專利名稱：朊病毒蛋白配基和使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
該發(fā)明涉及蛋白配基相互作用領(lǐng)域，更具體地涉及結(jié)合朊病毒蛋白的配基的鑒定和使用該配基檢測或除去生物學(xué)樣品中朊病毒的方法。
背景技術(shù)：
天然或細(xì)胞朊病毒蛋白“PrPc”在整個哺乳類中廣泛分布，并具有格外高度保守的氨基酸序列和蛋白結(jié)構(gòu)。感染性朊病毒被認(rèn)為是由正常細(xì)胞朊病毒蛋白(PrPc)的修飾型組成，被稱做“PrPsc”。朊病毒與其它感染性病原體有一些共同的性質(zhì)，但似乎不含有核酸。相反，推測非感染性PrPc向感染性PrPsc的轉(zhuǎn)變涉及翻譯后的構(gòu)象變化，在這期間α螺旋被轉(zhuǎn)換為β-折疊片。PrPc含有3個α螺旋，少有β-折疊片結(jié)構(gòu)；相反，PrPsc富含β-折疊片。據(jù)認(rèn)為PrPc轉(zhuǎn)變?yōu)镻rPsc會導(dǎo)致產(chǎn)生感染性海綿狀腦病(TSEs)，其間PrPsc積聚在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中，并伴有神經(jīng)病理性改變和神經(jīng)學(xué)功能障礙。PrPsc，通常稱作朊病毒蛋白的“瘙癢病(scrapie)”型，被認(rèn)為對動物和人的這些感染性神經(jīng)變性疾病的傳播和發(fā)病機(jī)理是必須的并且可能是足夠的。
TSEs的具體實(shí)例包括瘙癢病，其影響綿羊和山羊；牛海綿狀腦病(BES)，其影響牛；感染性水貂腦病，貓海綿狀腦病和長耳鹿、白尾鹿、黑尾鹿和麇鹿的慢性萎縮病(CWD)。在人類，TSE疾病可自我表現(xiàn)為庫魯病(kuru)、克-雅綜合癥(CJD)、格-施-沙(Gerstmann-Straussler-Scheinker)綜合征(GSS)、致死性失眠癥和變異克-雅綜合癥(vCJD)。vCJD最近在人類出現(xiàn)是BSE在英國流行的結(jié)果，很有可能是由于消費(fèi)了來源于感染了BsE或“瘋牛病”的牛的食物產(chǎn)品所致。在上世紀(jì)從80年代中期到90年代早期，在英國有未知數(shù)目的人攝入了被BSE感染的牛的神經(jīng)組織潛在性污染的食物。因?yàn)檫@種經(jīng)口感染的疾病的潛伏期在人類可能超過二十年，因此vCJD的準(zhǔn)確發(fā)病率可能許多年都不明顯。迄今為止，已知超過130個人已經(jīng)感染這種疾病，主要在英國；然而，加拿大、法國、香港、愛爾蘭、意大利和美國也有病例報道。被污染的牛飼料產(chǎn)品從英國向全世界的出口表明BSE有可能全球存在，因此有發(fā)生cVJD的可能性。與這些觀察一致的是在大多數(shù)歐洲國家、日本和以色列檢測到BSE。所以，從包括食物產(chǎn)品的各種材料中檢測和除去感染性朊病毒蛋白的能力是極其重要的。
在歷史上，TSEs的診斷是基于該疾病臨床癥狀的出現(xiàn)，而且只有通過對死后腦組織的組織學(xué)檢查才能夠確認(rèn)。所有TSEs的特征是缺乏對病因的可測量的宿主免疫應(yīng)答。因此，沒有抗體產(chǎn)生，不能使用常規(guī)的血清學(xué)試驗(yàn)鑒定被感染的動物。最近，對腦中異常朊病毒蛋白的鑒定已經(jīng)提高了做出疾病診斷的能力。
除了攝入牛來源的被感染產(chǎn)品，輸血和器官移植代表了另一種在人類中傳播vCJD的潛在方式。人類通過輸血傳播vCJD的可能性目前尚不知道，但是基于從實(shí)驗(yàn)動物模型、包括從經(jīng)口實(shí)驗(yàn)性感染BSE的綿羊和天然感染搔癢病的綿羊傳播的數(shù)據(jù)，這似乎非常有可能。和其它人類TSEs不同，PrPsc存在于vCJD病人的淋巴網(wǎng)狀系統(tǒng)中，因此增加了傳染原存在于血液中以及其通過輸血傳播的可能性。提高對通過輸血傳播的風(fēng)險關(guān)注的其它因素包括未知數(shù)目、但是推測有大量的人暴露于BSE并且缺乏vCJD臨床前診斷性試驗(yàn)。而且，在靈長類和小鼠中的物種適應(yīng)后，vCJD的毒力似乎增強(qiáng)，提示人和人之間的傳播可能比從牛到人的傳播更有效。因此，急需用于防止vCJD通過輸血傳播的方法。這樣的措施可能包括感染供體的早期鑒定以及動物來源食品和旨在用于動物或人類消費(fèi)或應(yīng)用的健康產(chǎn)品、人和牛來源的血源性產(chǎn)品、以及器官移植中TSE病原的延遲，除去和滅活。不幸的是，PrPsc顯著耐受化學(xué)和物理滅活方法，選擇性的滅活方法很難找。
通過與配基的特異性相互作用除去朊病毒似乎更有希望。已經(jīng)鑒定出許多結(jié)合朊病毒蛋白的配基。如在PCT/US01/11150中所描述的，已經(jīng)嘗試了從組合肽文庫中篩選出能和在所有已知哺乳動物朊病毒蛋白中發(fā)現(xiàn)的八肽重復(fù)序列(PHGGGWGQ(SEQ ID NO220))結(jié)合的配基，而且發(fā)現(xiàn)了一系列的配基。其它材料包括各種聚合物，例如，TosoBioSep的氨基聚丙烯酸甲酯、常用的離子交換樹脂(見美國專利No.5,808,011，Gawryl等)、與淀粉樣斑塊相互作用的配基，例如剛果紅(Ingrosso，L.，等，Congo red prolongs the incubation periodin scrapie-infected hamsters.J.Virology 69506-508(1995))、4-碘，4-脫氧阿霉素(Tagliavini，F(xiàn).，等，Effectiveness ofanthracycline against experimental prion disease in Syrianhamster.Science 2761119-1122(1997))、兩性霉素B、卟啉和酞菁(Priola，S.A.，等，Porphyrin and Phthalocyainine antiscrapiecompounds，Science 2871503-1506(2000))、金屬(Stockel等，Biochemistry，37，7185-7193(1998))、以及與PrP相互作用形成復(fù)合體的肽(見美國專利5,750,361，Prusiner等，和Soto，C.等，Reversion of prion protein conformational changes insynthetic β -sheet breakerpeptides，Lancet，355192-197(2000))、肝素和其它多硫酸化聚陰離子(Caughey，B.，等，Binding of the Protease-sensitive form ofprion protein PrP to Sulphated Glycosaminoglycan and CongoRed，J.Virology 682135-2141(1994))、抗體(Kascsak，R.J.，等，Immunodiagnosis of prion disease，Immunological Invest.26259-268(1997))，以及其它蛋白，例如纖溶酶原(Fischer，M.B.等，Binding of disease-associated prion protein to plasminogen.，Nature 408479-483(2000))。目前，盡管一些配基在特定的環(huán)境中可能有用，但是還沒有完全表征一個配基或者發(fā)現(xiàn)它能結(jié)合來自多種介質(zhì)的朊病毒(見美國專利No.5,808,011，Gawryl等)。
到目前為止，人類TSE疾病100％是致命的。不幸的是，盡管已經(jīng)報道有許多化合物可能是有前景的治療劑，包括兩性霉素，硫酸化聚陰離子、剛果紅染料以及蒽環(huán)抗生素，但所有化合物均顯示較微弱的阻礙朊病毒增殖的潛能，沒有一個顯示對從感染宿主中除去預(yù)先存在的朊病毒有任何影響。因此，仍急需新的治療試劑。
在許多其它疾病中，其中許多疾病是神經(jīng)性疾病，正?？扇艿鞍椎难b配和分解形成構(gòu)象改變和不溶形式被認(rèn)為是致病過程。疾病的發(fā)生和從正常形式轉(zhuǎn)變到構(gòu)象改變蛋白之間的關(guān)系還很不清楚。除了朊病毒外，這種不溶蛋白的實(shí)例還包括阿爾茨海默氏(Alzheimer′s)病和腦淀粉樣血管病(CAA)的淀粉樣蛋白斑中的β-淀粉狀蛋白肽；帕金森氏(Parkinson′s)病的Lewy小體中的α突觸核蛋白(α-synuclein)沉積物、在額顳葉癡呆(frontal temporal dementia)和皮克(Pick’s)病中神經(jīng)原纖維纏結(jié)中的tau、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化中的超氧化物歧化酶；以及亨廷頓(Huntington′s)病中的亨廷頓蛋白(huntingtin)。
一般這些高度不溶的蛋白形成由具有β-片層構(gòu)象共有特征的無分支原纖維構(gòu)成的聚集物。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，淀粉狀蛋白可存在于腦和腦脊膜血管中(腦血管沉積)以及腦實(shí)質(zhì)(斑塊)中。在人和動物模型中神經(jīng)病理學(xué)的研究表明鄰近淀粉樣沉積物的細(xì)胞的正常功能受到擾亂。
神經(jīng)炎斑塊形成的確切機(jī)制以及斑塊形成與疾病相關(guān)性神經(jīng)變性過程的相互關(guān)系在很大程度上還不清楚。為理解其轉(zhuǎn)變的過程以及發(fā)現(xiàn)將與疾病相關(guān)形式特異性相互作用的結(jié)構(gòu)，都需要有可容易地分離或可區(qū)別蛋白的兩個或多個構(gòu)象型(例如PrPc和PrPsc)的方法學(xué)。當(dāng)前分離或區(qū)別同種型的方法學(xué)包括在存在離液劑如尿素的聚丙烯酰胺凝膠即橫向尿素梯度膠中的不同遷移率；對蛋白酶，例如蛋白酶K(PK)處理的不同敏感性，稱作PrPres的PrPsc的PK耐受性消化產(chǎn)物的檢測；不同的溫度穩(wěn)定性；在非離子型去污劑中的相對溶解度；以及纖維結(jié)構(gòu)結(jié)合某些化學(xué)物質(zhì)(例如剛果紅和異黃酮S)的能力。然而，仍迫切需要鑒定對構(gòu)象發(fā)生改變的蛋白、尤其是疾病相關(guān)型蛋白特異的高親合力試劑。這種試劑將可用于開發(fā)可能的診斷性試劑盒，分離和純化不同形式的蛋白，用于從治療劑、生物產(chǎn)品、疫苗、和食品中除去所述疾病的感染型，以及用于治療。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了結(jié)合朊病毒蛋白的配基及其應(yīng)用。所述配基是與朊病毒分析物以選擇性和特異性相結(jié)合的肽。它們能夠結(jié)合朊病毒蛋白中的一種或多種形式，包括細(xì)胞朊病毒蛋白(PrPc)、感染性朊病毒蛋白(PrPsc)以及重組朊病毒蛋白(PrPr)。該配基可結(jié)合來自各種物種，包括人和倉鼠的朊病毒。也提供了包含在支持物如樹脂或膜上的朊病毒蛋白結(jié)合配基的組合物。
配基可用于從樣品中檢測或除去朊病毒蛋白，所述樣品例如是生物學(xué)流體或環(huán)境樣品。配基可用于檢測或除去樣品中所有的朊病毒蛋白，或可選擇性地挑選以檢測或除去朊病毒蛋白的單一型，因此配基可用于在來自患人TSEs的病人和患瘙瘁病、BSE和CWD的動物的樣品中區(qū)分感染性和非感染性朊病毒蛋白。
也提供了一種治療受試者中朊病毒相關(guān)病理或延緩其進(jìn)展的方法。例如，本發(fā)明的配基可用于治療病變，如CJD、vCJD、GSS、致死性失眠癥、瘙癢病、BSE和CWD。這種配基可能是通過抑制PrPsc的聚合或通過抑制PrPsc和PrPc的相互作用、從而延緩PrPsc的進(jìn)一步進(jìn)展而起作用的。
本發(fā)明的另一方面提供了用于鑒定額外配基，特別是對蛋白的構(gòu)象改變形式特異的配基的方法，其中的一些形式參與疾病的發(fā)展。所描述的方法學(xué)也適合開發(fā)、評價或篩選直接結(jié)合PrPsc的大量潛在的藥物候選物。
從下面詳細(xì)的描述和優(yōu)選的實(shí)施例中明顯可知本發(fā)明的其它特征和優(yōu)勢。
附圖的簡要描述

圖1來自結(jié)合腦勻漿物的haPrPc和haPrPsc的組合文庫的珠中的化學(xué)發(fā)光信號。通過特異性單克隆抗體(3F4)與綴合了對3F4特異的二抗的堿性磷酸酶的結(jié)合檢測PrPc和PrPsc。在放射自顯影膠片上檢測對堿性磷酸酶特異性的化學(xué)發(fā)光底物所產(chǎn)生的光。對組合文庫的珠所產(chǎn)生的信號的位置編號。隨后對珠上的配基測序。這些珠在轉(zhuǎn)移和變性之前不產(chǎn)生信號，但是在結(jié)合蛋白的轉(zhuǎn)移和變性以及用綴合3F4抗體的酶標(biāo)記之后，發(fā)射出強(qiáng)信號。
圖2顯示了正常人腦提取物中的huPrPc與柱樣形式的親和樹脂的結(jié)合。制備腦勻漿物和珠，并在磷酸鹽(PBS)或檸檬酸鹽磷酸鹽葡萄糖(CPD)緩沖液中平衡。蛋白印跡上信號的強(qiáng)度是結(jié)合到樹脂上的PrPc的強(qiáng)度的函數(shù)。泳道1包含分子量標(biāo)準(zhǔn)(MW)；泳道220ul 0.1％正常人腦勻漿物。泳道3-8，從珠中洗脫的PrPc。
圖3顯示了CJD感染的人腦的提取物中huPrPsc以分批形式與親和樹脂的結(jié)合。該圖是蛋白印跡，其中顯示與含有散發(fā)性CJD病人的huPrPsc的組織勻漿物相接觸后從珠中洗脫的朊病毒量。在與已用PK處理以顯示PrPres的存在或者保持未處理的組織勻漿物接觸后，沖洗珠。將它們在含有SDS的緩沖液中煮沸以釋放結(jié)合蛋白，在蛋白印跡之后通過SDS-PAGE拆分樣品。用單克隆抗體3F4探針探測后，由PrP特異性條帶的出現(xiàn)證明huPrPsc和PrPc與樹脂的結(jié)合。在凝膠的頂端顯示了肽序列。PK消化的樣品表示為(+)，未消化的為(-)。
圖4CJD感染人腦的提取物中的huPrPsc與柱形式的親和性樹脂的結(jié)合。在凝膠的頂端顯示肽序列。事先用PK消化過的樣品以+表示，未消化的以-表示。對照包括20ul 1％腦勻漿。使用單克隆抗體3F4特異性檢測PrPc和PrPsc，并通過化學(xué)發(fā)光信號的檢測使其可見。
圖5“珠印跡”轉(zhuǎn)移方案的圖示。在與起始材料孵育之后在凝膠中排列珠。結(jié)合蛋白從珠上轉(zhuǎn)移并如所示通過緩沖液的毛細(xì)管轉(zhuǎn)移捕獲在膜上。
圖6通過各種親和樹脂從感染的RBCCs中除去PrPres。用患瘙癢病的倉鼠的腦勻漿使紅細(xì)胞濃縮物(RBCCs)致敏，并順序通過具有不同親和配基的樹脂柱。通過凝膠電泳分析樹脂結(jié)合型蛋白。凝膠上樣的方式顯示于表11中。
發(fā)明詳述這里描述了結(jié)合朊病毒蛋白的配基及其應(yīng)用。所述配基是能夠以特異性和親和性結(jié)合朊病毒蛋白的蛋白、肽或多肽。優(yōu)選地，配基具有6kDa或更低的分子量。
配基可用于檢測樣品、如人或動物來源的生物學(xué)流體或環(huán)境樣品中朊病毒蛋白的方法，以及診斷和治療朊病毒疾病的方法。例如，本發(fā)明的配基可用于使用全血、血液成分、細(xì)胞、血清、血漿、血漿衍生物、腦脊液、尿液、淚液、扁桃體、闌尾和其它樣品治療診斷病變?nèi)鏑JD、vCJD、GSS、致死性失眠癥、瘙癢病、BSE和CWD以及其它TSEs。配基也可用于從樣品中除去朊病毒蛋白，所述樣品例如是血液樣品、血液成分、細(xì)胞、血清、血漿、血漿衍生物、腦脊液、尿液、淚液、扁桃體、闌尾和其它樣品。配基用于在樣品中檢測或從中除去所有朊病毒蛋白，或者可選擇性的選取以檢測或除去朊病毒蛋白的單一形式，因此可用來區(qū)分樣品中的感染性和非感染性朊病毒蛋白。
所描述的方法可用于從聚合物、合成化合物以及合成化合物文庫中篩選朊病毒的額外配基。
這里也提供了鑒定額外配基，特別是對蛋白的構(gòu)象改變形式特異的配基的方法，其中的一些改變形式與是疾病的進(jìn)展有關(guān)。
也提供了適于發(fā)現(xiàn)、評價或篩選大量潛在藥物候選物的方法學(xué)。
定義這里使用的術(shù)語“一個”、“一種”、“這個”和“這種”定義為“一個或多個”或“一種或多種”，還包含多個(種)的情形，除非上下文顯示不適當(dāng)。
術(shù)語“3F4”指對PrPc的天然型，但不對天然PrPsc或PrPres特異的單克隆抗體?？贵w對倉鼠和人類PrPc，PrPsc和PrPres的變性形式有特異性。
如這里使用的，術(shù)語“血源性組合物”和血液組合物可交換地使用，意思是包括全血、紅細(xì)胞濃縮物、血漿、血清、富含血小板和缺乏血小板的成分、血小板濃縮物、白細(xì)胞、血漿沉淀物、血漿分級分離沉淀物和上清液，包括IgA、IgE、IgG和IgM的免疫球蛋白制品、純化的凝血因子濃縮物、纖維蛋白原濃縮物，或來源于人類或動物的各種其它組合物。其也包括通過現(xiàn)有技術(shù)中的各種常用方法中的任何一種方法，包括離子交換、親和、凝膠滲透、和/或疏水層析或通過示差沉淀所制備的純化的血源性蛋白。
術(shù)語“組合文庫”指通過固相組合化學(xué)技術(shù)合成的化學(xué)制劑的集合。這個定義包括使用產(chǎn)生數(shù)百萬有明確長度的隨機(jī)肽或可設(shè)計成包括明確結(jié)構(gòu)的分離-偶聯(lián)-重組方法。構(gòu)件可以是天然氨基酸、合成分子、氨基酸類似物、分枝類似物、三嗪染料等。
術(shù)語特定序列的“保守性變異”或“保守性修飾變異”指氨基酸或其它具有實(shí)質(zhì)性化學(xué)相似性的密切相關(guān)的結(jié)構(gòu)。此外，改變、添加或缺失編碼序列中單個氨基酸或小比例氨基酸的各取代、缺失或添加是保守性修飾變異，其中所述變異導(dǎo)致用化學(xué)上相似的氨基酸取代另一種氨基酸。提供功能相似性氨基酸的保守取代表是本領(lǐng)域公知的。在下面的六組中，每一組都含有可相互進(jìn)行保守性取代的天然氨基酸1)絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、賴氨酸(K)；5)異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V)、丙氨酸(A)6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
許多非天然氨基酸也被視為是天然存在的氨基酸的保守取代。如果當(dāng)序列排列以達(dá)到最大對應(yīng)時，兩個序列中的氨基酸殘基序列相同，那么這兩個多肽可以說成是“同一的”。可通過Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2482(1981)的局部同源性算法、通過Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48443(1970)的同源性排列算法、通過Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.(US.AJ 852444(1988)的相似性搜索方法、通過電腦完成這些算法(GAP，BESTFIT，F(xiàn)ASTA，和TFASTA，Wisconsin Genetics Software Package，Genetics ComputerGroup，575 Science Dr.，Madison，WI)或通過檢查，進(jìn)行序列的最佳排列以便比較。
術(shù)語“配基”指與蛋白、肽或多肽結(jié)合的分子。本發(fā)明的配基可以是抗體制劑、蛋白、肽、多肽、氨基酸、核酸、碳水化合物、糖、脂類、有機(jī)分子、聚合物、和/或推定的治療劑等。
術(shù)語“蛋白”、“肽”、“多肽”、和“寡肽”可交換使用，這里被定義為氨基酸鏈，其中碳通過由一個氨基酸的羧基和另一個氨基酸的氨基之間的縮合反應(yīng)所形成的肽鍵相連接。在鏈一端的末端氨基酸(即氨基末端)有游離氨基，而在鏈的另一端的末端氨基酸(即羧基末端)有游離羧基。這樣，術(shù)語“氨基末端”(縮寫為N-末端)指肽的氨基末端處氨基酸上的游離氨基，或者指肽內(nèi)任何其它部位處的氨基酸的氨基(當(dāng)參與肽鍵時指亞氨基)。類似地，術(shù)語“羧基末端”(縮寫為C-末端)指肽的羧基末端處氨基酸上的游離羧基，或者指肽內(nèi)任何其它部位處氨基酸的羧基。當(dāng)在樹脂上通過Merrifield合成法合成時，通常通過與固定化氨基的肽鍵將C-末端羧基偶聯(lián)到樹脂上。
典型地，按順序?qū)M成肽的氨基酸編號，從氨基末端開始，并且向肽的羧基末端的方向增加。因此，當(dāng)提及一個氨基酸“跟隨”另一個時，則后一氨基酸比“前面的”氨基酸更靠近肽的羧基末端。
術(shù)語“PrPc”指在哺乳動物體內(nèi)自然而廣泛表達(dá)的天然朊病毒蛋白分子。其結(jié)構(gòu)高度保守，而且與疾病狀態(tài)不相關(guān)。
術(shù)語“PrPsc”指PrPc分子的構(gòu)象改變型，其被認(rèn)為是有感染性的，而且與TSE/朊病毒疾病有關(guān)，包括vcJD、CJD、庫魯病(kuru)、致命性失眠癥、GSS、瘙癢病、BSE、CWD，以及俘獲和實(shí)驗(yàn)動物的其它罕見TSEs。它和正常的細(xì)胞PrPc有相同的氨基酸序列，但已經(jīng)將其中一些α-螺旋轉(zhuǎn)換成了β-片層，并且與疾病狀態(tài)有關(guān)。
術(shù)語″PrPres″指在用PK部分消化PrPsc后仍然存在的PrPsc蛋白的27-30kDa蛋白酶耐受性衍生物。
術(shù)語″PrPr″指通過重組技術(shù)表達(dá)的朊病毒蛋白。
術(shù)語″PrP″指一般的朊病毒蛋白。
這里使用的術(shù)語“殘基”指通過酰胺鍵或酰胺鍵模擬物摻入到寡肽中的氨基酸(D或L)或氨基酸模擬物。這樣，氨基酸可以是天然存在的氨基酸，或者，除非另有限制，還可包括以與天然存在的氨基酸相似的方式起作用的天然氨基酸的已知類似物(即氨基酸模擬物)。此外，酰胺鍵模擬物包括本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的肽骨架修飾。
術(shù)語“基本相同”意思是多肽包含至少66％或更多相同氨基酸的序列。多肽序列基本相同的另一個指征是一種肽是否與針對所公開肽產(chǎn)生的抗體有免疫學(xué)反應(yīng)性。因此，本發(fā)明的肽包括與針對所公開的免疫原性肽所產(chǎn)生的抗體有免疫學(xué)反應(yīng)性的肽和其它化學(xué)物質(zhì)。
這里使用的術(shù)語“能夠結(jié)合”指兩個或多個分子在其中所述兩個或多個分子能夠形成復(fù)合體、例如蛋白質(zhì)-配基復(fù)合體的條件下相互結(jié)合而形成復(fù)合體，例如，配基與蛋白或肽的結(jié)合。
結(jié)合PrP的特定氨基酸序列的配基這里所描述的朊病毒結(jié)合配基都是小分子，優(yōu)選肽。配基結(jié)合來源于朊病毒蛋白的肽、多肽，或者整個朊病毒分子。如在這里使用的，術(shù)語“肽”沒有暗示特定的長度。優(yōu)選地，這里所描述的配基結(jié)合具有下列氨基酸序列中的一個或多個的朊病毒蛋白RYPxQ(SEQ ID NO221)，其中x是G，P或NXxYYux(SEQ ID NO222)，其中x是任何氨基酸，u是R或Q更優(yōu)選地，配基結(jié)合具有下列氨基酸序列中的一個或多個的朊病毒蛋白RYPGQ(SEQ ID NO1)DRYYRD(SEQ ID NO2)QAYYQR(SEQ ID NO3)QVYYRP(SEQ ID NO4)
當(dāng)用于探測組合文庫以篩選結(jié)合朊病毒的配基時，具有上面提供的一個或多個氨基酸序列的標(biāo)記肽是有用的。優(yōu)選地，當(dāng)用于篩選文庫以尋找朊病毒配基時，將肽在氨基末端放射標(biāo)記和乙?；?，在羧基末端酰胺化。
這里所描述的配基的氨基酸序列缺少在WO 01/77687中公開的氨基酸序列，其結(jié)合朊病毒蛋白的八肽重復(fù)序列。
在第一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，配基是具有可結(jié)合SEQ ID NO1的氨基酸序列的蛋白或肽。在下面表1中所示的氨基酸序列(SEQ IDNO5-13)是可結(jié)合SEQ ID NO1的氨基酸序列的實(shí)例。因此，在第一個優(yōu)選的實(shí)施方案的配基中包括了具有下表1所示序列中的一個或多個序列的配基。在6聚體文庫中篩選可結(jié)合SEQ ID NO1的6聚體，鑒定出了表1中所示的氨基酸序列。用丙氨酸(A)作為樹脂和文庫的組合肽之間的間隔子來構(gòu)建文庫，在表1包括的序列中表示為最后的A。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解這里提供的配基不限于具有表1所示示范性序列的那些配基。
表1結(jié)合SEQ ID NO1的6氨基酸序列
在第二個優(yōu)選的實(shí)施方案中，配基是具有可結(jié)合SEQ ID NO2的氨基酸序列的蛋白或肽。在下表2中所示的氨基酸序列(SEQ IDNOS14-22)是結(jié)合SEQ ID NOS2的氨基酸序列的實(shí)例。因此，在第二個優(yōu)選的實(shí)施方案的配基中包括了具有在表2所示序列中的一個或多個序列的配基。在6聚體文庫中篩選可結(jié)合SEQ ID NO2的6聚體，鑒定出了表2所示的氨基酸序列。用丙氨酸(A)作為樹脂和文庫的組合肽之間的間隔子來構(gòu)建文庫，在序列中表示為最后的A。賴氨酸(K)出現(xiàn)11次，組氨酸(H)出現(xiàn)7次，二者都高于分布平均值-3。因此，優(yōu)選含有賴氨酸(K)或組氨酸(H)的6聚體。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會理解這里所提供的配基不限于具有表2所示示范性序列的那些配基。
表2可結(jié)合SEQ ID NO2的6-氨基酸序列
在第三個優(yōu)選的實(shí)施方案中，配基是具有可結(jié)合SEQ ID NO3的氨基酸序列的蛋白或肽。在下表3中所示的氨基酸序列(SEQ ID NO23-31)是可結(jié)合SEQ ID NO3的氨基酸序列的實(shí)例。因此，在第三個優(yōu)選實(shí)施方案的配基中包括了具有表3所示序列中的一個或多個序列的配基。在6聚體文庫中篩選可結(jié)合SEQ ID NO3的6聚體，鑒定出了在表3中所示的氨基酸序列。用丙氨酸(A)作為樹脂和文庫的組合肽之間的間隔子來構(gòu)建文庫，在序列中表示為最后的A。若在鑒定中序列并不明確，在表中則針對單個位置給出一個或多個氨基酸，例如，如在SEQ ID NO29中所示的(A/G)。這些序列中組氨酸(H)出現(xiàn)10次，在8種肽中的6種中均存在，明顯高于平均分布值-3。除了SEQ ID NO23之外的所有肽在pH 7時有凈正電荷。因此，優(yōu)選含有組氨酸(H)的6聚體和在pH 7時帶有凈正電荷的肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解這里所提供的配基不限于具有在表3中所示示范性序列的那些配基。
表3結(jié)合SEQ ID NO3的6-氨基酸序列
在第四個優(yōu)選的實(shí)施方案中，配基是具有可結(jié)合SEQ ID NO4的氨基酸序列的蛋白或肽。在下表4中所示的氨基酸序列(SEQ ID NO31-47)是可結(jié)合SEQ ID NO4的氨基酸序列的實(shí)例。因此，在第四個優(yōu)選實(shí)施方案的配基中包括了具有表4中所示序列中的一個或多個序列的配基。在6聚體文庫中篩選可結(jié)合SEQ ID NO4的6聚體，鑒定出了表4中所示的氨基酸序列。用丙氨酸(A)作為樹脂和文庫的組合肽之間的間隔子來構(gòu)建文庫，在序列中表示為最后的A。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會理解這里所提供的配基不限于具有表4中所示示范性序列的那些配基。若在鑒定中序列不明確，則在單個位置給出一個或多個氨基酸，例如SEQ ID NO33中所示的(W/G)。不能明確鑒定出SEQ ID NO37中第二位的氨基酸。序列“LL”(兩個亮氨酸)出現(xiàn)在SEQ ID NOS31，32，41，43和45中，其密切的類似物L(fēng)I，VL，II(異亮氨酸或纈氨酸)出現(xiàn)在SEQ ID NOS33，36，38，40和44中。LL不出現(xiàn)在朊病毒衍生肽或蛋白的任何其它篩選中。此外，17種肽中的15種含有芳香族氨基酸，如苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸(F，W或Y)。7種肽序列呈電荷中性，但具有帶正電的末端氨基。因此，優(yōu)選在序列中含有一個或多個亮氨酸(L)或亮氨酸類似物、如異亮氨酸或纈氨酸(I或V)(優(yōu)選LL，LI，VL或II)的6聚體；含有芳香族氨基酸如苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸(F，W或Y)的6聚體；以及呈電荷中性、但具有帶正電的末端氨基的六聚體。
表4可結(jié)合SEQ ID NO4的6-氨基酸序列
結(jié)合倉鼠PrPc的配基在另一個實(shí)施方案中，配基是以特異性和選擇性結(jié)合在特定物種、例如人類或其它哺乳動物(如倉鼠)中發(fā)現(xiàn)的一種或多種形式的朊病毒蛋白的肽。下面提供了結(jié)合朊病毒蛋白(PrPc)的示范性配基，所述配基具有不同的氨基酸序列長度，2聚體，3聚體，4聚體，5聚體和6聚體，優(yōu)選具有6kDa或更低的分子量。
在SEQ ID NOS48-50中顯示了可結(jié)合倉鼠天然朊病毒(haPrPc)的示范性二聚體配基，其列于表5A中。配基優(yōu)選含有色氨酸(W)優(yōu)選的配基是電荷中性的，但在pH7時具有帶正電荷的末端氨基。優(yōu)選的配基是含有色氨酸(W)的2聚體。萘基-丙氨酸(na)取代色氨酸也導(dǎo)致這些序列中PrP的結(jié)合。將文庫直接合成在樹脂(Toyopearl氨基樹脂Tosoh Bioscience LLC，Monctgomerville，PA)上，沒有間隔子。在篩選中2次(2x)發(fā)現(xiàn)SEQ ID NO50。
表5A結(jié)合haPrPc的2-氨基酸序列
2x表示篩選中發(fā)現(xiàn)2次的序列在SEQ ID NOS51-61中顯示了可結(jié)合倉鼠朊病毒(haPrPc)的示例性3聚體配基，其列于表5B中。芳香族氨基酸F，W或Y出現(xiàn)在除了SEQ ID NO60之外的所有選擇出的肽中。氨基酸A在最靠近樹脂的位置出現(xiàn)3次，并在一些文庫中用作樹脂和肽文庫之間的間隔子。R和K都不存在，但是E出現(xiàn)3次，為8種序列中的3種提供負(fù)電荷。
圖5B可結(jié)合haPrPc的3-氨基酸序列
在SEQ ID NOS62-64中顯示了可結(jié)合倉鼠朊病毒(haPrPc)的示范性4聚體配基，其列于表5C中。用在樹脂和組合肽之間的丙氨酸間隔子構(gòu)建文庫，該丙氨酸出現(xiàn)在下面序列中的最后位置。芳香族氨基酸出現(xiàn)在所有所選肽的第一個位置處。另外，所有選擇的肽在第3或第4位置上含有酸性氨基酸(D或E)。WXD出現(xiàn)1次，其中X是任何氨基酸。
表5C可結(jié)合haPrPc的4-氨基酸序列
在SEQ ID NOS65-68中顯示了可結(jié)合倉鼠朊病毒(haPrPc)的示范性5聚體配基，其列于表5D中。芳香族氨基酸和酸性氨基酸出現(xiàn)在所有選擇的肽中。D或E出現(xiàn)在所有配基的第4或5位上。序列WXD出現(xiàn)在SEQ ID NO65，67和68中。
表5D可結(jié)合haPrPc的5-氨基酸序列
在SEQ ID NOS69-100中顯示了結(jié)合倉鼠朊病毒(haPrPc)的示范性6聚體配基，其列于表5E中。構(gòu)建在樹脂和組合肽之間有丙氨酸間隔子的文庫，該丙氨酸在下面序列中存在于最后位置處。芳香族氨基酸F，W或Y出現(xiàn)在幾乎全部(32個中的29個)所選的肽中，D或E也一樣(32個中的29個)。另外，20個肽在其序列中有2個芳香族氨基酸。共有序列“WXD”出現(xiàn)在SEQ ID NOS75，79，83，86和89中。含有(F/W/Y)X(D/E)(F/W/Y)SEQ ID NO))的序列出現(xiàn)在SEQ IDNOS71，73，77，78，91和95中，(F/W/Y)(D/E)X(F/W/Y)SEQ ID NO))出現(xiàn)在SEQ ID NOS70，72，82，91和95中。32個肽中的24個肽在1-3位上有芳香族氨基酸，外加酸性基團(tuán)；23個在4-6位上有凈負(fù)電荷。20個肽既在1-3位上有芳香族氨基酸外加酸性氨基酸，又在4-6位上有凈負(fù)電荷。
表5E結(jié)合haPrPc的6-氨基酸序列
結(jié)合倉鼠PrPc和倉鼠PrPsc的配基在另一個實(shí)施方案中，配基是以特異性和選擇性結(jié)合兩種或多種形式的朊病毒的肽。下面提供了可結(jié)合(PrPc)和/或構(gòu)象改變的(PrPsc)朊病毒蛋白的配基。在SEQ ID NOS101-115中顯示了可結(jié)合倉鼠朊病毒(haPrPc)的示范性3聚體配基，其列于表6中。芳香族氨基酸出現(xiàn)在幾乎全部(18個中的15個)所選的肽中，D或E也一樣(18個中的15個)。另外，7個肽有兩個芳香族結(jié)構(gòu)和一個酸性氨基酸。序列WXD出現(xiàn)在SEQ ID NOS105和115中。所選的結(jié)合PrPsc比結(jié)合PrPc優(yōu)先的結(jié)構(gòu)是SEQ ID NOS111和SEQ ID NO114，兩者在位置3處都有R。在3聚體文庫中鑒定了SEQ ID NO101-115可結(jié)合來自感染瘙瘁病的腦的勻漿物本身(*)或其與正常倉鼠腦的混合物中的haPrPc和/或PrPsc。
表6結(jié)合haPrPc和haPrPsc的3-氨基酸序列
結(jié)合人PrPc的配基下面提供了可結(jié)合(huPrPc)朊病毒蛋白的配基。在SEQ ID NOS116-139中顯示了可結(jié)合人朊病毒(haPrPc)的示范性3聚體配基，其列于表7A和B中。在三聚體序列(表7A)中，W/YXD在6個三聚體序列中的4個中出現(xiàn)，且6個序列中的5個有疏水性和酸性氨基酸殘基。
表7A結(jié)合huPrPc的3-氨基酸序列
用樹脂和組合肽之間的丙氨酸間隔子構(gòu)建6聚體文庫，該間隔子在下面序列中處于最后位置(表7B)處。氨基酸F，W或Y出現(xiàn)在18個6聚體肽中的13個，D或E出現(xiàn)在18個肽中的17個內(nèi)。6個肽在1-3位上有芳香族和酸性氨基酸，而且在4-6位上也是凈負(fù)電荷。另外，5個肽有2個芳香族結(jié)構(gòu)和一個酸性氨基酸。WxD存在于SEQ ID NO124中，(F/W/Y)x(D/E)(F/W/Y)(SEQ ID NO223)存在于SEQ ID NOS124和133中。除N-末端氨基電荷外，大多數(shù)序列具有負(fù)電荷，僅SEQ ID NO139在中性pH攜帶部分凈正電荷。在3聚體文庫中鑒定了SEQ ID NOS116-121可結(jié)合正常人腦勻漿物中的huPrPc。在6聚體文庫中鑒定了SEQ ID NOS122-139可結(jié)合缺乏血小板的人血漿或富含血小板的人血漿(*)來源的huPrPc。
表7B結(jié)合huPrPc的6-氨基酸序列
*結(jié)合富含血小板的血漿來源的huPrPc結(jié)合人重組PrP的配基下面提供了可結(jié)合重組朊病毒蛋白(PrPr)的配基。在SEQ ID NOS54，105，140-153中顯示了可結(jié)合重組人朊病毒(huPrPr)的示范性3聚體配基，其列于表8中。氨基酸W，F(xiàn)或Y出現(xiàn)在所有選取的16個肽中，D或E出現(xiàn)在16個肽的13個中。共有序列WXD出現(xiàn)在SEQ ID NOS105，143和145中。一些肽以前被鑒定出可結(jié)合PrPc，SEQ ID NOS149和153在本次篩選中兩次被鑒定出來。在3聚體文庫中鑒定了SEQ IDNOS54 105，140-153可結(jié)合用(*)0.5％十二烷基肌氨酸鈉或(**)PBS稀釋的huPrPr(Prionics AG，Switzerland，Cat.#03-040)。在表8中，每柱中將2.5mg干重的組合文庫的樹脂接觸稀釋在0.5％十二烷基肌氨酸鈉(*)或含有1％BSA的磷酸緩沖鹽水(**)稀釋的0.5μg/mlPrPr。在篩選中2次發(fā)現(xiàn)的序列表示為2x。
表8與huPrPr結(jié)合的3-氨基酸序列
(*)用0.5％十二烷基肌氨酸鈉稀釋的人PrPr(**)用PBS稀釋的人PrPr2x表示在篩選中發(fā)現(xiàn)2次的序列結(jié)合人PrPc，人PrPsc或二者的6聚體配基表9A中提供了結(jié)合朊病毒蛋白(PrPc)、構(gòu)象改變的朊病毒蛋白(PrPsc)或二者的6聚體配基。用樹脂和組合肽之間的丙氨酸間隔子構(gòu)建6聚體文庫，該間隔子在下面序列中處于最后位置處。該配基可優(yōu)先結(jié)合huPrPsc。在SEQ ID NOS154-173中顯示了示范性配基，其列于表9A中。除了SEQ ID NO156外，所有配基都含有芳香族氨基酸，20個肽中的15個含有酸性氨基酸。那些對huPrPsc的特異性比PrPc的特異性更高的是SEQ ID NO154，155和156。通過在將蛋白從珠轉(zhuǎn)移到膜上之前對PrPc的選擇性蛋白水解可檢測對散發(fā)CJD患者來源的腦勻漿物中PrPsc的特異性增高的配基。這種文庫包括非天然芳香族氨基酸2-萘基-丙氨酸(na)。
表9A結(jié)合huPrPc，huPrPsc或二者的6-氨基酸序列
*未用PK處理的0.5％散發(fā)CJD(huPrPsc)腦勻漿物**未用PK處理的5％huPrPsc腦勻漿物***用PK處理、但未顯色的0.5％huPrPsc腦勻漿物****用PK處理、但未顯色的5％huPrPsc腦勻漿物na表示2-萘基-丙氨酸結(jié)合人PrPsc的配基下面提供了可結(jié)合構(gòu)象改變的朊病毒蛋白(PrPsc)的配基。用在樹脂和組合肽之間的丙氨酸間隔子構(gòu)建6聚體文庫，所述間隔子在下面序列中處于最后位置。在SEQ ID NOS174-194中顯示了示范性配基，其列于表9B中。SEQ ID NOS188，189，190和191都顯示信號的最大差異(白色和強(qiáng)光信號)。在6聚體文庫中鑒定了SEQ ID NOS174-194，其可結(jié)合摻入到人血漿中的散發(fā)CJD患者腦勻漿物的huPrPsc。含有對PrPsc具有最大特異性的配基的珠對PrPc染色是白色的，但是在變性之后產(chǎn)生強(qiáng)化學(xué)發(fā)光信號。
表9B結(jié)合huPrPsc的6-氨基酸序列
*用經(jīng)PK處理的散發(fā)CJD腦來源的腦勻漿物(huPrPsc)篩選的100-300μm珠*用未經(jīng)PK處理的huPrPsc篩選的100-300μm珠***用未經(jīng)PK處理的huPrPsc篩選的65μm珠結(jié)合人PrPc，人PrPsc或二者的3聚體配基下面提供了可結(jié)合朊病毒蛋白(PrPc)、構(gòu)象改變的朊病毒蛋白(PrPsc)或兩者的3聚體配基。配基可優(yōu)先結(jié)合huPrPsc。在SEQ ID NOS195-212中顯示了示范性配基，其列于表9C中。在這個篩選中，將散發(fā)CJD腦勻漿物在CPD中稀釋，并用作huPrPsc的來源。在這個篩選中3次發(fā)現(xiàn)HYD。紅色珠表示結(jié)合PrPc；13個序列中有8個含有H在所有13個序列中都發(fā)現(xiàn)氨基酸F、W或Y，而R或K只出現(xiàn)1次相對于PrPc(白色珠)而優(yōu)先結(jié)合PrPsc(強(qiáng)信號)的5個珠中有3個含有K或R。WXD出現(xiàn)在SEQ ID NOS200和208中。在3聚體文庫中鑒定了SEQ ID NOS195-212可結(jié)合經(jīng)PK處理的huPrPc和/或huPrPsc。
表9C結(jié)合huPrPc、huPrPsc或兩者的3-氨基酸序列(耐受PK)
*在0.05％十二烷基肌氨酸鈉中的0.5％huPrPsc，經(jīng)PK處理**在0.1％十二烷基肌氨酸鈉中的1.0％huPrPsc，未經(jīng)PK處理***在0.1％十二烷基肌氨酸鈉中的1.0％huPrPsc，經(jīng)PK處理****轉(zhuǎn)移前從凝膠中選擇珠；對于SEQ ID NOS204和205，在洗滌和直接從凝膠中取出之后，對在0.01％十二烷基肌氨酸鈉中的經(jīng)PK處理的0.1％huPrPsc孵育的珠進(jìn)行選擇。
結(jié)合人PrPc、人PrPsc或兩者的3聚體配基下面提供了可結(jié)合朊病毒蛋白(PrPc)、構(gòu)象改變的朊病毒蛋白(PrPsc)或兩者的3聚體配基。配基可優(yōu)先結(jié)合huPrPsc。在SEQ ID NOS147，152，206，213，和214中顯示了示范性配基，其列于表9D中。在3聚體文庫中鑒定出了這些序列，用于結(jié)合在(*)CPD緩沖液或(**)PBS中稀釋的散發(fā)CJD腦勻漿物的huPrPsc和/或huPrPc。
表9D結(jié)合huPrPc、huPrPsc或兩者的3-氨基酸序列
(*)在CPD緩沖液中稀釋的散發(fā)CJD腦勻漿物(**)在PBS緩沖液中稀釋的散發(fā)CJD腦勻漿物配基的合成這里所描述的配基可通過化學(xué)合成生產(chǎn)。許多蛋白合成方法在現(xiàn)有技術(shù)中是常用的，包括應(yīng)用肽合成儀的合成。參見例如PeptideChemistry，A Practical Textbook，Bodasnsky，編輯.Springer-Verlag，1988；Merrifield，Science 232241-247(1986)。優(yōu)選地，合成肽，純化，然后偶聯(lián)到樹脂或膜上用于篩選?？蛇x擇地，在樹脂上直接合成肽，然后純化樹脂結(jié)合型肽。
純化肽，使得它們基本上沒有在標(biāo)準(zhǔn)肽純化技術(shù)中所使用的化學(xué)前體或其它化學(xué)物質(zhì)。表述“基本上沒有化學(xué)前體或其它化學(xué)物質(zhì)”包括肽的制品，其中肽已與在肽合成中所涉及的化學(xué)前體或其它化學(xué)物質(zhì)分離開。
肽的化學(xué)合成便于修飾的或非天然氨基酸的摻入，包括D-氨基酸和其它小的有機(jī)分子。通過用相應(yīng)的D-氨基酸同I型置換肽中一個或多個L-氨基酸，可以增加肽對酶促水解作用的抗性，以及提高活性肽的一個或多個特性，如朊病毒或配基結(jié)合。這里所描述的朊病毒肽和肽配基可以是L-或D-氨基酸或者兩者組合的多聚體。也包括其中本文所述的肽配基類似物存在于非肽酰鍵中的配基。
例如，在各種的實(shí)施方案中，肽配基是D-逆-反向(D-retro-inverso)異構(gòu)體肽。術(shù)語“逆-反向異構(gòu)體(retro-inverso isomer)”指線性肽的異構(gòu)體，其中序列的方向被顛倒并且倒轉(zhuǎn)每個氨基酸殘基的手性。參見例如Jameson等，Nature，368744-746(1994)。D-對映異構(gòu)體和反向合成結(jié)合的凈結(jié)果是每個酰胺鍵中羰基和氨基的位置發(fā)生互換，而每個α-碳處的側(cè)鏈基團(tuán)的位置保持不變。除非另外說明，據(jù)推測本發(fā)明的任何給定L-氨基酸序列都可被制成D-逆-反向(retro-inverso)異構(gòu)體肽。
可將額外的共價交聯(lián)引入到肽序列中，以約束肽主鏈的結(jié)構(gòu)。這種策略可用于開發(fā)效力、選擇性和穩(wěn)定性增強(qiáng)的肽類似物。通常通過在肽N和C末端之間、在側(cè)鏈和N或c末端之間(例如在pH 8.5用K3Fe(CN)6處理；Samson等，Endocrinology，1375182-5185(1996))或在兩個氨基酸側(cè)鏈之間形成酰胺鍵來進(jìn)行大環(huán)化。參見例如DeGrado，Adv.Protein Chem.，3951-124(1988)。
為了改善其效力、穩(wěn)定性和選擇性，許多其它方法也可將構(gòu)象約束引入到肽序列中。這些方法包括使用Cα-甲基氨基酸(參見例如Rose等，Adv.Protein Chem.，371-109(1985))或Nα-甲基氨基酸(參見例如Aubry等，Int.J.Pept.Protein Res.，18195-202(1981))。
如果需要的話，兩個或多個肽配基可以多拷貝存在。可存在一個或多個肽的相同拷貝(例如均二聚體，均三聚體等)，或者可存在序列上不同的肽的多個拷貝(例如雜二聚體，雜三聚體等)。
在另一個可供選擇的方法中，使用重組核酸方法合成配基。通常，這涉及產(chǎn)生編碼配基的核酸序列，將核酸置于表達(dá)盒中處于特定啟動子的控制下，在宿主中表達(dá)蛋白，分離所表達(dá)的蛋白，以及如果需要，這使蛋白復(fù)性。本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員熟知足以指導(dǎo)技術(shù)人員進(jìn)行這種方法的技術(shù)。
一旦得到表達(dá)，則可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法純化重組配基，包括硫酸銨沉淀、親和柱、柱層析、凝膠電泳等。優(yōu)選約50到95％均一的基本上純的組合物用作治療性試劑，最優(yōu)選大約80到95％或更高均一度的組合物。
可選擇地，將配基合并成嵌合蛋白。典型地，通過重組或合成技術(shù)將配基中的2到20種融合成單一多肽中。
在重組方法中，通過連接編碼免疫原性肽的合成或重組核酸制備嵌合蛋白?？捎妹复?例如，使用DNA連接酶)或合成法連接這些核酸。可選擇地，可合成編碼多個配基肽的單一核酸。在任一實(shí)例中，所得到的核酸將編碼多個配基，它們都處在相同的讀框中。因此，翻譯的多肽包含朊病毒結(jié)合配基。
若通過自動化學(xué)合成方法制備配基，則可直接偶聯(lián)肽的多聯(lián)體。這可通過使用標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)方法將肽連接起來而以化學(xué)方式進(jìn)行?？蛇x擇地，可以合成生產(chǎn)編碼多配基肽的多肽。
配基鑒定除了在上述表格中所示的配基外，可根據(jù)下列方法鑒定另外的配基。合成肽文庫，對其篩選結(jié)合朊病毒分析物的能力。配基可以是任何長度。然而，優(yōu)選長2到6個氨基酸。將合成的肽固定在珠上，將珠填充到層析柱中。然后使朊病毒分析物通過柱，使用常規(guī)方法，如通過對朊病毒蛋白特異的標(biāo)記抗體，檢測結(jié)合的分析物。有分析物結(jié)合其上的珠被鑒定為合適的配基。
使用配基除去朊病毒結(jié)合朊病毒或朊病毒片段的配基可用于多種分析、制備和診斷應(yīng)用中?？蓪㈦貌《窘Y(jié)合配基固定在支持物如珠或膜上，用于結(jié)合或除去樣品中的朊病毒。在足以形成朊病毒-配基復(fù)合物以及樣品中的朊病毒蛋白結(jié)合配基的條件下，使結(jié)合了配基的固相接觸樣品，如生物學(xué)流體。然后將固相與樣品分離，從而從樣品中除去結(jié)合到附著于固相的配基上的朊病毒蛋白。例如，用于除去污染物的樹脂和膜在現(xiàn)有技術(shù)中是公知的，如在美國專利No.5,834,318(Baumbach等)和PCT/USO 1/11150中所描述的那些。
生物學(xué)樣品的例子包括、但不限于血液、血源性組合物或血清。另外的生物學(xué)樣品包括腦脊液、尿液、唾液、乳汁、導(dǎo)管液、淚液或精液。其它的樣品可包含膠原、腦和腺體提取物。
在現(xiàn)有技術(shù)已知許多將分子固定到各種固體表面的方法。例如，固體表面可以是膜(例如，硝酸纖維)、微量滴定皿(例如，PVC、聚丙烯或聚苯乙烯)、試管(玻璃或塑料的)、dipstick(例如，玻璃、PVC、聚丙烯、聚苯乙烯、乳膠等)、微量離心管、或者玻璃、二氧化硅、塑料、金屬或聚合物珠。期望的成分可共價結(jié)合，或通過非特異性結(jié)合而非共價附著。
很多種有機(jī)和無機(jī)聚合物(包括天然的和合成的)都可用作固體表面的材料?？勺骼C的聚合物包括聚乙烯、聚丙烯、聚(4-甲基丁烯)、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚(對苯二甲酸亞乙酯)、人造絲、尼龍、聚丁酸乙烯酯、聚偏二氟乙烯(PVDF)、硅氧烷、聚甲醛、纖維素、乙酸纖維素、硝酸纖維素等。可使用的其它材料包括紙、玻璃、陶瓷、金屬、類金屬(metalloid)、半導(dǎo)體材料、水泥等。另外，可使用形成凝膠的材料，如蛋白(例如，明膠)、脂多糖類、硅酸鹽、瓊脂糖以及聚丙烯酰胺。形成幾種水相的聚合物，如葡聚糖、聚(亞烷基)二醇，或表面活化劑，如磷脂，長鏈(12-24碳原子)烷基銨鹽等也是合適的。若固體表面多孔，則視系統(tǒng)的性質(zhì)可使用各種孔徑大小。另外，可在固體表面的聚合期間摻入肽。
在制備表面中，可使用多種不同材料，例如片層，以獲得各種性質(zhì)。例如，可使用蛋白涂層，如明膠，以避免非特異性結(jié)合，簡化共價綴合，以及增強(qiáng)信號檢測等。
如果期望化合物和表面之間發(fā)生共價結(jié)合，則表面通常將會是多功能性的，或是能夠被多功能化。可在表面上存在且用于連接的官能團(tuán)可包括羧酸、醛、氨基、氰基、烯類基團(tuán)、羥基、巰基等。將很多種化合物連接到各種表面上的方式在現(xiàn)有技術(shù)中是公知的，并且已被充分闡明。
也可以通過親和層析將朊病毒蛋白與樣品中的其它蛋白分離開。根據(jù)本發(fā)明的配基可以附著到固體支持物，如樹脂或膜上，并用于結(jié)合和從溶液中除去朊病毒。在這種情況下，配基可偶聯(lián)到固體支持物，例如惰性支持物如膜或樹脂上，朊病毒蛋白和固定化的試劑結(jié)合?？赏ㄟ^抗體的手段檢測固定化試劑/朊病毒。如果期望的話，可將從初步篩選中獲得的一個或多個序列固定在樹脂如聚甲基丙烯酸酯或瓊脂糖上?？墒褂玫钠渌愋偷臉渲ɡ绛傊悄z、交聯(lián)的瓊脂糖、復(fù)合交聯(lián)的多糖、硅藻土、PVDF、丙烯酸酯、聚苯乙烯和纖維素。也可使用膜，如尼龍和纖維素。樹脂可以是聚甲基丙烯酸酯樹脂。
使用配基檢測朊病毒這里所描述的配基也可用于檢測生物學(xué)樣品中朊病毒蛋白的存在或?qū)ζ涠康姆椒ㄖ小Ｔ谧阋允闺貌《镜鞍缀团浠g形成復(fù)合體的條件下，將生物學(xué)樣品，例如、但不限于上面所列出的那些和配基接觸。然后通過常規(guī)的方法檢測復(fù)合體，從而檢測生物學(xué)樣品中朊病毒的存在情況。
通過標(biāo)記配基，使標(biāo)記的配基和樣品結(jié)合，以及檢測標(biāo)記的配基-朊病毒復(fù)合體，從而檢測復(fù)合體。在配基產(chǎn)生期間、如在肽合成期間標(biāo)記配基，或者通過將其與配基共價或非共價地連接而將標(biāo)記與配基綴合?？蛇x擇地，標(biāo)記對配基特異的結(jié)合分子，如抗體，并間接檢測復(fù)合體。已知有很多種標(biāo)記和綴合技術(shù)，它們在科技和專利文獻(xiàn)中被廣泛報道。合適的標(biāo)記包括放射性核苷酸、酶、底物、輔因子、抑制劑、熒光部分、化學(xué)發(fā)光部分、磁性顆粒等。
檢測可通過任何已知方法進(jìn)行，如免疫印跡、Western分析、凝膠遷移率變動分析、熒光原位雜交分析(FISH)、放射活性或生物發(fā)光標(biāo)記示蹤、核磁共振、電子順磁共振、停流光譜術(shù)、柱層析、毛細(xì)管電泳、或其它基于大小或電荷或兩者的改變而追蹤分子的方法。在測定中使用的具體標(biāo)記或可檢測的基團(tuán)不是本發(fā)明的關(guān)鍵方面。可檢測的基團(tuán)可以是具有可檢測的物理或化學(xué)性質(zhì)的任何材料。這些可檢測的標(biāo)記已得到充分開發(fā)，總的來說，可將在這些方法中有用的任何標(biāo)記應(yīng)用于本發(fā)明的方法中。因此，標(biāo)記是通過分光術(shù)、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)、電學(xué)、光學(xué)或化學(xué)方法可檢測到的任何組成。在本發(fā)明中有用的標(biāo)記包括熒光染料(例如，異硫氰酸熒光素、德克薩斯紅、羅丹明等)、放射標(biāo)記(例如，3H、125I、35S、14C或32P)、酶(例如，LacZ CAT、辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶和其它在EIA或在ELISA中通常用作可檢測酶的酶類)、顯色標(biāo)記如膠體金或有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、乳膠等)珠?？筛鶕?jù)本領(lǐng)域公知的方法將標(biāo)記直接或間接偶聯(lián)到試驗(yàn)中的期望組分上。如上所指出的，可使用很多種標(biāo)記，其中標(biāo)記的選擇依所需的靈敏度、化合物綴合的難易、穩(wěn)定性的需要、可用的儀器、以及處理規(guī)定而定。
常常通過間接方式附著非放射活性標(biāo)記。一般而言，將配基分子(例如，生物素)共價結(jié)合到分子上。然后配基結(jié)合抗配基(例如鏈霉親和素)分子，其本身是可檢測的或共價結(jié)合到信號系統(tǒng)上，如可檢測的酶、熒光化合物或化學(xué)發(fā)光化合物?？墒褂迷S多配基和抗配基。若配基有天然的抗配基，例如生物素、甲狀腺素和皮質(zhì)醇，則其可與標(biāo)記的天然抗配基聯(lián)合使用?？蛇x擇地，可將任何半抗原或抗原化合物與抗體結(jié)合使用。
也可將分子直接綴合產(chǎn)生信號的化合物，例如綴合酶或熒光基團(tuán)。作為標(biāo)記的感興趣的酶將主要是水解酶，尤其是磷酸酶、脂酶和糖苷酶，或者氧化還原酶，尤其是過氧化物酶。熒光化合物包括熒光素及其衍生物、羅丹明及其衍生物、丹酰、傘形酮(umbelliferone)等?；瘜W(xué)發(fā)光化合物包括熒光素和2，3-二氫酞嗪二酮(2，3-dihydrophthalazinediones)，例如魯米諾(luminol)。
檢測標(biāo)記的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。因此，例如，若標(biāo)記是放射活性標(biāo)記，則檢測的方法包括閃爍計數(shù)器，或在放射自顯影中使用照相膠片。若標(biāo)記是熒光標(biāo)記，則其可通過用適當(dāng)波長的光激發(fā)熒光染料并檢測得到的熒光，例如通過顯微鏡、視覺檢查、通過照相膠片、通過使用電子探測器如電荷偶聯(lián)裝置(CCDs)或光電倍增管等來檢測。類似地，通過提供酶的適當(dāng)?shù)孜锊⑶覚z測得到的反應(yīng)產(chǎn)物可檢測酶標(biāo)記。最后，可通過簡單地觀察與標(biāo)記有關(guān)的顏色而檢測簡單的顯色標(biāo)記。因此，在各種試紙條(dipstick)測定中，綴合的金常常呈現(xiàn)粉紅色，而不同的綴合珠則呈現(xiàn)珠的顏色。
本發(fā)明的配基也可用于檢測從固體材料中提取到溶液中的靶。例如，固體樣品可用水性、有機(jī)溶劑或臨界流體提取，可將得到的上清液與配基接觸。固體樣品的實(shí)例包括動物源性產(chǎn)品，特別是已接觸傳播朊病毒的介質(zhì)的產(chǎn)品，例如來自牛來源的骨粉。在一些實(shí)施方案中，配基可用于檢測土壤中是否存在朊病毒蛋白。其它固體樣品包括腦組織、角膜組織、糞便物、骨粉、牛肉副產(chǎn)品、綿羊、綿羊副產(chǎn)品、鹿和麋鹿、鹿和麇鹿副產(chǎn)品、以及其它動物和動物來源產(chǎn)品。
可選擇地，朊病毒-配基復(fù)合體可用PK處理。PrPc對PK高度敏感，而PrPsc被部分消化而形成PrPres。PrPres分子本身高度抗蛋白水解。因此，PK處理將消化PrPc，并且將PK敏感型PrPsc轉(zhuǎn)化為PrPres。除去PK后，可將PrPres變性并通過抗體如3F4檢測。
在另一個實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的配基可用于優(yōu)于PrPc而選擇性濃縮PrPsc。
使用配基對朊病毒定量配基-朊病毒復(fù)合體，或者可選擇地，針對配基或配基-朊病毒復(fù)合體的抗體可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的許多方法中的任何一種進(jìn)行檢測和定量。這些方法包括分析性生物化學(xué)方法，如分光光度法、放射術(shù)、電泳、毛細(xì)管電泳、高效液相層析(HPLC)、薄層層析(TLC)、高擴(kuò)散層析等，以及各種免疫學(xué)方法如流體或凝膠沉淀反應(yīng)、免疫擴(kuò)散(單相或雙相)、免疫電泳、放射免疫測定(RIAs)、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISAs)、免疫熒光測定等。
減少非特異性結(jié)合本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會意識到常常期望在試驗(yàn)中和在從樣品中除去分析物期間減少非特異性結(jié)合。若試驗(yàn)涉及固定在固體基質(zhì)上的配基或其它捕獲劑，則期望將與固體材料非特異性結(jié)合的量減少到最低。減少這種非特異性結(jié)合的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。典型地，這涉及用蛋白質(zhì)性組成包被基質(zhì)。具體地，已廣泛地應(yīng)用了蛋白質(zhì)組合物，如牛和人血清白蛋白(BSA)、脫脂奶粉以及明膠。
其它測定形式也可使用蛋白印跡分析檢測樣品中是否存在朊病毒蛋白以及定量。該技術(shù)通常涉及在SDS存在時基于分子量而通過凝膠電泳分離樣品產(chǎn)物，將被分離的蛋白轉(zhuǎn)移到合適的固體支持物(如硝酸纖維素濾膜，尼龍濾膜或衍生化的尼龍濾膜)上，以及用這里所描述的配基孵育被結(jié)合的樣品。配基特異性結(jié)合固定在固體支持物上的朊病毒肽。直接標(biāo)記這些配基，或者可變通地，可隨后使用特異性結(jié)合配基的標(biāo)記抗體進(jìn)行檢測。
其它測定形式包括脂質(zhì)體免疫測定(LIAs)，其使用設(shè)計成結(jié)合特異性分子(例如，配基)并釋放包被的試劑或標(biāo)記的脂質(zhì)體。然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)檢測所釋放的化學(xué)物質(zhì)。
藥物組合物這里所描述的配基可用于治療由朊病毒微生物感染哺乳動物所導(dǎo)致的TSEs的治療性和預(yù)防性應(yīng)用中。例如，在一個實(shí)施方案中，提供了通過向哺乳動物施用有效量的含有藥學(xué)上可接受的載體和本文所述的合成或分離配基的藥物組合物，從而治療哺乳動物TSEs的方法。配基可通過抑制PrPsc結(jié)合PrPsc而防止PrPsc的聚合。另外，它可防抑制PrPsc結(jié)合PrPc，從而降低PrPsc介導(dǎo)的PrPc向PrPsc的轉(zhuǎn)化，因此延遲臨床癥狀的發(fā)生。而且，配基本身可通過添加反應(yīng)性試劑而進(jìn)行修飾，以使該分子靶向PrPsc聚集的部位。這種組合物適合于在各種藥物輸送系統(tǒng)中使用。
將根據(jù)該方法治療的疾病包括、但不限于BSE、感染性貂腦病、貓海綿狀腦病、CWD、CJD、GSS、致命性失眠癥、以及vCJD。
藥物組合物可經(jīng)腸胃外、局部、口服或局部施用。優(yōu)選地，經(jīng)腸胃外施用該藥物組合物，例如靜脈內(nèi)、皮下、真皮內(nèi)、鼻內(nèi)或肌內(nèi)。因此，本發(fā)明提供了施用的組合物，其中包含在可接受的載體(優(yōu)選水性載體)中溶解或懸浮的上述試劑的溶液?？墒褂枚喾N水性載體，例如水、緩沖水、0.4％鹽水、0.3％甘氨酸、透明質(zhì)酸、血纖蛋白粘合劑等。這些組合物可通過常規(guī)的公知滅菌技術(shù)滅菌，或者可過濾除菌?？砂b或冷凍干燥所得到的水溶液，在施用前將冷凍干燥的制品與無菌溶液合并。組合物可根據(jù)需要而含有藥學(xué)上可接受的輔助材料以接近生理條件，如pH調(diào)節(jié)和緩沖液劑、張力調(diào)節(jié)劑、潤濕劑等，例如醋酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、脫水山梨糖醇單月桂酸酯、油酸三乙醇胺等。
對于固體組合物，可使用常規(guī)的無毒性固體載體，其包括例如藥學(xué)級的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石粉、纖維素、葡萄糖、蔗糖、碳酸鎂等。對于口服施用，可通過摻入通常使用的賦形劑中的任何一種，如前面所列舉的那些載體，而形成藥學(xué)上可接受的無毒性組合物，通?；钚猿煞譃榇蠹s1％到95％，更優(yōu)選地為大約25％到75％的濃度。
對于氣溶膠施用，優(yōu)選以被很好隔開的形式與表面活性劑和推進(jìn)劑一起提供多肽。表面活性劑當(dāng)然必須是無毒性的，優(yōu)選可溶于推進(jìn)劑。這種試劑的代表是含有6到22個碳原子的脂肪酸的酯或部分酯，如己酸、辛酸、月桂酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸、亞麻酸、olesteric和油酸與脂肪族多元醇或其環(huán)狀酸酐的酯。可使用混合酯，如混合型或天然甘油酯。如果期望的話，也可包括載體，例如用于鼻內(nèi)輸送的卵磷脂。
施用的量將依據(jù)施用的材料、接受治療的哺乳動物的狀態(tài)以及施用的方式而變化。在治療性應(yīng)用中，向已經(jīng)感染朊病毒的哺乳動物以足以抑制朊病毒傳播或者至少部分阻止疾病的癥狀及其并發(fā)癥的量施用組合物。將適于達(dá)到這個目的的量定義為“治療有效劑量”。對于這個用途有效的量將會視疾病的嚴(yán)重程度、具體的組合物、以及接受者的體重和總體狀態(tài)而定。一般而言，對一個大約70公斤的患者來說，劑量將在每天約1mg到約5mg的范圍內(nèi)，優(yōu)選每天約100mg。
另外，可將編碼配基的DNA或RNA引入到哺乳動物中，以獲得對該核酸所編碼配基的期望的治療反應(yīng)。
本發(fā)明將通過具體的實(shí)施例更詳細(xì)描述。提供下面的實(shí)施例是為了說明目的，并非旨在以任何方式限制或定義本發(fā)明。
實(shí)施例1朊病毒結(jié)合配基的鑒定根據(jù)下列方法鑒定本文所示表中所描述的朊病毒結(jié)合配基肽文庫合成可用于鑒定本文所述朊病毒結(jié)合配基的肽和肽文庫使用以Buettner等1996年所描述的方法為基礎(chǔ)的標(biāo)準(zhǔn)Fmoc化學(xué)，通過Peptides International(Louisville，KY)或CommonwealthBiotechnologies(Richmond，VA)直接在Toyopearl氨基樹脂(TosoBioSep，Montgomeryville，PA)上合成。用上述方案所獲得的肽密度通常在0.1-0.5毫摩爾/克樹脂的范圍內(nèi)。合成了包括1，2，3，4，5和6個氨基酸的文庫。4，5和6個氨基酸的文庫在氨基Toyopearl上合成，其中含有tBoc和Fmoc丙氨酸的混合物作為氨基酸和樹脂上的氨基之間的間隔子。肽從Fmoc丙氨酸開始合成，并tBoc是乙?；?。經(jīng)常在該文庫的第一個位置發(fā)現(xiàn)存在“A”以及配基的氨基末端氨基酸。這很可能是由于在肽合成期間的部分脫酰、去保護(hù)作用和/或在測序期間的Edman降解所致。
在一些實(shí)施方案中，事先與含有PrP的溶液接觸后，將每個都攜帶獨(dú)特配基的多個拷貝的單個珠固定在瓊脂糖內(nèi)。由于可在珠的表面合成大量配基，因此有可能產(chǎn)生大量珠粒，其中理論上每個珠都帶有獨(dú)特配基。使用所描述的方法篩選這些配基用于起始引導(dǎo)物。一旦鑒定出了引導(dǎo)物，則基于引導(dǎo)物配基合成另外的配基(亞文庫)。對這些亞文庫的篩選可得到具有改良特性的額外配基。通過重復(fù)合成和篩選的過程，有可能鑒定出優(yōu)選的配基。
肽文庫結(jié)合篩選將文庫中不同量的珠(5-500mg干燥珠)置于Bio-Spin拋棄型層析柱(Bio-Rad Laboratories，Cat.#732-6008)中，用20個柱體積(CV)的溶于水中的20％MeOH沖洗，以除去可能的雜質(zhì)和肽合成中使用的有機(jī)溶劑。然后洗滌珠，用20CV的1xTBS，pH 7.6(通過將10x TBS稀釋10倍制備1xTBS，BioSource International，Camarillo，CA Cat.#616US-000)平衡。然后停止水流，在1ml新鮮1xTBS中懸浮珠，讓其再膨脹15分鐘。通過重力排干TBS，關(guān)閉柱。為防止檢測材料與樹脂的非特異性結(jié)合，將添加了0.5％BSA(Sigma，Cat#A-7030)的溶于TBS的1ml BlockerTM酪蛋白溶液(Pierce，Rockford，11.Cat.#37532)加到珠上。在柱的兩端覆蓋后，在4℃輕輕振蕩下封閉過夜。排干封閉液，向樹脂中加入1ml含有PrPr、PrPc和/或PrPsc的檢測材料。將柱的兩端緊緊關(guān)閉，置入水平位置，室溫下輕輕振蕩3小時。排干含有PrP的材料，先用10ml含有0.05％Tween20的TBS、再用10mlTBS，在重力作用下驅(qū)動沖洗珠。
結(jié)合型PrPc的檢測使用在含有1％酪蛋白的TBS中1∶8,000稀釋的小鼠單克隆抗體3F4(Signet，Dedham，MA)進(jìn)行正常PrPc的檢測。該單克隆抗體可結(jié)合haPrPc、huPrPc和huPrPr，但對haPrPsc或huPrPsc的親和力極小或者沒有；然而，它卻結(jié)合變性的haPrPsc和huPrPsc。將1ml稀釋的3F4抗體加入到來自事先接觸過含有PrPc的材料的組合文庫的珠中。在室溫下將珠和3F4輕輕振蕩1小時。排干含有未結(jié)合型抗體的溶液，用10ml TBS和含有0.1％Tween 20的10ml TBS沖洗珠。然后在0.5％酪蛋白/0.5％BSA的TBS中1∶2,000稀釋的1ml堿性磷酸酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(γ)(KPL，Gaithersburg，MD Cat#741806)中孵育珠。在室溫下輕輕振蕩1小時進(jìn)行孵育。排干含有未結(jié)合型二抗的溶液，并用10ml TBS和10ml T-TBS沖洗珠。然后，根據(jù)生產(chǎn)商所描述的方法制備1ml ImmunoPure Fast液，即堿性磷酸酶的底物(Pierce，Rockford，IL，cat#34034)，并加到珠中。孵育在室溫下進(jìn)行約15分鐘或者直到珠開始變?yōu)闇\粉紅色，幾乎沒有暗紅色珠出現(xiàn)。排干底物溶液并用10ml TBS沖洗珠。
檢測包埋在瓊脂糖中的PrP結(jié)合珠根據(jù)下列步驟進(jìn)行在瓊脂糖中包埋的PrP結(jié)合珠的鑒定。首先，通過用9ml溶解在水中的1％瓊脂糖(Life Technologies，GrandIsland，NE，cat.#15510-027)覆蓋49cm2盤的表面，制備瓊脂糖的基層，所述瓊脂糖已預(yù)先熔化并冷卻至約60℃。使瓊脂糖凝固。根據(jù)上面所描述的方法將珠和含有朊病毒蛋白的檢驗(yàn)材料接觸，并用TBS沖洗。其次，根據(jù)凝膠中珠的期望濃度而調(diào)整珠的濃度。發(fā)現(xiàn)珠在每毫升為1.9mg干重量時分布很好。將90μl珠漿液加到800μl已溶于水、熔化并冷卻到40℃的0.5％低熔點(diǎn)瓊脂糖(BioWhittaker，Rockland，ME cat.#50111)中。將混合物非常短暫地輕輕渦旋，并倒在基層的表面上。將含有PrP的材料的等分試樣在其邊角處直接置于凝膠中，作為下面步驟的陽性對照。使凝膠在4℃凝固。
在瓊脂糖中包埋的PrP結(jié)合珠的化學(xué)發(fā)光檢測將珠包埋到凝膠中后，加入CDP-Star溶液(Applied Biosystems，Bedford，MA cat.#MS100R)以覆蓋凝膠表面，然后根據(jù)生產(chǎn)商的指導(dǎo)手冊中所描述的方法將其孵育5分鐘。對凝膠中剩余的底物溶液排干，然后放入一個透明密封的塑料袋中，對放射自顯影膠片曝光30分鐘。膠片通過與凝膠中的紅色珠進(jìn)行點(diǎn)比對而鑒定出PrPc或PrPr的位置。這些膠片隨后用于將膠片與在蛋白變性轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜后獲得的額外膠片進(jìn)行比對。
蛋白從包被的珠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜的方案這種轉(zhuǎn)移方法學(xué)從珠中洗脫蛋白，并通過毛細(xì)管作用將它們轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜或PVDF膜上。一張3MM濾紙發(fā)揮從槽中通過凝膠轉(zhuǎn)移緩沖液(其可以是適合實(shí)驗(yàn)的具體需要的任何緩沖液)的作用。該3MM濾紙燈芯預(yù)先用轉(zhuǎn)移緩沖液濕潤，放在表面上，紙的末端浸在緩沖液槽中。將凝膠放到濕潤的3MM上，軟瓊脂面朝上，確保在濾紙和凝膠之間沒有氣泡。將一張剪成凝膠大小的膜((ECL-標(biāo)準(zhǔn)硝酸纖維素Hybond Amersham，Germany，cat.#RPN303D)在轉(zhuǎn)移液中濕潤，并放置在凝膠的上面。用移液管在膜上滾動以除去氣泡。然后將兩張預(yù)先濕潤的3MM紙放在膜上，用移液管滾動以除去氣泡。將一疊干紙巾或其它吸收性紙放在頂部，壓300g重量?？杀M可能長地進(jìn)行轉(zhuǎn)移。
化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測方案將膜從凝膠的頂部取下來，漂洗，置入含有10ml溶于加有Tween的TBS(T-TBS)的5％(w/v)脫脂奶粉(Giant Fod Inc.，Landover，MD)的塑料容器中。在4℃下將膜與奶粉輕輕振蕩孵育長達(dá)16小時，或者室溫下孵育2小時，以防止抗體和膜的非特異性結(jié)合。在用奶粉封閉后，將膜與10ml溶于含5％奶粉的加有Tween的TBS(T-TBS)、按1∶8000稀釋的一抗3F4一起孵育。在室溫(20℃-25℃)下繼續(xù)輕輕振蕩孵育1.5小時。然后棄去一抗溶液，用T-TBS漂洗膜2次，接著在T-TBS中洗滌15分鐘，然后在新鮮的T-TBS中洗滌2次5分鐘。所有的洗滌都在輕輕振蕩下進(jìn)行。然后將每張膜與10ml溶于含5％奶粉的T-TBS、以1∶10000稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(KPL，Gaithersburg，MD)在室溫下輕輕振蕩孵育1.5小時。然后棄去二抗溶液，如上所述漂洗和洗滌膜。一些實(shí)驗(yàn)使用堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗用于檢測一抗。
根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明，通過制備“化學(xué)發(fā)光底物”(Supersignal，Pierce Rockford Il cat#34080)進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測。將10毫升混合物加到每張膜上，蛋白質(zhì)面朝上。用手輕輕旋轉(zhuǎn)底物5分鐘，將底物飽和的膜取出，并放在3MM濾紙上以快速吸干，然后包于SheetProtector(Boise Cascade Office Products，#L2A9113-NG)中。將膜的蛋白質(zhì)面對放射自顯影膠片曝光不同時間，使膠片顯影。
對來自瘙癢病倉鼠腦的PrPsc特異的三聚體結(jié)合物的檢測利用PrPc和PrPsc之間不同的生物化學(xué)性質(zhì)以及與抗體即3F4的結(jié)合差異，篩選選擇性結(jié)合PrPsc的配基。單克隆抗體3F4與變性的PrPsc相結(jié)合的親和力顯著高于與未非變性的PrPsc相結(jié)合的親和力(Safir，J.等Eight Prion Strains Have PrPsc Molecules WithDifferent Conformations.1998.Nature Medicine 41157-1165)。
在PBS中制備10％(w/v)的未感染和感染瘙瘁病的倉鼠腦組織勻漿物，凍存于-80℃(Robert Rohwer博士惠贈，VA Medical Center，Baltimore)。使用前將其在濕冰上解凍，將1.2ml(未感染的)和0.5ml(感染的)組織勻漿物在終濃度為0.5％(w/v)十二烷基肌氨酸鈉的存在下溶解，室溫下輕輕振蕩30分鐘。將樣品在14,000rpm離心5分鐘，收集含有PrPc(未感染型)以及PrPc和PrPsc的混合物(感染型)的上清。相對于PrPc，在感染瘙癢病的倉鼠腦組織中過多地顯示有PrPsc。通過將1ml溶于0.5％十二烷基肌氨酸鈉的10％正常倉鼠腦組織勻漿物與0.33ml瘙癢病感染型腦材料以及3.67ml含有1％酪蛋白和1％BSA(Sigma，St.Louis，MO)的TBS緩沖液(Pierce，Rockford，IL)相混合，制備用于分析的5ml腦材料。正常和瘙癢病感染型腦組織勻漿物的終比率是3∶1，顯示PrPc和PrPsc的量幾乎大致相等。將此材料與三聚體珠文庫接觸并根據(jù)步驟進(jìn)行試驗(yàn)。洗滌后，對珠進(jìn)行不同處理。在一種方法中，將它們與PK孵育以消化結(jié)合到珠上的PrPc，在另一種方法中，對它們?nèi)旧苑治鯬rPc的存在情況。這是通過將珠和3F4抗體孵育、洗滌、然后加入綴合了磷酸酶的3F4特異性二抗，洗滌并加入磷酸酶底物以使結(jié)合PrPc、3F4、二抗或磷酸酶的珠顯色來完成。因此，那些結(jié)合PrPc的珠呈紅色。一旦包埋在凝膠中，則在一些實(shí)驗(yàn)中加入對磷酸酶特異的另一種化學(xué)發(fā)光底物，從紅色珠中產(chǎn)生光信號。根據(jù)上面所描述的方法，在存在6M鹽酸胍(其也導(dǎo)致朊病毒蛋白的變性)時將PrPc、PrPsc和PrPres從瓊脂糖中轉(zhuǎn)移出來。PrPsc在捕獲膜上的變性和固定便于PrPc以及PrPsc的免疫檢測。若將這些點(diǎn)與以前染色的珠比對，則可能有不同群的珠。那些直接結(jié)合檢測試劑如3F4的珠和那些結(jié)合PrPc加PrPsc或單獨(dú)結(jié)合PrPc的珠將被染成紅色。那些只結(jié)合或優(yōu)先結(jié)合PrPsc的珠將在膜上產(chǎn)生信號，但將不會被染成紅色。這些被選作PrPsc特異性珠，盡管他們被進(jìn)一步驗(yàn)定為理論上可能在朊病毒蛋白上阻斷結(jié)合3F4的位點(diǎn)結(jié)合PrPc和/或PrPsc兩者的珠。在圖1中，將三聚體文庫中在第一次化學(xué)發(fā)光檢測(變性步驟前)時不產(chǎn)生信號、但在第二次化學(xué)發(fā)光檢測(變性步驟后)時產(chǎn)生信號、因此是用于測序的候選的珠用數(shù)字標(biāo)記。
這里在表中列舉本實(shí)施例中所描述的方法學(xué)的各種形式。
例如，在下面的表10A和B中，在存在摻入到正常人血漿中的散發(fā)CJD腦材料時篩選6聚體文庫(100-300μm和65μm)。使珠接觸收集到CPD中的摻入到正常人血漿中的0.5％腦組織勻漿物，然后用100μg/ml PK處理。為了證實(shí)PK沒有完全消化來自珠中的肽，在測序前用1％(w/v)酪蛋白和5％(w/v)人血清白蛋白以及100μg/ml PK處理樹脂。
表10A結(jié)合huPrPc、huPrPsc或兩者的6-氨基酸序列
*未用PK處理的0.5％散發(fā)CJD腦組織勻漿物(huPrPsc)**未用PK處理的5％huPrPsc***經(jīng)PK處理的0.5％huPrPsc，無顏色產(chǎn)生****經(jīng)PK處理的5％huPrPsc，無顏色產(chǎn)生
“NA”指示未做，na指示萘基丙氨酸表10B結(jié)合huPrPs c的6-氨基酸序列
*用經(jīng)PK處理的散發(fā)型CJD腦組織勻漿物(huPrPsc)篩選100-300μm珠**用未經(jīng)PK處理的huPrPsc篩選100-300μm珠***用未經(jīng)PK處理的huPrPsc篩選65μm珠****對照珠顯示在缺乏PrP時與PK孵育后無配基的顯著消化在下面的表10C中，在存在從患散發(fā)CJD(huPrPsc)的患者中制備的腦組織勻漿物時篩選3聚體文庫，在PrP特異性結(jié)合物的免疫檢測前用PK處理珠。在這個試驗(yàn)中，將每柱10mg樹脂與1ml在CPD中稀釋并分別含有0.05％或0.1％(w/v)十二烷基肌氨酸鈉以及0.2mM蛋白酶抑制劑(PMSF)的0.5％(w/v)或1％(w/v)腦組織勻漿物一起孵育。進(jìn)行在一般方案中所描述的適當(dāng)洗滌，將珠在37℃用1ml PK(100μg/ml)處理1小時。然后進(jìn)行上述一般步驟。表10C中列舉了在兩個實(shí)驗(yàn)中所獲得的序列。對每組序列標(biāo)明了在孵育期間腦組織勻漿材料使用的適當(dāng)濃度。
在表10D中，將組合文庫的樹脂以每柱5mg干重的量與1ml在PBS或CPD中稀釋并含有0.01％(w/v)十二烷基肌氨酸鈉和0.2mM PMSF的0.1％(w/v)腦組織勻漿物一起孵育。所有的操作都根據(jù)上面提到的方案來完成。
表10C結(jié)合huPrPc、huPrPsc、或兩者的3-氨基酸序列
*溶于0.05％十二烷基肌氨酸鈉中的、經(jīng)PK處理的0.5％huPrPsc**溶于0.1％十二烷基肌氨酸鈉的、未經(jīng)PK處理的1.0％huPrPsc**溶于0.1％十二烷基肌氨酸鈉的、經(jīng)PK處理的1.0％huPrPsc****在轉(zhuǎn)移前從凝膠中選擇珠*****在洗滌后獲取珠3x表示3次檢測到的序列表10D結(jié)合huPrPc、huPrPsc、或兩者的3-氨基酸序列
實(shí)施例2配基的第二次篩選下面的實(shí)施例提供了關(guān)于在第一次篩選期間從不同文庫中所選擇的配基進(jìn)行第二次篩選的信息，以進(jìn)一步證實(shí)所述配基結(jié)合PrP。
在圖2中顯示了正常人腦的PrPc與三聚體樹脂的結(jié)合。每柱每種樹脂(氨基、HYD(SEQ ID NO206))、RWD(SEQ ID NO113)、SYA(SEQ ID NO108)、SYF(SEQ ID NO213)、和YEY(SEQ ID NO154))使用10mg。氨基樹脂是基礎(chǔ)聚合物，肽在其上合成，該樹脂對朊病毒蛋白有些親和力。樹脂用PBS或CPD在pH 7.4平衡。冰凍的正常人腦組織用作huPrPc的來源。其首先在濕冰上解凍。將在PBS或CPD中制備的10％腦組織勻漿物樣品用1％十二烷基肌氨酸鈉溶解，并通過14,000rpm離心5分鐘澄清?；厥丈锨逡海♂?00倍使腦組織勻漿和十二烷基肌氨酸鈉的終濃度分別為0.1％和0.01％。將1毫升這種材料加到柱上并收集流過柱的液體。用20ml PBS或CPD洗滌珠，如下所述使用1mg珠(干重)通過蛋白印跡評價PrPc結(jié)合。
洗滌后，將大約1mg干重量的珠在100ul緩沖液中懸浮，并在含有2％β巰基乙醇的30μl Laemmli緩沖液中在100℃加熱10分鐘。將珠在14,000rpm離心1分鐘，通過蛋白印跡和探針探測PrP來評價上清液。在降低的變性條件下在NuPAGE 12％Bis-Tris凝膠(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA，USA)上分離樣品，電印跡到硝酸纖維素膜(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA，USA)上。使用稀釋為1∶10,000的單克隆抗體3F4使特異性PrP條帶顯色。使用含有用于辣根過氧化物酶檢測的化學(xué)發(fā)光試劑的SuperSignal West Pico檢測系統(tǒng)(Pierce，Rockford，IL，USA)使印跡顯影。在X-OmatTMBlue XB-1膠片(Eastman Kodak Company，Rochester，NY)上記錄信號，每柱使用(SEW ID NO113)，SYA(SEQID NO108)，WEY(SEQ ID NO102)，WSD(SEQ ID NO115)，YID(SEQ ID NO112)，YFE(SEQ ID NO106)，YEY(SEQ ID NO154)，和WQD，并根據(jù)上述的一般方案進(jìn)行處理。用PBS，pH 7.4平衡柱。將來自散發(fā)CJD患者的冰凍腦組織用于制備PrPsc。它也含有PrPc。在PBS中制備10％腦組織勻漿物樣品，用1％十二烷基肌氨酸鈉處理，通過14,000rpm離心5分鐘澄清?；厥丈锨逡海⑾♂?00倍使腦組織勻漿和十二烷基肌氨酸鈉終濃度分別為0.1％和0.01％。將1ml這種材料加到珠上，并分批在室溫下孵育3小時。然后用20ml PBS洗滌珠，在37℃下將1mg珠(干重)與PBS或含PK(100μg/ml)的PBS孵育1小時。這些條件可完全消化PrPc。因此，這會有助于區(qū)分PrPsc和PrPc特異性配基。按照實(shí)施例1中所描述的方法常規(guī)處理珠以用于蛋白印跡。
在圖4中顯示了從散發(fā)型CJD患者的腦組織勻漿物中獲得的PrPsc以流過的方式結(jié)合樹脂。在實(shí)驗(yàn)中每種樹脂(氨基、RWERED(SEQID NO157)、LW(SEQ ID NO50)、EYY(SEQ ID NO214)、HYD(SEQ ID NO206))、RWD(SEQ ID NO113)、SYA(SEQ ID NO108)、SYF(SEQ ID NO213)、和YEY(SEQ ID NO154))使用50mg。使用Captiva 96孔濾板(CaptiVac Vacuum Sistem，ANSYSTechnologies，Inc，Cat.#796)替代單個柱。根據(jù)上述一般方案制備樹脂。樹脂用CPD pH 7.4平衡。將散發(fā)型CJD患者的冰凍腦組織用作huPrPc和huPrPsc的來源。在CPD中制備10％腦組織勻漿物樣品，用1％十二烷基肌氨酸鈉處理，在14,000rpm離心5分鐘澄清。回收上清液，稀釋10倍以使腦組織勻漿物和十二烷基肌氨酸鈉的終濃度分別為1％和0.1％。向每孔加入250μl此材料。使該材料在重力作用下經(jīng)過樹脂，接觸時間約4分鐘，收集流過的液體。用2.5ml CPD洗滌樹脂。在37℃下將1mg珠(干重)與PK(100μg/ml)孵育1小時。之后根據(jù)上述方法進(jìn)行珠的常規(guī)處理以用于蛋白印跡。
盡管可在本發(fā)明的實(shí)施或檢測中使用與這里所描述的那些相似或等同的方法和材料，但合適的方法和材料如上文所述。將這里所提到的所有出版物、專利申請、專利和其它引用的參考文獻(xiàn)完整并入作為參考。另外，這些材料、方法和實(shí)施例只是說明性的，并非旨在限制。
提供前面的說明以描述與本發(fā)明有關(guān)的各種實(shí)施方案?？蓪@些實(shí)施方案和/或結(jié)構(gòu)進(jìn)行各種修飾、增加和刪除，而不背離本發(fā)明的范圍和精神。
實(shí)施例3顯現(xiàn)結(jié)合于樹脂上的PrPc為了顯現(xiàn)PrPc與親和樹脂的結(jié)合，使正常腦勻漿物結(jié)合柱形式的氨基DVR(SEQ ID NO114)樹脂，通過產(chǎn)色的底物顯現(xiàn)蛋白在珠的內(nèi)部和外部的位置。將在Toyopearl 650-M氨基樹脂上合成的0.5ml親和配基DVR(SEQ ID NO114)柱填充到PIKSI柱(ProMeticBioSciences Ltd，Montreal，Quebec，Canada)中。由蠕動泵控制，以0.5ml/分的流速，將稀釋在工作緩沖液(WB)(20mM檸檬酸，140mM氯化鈉，pH 7.0)中的1.5ml 1％正常倉鼠腦組織勻漿物(HaBH)加到柱中。加載HaBH后，用5ml WB洗滌柱。從柱中移出珠，用剃刀片砍碎以暴露珠的內(nèi)部，在室溫下通過旋轉(zhuǎn)振蕩與在1％酪蛋白緩沖液(Pierce，Rockford，IL)中1∶4000稀釋的一抗3F4孵育1小時。用TBS，pH 7.4(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA，USA)洗滌珠，與在1％酪蛋白中1∶1000稀釋的堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗(KPL，Gaithersburg，MD)在室溫下旋轉(zhuǎn)孵育1小時。用10mlTBS，pH 7.4洗滌珠，然后用5ml TBS，pH 9.5洗滌。將珠與BCIP/NBT堿性磷酸酶底物(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)孵育幾個小時并在立體顯微鏡下觀察。珠的外表面被染成褐色/藍(lán)色，但內(nèi)表面仍保持白色，提示蛋白質(zhì)結(jié)合在珠的外面。
實(shí)施例4
從血紅細(xì)胞濃縮物中除去PrPsc向血紅細(xì)胞濃縮物(RBCCs)以高于可能在感染動物血液中內(nèi)源性存在的數(shù)量級的濃度摻入感染了瘙癢病的倉鼠的腦組織勻漿物。為了評價當(dāng)以高濃度存在時親和配基結(jié)合和從RBCCs中除去PrP的能力，將有摻入的RBCCs連續(xù)通過具有不同親和配基的樹脂柱。
將10單位O型陰性紅血細(xì)胞濃縮物(RBCCs)在Pall Leukotrapfilters(Pall，East Hills，NY)上除去白細(xì)胞，合并，并摻入溶于0.1％十二烷基肌氨酸鈉的0.1％瘙癢病倉鼠腦組織勻漿物。以2ml/分鐘，振蕩加入摻入物。將有摻入的RBCCs再分成每份300ml的10等份，每份裝入到轉(zhuǎn)移袋(Fenwal Products，Baxter HealthcareCorporation，Deerfild，IL)中。
串連裝配5個柱，每個都含有10ml特定樹脂，從而使流經(jīng)第一個柱的含有未結(jié)合材料的液體施加到第二個柱上。連續(xù)進(jìn)行這種步驟直到所有的5個柱都接觸過RBCCs。使300ml有摻入的RBCCs通過第一個柱，收集流過柱的液體，流經(jīng)第二個柱，等等，直到所有的柱都接觸過RBCCs。收集柱中的珠，洗滌100μl珠樣品，并分為兩份。一份在37℃與1mg/ml蛋白酶K(在表11，與蛋白酶K孵育的樣品表示為+PK，未與蛋白酶K孵育的樣品表示為-PK)孵育1小時。通過在2×樣品緩沖液(NuPAGE，Helixx Technologies Inc.，Toronto，Ontario，Canada)中煮沸珠，從珠中洗脫與+PK和-PK珠兩者都結(jié)合的蛋白質(zhì)。將每個樣品以10μl的量加樣到12％Bis-Tris SDS-PAGE凝膠(Invitrogen)上并電泳45分鐘。將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到膜上，使用小鼠抗人PrP抗體3F4作為一抗，綴合了堿性磷酸酶的山羊抗小鼠抗體作為二抗，用Western Breeze化學(xué)發(fā)光檢測(Invitrogen)在蛋白質(zhì)印跡中檢測PrP蛋白。通過洗脫樹脂結(jié)合型蛋白而獲得的凝膠上的條帶指示在來源于前面柱子的流過液(或在第一個柱子時指起始材料)的珠上存在PrPres。
對于陰性對照，乙?；腟YA(Ac-SYA)(SEQ ID NO108)樹脂，在柱1-5的珠上發(fā)現(xiàn)了PrPres，表明這種樹脂不結(jié)合PrPsc。在柱1上發(fā)現(xiàn)大量PrPres，在DVR(SEQ ID NO114)和SYA(SEQ ID NO10)的柱2上數(shù)量降低，在柱3的珠上僅有少量PrPres存在。這顯示這些樹脂在三個柱或30ml樹脂中除去了所有的PrPres，可達(dá)到蛋白印跡檢測的極限。樹脂YVHEA(SEQ ID NO63)和(D)ES(na)PRQ-EACA(SEQ ID NO226-EACA)也顯示從柱1到柱3上PrPres的量降低；然而，柱3上結(jié)合的PrPres比在前2個樹脂中的更多。在WFVEA(SEQID NO225)的每個柱上發(fā)現(xiàn)了等量的PrPres，表明此樹脂在每個柱上結(jié)合少量PrPres，但結(jié)合以及除去所有朊病毒蛋白的程度不能達(dá)到檢測的極限。由于摻入物比在動物血中內(nèi)源性觀察到的PrP的量高幾倍，因此這些結(jié)果表明這些樹脂中的某些類型即使不能除去血液中存在的所有內(nèi)源性PrPres，也能除去其中的絕大部分。
表11在實(shí)施例4中樣品的凝膠電泳上樣方式
MWM表示分子量標(biāo)記序列表序列表<110>The American National Red CrossNorth Carolina State University<120>朊病毒蛋白配體及其使用方法<130>51821-295083(51821-0101WP)<150>US 60/430,423<151>2002-12-03<160>226<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>5<212>PRT<213>prion sp.
<400>1Arg Tyr Pro Gly Gln1 5<210>2<211>6<212>PRT<213>prion sp.
<400>2Asp Arg Tyr Tyr Arg Asp1 5<210>3<211>6<212>PRT<213>prion sp.
<400>3Gln Ala Tyr Tyr Gln Arg1 5<210>4<211>6
<212>PRT<213>prion sp.
<400>4Gln Val Tyr Tyr Arg Pro1 5<210>5<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>5Lys Ile His Lys Phe Leu Ala1 5<210>6<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>6Gly Thr His Asp Phe Gln Ala1 5<210>7<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>7Lys Phe Gly Ser Thr His Ala1 5
<210>8<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>8Phe Val Asn Glu Ile Glu Ala1 5<210>9<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>9Gly Leu His Phe Lys Ser Ala1 5<210>10<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>10Gly Arg Val Leu His His Ala1 5<210>11<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>11
Gln Lys Asn Ser Glu Trp Ala1 5<210>12<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>12His Ala Tyr Phe Thr His Ala1 5<210>13<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>13Trp Pro Lys Gly Ala Val Ala1 5<210>14<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>14Arg Pro Trp Lys Lys Ala Ala1 5<210>15<211>7<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>15Pro Lys His Ile Trp Pro Ala1 5<210>16<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>16His Lys Leu Trp Gly Val Ala1 5<210>17<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>17Gly Gly Tyr Lys Pro Tyr Ala1 5<210>18<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>18Glu Asn Val Ser Gln Asn Ala1 5
<210>19<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>19His Thr Tyr Tyr Asn Gly Ala1 5<210>20<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>20Lys Lys Lys Ser Asp His Ala1 5<210>21<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>21His His Leu Lys Gly Thr Ala1 5<210>22<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體
<400>22Lys Lys His Gly Val Trp Ala1 5<210>23<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>23Asp Gly Thr Gln Ala His Ala1 5<210>24<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>24Ala Pro His Arg Asn Asn Ala1 5<210>25<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>25His His Gly His Asn Ile Ala1 5<210>26<211>7<212>PRT
<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>26His Thr Trp His Gly Gln Ala1 5<210>27<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>27His Val Phe Val Thr Trp Ala1 5<210>28<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>28Thr His His Phe Tyr Ile Ala1 5<210>29<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(6)..(6)
<223>在第6位的Xaa是Ala或Gly<400>29Lys Leu Gly Trp Gly Xaa Ala1 5<210>30<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>30Gly Ser Lys Lys Lys Glu Ala1 5<210>31<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>31Pro Leu Leu Val Val Trp Ala1 5<210>32<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>32Trp Leu Leu Val Gly Gly Ala1 5<210>33
<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(1)<223>在第1位的Xaa是Trp或Gly<400>33Xaa Gln Val Leu Val Tyr Ala1 5<210>34<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>34Arg Arg His Gln Arg Gln Ala1 5<210>35<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>35Leu Pro Trp Thr Phe Gly Ala1 5<210>36<211>7<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>36Ile Phe Ile Ile Ile Thr Ala1 5<210>37<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(2)..(2)<223>在第2位的Xaa未知<400>37Pro Xaa Ile Glu Pro His Ala1 5<210>38<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>38Glu Trp Gly Ile Ile Trp Ala1 5<210>39<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體
<400>39Gly Trp Tyr Ile Tyr Phe Ala1 5<210>40<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>40Thr Leu Ile Leu Phe His Ala1 5<210>41<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>41Phe Leu Leu Ser Asn His Ala1 5<210>42<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>42Trp Gln Ile Arg Phe Phe Ala1 5<210>43<211>7
<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>43Val Leu Leu Val Phe Glu Ala1 5<210>44<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>44Gly Trp Val Leu Glu Ile Ala1 5<210>45<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>45Phe Leu Leu Ile Asp Thr Ala1 5<210>46<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>46Gly Phe Leu Phe Lys Phe Ala
1 5<210>47<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>47Pro Trp Thr Ile Tyr Ile Ala1 5<210>48<211>2<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>48Trp His1<210>49<211>2<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>49Trp Trp1<210>50<211>2<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>50Leu Trp1<210>51<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>51Trp Asn Ala1<210>52<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>52Glu Phe Trp1<210>53<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>53Leu Pro Trp1<210>54
<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>54Tyr Glu Tyr1<210>55<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>55Trp Pro Ala1<210>56<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>56Phe Asn Gln1<210>57<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>57
Tyr His Glu1<210>58<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>58Leu Phe Ala1<210>59<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>59Asn His Tyr1<210>60<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>60Thr Leu Gly1<210>61<211>3<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>61Trp Val Asp1<210>62<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>62Tyr Trp Asp Gln Ala1 5<210>63<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>63Tyr Val His Glu Ala1 5<210>64<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>64Trp Phe Asp Glu Ala1 5
<210>65<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>65Leu Gln Trp Tyr Asp Ala1 5<210>66<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>66Tyr Thr His Ser Glu Ala1 5<210>67<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>67Trp Ile Asp Tyr Glu Ala1 5<210>68<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>68
Val Trp Ile Asp Ala Ala1 5<210>69<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>69Trp Asp Glu Ala Glu Glu Ala1 5<210>70<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>70Tyr Asp Ser Tyr Asp Asp Ala1 5<210>71<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>71Asn Asp Phe Ile Asp Phe Ala1 5<210>72<211>7<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>72Tyr Glu Pro Trp Gly Ser Ala1 5<210>73<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>73Glu Tyr Gly Asp Trp Trp Ala1 5<210>74<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>74Trp Asp Tyr Asp Gln Glu Ala1 5<210>75<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>75Asp Trp Gly Asp Pro Phe Ala1 5
<210>76<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>76Asp Trp Pro Glu Val Trp Ala1 5<210>77<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>77Phe His Asp Phe Ser Glu Ala1 5<210>78<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>78Asp Thr Phe Trp Asp Tyr Ala1 5<210>79<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體
<400>79Trp Asn Asp Leu Asp Asn Ala1 5<210>80<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>80Ala Ser Ala Leu Val Tyr Ala1 5<210>81<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>81Leu Ile Asn Ala Gly Gly Ala1 5<210>82<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>82Trp Glu Ser Tyr Val Thr Ala1 5<210>83<211>7<212>PRT
<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>83Trp Ser Asp Glu Gly Tyr Ala1 5<210>84<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>84ryr Arg Trp Thr Gly Pro Ala1 5<210>85<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>85Tyr Glu Asp Gln Trp Gln Ala1 5<210>86<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>86Glu Trp Ala Asp Asp Asn Ala1 5
<210>87<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>87Tyr Glu Ile Asp Tyr Gly Ala1 5<210>88<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>88Glu Phe Gly Tyr Phe Asp Ala1 5<210>89<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>89Trp Gly Asp Glu Gln Asp Ala1 5<210>90<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體
<400>90His Glu Glu Asp Trp Ala Ala1 5<210>91<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>91Phe Glu Asp Phe Glu Leu Ala1 5<210>92<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>92Thr Trp Gly Ile Asp Glu Ala1 5<210>93<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>93Trp Asp Pro Thr Asp Tyr Ala1 5<210>94<211>7
<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>94Asn Asp Lys Ile His Thr Ala1 5<210>95<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>95Phe Glu Asp Phe Phe Ser Ala1 5<210>96<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>96Tyr Glu Trp Ala Glu Gln Ala1 5<210>97<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>97Thr His Val Tyr Phe Leu Ala
1 5<210>98<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(1)<223>在第1位的Xaa是Ser，Thr或Trp<400>98Xaa Asp Phe Ser Asp Ala1 5<210>99<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>99Tyr Arg Thr Pro Asn Glu Ala1 5<210>100<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(1)<223>在第1位的Xaa是Gly或Leu
<400>100Xaa Arg Ser Glu Thr Ala1 5<210>101<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>101Ile His Asn1<210>102<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>102Trp Glu Tyr1<210>103<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>103Asp Tyr Trp1<210>104<211>3<212>PRT
<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>104Trp Asp Trp1<210>105<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>105Trp Gln Asp1<210>106<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>106Tyr Phe Glu1<210>107<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>107Asn Tyr Glu1
<210>108<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>108Ser Tyr Ala1<210>109<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>109Trp Asp Leu1<210>110<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>110Trp Leu Glu1<210>111<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體
<400>111Val Gln Arg1<210>112<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>112Tyr Ile Asp1<210>113<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>113Arg Trp Asp1<210>114<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>114Asp Val Arg1<210>115<211>3
<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>115Trp Ser Asp1<210>116<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>116His Trp Asp1<210>117<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>117Trp Gln Asp1<210>118<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>118Trp Asp Asp
1<210>119<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>119Trp Glu Asp1<210>120<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>120Ile Thr Asn1<210>121<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>121Tyr Glu Asp1<210>122<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>122Arg Val Ala Asp Glu Glu Ala15<210>123<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>123Glu Tyr Tyr Val Asp Ala Ala1 5<210>124<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>124Trp Gln Asp Phe Asn Leu Ala1 5<210>125<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>125Tyr Asp Asn Pro Ile Asp Ala1 5<210>126
<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>126Tyr Phe Asn Glu His Glu Ala1 5<210>127<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>127Glu Trp Gly Ala Asp Gly Ala1 5<210>128<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>128Asp Val Ile Tyr Ser His Ala1 5<210>129<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>129
Trp His Ile Leu Glu Glu Ala1 5<210>130<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>130Asn Pro His Glu Asn Phe Ala15<210>131<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>131His Glu Asp Asn Gly Gly Ala1 5<210>132<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>132Ser Asp Ser Glu Gly Pro Ala1 5<210>133<211>7<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>133Glu Phe Gln Glu Phe Thr Ala1 5<210>134<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>134Gln Glu Gly Asp Glu Ile Ala1 5<210>135<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>135Asp Ile Tyr Ala Glu Thr Ala1 5<210>136<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>136Asp Arg Val Arg Glu Thr Ala1 5
<210>137<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>137Phe Glu Glu Pro Gln Trp Ala1 5<210>138<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>138Phe Glu Gly Glu Glu Phe Ala1 5<210>139<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(1)<223>在第1位的Xaa是Thr或Leu<400>139Xaa Phe Asn Ile His Ala1 5<210>140<211>3<212>PRT
<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>140Tyr Asp Trp1<210>141<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>141Asn Tyr Thr1<210>142<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>142Ser Tyr Thr1<210>143<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>143Trp Ala Asp1
<210>144<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>144Gln Trp Gly1<210>145<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>145Trp Gly Asp1<210>146<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>146Glu Tyr Phe1<210>147<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體
<400>147Trp Glu His1<210>148<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>148Leu Tyr Asp1<210>149<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>149Asp Tyr Tyr1<210>150<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>150Phe Tyr Glu1<210>151<211>3
<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>151Glu Tyr Tyr1<210>152<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>152Tyr Asp Tyr1<210>153<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>153Trp Asp His1<210>154<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)<223>在第4位的Xaa是2-萘基丙氨酸<400>154Arg Glu Ser Xaa Asn Val Ala1 5<210>155<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(3)..(3)<223>在第3位的Xaa是2-萘基丙氨酸<400>155Glu Ser Xaa Pro Arg Gln Ala1 5<210>156<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>156Val Ala Arg Glu Asn Ile Ala1 5<210>157<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體
<400>157Arg Trp Glu Arg Glu Asp Ala1 5<210>158<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>158Glu Trp Trp Glu Thr Val1 5<210>159<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>159Ser Val Tyr Gln Leu Asp Ala1 5<210>160<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(1)<223>在第1位的Xaa是2-萘基丙氨酸<400>160Xaa His Glu Phe Tyr Gly Ala
1 5<210>161<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(3)..(3)<223>在第3位的Xaa是2-萘基丙氨酸<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(4)..(4)<223>在第4位的Xaa是2-萘基丙氨酸<400>161His Glu Xaa Xaa Leu Val Ala1 5<210>162<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(2)..(2)<223>在第2位的Xaa是2-萘基丙氨酸<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(6)..(6)<223>在第6位的Xaa是2-萘基丙氨酸<400>162Ala Xaa Val Pro Val Xaa Ala1 5
<210>163<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>163Tyr Phe Asp Tyr Trp Leu Ala1 5<210>164<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(3)..(3)<223>在第3位的Xaa是2-萘基丙氨酸<400>164Phe Glu Xaa His Arg Gln Ala1 5<210>165<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>165Trp Arg His Glu Pro Ala Ala1 5<210>166
<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(3)..(3)<223>在第3位的Xaa是2-萘基丙氨酸<400>166ser ser Xaa Lys Lys Asp Ala1 5<210>167<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(2)..(2)<223>在第2位的Xaa是2-萘基丙氨酸<400>167Arg Xaa Asp Lys Glu Ala Ala1 5<210>168<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(1)
<223>在第1位的Xaa是2-萘基丙氨酸<400>168Xaa His Glu Ile Phe Pro Ala1 5<210>169<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>169Lys Trp Tyr His His Arg Ala1 5<210>170<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>170His Trp Trp Pro His Asn Ala1 5<210>171<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>171His Trp Gln Val Phe Tyr Ala1 5<210>172
<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(4)..(4)<223>在第4位的Xaa是2-萘基丙氨酸<400>172Phe His Glu Xaa Glu Ile Ala1 5<210>173<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(5)..(5)<223>在第5位的Xaa是2-萘基丙氨酸<400>173His Ala Asp Phe Xaa Gln Ala1 5<210>174<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>174Ala Leu His Phe Glu Thr Ala1 5
<210>175<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>175Asp Asp Pro Thr Gly Phe Ala1 5<210>176<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>176Val Ala Pro Gly Leu Gly Ala1 5<210>177<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>177Ile Phe Arg Leu Ile Glu Ala1 5<210>178<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體
<400>178Gly Leu Glu Arg Pro Glu Ala1 5<210>179<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>179Ile Val Val Arg Leu Trp Ala1 5<210>180<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>180Trp His Asn Pro His Tyr Ala1 5<210>181<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>181Leu Ile Tyr Lys Ser Asp Ala1 5<210>182<211>7
<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>182Glu Lys Pro Ile Phe Asn Ala1 5<210>183<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>183His Trp Ser Glu Pro Ala Ala1 5<210>184<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>184Gly His Asn Trp Lys Glu Ala1 5<210>185<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>185Tyr Trp His His Asp Asp Ala
1 5<210>186<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>186Gly Tyr Pro Lys Glu Asn Ala1 5<210>187<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>187Pro Val Tyr Trp Leu Tyr Ala1 5<210>188<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>188Phe Gly Glu His Thr Pro Ala1 5<210>189<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>189Phe Gln Gly Thr Arg Glu Ala1 5<210>190<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>190Thr Gly Thr Asn Arg Tyr Ala1 5<210>191<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>191Lys Trp Ala Thr Arg Tyr Ala1 5<210>192<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>192Asn Ser Thr Lys Phe Asp Ala1 5<210>193
<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>193Leu Ile Tyr Lys Glu Glu Ala1 5<210>194<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>194Glu His Ala Thr Tyr Arg Ala1 5<210>195<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>195His Asn Asp1<210>196<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>196
His Glu Arg1<210>197<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>197His Gly Asp1<210>198<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>198His Ser Asp1<210>199<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>199His Phe Asp1<210>200<211>3<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>200Trp Asn Asp1<210>201<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>201Tyr Glu His1<210>202<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>202His Trp Asp1<210>203<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>203Tyr His Asp1
<210>204<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>204Tyr Asp Trp1<210>205<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>205Trp Asp Tyr1<210>206<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>206His Tyr Asp1<2l0>207<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>207
His Trp Asp1<210>208<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>208Trp Thr Asp1<210>209<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>209Phe Pro Lys1<210>210<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>210His Trp Lys1<210>211<211>3<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>211Trp Glu Glu1<210>212<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>212Leu Leu Arg1<210>213<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>213Ser Tyr Phe1<210>214<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>214Glu Tyr Tyr1
<210>215<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>215Asp Arg Asp Leu Thr Phe Ala1 5<210>216<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>216His Asn Trp Trp Ile Ile Ala1 5<210>217<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>217Glu Val Lys Ile Gly Asn Ala1 5<210>218<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體
<400>218Ser Ile Val1<210>219<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>219Ala Tyr Pro1<210>220<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>220Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln1 5<210>221<211>5<212>PRT<213>prion sp.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(4)..(4)<223>在第4位的Xaa是Gly，Pro或Asn<400>221Arg Tyr Pro Xaa Gln1 5
<210>222<211>6<212>PRT<213>prion sp.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(1)<223>在第1位的Xaa是任何氨基酸<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(2)..(2)<223>在第2位的Xaa是任何氨基酸<220>
<221>MISC_FEADRE<222>(5)..(5)<223>在第5位的Xaa是Arg或Gln<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(6)..(6)<223>在第6位的Xaa是任何氨基酸<400>222Xaa Xaa Tyr Tyr Xaa Xaa15<210>223<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(1)<223>在第1位的Xaa是Phe，Trp或Tyr<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(2)..(2)<223>在第2位的Xaa是任何氨基酸
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(3)..(3)<223>在第3位的Xaa是Asp或Glu<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(4)..(4)<223>在第4位的Xaa是Phe，Trp或Tyr<400>223Xaa Xaa Xaa Xaa1<210>224<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(1)<223>在第1位的Xaa是Phe，Trp或Tyr<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(2)..(2)<223>在第2位的Xaa是Asp或Glu<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(3)..(3)<223>在第3位的Xaa是任何氨基酸<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(4)..(4)<223>在第4位的Xaa是Phe，Trp或Tyr<400>224Xaa Xaa Xaa Xaa1
<210>225<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<400>225Trp Phe Val Glu Ala1 5<210>226<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>朊病毒結(jié)合配體<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(4)..(4)<223>Xaa＝2-萘基丙氨酸<400>226Asp Glu Ser Xaa Pro Arg Gln1 權(quán)利要求
1.一種朊病毒結(jié)合配基，其中該配基能與具有氨基酸序列RYPxQ(SEQ ID NO221)的肽結(jié)合，其中x是G，P或N，或其中該配基可結(jié)合具有氨基酸序列xxYYux(SEQ ID NO222)的肽，其中x是任何氨基酸并且u是R或Q。
2.權(quán)利要求1的配基，其中所述配基能結(jié)合具有選自RYPGQ(SEQID NO1)，DRYYRD(SEQ ID NO2)，QAYYQR(SEQ ID NO3)，和QVYYRP(SEQ ID NO4)中的氨基酸序列的肽。
3.權(quán)利要求1的配基，其中所述配基具有低于大約6kDa的分子量。
4.權(quán)利要求3的配基，其中所述配基是具有由6個氨基酸組成的氨基酸序列的肽。
5.權(quán)利要求4的配基，其中所述配基能結(jié)合具有氨基酸序列DRYYRD(SEQ ID NO2)的肽，并且其中配基氨基酸序列包含賴氨酸(K)或組氨酸(H)。
6.權(quán)利要求4的配基，其中所述配基能結(jié)合具有氨基酸序列QAYYQR(SEQ ID NO3)的肽，并且其中配基氨基酸序列包含組氨酸(H)，該配基在pH7具有凈正電荷。
7.權(quán)利要求1的配基，其中所述配基能結(jié)合具有氨基酸序列QVYYRP(SEQ ID NO4)的肽，并且該配基是具有包含氨基酸序列LL，LI，VL，或II的氨基酸序列的肽。
8.權(quán)利要求1的配基，其中所述配基能結(jié)合具有氨基酸序列QVYYRP(SEQ ID NO4)的肽，并且該配基是具有包含芳香族氨基酸的氨基酸序列的肽，其中該配基是中性帶電的。
9.權(quán)利要求1的配基，其中所述配基能結(jié)合具有氨基酸序列RYPGQ(SEQ ID NO1)的肽，并且該配基是具有選自SEQ ID NOS5-13中的氨基酸序列的肽。
10.權(quán)利要求1的配基，其中所述配基能結(jié)合具有氨基酸序列DRYYRD(SEQ ID NO2)的肽，并且該配基是具有選自SEQ ID NOS14-22中的氨基酸序列的肽。
11.權(quán)利要求1的配基，其中所述配基能結(jié)合具有氨基酸序列QAYYQR(SEQ ID NO3)的肽，并且該配基是具有選自SEQ ID NOS23-31中的氨基酸序列的肽。
12.權(quán)利要求1的配基，其中所述配基能結(jié)合具有氨基酸序列QVYYRP(SEQ ID NO4)的肽，并且該配基是具有選自SEQ ID NOS31-47中的氨基酸序列的肽。
13.一種朊病毒結(jié)合配基，其中所述配基能結(jié)合朊病毒蛋白的天然形式(PrPc)，并且是具有選自SEQ ID NOS48-100和SEQ ID NOS116-139中的氨基酸序列的肽。
14.權(quán)利要求13的配基，其中所述配基能結(jié)合感染人的天然朊病毒蛋白(huPrPc)，并且具有選自SEQ ID NOS116-139中的氨基酸序列。
15.一種朊病毒結(jié)合配基，其中所述配基能結(jié)合朊病毒蛋白的天然形式(PrPc)和朊病毒蛋白的構(gòu)象改變形式(PrPsc)，并且是具有選自SEQ ID NOS52，54，101-115和154-173中的氨基酸序列的肽。
16.權(quán)利要求15的配基，其中所述配基能結(jié)合人朊病毒蛋白的天然形式(huPrPc)和人朊病毒蛋白的構(gòu)象改變形式(huPrPsc)，并且是具有選自SEQ ID NOS154-173中的氨基酸序列的肽。
17.一種朊病毒結(jié)合配基，其中所述配基能結(jié)合通過重組技術(shù)表達(dá)的朊病毒蛋白(PrPr)，并且該配基是具有選自SEQ ID NOS54，105和140-153中的氨基酸序列的肽。
18.一種朊病毒結(jié)合配基，其中所述配基能結(jié)合朊病毒蛋白的構(gòu)象改變形式(PrPsc)，并且該配基是具有選自SEQ ID NOS174-194，147，152，206，213和214中的氨基酸序列的肽。
19.一種朊病毒結(jié)合配基，其中所述配基能結(jié)合朊病毒蛋白的天然形式(PrPr)或經(jīng)蛋白酶K處理過的朊病毒蛋白的構(gòu)象改變形式(PrPsc)，并且該配基是具有選自SEQ ID NOS195-212中的氨基酸序列的肽。
20.一種檢測樣品中朊病毒蛋白的方法，包括在足以導(dǎo)致在朊病毒蛋白，其片段，或者其衍生肽與配基之間形成復(fù)合體的條件下，將樣品與能結(jié)合一種或多種朊病毒蛋白、其片段或者其衍生肽的配基相接觸；以及檢測樣品中的復(fù)合體。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述樣品是生物學(xué)樣品。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述生物學(xué)樣品選自全血、白細(xì)胞、單核細(xì)胞、血小板濃縮物、血液、血漿、血清、腦脊液、尿液、唾液、乳汁、導(dǎo)管流體、眼淚、精液、糞便、扁桃體、淋巴結(jié)、膠原、腦提取物和腺體提取物。
23.權(quán)利要求21的方法，其中在接觸樣品前將配基附著到固體支持物上。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述固體支持物選自膜和樹脂。
25.權(quán)利要求23的方法，其中所述固體支持物是選自聚甲基丙烯酸酯、瓊脂糖、瓊脂糖凝膠、交聯(lián)瓊脂糖、復(fù)合交聯(lián)多糖、硅藻土、聚乙烯基D、丙烯酸酯氟化物、聚苯乙烯和纖維素中的樹脂。
26.權(quán)利要求23的方法，其中所述固體支持物是聚甲基丙烯酸酯樹脂。
27.權(quán)利要求23的方法，其中所述固體支持物是選自尼龍和纖維素的膜。
28.一種從樣品中除去朊病毒蛋白的方法，包括在足以導(dǎo)致在朊病毒蛋白和配基之間形成復(fù)合體的條件下，將樣品與能結(jié)合衍生自朊病毒蛋白的一種或多種肽或者多肽相接觸，其中所述朊病毒蛋白選自PrPc，PrPsc和PrPr；以及從樣品中除去復(fù)合體。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述樣品是生物學(xué)樣品。
30.權(quán)利要求28的方法，其中所述生物學(xué)樣品選自全血、白細(xì)胞、單核細(xì)胞、血小板濃縮物、血液、血漿、血清、腦脊液、尿液、唾液、乳汁、導(dǎo)管流體、眼淚、精液、糞便、扁桃體、淋巴結(jié)、膠原、腦提取物和腺體提取物。
31.權(quán)利要求28的方法，其中在與樣品接觸前將配基附著到固體支持物上。
32.權(quán)利要求28的方法，其中所述固體支持物選自膜和樹脂。
33.權(quán)利要求28的方法，其中所述固體支持物是選自聚甲基丙烯酸酯、瓊脂糖、瓊脂糖凝膠、交聯(lián)瓊脂糖、復(fù)合交聯(lián)多糖、硅藻土、聚乙烯基D、丙烯酸酯氟化物、聚苯乙烯和纖維素中的樹脂。
34.權(quán)利要求28的方法，其中所述固體支持物是聚甲基丙烯酸酯樹脂。
35.權(quán)利要求28的方法，其中所述固體支持物是選自尼龍和纖維素的膜。
36.用于結(jié)合朊病毒蛋白的組合物，其中包含能結(jié)合一種或多種朊病毒肽的配基；以及固體支持物，其中所述配基附著到所述固體支持物上。
37.權(quán)利要求36的組合物，其中所述固體支持物選自膜和樹脂。
全文摘要
本發(fā)明提供了結(jié)合朊病毒蛋白的配基以及使用該配基檢測或除去樣品、如生物學(xué)流體或環(huán)境樣品中朊病毒蛋白的方法。配基能夠結(jié)合一種或多種形式的朊病毒蛋白，包括細(xì)胞朊病毒蛋白(PrPc)，感染性朊病毒蛋白(PrPsc)和重組朊病毒蛋白(PrPr)。配基結(jié)合各種物種、包括人和倉鼠的朊病毒。也提供了一種治療受試者中朊病毒相關(guān)病理或延緩其進(jìn)展的方法。
文檔編號C07K16/00GK1739029SQ200380109043
公開日2006年2月22日 申請日期2003年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月3日
發(fā)明者D·J·哈蒙德, J·T·萊斯羅普, L·切爾維納科娃, R·G·卡博內(nèi)爾 申請人:美國國家紅十字會, 北卡羅來納州大學(xué)