顆粒的方法包括使用多孔膜(例如以一種中空紗或薄布形式的膜)的過濾法。
本發(fā)明使用的多孔膜的材料沒有特別的限制。優(yōu)選再生纖維素。多孔膜的形式例如包括一種中空紗或薄布，優(yōu)選中空紗。例如，用再生纖維素制成的中空紗，優(yōu)選由銨銅纖維素溶液使用微相分離法制備[美國化學(xué)會(huì)志，9197-228(1985)]。
多孔膜的平均孔徑是1-100nm，優(yōu)選10-75nm，更優(yōu)選10-50nm，最優(yōu)選35±2nm。其厚度優(yōu)選35±3.5μm。該膜優(yōu)選具有多層結(jié)構(gòu)。當(dāng)多孔膜是以中空紗為形式時(shí)，其內(nèi)徑優(yōu)選330±30μm。
當(dāng)多孔膜是以中空紗為形式時(shí)，其優(yōu)選以一個(gè)模件的方式使用。模件由一多孔中空紗膜和一個(gè)用來裝填多孔膜的容器以及將二者結(jié)合在一起的粘合劑組成，多孔膜面積優(yōu)選0.001-1.0m2。
下面是使用多孔膜進(jìn)行過濾處理的具體實(shí)例首先將免疫球蛋白餾份溶解在合適的含水溶劑中。含水介質(zhì)pH值優(yōu)選4-7(更優(yōu)選5-6)，優(yōu)選低的離子濃度(更優(yōu)選離子濃度為0.0001-0.1M)。含水介質(zhì)的實(shí)例包括氯化鈉水溶液，注射用蒸餾水和醋酸鹽緩沖液等。由此制備的免疫球蛋白溶液中蛋白濃度優(yōu)選1-15w/v％(更優(yōu)選3-10w/v％)，pH值優(yōu)選4-7(更優(yōu)選5-6)。
由此制備的免疫球蛋白溶液可以含有可藥用添加劑(例如載體、賦形劑、稀釋劑)，穩(wěn)定劑和/或一種藥用需要的成份，這種成份是藥用的并且其含量不損害本發(fā)明的目的。
使用的穩(wěn)定劑實(shí)例包括單糖(例如葡萄糖)，二糖(例如蔗糖，麥芽糖)，糖醇(例如甘露醇，山梨糖醇)，中性鹽(例如氯化鈉)，氨基酸(例如甘氨酸)和非離子表面活性劑(例如聚乙二醇，聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(商品名是“Pluronic”)，聚氧乙烯脫水山梨糖醇脂肪酸酯(商品名是“吐溫”))。加入穩(wěn)定劑的量?jī)?yōu)選1-10w/v％。
將上面描述的免疫球蛋白溶液用多孔膜過濾。過濾壓為0.1-1kgf/cm2，優(yōu)選0.1-0.5kgf/cm2，更優(yōu)選0.1-0.3kgf/cm2。溫度優(yōu)選450℃。
過濾方式包括截留過濾法(循環(huán)型)，其中過濾時(shí)液體的粗濾比例一定，和盲端過濾法(非循環(huán)型)，其中過濾時(shí)液體沒有給定粗濾比例。優(yōu)選加壓條件下的截留過濾法。
過濾處理能進(jìn)行多次。在進(jìn)行上面的過濾處理前，免疫球蛋白溶液可以進(jìn)行另一種過濾處理。
在由此制備的的免疫球蛋白制劑中，已經(jīng)除去了平均粒徑大小于100nm，優(yōu)選大于75nm，更優(yōu)選大于35nm的不溶性細(xì)小顆粒，和/或分子量比免疫球蛋白大的(約150000)不溶性細(xì)小顆粒，這兩種細(xì)小顆粒都可以作為核形成不溶性異質(zhì)，因此這種溶液形式的免疫球蛋白制劑即使在25℃、震蕩狀態(tài)下保存至少30天或在37℃保存至少39天，也不會(huì)引起免疫球蛋白的聚集，也就是說，產(chǎn)生不溶性異質(zhì)，表現(xiàn)出了良好的貯存穩(wěn)定性。也就是肉眼觀察不到不溶性異質(zhì)的存在。
為了進(jìn)一步純化免疫球蛋白，可以使用一種已知的方法。例如，使用一種固定化的二氨基化合物的處理方法(為了除去緩激態(tài)酶或緩激態(tài)酶原)，和使用一種固定化的人血型物質(zhì)的處理方法(為了除去人血型抗體)(見JP-A-9-176045，美國專利5,132,406，EP246579)。
本發(fā)明中的步驟(d)在必要時(shí)可以省去。
(e)用膠態(tài)二氧化硅處理這種方法是將免疫球蛋白溶液用膠態(tài)二氧化硅混合處理，回收沒被吸附的餾份。該步驟能降低免疫球蛋白制劑中血清白蛋白的含量。
(i)吸附劑用于吸附劑的膠態(tài)二氧化硅包括硅膠、輕質(zhì)硅酸酐、硅藻土、酸粘土、膨潤(rùn)土、高嶺土和硅酸鎂鋁。優(yōu)選輕質(zhì)硅酸酐(商品名“Aerosil”，是Nippon AerosilCo.，Ltd.的產(chǎn)品，和商品名“Delipid”，是ZetaInc的產(chǎn)品。)。
(ii)處理?xiàng)l件將純化的免疫球蛋白溶解在合適的含水溶劑中。含水介質(zhì)pH值優(yōu)選4-7(更優(yōu)選5-6)，優(yōu)選低的離子濃度(更優(yōu)選離子濃度為0.0001-0.1M)。使用的含水介質(zhì)包括上面陰離子交換劑處理方法中列舉的溶液。由此制備的免疫球蛋白溶液中蛋白濃度優(yōu)選1-15w/v％(更優(yōu)選3-10w/v％)，pH值優(yōu)選4-7(更優(yōu)選5-6)。
由此制備的免疫球蛋白溶液可以含有一種可藥用添加劑(例如載體、賦形劑、稀釋劑)，穩(wěn)定劑和/或一種藥用需要的成份，這種成份通常是藥用的其用量不損害本發(fā)明的目的。
使用的穩(wěn)定劑包括單糖(例如葡萄糖)，二糖(例如蔗糖，麥芽糖)，糖醇(例如甘露醇，山梨糖醇)，中性鹽(例如氯化鈉)，氨基酸(例如甘氨酸)和非離子表面活性劑(例如聚乙二醇，聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(商品名是“Pluronic”)，聚氧乙烯脫水山梨糖醇脂肪酸酯(商品名是“吐溫”))。加入穩(wěn)定劑的量?jī)?yōu)選1-10w/v％。
將免疫球蛋白溶液與上面提到的吸附劑進(jìn)行混合處理。在上面所描述的處理?xiàng)l件下，當(dāng)免疫球蛋白的濃度是1-100g/l(優(yōu)選10-100g/l)時(shí)，吸附劑使用的量是1-30g/l。例如，可以使用分批處理方法或柱方法。其中，優(yōu)選分批處理方法。在分批處理方法中，混合和攪拌是在下面條件下進(jìn)行，例如，在5-25℃進(jìn)行5分鐘-1小時(shí)。然后上清液(沒有被吸附的餾份)可以通過例如過濾或離心的方法回收。
在這種已除去血清白蛋白的免疫球蛋白制劑中，每50mg免疫球蛋白含有的血清白蛋白雜質(zhì)不超過10μg，優(yōu)選不超過5μg。特別當(dāng)免疫球蛋白制劑是以溶液形式存在，免疫球蛋白含量是5w/v％時(shí)，其含有的血清白蛋白雜質(zhì)不超過10μg/ml，優(yōu)選不超過5μg/ml。具有這些特征的免疫球蛋白制劑與常規(guī)制劑相比表現(xiàn)出了更好的貯存穩(wěn)定性。例如，即使在25℃、震蕩狀態(tài)下保存至少30天或在37℃保存至少39天，這種免疫球蛋白制劑在溶液形式下也不會(huì)產(chǎn)生不溶性異質(zhì)。也就是肉眼觀察不到不溶性異質(zhì)的存在?？梢允褂靡阎募夹g(shù)方法來檢測(cè)免疫球蛋白制劑中血清白蛋白的含量。例如ELISA方法，Mancini的方法和濁度測(cè)定法。
在本發(fā)明中，步驟(e)在必要時(shí)可以省去，然而，當(dāng)存在血清白蛋白雜質(zhì)時(shí)，步驟(e)是優(yōu)選的。
(f)病毒滅活處理在本過程中，將一種存在穩(wěn)定劑的含有免疫球蛋白的餾份在下面條件下進(jìn)行熱處理，雜質(zhì)例如HB病毒，AIDS病毒等被完全滅活，同時(shí)使免疫球蛋白的抗體活性降低程度減到最小。免疫球蛋白熱處理在水分含量為3％或更低的干燥狀態(tài)下進(jìn)行(即干熱處理)，或在水溶液中以溶解狀態(tài)進(jìn)行(即濕熱處理)。
既可以在干熱法又可以濕熱法處理中使用的穩(wěn)定劑優(yōu)選二糖(例如蔗糖，麥芽糖等)和糖醇(例如甘露醇，山梨糖醇等)。
穩(wěn)定劑推薦使用的量是，在干熱處理中，為0.5-5w/v％，優(yōu)選1-3w/v％，在濕熱處理中，為10w/v％或更多，優(yōu)選10-50w/v％。
在進(jìn)行熱處理的含有免疫球蛋白的餾份中，干熱處理時(shí)蛋白濃度需要調(diào)整到1-10w/v％，優(yōu)選3-7w/v％。濕熱處理時(shí)將其調(diào)整到0.1-30w/v％，優(yōu)選5-20w/v％。
在進(jìn)行干熱處理時(shí)，當(dāng)穩(wěn)定劑加入免疫球蛋白餾份后，如果需要的話，可以用過濾法進(jìn)行滅菌處理，將餾份中的水分含量用例如冷凍干燥法調(diào)到3％或更低，優(yōu)選1％或更低。冷凍干燥可以在例如溫度為20-40℃，真空度為0.5mmHg條件下進(jìn)行24-96小時(shí)。然后將餾份在50-70℃優(yōu)選約60℃加熱10-200小時(shí)，優(yōu)選50-100小時(shí)。熱處理過程中免疫球蛋白的穩(wěn)定性可以通過在加熱時(shí)通入惰性氣體例如氮?dú)狻鍤?、氦氣等得到保證。
在進(jìn)行濕熱處理時(shí)，當(dāng)免疫球蛋白水溶液pH值被調(diào)節(jié)到4.5-6.5優(yōu)選5-6后，將溶液在50-70℃，優(yōu)選約60℃條件下加熱10分鐘-20小時(shí)，優(yōu)選約10小時(shí)。
如果熱處理過程是干熱處理，優(yōu)選在制備過程的最后進(jìn)行，相反，如果是濕熱處理，則優(yōu)選在原料階段進(jìn)行。
另外，可以采用使用磷酸三烷基酯的溶劑洗滌劑的方法進(jìn)行滅活病毒。含有免疫球蛋白的組合物在與本發(fā)明中的磷酸三烷基酯混合時(shí)，其純度沒有特別的限定，但是可以使用純化到一定程度的組合物。因此可以在免疫球蛋白的分離步驟或純化步驟中進(jìn)行磷酸三烷基酯處理。
雖然沒有特別限定，作為例證，適于本發(fā)明中使用的磷酸三烷基酯包括三-(正丁基)磷酸酯，三-(叔丁基)磷酸酯，三-(正己基)磷酸酯，三-(2-乙基己基)磷酸酯，三-(正癸基)磷酸酯以及類似的化合物。尤其優(yōu)選的磷酸三烷基酯是三-(正丁基)磷酸酯(下面用“TNBF”表示)。由兩種或多種磷酸三烷基酯組成的混合物也可以使用。
基于免疫球蛋白的水溶液，本發(fā)明中的磷酸三烷基酯可以使用的量是0.01-10％(w/v)，優(yōu)選0.1-3％(w/v)。
免疫球蛋白與磷酸三烷基酯的混合是在0-60℃(優(yōu)選20-40℃)，需要30分鐘或更多時(shí)間(優(yōu)選1-30小時(shí)，更加優(yōu)選3-10小時(shí))并在pH6-8的條件下進(jìn)行。
磷酸三烷基酯可以單獨(dú)使用，也可以與一種表面活性劑一起使用。優(yōu)選與一種表面活性劑共同使用。表面活性劑可以在一個(gè)任選的步驟中加入到含有免疫球蛋白的組合物中，可以在組合物與磷酸三烷基酯混合前、混合當(dāng)中或混合后加入。表面活性劑起的作用是促進(jìn)含有免疫球蛋白的組合物中的病毒與磷酸三烷基酯接觸。
作為例證的表面活性劑包括脂肪酸的聚氧乙烯衍生物，山梨糖醇酐的偏酯例如吐溫80、吐溫20和聚山梨醇酯80，非離子型的油溶性清洗劑例如Triton X-100(氧乙基化的烷基苯酚)。也可以使用兩性離子劑，它們是合成的兩性離子洗滌劑中的脫氧膽酸鈉和磺基三甲銨乙內(nèi)酯，例如N-十二烷基-N，N-二甲基-2-ammonio-1-乙烷磺酸鹽及其同系化合物，非離子洗滌劑例如辛基-β，D-吡喃葡糖苷及其同系化合物也能使用。
當(dāng)表面活性劑使用時(shí)，它的使用量并不重要，但是可能的范圍是0.001％-10％，優(yōu)選0.01％-3％。
用磷酸三烷基酯處理對(duì)于滅活包膜病毒尤其有效，例如乙型肝炎病毒，非甲非乙型肝炎病毒，人體免疫缺陷病毒(HIV)，皰疹性口炎病毒和Sindbis病毒以及類似病毒。
在溶劑性洗滌劑處理過程中，免疫球蛋白的濃度是0.1-30w/v(％)，優(yōu)選1-20w/v(％)。
(3)制劑(尤其是液體制劑)(a)液體制劑的制備使用本發(fā)明中上面描述的制備免疫球蛋白靜脈注射制劑的方法，能得到一種免疫球蛋白靜脈注射劑。在一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，一種能靜脈給藥，含有未被化學(xué)修飾且完全以分子形式存在的免疫球蛋白的液體組合物(制劑)可以通過下面的方法得到，用常規(guī)方法調(diào)節(jié)含有未被化學(xué)修飾且完全以分子形式存在的免疫球蛋白的水溶液，使免疫球蛋白的濃度為1-10w/v％(更優(yōu)選3-7w/v％)，在得到的溶液中加入一種穩(wěn)定劑，例如山梨糖醇，濃度為1-20w/v％(優(yōu)選2-10w/v％)，用已知的方法將溶液的pH值調(diào)節(jié)為5-6(更優(yōu)選5.5±0.2)，導(dǎo)電度調(diào)到較低(更優(yōu)選不高于1mmho，特別優(yōu)選不高于0.6mmho，都是在8℃條件下測(cè)定的)，將得到的溶液過濾滅菌，用常規(guī)的配制技術(shù)成批灌裝。
從由此制成的制劑中，可以制備出一種用免疫球蛋白靜脈注射液體制劑，其含有未被化學(xué)修飾且完全以分子形式存在的免疫球蛋白，pH值為5-6(更優(yōu)選5.5±0.2)，導(dǎo)電度不大于1mmho(更優(yōu)選不大于0.6mmho，是在8℃條件下測(cè)定的)，能在室溫下貯存，抗補(bǔ)體活性不大于20單位，免疫球蛋白二聚體含量不超過7％。
本發(fā)明使用的術(shù)語“未被化學(xué)修飾且完全以分子形式存在”表示免疫球蛋白具有下述特征(i)它保持著完整的(天然的)特性，沒有經(jīng)受任何人為修飾和改變。因此，它不含有免疫球蛋白碎片，例如Fab，F(xiàn)(ab’)2，F(xiàn)c等。
(ii)與天然免疫球蛋白相比，它既不表現(xiàn)出抗體效價(jià)的降低，也不表現(xiàn)出抗體譜。
(iii)它的抗補(bǔ)體活性(補(bǔ)體結(jié)合活性)大大小于20單位(CH50測(cè)定值)，依照日本生物制劑標(biāo)準(zhǔn)，它是安全的，此標(biāo)準(zhǔn)見日本公共福利廳發(fā)布的第159號(hào)通知(1985年10月)。(依照CH50得到的1個(gè)單位被定義為，將7.5ml具有一定的離子濃度和pH值以及有一定量的Ca2+和Mg2+存在下的反應(yīng)混合物在37℃反應(yīng)60分鐘，使5×108個(gè)致敏細(xì)胞中的一半溶血所需的補(bǔ)體量)。
當(dāng)考慮到免疫球蛋白靜脈注射制劑中免疫球蛋白二聚體含量的安全范圍時(shí)，此制劑中含有未被化學(xué)修飾且完全以分子形式存在的免疫球蛋白，制劑中免疫球蛋白二聚體的含量被控制到7％或7％以下，優(yōu)選6％或6％以下，最優(yōu)選4％或4％以下。
依據(jù)本發(fā)明得到的制劑，其含有的免疫球蛋白基本上沒有失活，既不含有IgG聚合物，又不含有污染物，具有很好的溶解性和充分低的抗補(bǔ)體活性，當(dāng)病毒被滅活時(shí)，例如通過熱處理，是一種能通過生物制劑標(biāo)準(zhǔn)安全的制劑。
當(dāng)依據(jù)本發(fā)明得到的免疫球蛋白制劑是一種液體制劑時(shí)，它可以直接使用或用一種合適的溶劑(例如注射用蒸餾水，生理鹽水，葡萄糖溶液)稀釋后再使用。當(dāng)它是一種無水制劑時(shí)，上面提到的免疫球蛋白溶液被冷凍干燥。它可以用一種合適的溶劑(例如注射用蒸餾水)溶解后使用。
(b)適于用本發(fā)明中的制劑治療的疾病的具體實(shí)例1.血內(nèi)丙種球蛋白過少和血內(nèi)γ球蛋白缺乏病2.嚴(yán)重炎癥3.繼發(fā)性血小板減少性紫癜
4.急性川崎病(c)使用和劑量本發(fā)明中的藥物制劑可以靜脈滴注給藥或直接靜脈推注。當(dāng)直接靜脈推注時(shí)，應(yīng)該以很慢的速度注射。
通常，對(duì)于成年人，人免疫球蛋白G是以2500-5000mg/kg體重作為劑量單位，對(duì)于兒童，人免疫球蛋白G是以100-150mg/kg體重作為劑量單位。這些劑量范圍可以根據(jù)年齡和癥狀任選。
在治療繼發(fā)性血小板減少性紫癜時(shí)，人免疫球蛋白G是以200-400mg/kg體重/天的劑量給藥。這些劑量范圍可以根據(jù)年齡和癥狀任選。
在治療川崎病時(shí)，人免疫球蛋白G是以400mg/kg體重/天的劑量給藥5天。這些劑量范圍可以根據(jù)年齡和癥狀任選。
依據(jù)本發(fā)明，免疫球蛋白的產(chǎn)量和室溫貯存的穩(wěn)定性都能得到改善。另外，通過除去雜質(zhì)白蛋白和能形成不溶性異質(zhì)的細(xì)小顆粒，抑制了不溶性異質(zhì)的產(chǎn)生。因此，本發(fā)明能提供一種制劑，尤其是一種液體制劑，其中免疫球蛋白在溶解狀態(tài)下的穩(wěn)定性得到了改善。
下面將通過實(shí)施例和試驗(yàn)對(duì)本發(fā)明做更具體的描述。然而應(yīng)該注意這不是對(duì)本發(fā)明的限定。
實(shí)施例1將10升水加入到1kg用冷乙醇方法從人血漿中得到的Cohn的餾份II+III中，隨后提取IgG。將山梨糖醇以50g/100ml的量加入得到的上清液中，將pH值調(diào)到5.5，得到的混合物在60℃加熱10小時(shí)。然后將混合物pH值調(diào)到5.5，用冷的注射用水稀釋3倍。向被稀釋的溶液中加入聚乙二醇(平均分子量是4000)，最終濃度為8w/v％。將得到的混合物在2℃離心以得到上清液。將回收的上清液pH值調(diào)到4，將溶液用一種截留分子量為100,000的超濾膜(Pericon2 Biomax由Millipore公司生產(chǎn))在注射用水中透析以濃縮溶液。將得到的溶液pH值調(diào)到5-7，加入在注射用水中達(dá)到平衡的二乙氨乙基交聯(lián)葡聚糖(DEAE-Sephadex)(以2ml/50ml溶液)。在0-4℃，將得到的混合物用二乙氨乙基交聯(lián)葡聚糖處理1小時(shí)。處理完后，將二乙氨乙基交聯(lián)葡聚糖過濾除去，回收濾液(IgG溶液)。
回收的IgG溶液用注射用水稀釋至濃度為5w/v％，用醋酸鈉將pH值調(diào)到5.5。加入山梨糖醇，其最終濃度為5％。將獲得的水溶液(導(dǎo)電度約為1mmho)進(jìn)行過濾滅菌處理，得到了一種免疫球蛋白靜脈注射制劑。
實(shí)施例2使在實(shí)施例1中制備的含有5w/v％免疫球蛋白的溶液通過一種填充有無水二氧化硅的濾器(Zeta plus Delpid，由Quno Corp.生產(chǎn))，回收沒有被吸收的餾份。這是進(jìn)一步進(jìn)行過濾滅菌處理以得到一種免疫球蛋白靜脈注射液體制劑。
使用Mancini的方法檢測(cè)含有5w/v％免疫球蛋白的溶液，結(jié)果其中雜質(zhì)白蛋白的含量是5μg/ml。
實(shí)施例3使用一種多孔的中空紗(Bemberg微孔膜；下面將用“BMM”表示)模件(商品名Planova35)，是從Asahi化學(xué)公司購買的，通過調(diào)整多孔中空紗(BMM)制成的。BMM的平均孔徑是35±2nm，膜面積為0.001-1.0m3，中空紗的內(nèi)徑是330±30μm，膜厚度為35±3.5μm并具有150層或更多層的多層結(jié)構(gòu)，是由銅銨再生纖維素制成的。BMM模件是用一種聚氨基甲酸酯粘合劑與內(nèi)部的塑料容器粘合在一起組成的，塑料容器是由一種能經(jīng)受壓熱的聚碳酸酯制成的，注射用蒸餾水填充在模件中。每一種制作Planova的材料的安全性已經(jīng)被日本藥典所制訂的各自的檢驗(yàn)方法所證實(shí)(依據(jù)BMM的說明)。
將在實(shí)施例1中制備的含有5w/v％免疫球蛋白的溶液進(jìn)行過濾滅菌處理(使用一種膜濾器過濾，膜的孔徑是0.2μm)。然后將溶液在5℃用Planova35模件進(jìn)行膜過濾處理1-5小時(shí)，過濾壓為0.2kgf/cm2(采用大氣壓的盲端過濾)。冷卻后，可以再進(jìn)行一次滅菌處理以制備一種免疫球蛋白靜脈注射液體制劑。
實(shí)施例4使在實(shí)施例1中制備的含有5w/v％免疫球蛋白的溶液通過一個(gè)多孔的/低Al的濾器(Zeta plus LA90，由Quno Corp.生產(chǎn))和一個(gè)填充有無水二氧化硅的濾器(Zeta plus Delpid，由Quno Corp.生產(chǎn))，回收沒有被吸收的餾份。這是進(jìn)一步進(jìn)行過濾滅菌處理以得到一種免疫球蛋白靜脈注射液體制劑。
實(shí)施例5使在實(shí)施例1中制備的含有5w/v％免疫球蛋白的溶液通過一個(gè)多孔的低Al的濾器(Zeta plus LA90，由Quno Corp.生產(chǎn))和一個(gè)填充有無水二氧化硅的濾器(Zeta plus Delipid，由Quno Corp.生產(chǎn))，回收沒有被吸收的餾份。進(jìn)行如實(shí)施例3中的BMM處理，這是進(jìn)一步進(jìn)行過濾滅菌處理以得到一種免疫球蛋白靜脈注射液體制劑。
實(shí)施例6一種用實(shí)施例1所描述的方法制備的靜脈注射用免疫球蛋白液體制劑，只是病毒滅活處理是在pH值為7，30℃條件下用0.3w/v％TNBP(三-正丁基磷酸酯)和1w/v％聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯(Tween80)處理免疫球蛋白溶液6小時(shí)，取代了實(shí)施例1中的在pH值為5.5，60℃條件下熱處理10小時(shí)這一過程。
實(shí)施例7一種用實(shí)施例1所描述的方法制備的靜脈注射用免疫球蛋白粉劑，只是把免疫球蛋白溶液pH值調(diào)到6.4-7.2，再將溶液與0.6％氯化鈉，2％甘露醇，1％白蛋白混合之后進(jìn)行冷凍干燥，取代了實(shí)施例1中的把溶液pH值調(diào)到5.5，再將溶液與山梨糖醇混合這一制備液體制劑的過程。
實(shí)施例8一種用實(shí)施例1所描述的方法制備的靜脈注射用免疫球蛋白粉劑，只是在實(shí)施例1中，在pH值為5.5，60℃條件下進(jìn)行10小時(shí)的溶液狀態(tài)熱處理是在第一步中進(jìn)行的，并且液體制劑是通過將溶液pH值調(diào)到5.5并與山梨糖醇混合制備的，而在實(shí)施例8中，不進(jìn)行第一步液體狀態(tài)下的熱處理及與山梨糖醇混合，而是代之為，在最后一步中，將溶液pH值調(diào)到6.4-7.2，將溶液與0.6％氯化鈉，2％甘露醇，1％白蛋白混合再進(jìn)行冷凍干燥，之后在60℃熱處理72小時(shí)。
試驗(yàn)實(shí)施例1測(cè)定實(shí)施例1-8中制備的免疫球蛋白靜脈注射制劑的特性。粉劑是用注射用水溶解后測(cè)定。
(1)外觀肉眼觀察和外觀相聯(lián)系的液體制劑的濁度。
進(jìn)一步測(cè)定在600nm波長(zhǎng)的吸光度來評(píng)價(jià)制劑的濁度。
(2)測(cè)定聚合物的含量在液體制劑中基于免疫球蛋白總重的免疫球蛋白聚合物的含量用高效液相色譜法測(cè)定。
(3)抗補(bǔ)體效價(jià)依據(jù)Capat和Mayer，Experimental Immunochemistry，225(1961)和Nishioka&Okada，Men-eki no Seikagaku(Biochemistry in Immunology)，Vol.103，KyoritsuShuppan(1971)中的方法測(cè)定。向樣品中加入100單位的補(bǔ)體，根據(jù)測(cè)得的補(bǔ)體單位減少的數(shù)量來確定樣品的抗補(bǔ)體效價(jià)。
(4)麻疹抗體效價(jià)；依據(jù)血凝抑制測(cè)定方法(Rosen，L.，Virology，13，139(1961))檢測(cè)，以國際單位(IU/100mg)表示。
(5)導(dǎo)電度用導(dǎo)電度測(cè)定儀，CD-35 MII型(M & S Instrument Co)測(cè)定電導(dǎo)率。
在實(shí)施例1-6中制備的靜脈注射用免疫球蛋白液體制劑具有下述特性pH5.5導(dǎo)電度1mmho或更低(在8℃條件下的測(cè)定值)二聚體含量7w/w％或更低聚合物含量0.1w/w％或更低抗補(bǔ)體效價(jià)20單位/ml或更低滲透比約為1(和等滲鹽水的比值)外觀無色到透明的淺黃色麻疹抗體效價(jià)40IU或更大濁度0.01或更低依據(jù)本發(fā)明(實(shí)施例5)得到的液體制劑在37℃條件下貯存40天后，其特性和貯存前(剛制備成時(shí))的制劑一樣。因此，可以認(rèn)為依據(jù)本發(fā)明得到的制劑室溫貯存至少一年后仍能保持穩(wěn)定。
在實(shí)施例7和8中制備的靜脈注射用免疫球蛋白液體制劑具有下述特性pH6.4-7.2二聚體含量7w/w％或更低聚合物含量0.1w/w％或更低抗補(bǔ)體效價(jià)20單位/ml或更低滲透比約為1(和等滲鹽水的比值)外觀透明的淺黃色或有輕度混濁麻疹抗體效價(jià)40IU或更大實(shí)施例9一種用與實(shí)施例1相同的方法制備的免疫球蛋白液體制劑，只是最終得到的制劑pH值被調(diào)到4.25，代替了實(shí)施例1中的5.5。
試驗(yàn)實(shí)施例2用與試驗(yàn)實(shí)施例1相同的方法測(cè)定實(shí)施例9中制備的免疫球蛋白靜脈注射用液體制劑的特性。其具有下述特性特性pH4.25導(dǎo)電度1-2mmho或更低(在8℃條件下的測(cè)定值)二聚體含量7w/w％或更低聚合物含量0.1w/w％或更低抗補(bǔ)體效價(jià)20單位/ml或更低滲透比約為1(和等滲鹽水的比值)外觀無色透明麻疹抗體效價(jià)40IU或更大濁度0.01或更低實(shí)施例10一種用與實(shí)施例1相同的方法制備的免疫球蛋白液體制劑，只是最終得到的制劑pH值被調(diào)到5.2，代替了實(shí)施例1中的5.5。
試驗(yàn)實(shí)施例3用與試驗(yàn)實(shí)施例1相同的方法測(cè)定實(shí)施例10中制備的免疫球蛋白靜脈注射用液體制劑的特性(A-F組)。其具有下述特性1)特性pH；5.2導(dǎo)電度1mmho(在8℃條件下的測(cè)定值)二聚體含量7w/w％或更低聚合物含量0.1w/w％或更低抗補(bǔ)體效價(jià)20單位/ml或更低滲透比約為1(和等滲鹽水的比值)外觀無色到透明的淺黃色麻疹抗體效價(jià)40IU或更大濁度0.01或更低依據(jù)本發(fā)明(實(shí)施例10)得到的液體制劑在30℃條件下貯存6個(gè)月后，其特性和貯存前(剛制備成時(shí))的制劑一樣。
2)污染物檢測(cè)依據(jù)本發(fā)明(實(shí)施例10)得到的液體制劑中含有的污染物。
下面是檢測(cè)方法。
人血清白蛋白比濁法MCP-1(人單核細(xì)胞趨化性蛋白-1)ELISA方法激活的人補(bǔ)體-3(C3a)使用125I-精氨酸的放射法聚乙二醇(PEG)
使用鋇或碘化物的比色法(Microchemical Journal，20，p.190-192(1975))或凝膠色譜法。
結(jié)果如下面表1所示。
表1

依據(jù)表1所示的結(jié)果可以看出，本發(fā)明提供了一種免疫球蛋白靜脈注射制劑，在溶解狀態(tài)下室溫保存至少1年后仍能保持穩(wěn)定，含有的HSA(人血清白蛋白)至多是5μg/ml，MCP-1(人單核細(xì)胞趨化性蛋白-1)至多是16pg/ml，C3a(激活的人補(bǔ)體-3)至多是3μg/ml，聚乙二醇至多是1mg/dl。本發(fā)明已經(jīng)通過具體的實(shí)施方案進(jìn)行了詳細(xì)的描述，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，很明顯可以在其中做一些不脫離本發(fā)明實(shí)質(zhì)和范圍的變化和修飾。
本申請(qǐng)以日本專利申請(qǐng)平9-291374為基礎(chǔ)，其全部?jī)?nèi)容都列入本發(fā)明中以供參考。
權(quán)利要求
1.一種免疫球蛋白靜脈注射制劑，在溶液狀態(tài)下室溫保存至少1年后仍能保持穩(wěn)定，并且該制劑含有至多5μg/ml的人血清白蛋白、至多16pg/ml的人單核細(xì)胞趨化性蛋白-1、至多3μg/ml的激活的人補(bǔ)體-3和至多1mg/dl的聚乙二醇。
全文摘要
一種免疫球蛋白靜脈注射制劑，在溶液狀態(tài)下室溫保存至少1年后仍能保持穩(wěn)定，并且該制劑含有至多5μg/ml的人血清白蛋白、至多16pg/ml的人單核細(xì)胞趨化性蛋白－1、至多3μg/ml的激活的人補(bǔ)體－3和至多1mg/dl的聚乙二醇。
文檔編號(hào)C07K16/06GK1520885SQ200410005529
公開日2004年8月18日 申請(qǐng)日期1998年10月23日 優(yōu)先權(quán)日1997年10月23日
發(fā)明者平尾豐, 橋本元范, 北村妙, 上村八尋, 尋, 范 申請(qǐng)人:三菱制藥株式會(huì)社