專利名稱：核苷酸衍生物和dna微陣列的制作方法
技術領域：
本申請發(fā)明涉及用于確定核苷酸序列中的特定堿基種類的核苷酸衍生物，以及具有含有該核苷酸衍生物的捕獲探針的DNA微陣列。
背景技術：
隨著迎來后基因組時代，要求能夠正確、有效、進而以低成本檢測核苷酸序列中的堿基種類的新技術。例如，SNP(Single Nucleotide Polymorphism單核苷酸多態(tài)性)是在人類基因組中以約0.1％(約1000堿基單核苷酸)的比例存在的頻率最高的多態(tài)性，已越來越明確，其有無狀態(tài)還會影響各種疾病(如與肺癌有關的p53基因的SNP非專利文獻1)，從而以診斷和遺傳治療法等為目的，正確判斷SNP的有無的技術(SNP分型)也就變得越來越重要。
作為SNP分型方法，已知有“利用雜交效率的方法”、“利用酶識別效率的方法”、“利用電氣性技術的方法”等，尤其是利用雜交效率的方法，正在被多方面研究應用于DNA微陣列(如參照專利文獻1～4、非專利文獻2、3)，如在非專利文獻4中報道了使用DNA微陣列(微陣列)的BRCAI基因SNP的檢測例。
但是，以往DNA微陣列不僅只限于檢測SNP，而且通常是由熒光等標記目標核苷酸序列，用熒光信號作為指標來檢測與微陣列的捕獲探針雜交的目標核苷酸序列。因此，如調制目標核苷酸序列時，使用采用了標記dNTP的PCR擴增等方法，但這會需要過多的勞力、時間和費用。另外，檢測SNP等時，一般采用把雜交探針和目標核苷酸序列時的熔解溫度作為指標的方法，但此時，需要把雜交的嚴格度(stringency)條件對應每個單個目標核苷酸序列進行嚴格地設定，并且即使是如此設定條件，也會存在無法避免錯誤雜交等引起的測定誤差的不良情況。
另一方面，已知有在天然的核酸堿基上連接熒光分子而得的熒光修飾核酸堿基，如在非專利文獻5中提出了利用根據所雜交的對鏈的情況而變化熒光信號強度的熒光探針的方法。
專利文獻1美國專利第5,474,796號說明書專利文獻2美國專利第5,605,662號說明書專利文獻3國際公開第95/251116號小冊子專利文獻4國際公開第95/35505號小冊子非專利文獻1Biros et al.Neoplasma 48(5)407-11，2001非專利文獻2Schena，M.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.9310614-10619，1996非專利文獻3Heller，R.A.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 942155，1997非專利文獻4Hacia JG et al.Nat.Genet.14441-447，1996非專利文獻5Nucleic Acids Res.30e97，2002發(fā)明內容如上所述，為了確定SNP檢測等中的堿基種類，尤其是考慮應用DNA微陣列時，需要一種不需要用熒光等標記目標核苷酸序列，并且不依賴于熔解溫度測定等間接性指標的新的方法。從這種觀點來看，使用熒光修飾核酸堿基的探針(如非專利文獻5)，可以把探針側的熒光信號變化作為指標而直接確定堿基種類，從這方面來說是有效的方法。其中，該非專利文獻5的情況下，把與熒光修飾核酸堿基配對的堿基種類的周邊環(huán)境(特定的堿基序列等)所對應的熒光信號作為指標，并非根據單堿基的種類而變化熒光信號。
本申請發(fā)明就是鑒于如上所述的問題而進行的，其課題為提供能夠根據雜交的對方鏈的相應堿基種類而變化熒光信號強度的新的核苷酸衍生物。
另外，本申請發(fā)明的課題為提供使用所述核苷酸衍生物的堿基種類的確定方法、及以該方法為測定原理的DNA微陣列。
本申請的第一個發(fā)明是，在嘧啶堿基或嘌呤堿基上經接頭(linker)連接了熒光色素嵌入劑而成的核苷酸衍生物，其特征為，作為單鏈核苷酸序列的成員存在，當該單鏈核苷酸序列的雜交對方鏈的相應堿基為，(1)腺嘌呤時，是熒光色素發(fā)光最強的胸腺嘧啶/尿嘧啶衍生物；(2)鳥嘌呤時，是熒光色素發(fā)光最強的胞嘧啶衍生物；
(3)胞嘧啶時，是熒光色素發(fā)光最強的腺嘌呤衍生物；或者(4)胞嘧啶或胸腺嘧啶/尿嘧啶時，是熒光色素發(fā)光最強的鳥嘌呤衍生物。
該第一個發(fā)明中，“核苷酸衍生物”是，在核苷酸，即嘌呤或嘧啶與糖進行β-N-糖苷結合而得的核苷的磷酸酯(ATP、GTP、CTP、UTP；或dATP、dGTP、dCTP、dTTP)的任意位置，經亞烷基鏈連接熒光色素嵌入劑而成的化合物。另外，該核苷酸衍生物“作為單鏈核苷酸序列的成員存在”是指，在3個核苷酸或其以上的核苷酸序列中的非端部位置，核苷酸衍生物與其左右的核苷酸形成磷酸二酯鍵的狀態(tài)。進而，“熒光色素發(fā)光最強”是指，例如用熒光分光光度計測定時，如胸腺嘧啶/尿嘧啶衍生物時，與對應的堿基種類為鳥嘌呤、胞嘧啶及胸腺嘧啶/尿嘧啶時相比，對應的堿基種類為腺嘌呤時可以得到更強的熒光信號強度。
另外，在以下說明中有時只用“尿嘧啶(U)”或“胸腺嘧啶(T)”來記載“胸腺嘧啶/尿嘧啶”。
該第一個發(fā)明的具體例是由以下通式(1)表示的胸腺嘧啶衍生物 由以下通式(2)表示的胞嘧啶衍生物
由以下通式(3)表示的腺嘌呤衍生物 以及，由以下通式(4)表示的鳥嘌呤衍生物
并且，本申請的第二個發(fā)明是所述各核苷酸衍生物的前體物質的具體例，分別為如下的核苷衍生物。
是胸腺嘧啶/尿嘧啶衍生物的前體物質，且由以下通式(5)表示的核苷衍生物。

是胞嘧啶衍生物的前體物質，且由以下通式(6)表示的核苷衍生物。
是腺嘌呤衍生物的前體物質，且由以下通式(7)表示的核苷衍生物。
是鳥嘌呤衍生物的前體物質，且由以下通式(8)表示的核苷衍生物。
上述通式(1)～(8)中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9相同或不同，表示氫原子或取代基，R10是氫原子或羥基，X是從亞氨基(NH)、氧基(O)、硫基(S)、亞甲基(CH2)及烷基氨基中選出的連接基團，整數n表示亞烷基鏈長度，當X為亞甲基或烷基氨基時，是0～5，當X為亞氨基、氧基或硫基時，是1～5。
本申請的第三個發(fā)明是，將所述第一個發(fā)明的核苷酸衍生物(1)～(4)中的一個或其以上作為成員而具有的單鏈核苷酸序列。
該第三個發(fā)明的單鏈核苷酸序列中，可以是任一種核苷酸衍生物存在多個，也可以是兩種或其以上的核苷酸衍生物各自存在一個，或者各自存在多個。其中，如上所述，該單鏈核苷酸序列中，核苷酸衍生物不存在于序列的端部。
本申請的第四個發(fā)明是，確定所述第三個發(fā)明的單鏈核苷酸序列的雜交對方鏈的單堿基X的方法，是確定下述情況中的堿基種類的方法(i)單鏈核苷序列中的胸腺嘧啶衍生物(1)的熒光色素發(fā)光最強時，則確定堿基X為腺嘌呤；(ii)單鏈核苷序列中的胞嘧啶衍生物(2)的熒光色素發(fā)光最強時，則確定堿基X為鳥嘌呤；(iii)單鏈核苷序列中的腺嘌呤衍生物(3)的熒光色素發(fā)光最強時，則確定堿基X為胞嘧啶；(iv)單鏈核苷序列中的鳥嘌呤衍生物(4)的熒光色素發(fā)光最強時，則確定堿基X為胞嘧啶或胸腺嘧啶。
該第四個發(fā)明的方法的優(yōu)選方案為，把在同一位置分別具有腺嘌呤衍生物(3)和鳥嘌呤衍生物(4)的兩條單鏈核苷酸序列分別與相同互補鏈雜交，進行如下確定(v)腺嘌呤衍生物(3)和鳥嘌呤衍生物(4)雙方的熒光色素發(fā)光最強時，則確定互補鏈的堿基X為胞嘧啶；(vi)只是鳥嘌呤衍生物(4)的熒光色素發(fā)光最強時，則確定互補鏈的堿基種類X為胸腺嘧啶。
第四個發(fā)明的所述方案中，“兩條單鏈核苷酸序列”是指除了核苷酸衍生物(3)(4)以外由完全相同的堿基序列構成的兩條單鏈核苷酸序列。
本申請的第五個發(fā)明是把所述第二個發(fā)明的單鏈核苷酸序列作為捕獲探針的DNA微陣列。
所述第五個發(fā)明的DNA微陣列的一個方案如下其是檢測目標核苷酸序列的單核苷酸多態(tài)性(SNP)的DNA微陣列，捕獲探針的組與目標核苷酸序列的至少含有SNP核苷酸的區(qū)段互補，各個捕獲探針是，其對應于目標核苷酸序列的SNP核苷酸的部位的核苷酸各自為核苷酸衍生物(1)～(4)。
所述第五個發(fā)明的DNA微陣列的另一個方案如下其是確定序列未知的n(n＝3～100)個核苷酸序列的DNA微陣列，捕獲探針是核苷酸序列完全不同的至少4n個探針的組，各捕獲探針從第1位到第n位的至少一個為核苷酸衍生物(1)～(4)。
所述第五個發(fā)明的DNA微陣列的再一個方案如下其是檢測目標核苷酸序列中是否存在與由n(n＝3～100)個核苷酸構成的已知序列區(qū)段相同區(qū)段的DNA微陣列，捕獲探針組與目標核苷酸序列中的已知序列區(qū)段互補，各個捕獲探針從第1位到第n位的至少一個為核苷酸衍生物(1)～(4)。
所述第五個發(fā)明的DNA微陣列的又一個方案如下其是確定具有由n(n＝3～100)個核苷酸構成的未知序列區(qū)段和已知序列區(qū)段的目標核苷酸序列的未知序列區(qū)段的序列的DNA微陣列，捕獲探針組是具有對應于目標核苷酸序列中的已知序列區(qū)段的互補序列和核苷酸序列完全不同的探針序列區(qū)段的至少4n個探針的組，各探針序列區(qū)段從第1位到第n位的至少一個為核苷酸衍生物(1)～(4)。
本申請各發(fā)明中的具體構成、用語和概念將在發(fā)明的實施方式的說明和實施例中進行詳細的規(guī)定。另外，為了實施該發(fā)明而使用的各種技術，除了特別指出其出處的技術以外，都是基于公知的文獻等，只要是本行業(yè)熟練人員都可以容易且確實地實施。例如，基因工學和分子生物學技術在Sambrookand Maniatis，in Molecular Cloning-A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York，1989；Ausubel，F.M.et al.，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons，New York，N.Y，1995等中有記載。
發(fā)明效果根據所述的第一個發(fā)明，提供對應于雜交的對方鏈的相應堿基種類而變化熒光信號強度的新的核苷酸衍生物。不需要目標核苷酸序列的標記操作，并且不用依賴于熔解溫度測定等間接性指標，通過直接測定捕獲探針發(fā)出的熒光強度就可以測定目標核苷酸序列的特定堿基種類。并且，本發(fā)明的核苷酸衍生物不是以基于于堿基的周邊環(huán)境(特定的堿基序列等)的熒光信號為指標，而只是基于配對的堿基種類而變化熒光信號，因此不管目標序列為何種序列都可以應用。
根據所述的第二個發(fā)明，提供所述第一個發(fā)明的核苷酸衍生物的前體即核苷衍生物。通過使用該核苷衍生物，可以容易地制成所述第一個發(fā)明的核苷酸衍生物。
根據所述的第三個發(fā)明，提供具有所述第一個發(fā)明的核苷酸衍生物的單鏈核苷酸序列，通過把該核苷酸序列作為探針，可以確定目標核苷酸序列中的未知堿基的堿基。
根據所述的第四個發(fā)明，提供通過把所述第三個發(fā)明的單鏈核苷酸序列用作探針，確定目標核苷酸序列中的未知堿基的堿基種類的方法。該方法可以把探針的熒光強度作為指標而簡便確實地確定未知堿基種類。
根據所述的第五個發(fā)明，提供把所述第三個發(fā)明的單鏈核苷酸序列作為捕獲探針的DNA微陣列。由此，可以把捕獲探針的熒光強度作為指標而簡便確實地確定目標核苷酸序列的單核苷酸多態(tài)性(SNP)、序列未知的核苷酸序列的序列、目標核苷酸序列中是否存在與已知序列區(qū)段相同的區(qū)段等。


圖1表示分別使在第3位具有核苷酸衍生物的探針序列與在第3位含有未知堿基X的目標核苷酸序列雜交來確定堿基X的例子。由于具有T衍生物的探針序列發(fā)出最強的熒光信號，所以可以確定目標核苷酸序列的未知堿基X是腺嘌呤。
圖2表示，分別使在第3位具有A衍生物及G衍生物的探針序列與在第3位含有未知堿基X的目標核苷酸序列雜交，來確定堿基X的例子。由于在上部是具有A衍生物及G衍生物的探針序列發(fā)出最強的熒光信號，所以可以確定目標核苷酸序列的未知堿基X是胞嘧啶。由于在下部是具有G衍生物的探針序列發(fā)出最強的熒光信號，所以可以確定目標核苷酸序列的未知堿基X是胸腺嘧啶。
圖3表示，分別使在第4位具有核苷酸衍生物的探針序列與在第4位含有G/A多態(tài)性的雙鏈核苷酸序列雜交，來確定G/A多態(tài)性的例子。在上部表示的G/G純合時，在該位置含有C衍生物的探針發(fā)出最強的熒光信號，在中部表示的G/A雜合時，則含有C衍生物的探針和含有T衍生物的探針發(fā)出最強的熒光信號，在下部表示的A/A純合時，從含有T衍生物的捕獲探針得到強信號。
圖4表示確定序列未知的6-mer寡核苷酸(NNNNNN)的堿基序列的例子。對于第1位的X，從在該位置含有T衍生物的捕獲探針得到強信號，由此可以確定該寡核苷酸的第1位X是與胸腺嘧啶(T)互補結合的腺嘌呤(A)。同樣地通過研究第2～6位，從而確定該6-mer寡核苷酸是由AGGCGA構成的序列。
圖5表示目標核苷酸序列對于目的已知序列區(qū)段有一部分不一致時，確定其不一致堿基的例子。在第3位具有T衍生物的探針和在第6位具有C衍生物的探針各自發(fā)出強信號，從而可以知道目標核苷酸序列的第3位被A取代，第6位被G取代。
圖6是本發(fā)明的核苷酸衍生物的一例(PyU(5)、PyC(5))的合成工序。Py是1-芘基、DMTr是4，4’-二甲氧基三苯甲基。
圖7是本發(fā)明的核苷酸衍生物的一例(PyA(7))的合成工序。Py是1-芘基、DMTr是4，4’-二甲氧基三苯甲基。
圖8是本發(fā)明的核苷酸衍生物的一例(PyG(8))的合成工序。
圖9表示熒光光譜，含有核苷酸衍生物PyC(5)的寡脫氧核糖核苷酸，當互補鏈上與PyC(5)配對的核苷酸為脫氧鳥苷酸(G)時發(fā)出強發(fā)光信號。
圖10表示另一熒光光譜，含有核苷酸衍生物PyC(5)的寡脫氧核糖核苷酸，當互補鏈上與PyC(5)配對的核苷酸為脫氧鳥苷酸(G)時發(fā)出強發(fā)光信號。
圖11表示熒光光譜，含有核苷酸衍生物PyU(5)的寡脫氧核糖核苷酸，當互補鏈上與PyU(5)配對的核苷酸為脫氧鳥苷酸(A)時發(fā)出強發(fā)光信號。
圖12是圖11所表示結果的熒光照片圖像。
圖13表示熒光光譜，含有核苷酸衍生物PyU(5)的寡脫氧核糖核苷酸，當互補鏈上與PyU(5)配對的核苷酸為脫氧鳥苷酸(A)時發(fā)出強發(fā)光信號。
圖14表示熒光光譜，含有核苷酸衍生物PyA(7)的寡脫氧核糖核苷酸，當互補鏈上與PyA(7)配對的核苷酸為脫氧胞苷酸(C)時發(fā)出強發(fā)光信號。
圖15表示熒光光譜，含有核苷酸衍生物PyG(8)的寡脫氧核糖核苷酸，當互補鏈上與PyG(8)配對的核苷酸為脫氧胞苷酸(C)時和脫氧胸腺酸(T)時發(fā)出強發(fā)光信號。
具體實施例方式
第一個發(fā)明是，在嘧啶堿基或嘌呤堿基上經接頭連接了熒光色素嵌入劑而成的核苷酸衍生物，其特征為，作為單鏈核苷酸序列的成員存在，可以識別該單鏈核苷酸序列雜交的對方鏈的相應特定堿基，發(fā)出比其他堿基種類相對較強的熒光信號。具體講是，(1)識別腺嘌呤(A)的胸腺嘧啶(T)衍生物；(2)識別鳥嘌呤(G)的胞嘧啶(C)衍生物；(3)識別胞嘧啶(C)的腺嘌呤(A)衍生物；以及
(4)識別胞嘧啶(C)或胸腺嘧啶(T)的鳥嘌呤(G)衍生物。
“熒光色素嵌入劑”是能夠插入到雙鏈核苷酸序列的相鄰核苷酸對之間的物質，同時也是發(fā)出熒光的物質。作為這種物質，可以使用發(fā)出熒光信號、且產生嵌入作用的芘(1-芘基)等?；蛘咭部梢允褂迷诠那度雱┥辖Y合同樣公知的熒光物質而成的物質。作為嵌入劑，可以使用如吖啶橙、普魯黃素、溴化乙錠、放線菌素D等芳香族色素分子。另外，作為熒光物質，可以使用如熒光素異硫氰酸酯(FITC)、羅丹明衍生物(如羅丹明B異硫氰酸酯、四甲基羅丹明異硫氰酸酯(RITC)、四甲基羅丹明異硫氰酸酯異構體R)等。另外，嵌入劑和熒光物質的結合是，可以利用硫醇基和馬來酰亞胺基的反應、吡啶二硫化物和硫醇基的反應、氨基和醛基的反應等，可以從公知的方法或本領域技術人員容易實施的方法、進而它們經修飾后的方法中適當選擇應用。
用于在嘧啶堿基或嘌呤堿基上連接嵌入劑的“接頭”可以使用如碳鏈或聚合物等。進而，經過接頭連接嵌入劑的嘧啶堿基或嘌呤堿基的位置，可以從各自的非取代碳位置任意選擇使用。即，嘧啶堿基時，為第4位或第5位，嘌呤堿基時，為第7位或第8位。
這種核苷酸衍生物，更具體地講，可以各自用前述通式(1)～(4)各自表示。即，式(1)是嘧啶堿基第5位取代的T衍生物、式(2)是嘧啶堿基第5位取代的C衍生物、式(3)是嘌呤堿基第7位取代的A衍生物、式(4)是嘌呤堿基第8位取代的G衍生物。在以下敘述中，用芘(Py)作為熒光色素嵌入劑時，這些核苷酸衍生物有時會各自被記載為PyU(5)、PyC(5)、PyA(7)、PyG(8)。
這些核苷酸衍生物可以使用嘧啶堿基或嘌呤堿基、接頭、及適宜的熒光色素嵌入劑，由例如后述實施例中記載的方法合成。另外，所述通式(1)～(4)中表示的核苷酸衍生物的情況下，可以通過前述通式(5)～(8)表示的核苷衍生物作為前體，來容易地制作。
另外，通式(1)～(8)中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9相同或不同，表示氫原子或取代基，R10是氫原子或羥基，X是從亞氨基(NH)、氧基(O)、硫基(S)、亞甲基(CH2)及烷基氨基中選出的連接基團，表示亞烷基鏈長度的整數n，當X為亞甲基或烷基氨基時，是0～5，當X為亞氨基、氧基或硫基時，是1～5。其中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9的取代基是鹵原子、含氧基、含氮基、含硫基、及含有這些原子或取代基的烴基或雜環(huán)基等。更詳細地說，取代基是鹵原子、烷氧基、酯基、氨基、取代氨基、硝基、酰胺基、氰基、氨基甲酸酯基、脲基、硫醇基、硫醚基、硫酯基等。另外，也可以是R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7及R8并非同時為氫原子，可以是R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9中彼此相鄰基團結合而形成苯基，該苯基可以具有取代基。
第3個發(fā)明的單鏈核苷酸序列是具有一個或多個前述核苷酸衍生物的3～200個、優(yōu)選是10～100個核苷酸的序列(寡核苷酸、或者核苷酸片段)。這種單鏈核苷酸序列可以采用如Carruthers(1982)Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.47411-418；Adams(1983)J.Am.Chem.Soc.105661；Belousov(1997)Nucleic Acid Res.253440-3444；Frenkel(1995)Free Radic.Biol.Med.19373-380；Blommers(1994)Biochemistry 337886-7896；Narang(1979)Meth.Enzymol.6890；Brown(1979)Meth.Enzymol.68109；Beaucage(1981)Tetra.Lett.221859；美國專利第4,458,066號中記載的眾所周知的化學合成技術，在在試管中合成。另外，也可以使用DNA合成裝置自動合成。
通過利用以上的單鏈核苷酸序列，可以實施本申請的第四個發(fā)明的堿基種類確定方法。
該第四個發(fā)明是，使含有未知堿基X的目標核苷酸序列和、在與堿基X相同的位置具有核苷酸衍生物的第三個發(fā)明的單鏈核苷酸序列(以下有時也記載為“探針序列”)進行雜交，當核苷酸衍生物(1)～(4)的各自熒光色素發(fā)出最強熒光信號時，如下確定堿基X(i)T衍生物的熒光色素發(fā)光最強時，為腺嘌呤；(ii)C衍生物的熒光色素發(fā)光最強時，為鳥嘌呤；(iii)A衍生物的熒光色素發(fā)光最強時，為胞嘧啶；(iv)G衍生物的熒光色素發(fā)光最強時，為胞嘧啶或胸腺嘧啶。
此時的“發(fā)光最強”是指，例如在觀察到，PyU(5)時與其他核苷酸相比為約大于等于3倍、PyC(5)時為大于等于1.5倍、PyA(7)時為大于等于2.5倍、PyG(8)時為大于等于2倍的發(fā)光信號的情況下，可以如上所述確定各自配對的堿基種類。
具體講，例如圖1所示的例子中，對于在第3位含有未知堿基X的目標核苷酸序列，準備各自在第3位具有A衍生物、T衍生物、G衍生物、C衍生物的探針序列，把各個探針序列雜交到目標核苷酸序列上，則由于具有T衍生物的探針序列發(fā)出最強的熒光信號，所以可以確認目標核苷酸序列的未知堿基X為腺嘌呤。
只是，所述第四個發(fā)明的方法中，A衍生物和G衍生物一同識別胞嘧啶，G衍生物分別識別胞嘧啶和胸腺嘧啶。因此，第四個發(fā)明的方法為，如在圖2所示，把在相同位置分別具有A衍生物和G衍生物的兩條單鏈核苷酸序列雜交到各自相同的對方鏈上，通過組合各自的熒光信號強度，如下確定堿基X。
(v)A衍生物和G衍生物雙方的熒光色素發(fā)光最強時，為胞嘧啶；(vi)只是G衍生物的熒光色素發(fā)光最強時，為胸腺嘧啶。
根據如上所述方法，可以檢測目標核苷酸序列的SNP、確定未知序列的序列、是否存在與已知序列區(qū)段相同的區(qū)段、或者確定已知序列區(qū)段內的未知序列等。這些可以作為使用所述探針序列的常規(guī)雜交分析來實施，尤其可以在把所述探針序列作為捕獲探針的DNA微陣列中實施。
第五個發(fā)明的DNA微陣列，除了把所述第三個發(fā)明的單鏈核苷酸序列作為捕獲探針以外，可以與通常的DNA微陣列同樣地制作。作為DNA微陣列的制作方法，已知有在固相載體表面直接合成捕獲探針的方法(在片法)、把預先制備的捕獲探針固定在固相載體表面的方法，但本發(fā)明的DNA微陣列優(yōu)選采用后一方法制作。就把預先制備的捕獲探針固定在固相載體表面的情況而言，合成引入了官能團的捕獲探針，在進行了表面處理的固相載體表面點印捕獲探針，進行共價結合(例如，Lamture，J.B.et al.Nucl.Acids Res.222121-2125，1994；Guo，Z.et al.Nucl.Acids Res.225456-5465，1994)。捕獲探針一般是在進行了表面處理的固相載體上經間隔子(spacer)或交聯劑進行共價結合。也已知有在玻璃表面排列聚丙烯酰胺凝膠的微小片，使其與捕獲探針進行共價結合的方法(Yershov，G. et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 944913，1996)。另外，也已知有在硅微陣列上制作微小電極陣列，在電極上設置含有鏈霉親和素的瓊脂糖的滲透層作為反應部位，通過使該部位呈正電荷，固定生物素化捕獲探針，控制部位的電荷，以進行高速而嚴格的雜交的方法(Sosnowski，R.G. et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 941119-1123，1997)。本發(fā)明的DNA微陣列可以用以上的任意方法制作。
另外，該DNA微陣列和目標核苷酸序列的雜交也可以與通常的DNA微陣列同樣地進行。即，使目標核苷酸序列與DNA微陣列接觸，雜交到DNA微陣列的捕獲探針上。雜交可以通過分注到96孔或384孔塑料板上，把標記cDNA水性液點印在微陣列上來實施。點印量可以是1～100nl左右。雜交優(yōu)選在室溫～70℃的溫度范圍、6～20小時的范圍實施。雜交結束后，使用表面活性劑和緩沖液的混合溶液進行清洗，去除未反應的標記cDNA。作為表面活性劑，優(yōu)選使用十二烷基硫酸鈉(SDS)。作為緩沖液，可以使用檸檬酸緩沖液、磷酸緩沖液、硼酸緩沖液、tris緩沖液、Good′s緩沖液等，但優(yōu)選使用檸檬素緩沖液。
其中，本發(fā)明的DNA微陣列時，由于雜交了目標核苷酸序列的捕獲探針發(fā)出熒光信號，所以并不需要象通常的DNA微陣列那樣對目標核苷酸序列附加標記標簽等。
本第五個發(fā)明的DNA微陣列的一個方式，是用于檢測目標核苷酸序列的單核苷酸多態(tài)性(SNP)的DNA微陣列。即，該DNA微陣列的捕獲探針組，與目標核苷酸序列的至少含有SNP核苷酸的區(qū)段互補，各捕獲探針的與目標核苷酸序列的SNP核苷酸對應的位置的核苷酸是各自不同的核苷酸衍生物。從而，以捕獲探針中的核苷酸衍生物發(fā)出的熒光信號強度作為指標，可以檢測目標寡核苷酸序列的SNP。例如，圖3所示G/A多態(tài)性的情況，G/G純合時是在該位置含有C衍生物的捕獲探針發(fā)出強熒光信號，而G/A雜合時則是含有C衍生物的捕獲探針和含有T衍生物的捕獲探針發(fā)出強熒光信號。另外，A/A純合體時是從含有T衍生物的捕獲探針得到強熒光信號。
本發(fā)明DNA微陣列的另一方案為，用于確定序列未知的n(n＝3～100)個核苷酸序列的DNA微陣列。即，該DNA微陣列中，捕獲探針是核苷酸序列完全不同的至少4n個探針的組，其特征在于，各捕獲探針從第1位到第n位是順次不同的核苷酸衍生物。例如，如圖4表示的序列未知的6-mer寡核苷酸(NNNNNN)時，對于第1位的X，從在該位置含有T衍生物的捕獲、針得到強信號時，該寡核苷酸的第1位X是與胸腺嘧啶(T)互補結合的腺嘌呤(A)。同樣地研究第2～6位，就可以確定該6-mer寡核苷酸是由AGGCGA構成的序列。另外，通過比較如圖2所示的A衍生物和G衍生物的熒光，還可以確定含有胸腺嘧啶(T)的未知序列。并且，用通常的測序儀無法確定短鏈(3～100)的寡核苷酸的序列，但使用本發(fā)明的DNA微陣列，就可以簡便且正確地確定短鏈寡核苷酸的序列。
本發(fā)明的DNA微陣列的再一個方案是，用于檢測目標核苷酸序列中是否存在與由n(n＝3～100)個核苷酸構成的已知序列區(qū)段(區(qū)域(domain)或模體(motif))相同區(qū)段的DNA微陣列。即，其特征在于，該DNA微陣列中的捕獲探針組與已知序列區(qū)段互補，各捕獲探針從第1位到第n位是順次不同的核苷酸衍生物。從而，如當目標核苷酸序列具有與目的的已知序列區(qū)段完全相同的序列時，可以從在對應于已知序列的各位置含有給定核苷酸衍生物的所有捕獲探針得到強信號。另一方面，如圖5所示，當第3位被A取代、第6位被G取代時，在第3位含有T衍生物的捕獲探針和在第6位含有C衍生物的捕獲探針各自發(fā)出強信號。由此，不僅可以檢測是否存在與已知序列區(qū)段完全一致的序列，還可以簡便且容易地檢測是否存在一部分不一致的相同序列。
進而，本發(fā)明的DNA微陣列的再另一個方案是，確定具有由n(n＝3～100)個核苷酸構成的未知序列區(qū)段和已知序列區(qū)段的目標核苷酸序列的未知序列區(qū)段的序列的DNA微陣列。即，該DNA微陣列中，捕獲探針組是具有與目標核苷酸序列中的已知序列區(qū)段互補的序列和核苷酸序列完全不同的探針序列區(qū)段的至少4n個探針的組，各探針序列區(qū)段從第1位到第n位的至少一個為核苷酸衍生物。此時，目標核苷酸序列和捕獲探針是根據其已知序列區(qū)段的互補性而雜交，并根據與前述相同的用于確定未知序列的捕獲探針發(fā)出的熒光信號來確定其序列。
實施例下面，對于本發(fā)明的核苷酸衍生物表示實施例，但本發(fā)明并不受以下例子的限定。
實施例1核苷酸衍生物(PyU(5)、PyC(5)、PyA(7))的合成按照圖6和7，如下合成核苷酸衍生物(PyU(5)、PyC(5)、PyA(7))。其中，化合物的序號對應于圖6和7的序號。
方案i(化合物2的合成)把丙炔胺(1，和光純藥)和1-芘基羧酸(2，Aldrich(アルドリツチ))(1∶1)，在縮合劑PyBOP(1當量，NOVA Biochem)存在下，在N，N-二甲基甲酰胺中，在室溫攪拌2.5小時，萃取，用柱色譜精制后，得到產物2(91％)。
方案ii(化合物4PyU(5)的核苷衍生物的合成)把3(把5-碘-2’-脫氧尿苷(西格瑪)在4，4’-二甲氧基三苯甲基氯化物(東京化成)和吡啶中攪拌而得到)和2(1∶1)在(四三苯膦)鈀(0.15當量，和光純藥)、碘化銅(0.3當量，和光純藥)、三乙胺(1當量，和光純藥)存在下，在N，N-二甲基甲酰胺中，在室溫攪拌10小時，萃取，用柱色譜精制后，得到產物4(82％)。
方案iii(化合物5的合成)把4在3％三氯醋酸-二氯甲烷溶液(Glen Research公司)中，在室溫攪拌5分鐘，萃取，用柱色譜精制后，得到產物5(27％)。
方案iv(化合物6PyU(5)的合成)把4和2-氰乙基四異丙基亞磷二酰胺(aldrich公司)(1∶1)，在四唑(1當量，同仁化學)存在下，在乙腈中，在室溫攪拌2小時，直接用于DNA合成儀。
方案v(化合物8的合成)把5-碘-2’-脫氧胞苷(7，生化學工業(yè))，在N，N-二甲基甲酰胺二乙縮醛(1當量，東京化成)存在下，在N，N-二甲基甲酰胺中，在55度攪拌2小時，并濃縮。粗產物8供于下一反應。
方案vi(化合物9的合成)把化合物8和4，4’-二甲氧基三苯甲基氯化物(東京化成)(1∶1)，在吡啶中，在室溫攪拌1小時，萃取，用柱色譜精制后，得到產物9(50％在兩個步驟)。
方案vii(化合物10PyC(5)的核苷衍生物的合成)把化合物9和2(1∶1)在(四三苯膦)鈀(0.15當量，和光純藥)、碘化銅(0.3當量，和光純藥)、三乙胺(1當量，和光純藥)存在下，在N，N-二甲基甲酰胺中，在室溫攪拌12小時，萃取，用柱色譜精制后，得到產物10(47％)。
方案viii(化合物11PyC(5)的合成)把化合物4和2-氰乙基四異丙基亞磷二酰胺(aldrich公司)(1∶1)，在四唑(1當量，同仁化學)存在下，在乙腈中，在室溫攪拌2小時，直接用于DNA合成儀。
方案ix(化合物13的合成)把化合物12(Ramzaeva and Seela，Helv.Chim.Acta 78，1083-1090(1995))和2(1∶2)在(四三苯膦)鈀(0.1當量，和光純藥)、碘化銅(0.1當量，和光純藥)、三乙胺(2當量，和光純藥)存在下，在N，N-二甲基甲酰胺中，在室溫攪拌6小時，萃取，用柱色譜精制后，得到產物13(88％)。
方案x(化合物14的合成)把化合物13，在N，N-二甲基甲酰胺二乙縮醛(1當量，東京化成)存在下，在N，N-二甲基甲酰胺中，在50度攪拌3小時，并濃縮。粗產物供于下一反應。
方案xi(化合物15PyA(7)的核苷衍生物的合成)把化合物14和4，4’-二甲氧基三苯甲基氯化物(東京化成)(1∶1)，在N，N-二甲基氨基吡啶催化劑量存在下，在吡啶中，在室溫攪拌1小時，萃取，用柱色譜精制后，得到產物15(73％在兩個步驟)。
方案xii(化合物16PyA(7)的合成)把化合物4和2-氰乙基四異丙基亞磷二酰胺(aldrich公司)(1∶1)，在四唑(1當量，同仁化學)存在下，在乙腈中，在室溫攪拌2小時，直接用于DNA合成儀。
實施例2核苷酸衍生物(PyG(8))的合成按照圖8，如下合成核苷酸衍生物(PyG(8))。其中，化合物的序號對應于圖8的序號。
方案1(化合物2的合成)使用1-溴化芘作為起始原料，通過與三甲基甲硅烷基乙酸甘油酯發(fā)生Sonogashira偶合反應，得到化合物1。接著，在甲醇中由甲醇鈉去除保護基三甲基甲硅烷基，得到化合物2(芘單元)(生成率70％)。
方案2(化合物6PyG(8)的核苷衍生物的合成)在2’-脫氧鳥苷中加入N-溴化琥珀酰亞胺，通過在水中反應而得到化合物3(生成率60％)。接著，用叔丁基二甲基氯硅烷和咪唑，由叔丁基二甲基甲硅烷基來保護化合物3的糖的3’位和5’位的羥基，然后與化合物2進行Sonogashira偶合反應而得到化合物5(生成率61％)。由TBAF去除化合物5的羥基保護基即叔丁基二甲基甲硅烷基而得到單體化合物6(生成率60％)。
方案3(化合物10PyG(8)的合成)使化合物3在DMF中與DMF二乙縮醛反應而得到化合物7。由4，4’-二甲氧基三苯甲基氯化物在化合物7的5’位的羥基導入4，4’-二甲氧基三苯甲基，得到化合物8(生成率22％)。通過Sonogashira偶合反應在該化合物8的8位導入化合物2，得到化合物9(生成率58％)。最后，在乙腈和二氯甲烷中與N，N，N’，N’-四異丙基氰乙基亞磷二酰胺，以四唑為酸性活化劑進行反應，合成作為amidite單元的化合物10。把它作為0.1M乙腈溶液供于DNA合成儀。
實施例3寡脫氧核糖核苷酸的合成使用在實施例1制成的核苷酸衍生物(PyU(5)、PyC(5)、PyA(7))、及在實施例2制成的核苷酸衍生物(PyG(8))，合成含有核苷酸衍生物的寡脫氧核糖核苷酸。寡脫氧核糖核苷酸是用美國應用生物系統公司的392DNA/RNA合成儀按照通常的亞磷酰胺法合成。從固相載體切取及脫保護是，通過在25％的氨水中，孵育一定溫度和一定時間來進行，然后利用高效液相色譜精制。
實施例4
含有PyC(5)的寡脫氧核糖核苷酸(1)的熒光分析把在實施例3得到的含有PyC(5)的寡脫氧核糖核苷酸(5’-CGCAACPyCCAAGCG-3；序列號1)溶解到含有0.1M氯化鈉的50mM磷酸緩沖液(pH7.0)中配制成2.5μM的溶液。使用熒光分光光度計在約25℃測定該溶液的熒光光譜的結果，激發(fā)波長為329nm、發(fā)射波長為400nm，在400nm的熒光強度為7.0。
在上述溶液中分別添加與含有PyC(5)的寡脫氧核糖核苷酸的除PyC(5)以外的部分互補的下述另行合成的寡脫氧核糖核苷酸，使其成為2.5μM，用渦流混合器混合(A’)5’-GCGTTGAGTTGCG-3’(序列號2)；(T’)5’-GCGTTGTGTTGCG-3’(序列號3)；(G’)5’-GCGTTGGGTTGCG-3’(序列號4)；(C’)5’-GCGTTGCGTTGCG-3’(序列號5)。
用熒光分光光度計測定這些溶液的熒光光譜的結果是，添加寡脫氧核糖核苷酸(A’)時，在400nm的熒光強度為4.1。添加寡脫氧核糖核苷酸(T’)時，在400nm的熒光強度為2.6；添加寡脫氧核糖核苷酸(G’)時，在400nm的熒光強度為18.3；添加寡脫氧核糖核苷酸(C’)時，在400nm的熒光強度為1.4。
這樣，對于含有PyC(5)的寡脫氧核糖核苷酸，當互補鏈上的與PyC(5)配對的核苷酸為脫氧鳥苷酸時，可以觀察得到強發(fā)光，與此相比，當為脫氧腺苷酸時，熒光就消光78％；當為脫氧胸苷酸時，熒光就消光86％；當為脫氧胞苷酸時熒光就消光92％。在圖9表示熒光光譜。
實施例5含有PyC(5)的寡脫氧核糖核苷酸(2)的熒光分析把在實施例3得到的含有PyC(5)的寡脫氧核糖核苷酸(5’-CGCAACPyCTAAGCG-3；序列號6)溶解到含有0.1M氯化鈉的50mM磷酸緩沖液(pH7.0)中配制成2.5μM的溶液。使用熒光分光光度計在約25℃測定該溶液的熒光光譜的結果，激發(fā)波長為327nm、發(fā)射波長為405nm，在405nm的熒光強度為9.2。
在上述溶液中分別添加與含有PyC(5)的寡脫氧核糖核苷酸的除PyC(5)以外的部分互補的下述另行合成的寡脫氧核糖核苷酸，使其成為2.5μM，用渦流混合器混合(A’)5’-GCGTTAAATTGCG-3’(序列號7)；(T’)5’-GCGTTATATTGCG-3’(序列號8)；(G’)5’-GCGTTAGATTGCG-3’(序列號9)；(C’)5’-GCGTTACATTGCG-3’(序列號10)。
用熒光分光光度計測定這些溶液的熒光光譜的結果，添加寡脫氧核糖核苷酸(A')時，在405nm的熒光強度為10.9。添加寡脫氧核糖核苷酸(T’)時，在400nm的熒光強度為8.8；添加寡脫氧核糖核苷酸(G’)時，在400nm的熒光強度為18.2；添加寡脫氧核糖核苷酸(C’)時，在400nm的熒光強度為11.9。
這樣，對于含有PyC(5)的寡脫氧核糖核苷酸，當互補鏈上的與PyC(5)配對的核苷酸為脫氧鳥苷酸時，可以觀察得到強發(fā)光，與此相比，當為脫氧腺苷酸時，熒光就消光40％；當為脫氧胸苷酸時，熒光就消光52％；當脫氧胞苷酸時，熒光就消光35％。在圖10表示熒光光譜。
比較該實施例5和所述實施例4的結果，可以確認核苷酸衍生物PyC(5)與其配對的堿基的前后堿基種類無關，對應于特定的堿基種類(G)而發(fā)出強熒光信號。
實施例6含有PyU(5)的寡脫氧核糖核苷酸(1)的熒光分析把在實施例3得到的含有PyU(5)的寡脫氧核糖核苷酸(5’CGCAACPyUCAAGCG-3；序列號11)溶解到含有0.1M氯化鈉的50mM磷酸緩沖液(pH7.0)中配制成2.5μM的溶液。使用熒光分光光度計在約25℃測定該溶液的熒光光譜的結果，激發(fā)波長為344nm、發(fā)射波長為398nm，在398nm的熒光強度為7.4。
在上述溶液中分別添加與含有PyU(5)的寡脫氧核糖核苷酸的除PyU(5)以外的部分互補的下述另行合成的寡脫氧核糖核苷酸，使其成為2.5μM，用渦流混合器混合
(A’)5’-GCGTTGAGTTGCG-3’(序列號2)；(T’)5’-GCGTTGTGTTGCG-3’(序列號3)；(G’)5’-GCGTTGGGTTGCG-3’(序列號4)；(C’)5’-GCGTTGCGTTGCG-3’(序列號5)。
用熒光分光光度計測定這些溶液的熒光光譜的結果是，當添加寡脫氧核糖核苷酸(A’)時，在398nm的熒光強度為29.8；添加寡脫氧核糖核苷酸(T’)時，在398nm的熒光強度為4.5；添加寡脫氧核糖核苷酸(G’)時，在398nm的熒光強度為3.7；添加寡脫氧核糖核苷酸(C’)時，在398nm的熒光強度為3.3。
這樣，對于含有PyU(5)的寡脫氧核糖核苷酸，當互補鏈上的與PyU(5)配對的核苷酸為脫氧腺苷酸時，可以觀察得到強發(fā)光，與此相比，當脫氧胸苷酸時熒光就消光85％；脫氧鳥苷酸時熒光就消光88％；脫氧胞苷酸時熒光就消光89％。在圖11表示熒光光譜。另外，在圖12表示熒光照片圖像。
實施例7含有PyU(5)的寡脫氧核糖核苷酸(2)的熒光分析把在實施例3得到的含有PyU(5)的寡脫氧核糖核苷酸(5’-CGCAACPyUTAAGCG-3；序列號12)溶解到含有0.1M氯化鈉的50mM磷酸緩沖液(pH7.0)中配制成2.5μM的溶液。使用熒光分光光度計在約25℃測定該溶液的熒光光譜的結果，激發(fā)波長為327nm、發(fā)射波長為398nm，在398nm的熒光強度為6.3。
在上述溶液中分別添加與含有PyU(5)的寡脫氧核糖核苷酸的除PyU(5)以外的部分為互補的下述另行合成的寡脫氧核糖核苷酸，使其成為2.5μM，用渦流混合器混合(A’)5’-GCGTTAAATTGCG-3’(序列號7)；(T’)5’-GCGTTATATTGCG-3’(序列號8)；(G’)5’-GCGTTAGATTGCG-3’(序列號9)；(C’)5’-GCGTTACATTGCG-3’(序列號10)。
用熒光分光光度計測定這些溶液的熒光光譜的結果，添加寡脫氧核糖核苷酸(A’)時，在398nm的熒光強度為26.0；添加寡脫氧核糖核苷酸(T’)時，在398nm的熒光強度為2.7；添加寡脫氧核糖核苷酸(G’)時，在398nm的熒光強度為4.8；添加寡脫氧核糖核苷酸(C’)時，在398nm的熒光強度為10.6。
這樣，對于含有PyU(5)的寡脫氧核糖核苷酸，當互補鏈上的與PyU(5)配對的核苷酸為脫氧腺苷酸時，可以觀察得到強發(fā)光，與此相比，當為脫氧胸苷酸時，熒光就消光90％；當為脫氧鳥苷酸時，熒光就消光82％；當為脫氧胞苷酸時，熒光就消光59％。在圖13表示熒光光譜。
比較該實施例7和所述實施例6的結果，可以確認核苷酸衍生物PyU(5)與其配對的堿基的前后堿基種類無關，對特定的堿基種類(A)發(fā)出強熒光信號。
實施例8含有PyA(7)的寡脫氧核糖核苷酸的熒光分析把在實施例3得到的含有PyA(7)的寡脫氧核糖核苷酸(5’CGCAACPyACAAGCG-3；序列號13)溶解到含有0.1M氯化鈉的50mM磷酸緩沖液(pH7.0)中配制成2.5μM的溶液。使用熒光分光光度計在約25℃測定該溶液的熒光光譜的結果，激發(fā)波長為353nm、發(fā)射波長為395nm，在395nm的熒光強度為4.3。
在上述溶液中分別添加與含有PyA(7)的寡脫氧核糖核苷酸的除PyA(7)以外的部分為互補的下述另行合成的寡脫氧核糖核苷酸，使其成為2.5μM，用渦流混合器混合(A’)5’-GCGTTGAGTTGCG-3’(序列號2)；(T’)5’-GCGTTGTGTTGCG-3’(序列號3)；(G’)5’-GCGTTGGGTTGCG-3’(序列號4)；(C’)5’-GCGTTGCGTTGCG-3’(序列號5)。
用熒光分光光度計測定這些溶液的熒光光譜的結果，添加寡脫氧核糖核苷酸(A’)時，在395nm的熒光強度為2.5；添加寡脫氧核糖核苷酸(T’)時，在395nm的熒光強度為1.8；添加寡脫氧核糖核苷酸(G’)時，在395nm的熒光強度為7.4；添加寡脫氧核糖核苷酸(C’)時，在395nm的熒光強度為18.2。
這樣，對于含有PyA(7)的寡脫氧核糖核苷酸，當互補鏈上的與PyA(7)配對的核苷酸為脫氧胞苷酸時，可以觀察得到強發(fā)光，與此相比，當為脫氧胸苷酸時，熒光就消光90％；當為脫氧腺苷酸時，熒光就消光86％；當為脫氧鳥苷酸時，熒光就消光59％。在圖14表示熒光光譜。
實施例9含有PyG(8)的寡脫氧核糖核苷酸(2)的熒光分析把在實施例3得到的含有PyG(8)的寡脫氧核糖核苷酸(5’-CGCAACPyGTAAGCG-3；序列號14)溶解到含有0.1M氯化鈉的50mM磷酸緩沖液(pH7.0)中配制成2.5μM的溶液。使用熒光分光光度計在約25℃測定該溶液的熒光光譜的結果，激發(fā)波長為420nm、發(fā)射波長為430nm和460nm，在430nm的熒光強度為16.0，而在460nm的熒光強度為15.3。
在上述溶液中分別添加與含有PyG(8)的寡脫氧核糖核苷酸的除PyG(8)以外的部分為互補的下述另行合成的寡脫氧核糖核苷酸，使其成為2.5μM，用渦流混合器混合(A’)5’-GCGTTAAATTGCG-3’(序列號7)；(T’)5’-GCGTTATATTGCG-3’(序列號8)；(G’)5’-GCGTTAGATTGCG-3’(序列號9)；(C’)5’-GCGTTACATTGCG-3’(序列號10)。
用熒光分光光度計測定這些溶液的熒光光譜的結果，添加寡脫氧核糖核苷酸(A’)時，在430nm的熒光強度為65.0；添加寡脫氧核糖核苷酸(T’)時，在430nm的熒光強度為144.0；添加寡脫氧核糖核苷酸(G’)時，在430nm的熒光強度為65.0；添加寡脫氧核糖核苷酸(C’)時，在430nm的熒光強度為136.0。
這樣，對于含有PyG(8)的寡脫氧核糖核苷酸，當互補鏈上的與PyG(8)配對的核苷酸為脫氧胸苷酸和脫氧胞苷酸時，可以觀察得到強發(fā)光，與此相比，當為脫氧鳥苷酸和脫氧腺苷酸時，熒光各自消光55％。在圖15表示相對熒光光譜。
實施例10使用DNA微陣列確定序列號15的寡脫氧核糖核苷酸(樣品DNA片段)的第8～11位的未知序列。作為DNA微陣列的捕獲探針，使用含有序列號16～31的核苷酸序列的DNA片段(探針DNA片段)(參照表1)。其中，樣品DNA片段含有序列號15的核苷酸序列，全長50b；探針DNA片段1～16各自含有序列號16～31的核苷酸序列，全長68～70b。
1.探針DNA片段的制備各自含有序列號16～31的核苷酸序列的探針DNA片段1～16，使用美國應用生物系統公司的392DNA/RNA合成裝置，按照通常的亞磷酰胺法合成。從固相載體切取及脫保護是，通過在25％的氨水中孵育來進行，然后利用高效液相色譜精制。
序列號16～31的各自第8位(T、G、C、A)為各核苷酸衍生物(PyU(5)、PyC(5)、PyA(7)、PyG(8))。同樣，序列號20～23的第9位、序列號24～27的第10位、序列號28～31的第11位的T、G、C、A各自為PyU(5)、PyC(5)、PyA(7)、PyG(8)(參照表1)。
2.固定用基板的制備把在10％NaOH-60％乙醇水溶液中浸漬2小時且用純水清洗10次的76×26×1mm大小的玻璃制載片(slide)(松波硝子工業(yè)公司制)，在10％聚L-賴氨酸水溶液中浸漬1小時。用純水清洗10次后，以800rpm、離心5分鐘，去除水分，在室溫干燥，制備固定用基板。
3.DNA微陣列的制備把在上述1中制備的各個探針DNA片段，調整成最終濃度50pmol/μl，在上述2制備的基板上分別點印200pl(10nmol)。然后，在80℃干燥處理1小時，在各點上添加水，將DNA片段固定在基板上。把該基板用1％BSA封閉液(50mg/ml)5ml、10％SDS 1.25ml)振蕩45分鐘(42℃)。然后，分別用95℃純水浸漬1分鐘、用95％乙醇浸漬1分鐘，離心(800rpm、1分鐘)，來制備目的DNA微陣列。
4.樣品DNA片段的制備在含有由含有序列號15的核苷酸序列的全長50b的寡脫氧核糖核苷酸構成的樣品DNA片段(15fmol/10.5μl)的樣品管中，添加20×SSC(3.75μl)和10％SDS(0.75μl)。用95℃加熱模塊(heatblock)進行2分鐘加熱后，在室溫放置5分鐘，離心，來制備樣品液(最終濃度1nM)。
5.雜交在上述3制備的DNA微陣列上，把在上述2制備的樣品液點印在1點，12μl/點，用蓋玻片覆蓋，進行雜交反應(65℃、16小時)。反應終止后，在2×SSC-0.1％SDS溶液中浸漬5分鐘、20分鐘，在0.2×SSC-0.1％SDS溶液中浸漬20分鐘，然后在55℃進一步浸漬2次，每次20分鐘。用同溶液沖洗后，進而用0.05×SSC溶液沖洗。用900rpm離心1分鐘，放置，干燥。
6.測定使用熒光顯微鏡BX-50(奧林帕斯公司制)，測量各DNA點的熒光強度，得到圖像文件后，進行信號的數值化處理。結果示于表1。
表1

從表1所示的熒光強度的結果可以確定樣品DNA片段的序列號15的第8～11位的未知核苷酸如下。
(1)位于探針DNA片段1～4的第8位的各核苷酸衍生物的熒光強度為，探針DNA片段2的PyG(8)最高，探針DNA片段4的PyA(7)則明顯要低，因此樣品DNA片段的第8位確定為胸腺嘧啶(T)。
(2)位于探針DNA片段5～8的第9位的各核苷酸衍生物的熒光強度為，探針DNA片段5的PyU(5)最高，因此樣品DNA片段的第9位確定為腺嘌呤(A)。
(3)位于探針DNA片段9～12的第10位的各核苷酸衍生物的熒光強度為，探針DNA片段10的PyG(8)和探針DNA片段12的PyA(7)最高，因此樣品DNA片段的第10位確定為胞嘧啶(C)。
(4)位于探針DNA片段13～16的第11位的各核苷酸衍生物的熒光強度為，探針DNA片段15的PyC(5)最高，因此樣品DNA片段的第11位確定為鳥嘌呤(G)。
并且，從該結果可以確認，本發(fā)明的核苷酸衍生物為，與配對的堿基的前后堿基種類無關，對特定的堿基種類發(fā)出強熒光信號。
產業(yè)上的利用可能性如在上面詳細說明，本申請的發(fā)明可以大幅度簡化使用DNA探針或DNA微陣列的SNP判定或序列確認等中的試樣制備和測定過程。
序列表<110>齋藤烈和日本礙子株式會社(Isao Saito and NGK Insulators，Ltd.)<120>核苷酸衍生物和DNA微陣列<130>
<160>31<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>13<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(7)<223>用1-芘基改性的胞嘧啶衍生物<400>1cgcaacccaa gcg 13<210>2<211>13<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>2gcgttgagtt gcg 13<210>3<211>13<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>3gcgttgtgtt gcg 13<210>4<211>13<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>4gcgttgggtt gcg 13<210>5<211>13<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>5gcgttgcgtt gcg 13
<210>6<211>13<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(7)<223>用1-芘基改性的胞嘧啶衍生物<400>6cgcaatctaa gcg 13<210>7<211>13<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>7gcgttaaatt gcg 13<210>8<211>13<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>8gcgttatatt gcg 13<210>9<211>13<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>9gcgttagatt gcg 13<210>10<211>13<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>10gcgttacatt gcg 13<210>11<211>13<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature<222>(7)<223>用1-芘基改性的胸腺嘧啶衍生物<400>11cgcaactcaa gcg 13<210>12<211>13<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(7)<223>用1-芘基改性的胸腺嘧啶衍生物<400>12cgcaatttaa gcg 13<210>13<211>13<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(7)<223>用1-芘基改性的腺嘌呤衍生物<400>13cgcaacacaa gcg 13<210>14<211>13<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(7)<223>用1-芘基改性的鳥嘌呤衍生物<400>14cgcaatgtaa gcg 13<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(10)..(13)<223>na，t，g或c<400>15
gtaatccgcn nnnaatgact 20<210>16<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(8)<223>用1-芘基改性的胸腺嘧啶衍生物<400>16agtcattttg ccgcctaatg 20<210>17<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(8)<223>用1-芘基改性的鳥嘌呤衍生物<400>17agtcattgtg ccgcctaatg 20<210>18<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(8)<223>用1-芘基改性的胞嘧啶衍生物<400>18agtcattctg ccgcctaatg 20<210>19<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(8)<223>用1-芘基改性的腺嘌呤衍生物<400>19agtcattatg ccgcctaatg 20<210>20<211>20<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(9)<223>用1-芘基改性的胸腺嘧啶衍生物<400>20agtcattatg ccgcctaatg 20<210>21<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(9)<223>用1-芘基改性的鳥嘌呤衍生物<400>21agtcattagg ccgcctaatg 20<210>22<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(9)<223>用1-芘基改性的胞嘧啶衍生物<400>22agtcattacg ccgcctaatg 20<210>23<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(9)<223>用1-芘基改性的腺嘌呤衍生物<400>23agtcattaag ccgcctaatg 20<210>24<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(10)<223>用1-芘基改性的胸腺嘧啶衍生物
<400>24agtcattatt ccgcctaatg 20<210>25<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(10)<223>用1-芘基改性的鳥嘌呤衍生物<400>25agtcattatg ccgcctaatg 20<210>26<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(10)<223>用1-芘基改性的胞嘧啶衍生物<400>26agtcattatc ccgcctaatg 20<210>27<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(10)<223>用1-芘基改性的腺嘌呤衍生物<400>27agtcattata ccgcctaatg 20<210>28<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(11)<223>用1-芘基改性的胸腺嘧啶衍生物<400>28agtcattatg tcgcctaatg 20<210>29<211>20
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(11)<223>用1-芘基改性的鳥嘌呤衍生物<400>29agtcattatg gcgcctaatg 20<210>30<211>20<212>DNA<213>人工序列<223>合成的寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(11)<223>用1-芘基改性的胞嘧啶衍生物<400>30agtcattatg ccgcctaatg 20<210>31<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(11)<223>用1-芘基改性的腺嘌呤衍生物<400>31agtcattatg acgcctaatg 20
權利要求
1.一種核苷酸衍生物，其是熒光色素嵌入劑經由接頭連接于嘧啶堿基或嘌呤堿基而成，其特征在于，作為單鏈核苷酸序列的成員存在，當與該單鏈核苷酸序列雜交的對方鏈的相應堿基為(1)腺嘌呤時，是熒光色素發(fā)光最強的胸腺嘧啶/尿嘧啶衍生物；(2)鳥嘌呤時，是熒光色素發(fā)光最強的胞嘧啶衍生物；(3)胞嘧啶時，是熒光色素發(fā)光最強的腺嘌呤衍生物；或者(4)胞嘧啶或胸腺嘧啶/尿嘧啶時，是熒光色素發(fā)光最強的鳥嘌呤衍生物。
2.根據權利要求1所述的核苷酸衍生物，其特征在于，胸腺嘧啶/尿嘧啶衍生物是由以下通式(1)表示 式中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9相同或不同地表示氫原子或取代基，R10是氫原子或羥基，X是從亞氨基(NH)、氧基(O)、硫基(S)、亞甲基(CH2)及烷基氨基中選出的連接基團，整數n表示亞烷基鏈長度，當X為亞甲基或烷基氨基時，是0～5，當X為亞氨基、氧基或硫基時，是1～5。
3.根據權利要求1所述的核苷酸衍生物，其特征在于，胞嘧啶衍生物是由以下通式(2)表示 式中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9相同或不同地表示氫原子或取代基，R10是氫原子或羥基，X是從亞氨基(NH)、氧基(O)、硫基(S)、亞甲基(CH2)及烷基氨基中選出的連接基團，整數n表示亞烷基鏈長度，當X為亞甲基或烷基氨基時，是0～5，當X為亞氨基、氧基或硫基時，是1～5。
4.根據權利要求1所述的核苷酸衍生物，其特征在于，腺嘌呤是由以下通式(3)表示 式中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9相同或不同地表示氫原子或取代基，R10是氫原子或羥基，X是從亞氨基(NH)、氧基(O)、硫基(S)、亞甲基(CH2)及烷基氨基中選出的連接基團，整數n表示亞烷基鏈長度，當X為亞甲基或烷基氨基時，是0～5，當X為亞氨基、氧基或硫基時，是1～5。
5.根據權利要求1所述的核苷酸衍生物，其特征在于，鳥嘌呤衍生物是由以下通式(4)表示 式中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9相同或不同地表示氫原子或取代基，R10是氫原子或羥基，X是從亞氨基(NH)、氧基(O)、硫基(S)、亞甲基(CH2)及烷基氨基中選出的連接基團，整數n表示亞烷基鏈長度，當X為亞甲基或烷基氨基時是0～5，當X為亞氨基、氧基或硫基時，是1～5。
6.胸腺嘧啶/尿嘧啶衍生物的前體物質，其是由以下通式(5)表示的核苷衍生物 式中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9相同或不同地表示氫原子或取代基，R10是氫原子或羥基，X是從亞氨基(NH)、氧基(O)、硫基(S)、亞甲基(CH2)及烷基氨基中選出的連接基團，整數n表示亞烷基鏈長度，當X為亞甲基或烷基氨基時，是0～5，當X為亞氨基、氧基或硫基時，是1～5。
7.胞嘧啶衍生物的前體物質，其是由以下通式(6)表示的核苷衍生物 式中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9相同或不同地表示氫原子或取代基，R10是氫原子或羥基，X是從亞氨基(NH)、氧基(O)、硫基(S)、亞甲基(CH2)及烷基氨基中選出的連接基團，整數n表示亞烷基鏈長度，當X為亞甲基或烷基氨基時，是0～5，當X為亞氨基、氧基或硫基時，是1～5。
8.腺嘌呤衍生物的前體物質，其是由以下通式(7)表示的核苷衍生物 式中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9相同或不同地表示氫原子或取代基，R10是氫原子或羥基，X是從亞氨基(NH)、氧基(O)、硫基(S)、亞甲基(CH2)及烷基氨基中選出的連接基團，整數n表示亞烷基鏈長度，當X為亞甲基或烷基氨基時，是0～5，當X為亞氨基、氧基或硫基時，是1～5。
9.鳥嘌呤衍生物的前體物質，其是由以下通式(8)表示的核苷衍生物 式中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9相同或不同地表示氫原子或取代基，R10是氫原子或羥基，X是從亞氨基(NH)、氧基(O)、硫基(S)、亞甲基(CH2)及烷基氨基中選出的連接基團，整數n表示亞烷基鏈長度，當X為亞甲基或烷基氨基時，是0～5，當X為亞氨基、氧基或硫基時，是1～5。
10.將權利要求1的核苷酸衍生物(1)～(4)中的一個或其以上作為成員而具有的單鏈核苷酸序列。
11.確定與權利要求10的單鏈核苷酸序列雜交的對方鏈的單堿基X的方法，其中，(i)當單鏈核苷酸序列中的胸腺嘧啶/尿嘧啶衍生物(1)的熒光色素發(fā)光最強時，確定堿基X為腺嘌呤；(ii)當單鏈核苷酸序列中的胞嘧啶衍生物(2)的熒光色素發(fā)光最強時，確定堿基X為鳥嘌呤；(iii)當單鏈核苷酸序列中的腺嘌呤衍生物(3)的熒光色素發(fā)光最強時，確定堿基X為胞嘧啶；(iv)當單鏈核苷酸序列中的鳥嘌呤衍生物(4)的熒光色素發(fā)光最強時，確定堿基X為胞嘧啶或胸腺嘧啶/尿嘧啶。
12.根據權利要求11所述的堿基種類確定方法，其特征在于，把在同一位置具有腺嘌呤衍生物(3)和鳥嘌呤衍生物(4)的兩條單鏈核苷酸序列各自雜交到同一對方鏈，(v)當腺嘌呤衍生物(3)和鳥嘌呤衍生物(4)雙方的熒光色素發(fā)光最強時，確定對方鏈的堿基X為胞嘧啶；(vi)只是鳥嘌呤衍生物(4)的熒光色素發(fā)光最強時，確定對方鏈的堿基X為胸腺嘧啶/尿嘧啶。
13.把權利要求6的單鏈核苷酸序列作為捕獲探針的DNA微陣列。
14.根據權利要求13所述的DNA微陣列，其是檢測目標核苷酸序列的單核苷酸多態(tài)性(SNP)的DNA微陣列，其特征在于，捕獲探針的組與目標核苷酸序列的至少含有SNP核苷酸的區(qū)段互補，各個捕獲探針的與目標核苷酸序列的SNP核苷酸對應的位置的核苷酸各自為核苷酸衍生物(1)～(4)。
15.根據權利要求13所述的DNA微陣列，其是確定序列未知的n(n＝3～100)個核苷酸序列的DNA微陣列，其特征在于，捕獲探針是核苷酸序列完全不同的至少4n個的組，各捕獲探針從第1位到第n位的至少一個為核苷酸衍生物(1)～(4)。
16.根據權利要求13所述的DNA微陣列，其是檢測目標核苷酸序列中是否存在與由n(n＝3～100)個核苷酸構成的已知序列區(qū)段相同的區(qū)段的DNA微陣列，其特征在于，捕獲探針組與目標核苷酸序列中的已知序列區(qū)段互補，各捕獲探針從第1位到第n位的至少一個為核苷酸衍生物(1)～(4)。
17.根據權利要求13所述的DNA微陣列，其是確定目標核苷酸序列的未知序列區(qū)段的序列的DNA微陣列，所述目標核苷酸序列具有由n(n＝3～100)個核苷酸構成的未知序列區(qū)段和已知序列區(qū)段，其特征在于，捕獲探針組是具有與目標核苷酸序列中的已知序列區(qū)段互補的序列和核苷酸序列完全不同的探針序列區(qū)段的至少4n個的組，各探針序列區(qū)段從第1位到第n位的至少一個為核苷酸衍生物(1)～(4)。
全文摘要
對應于雜交的對方鏈的相應堿基種類而變化熒光信號強度的新的核苷酸衍生物，其特征在于，作為單鏈核苷酸序列的成員存在，與該單鏈核苷酸序列雜交的對方鏈的相應堿基為，(1)腺嘌呤時，是熒光色素發(fā)光最強的胸腺嘧啶/尿嘧啶衍生物；(2)鳥嘌呤時，是熒光色素發(fā)光最強的胞嘧啶衍生物；(3)胞嘧啶時，是熒光色素發(fā)光最強的腺嘌呤衍生物；或者(4)胞嘧啶或胸腺嘧啶/尿嘧啶時，是熒光色素發(fā)光最強的鳥嘌呤衍生物。
文檔編號C07H21/00GK1732181SQ200380107619
公開日2006年2月8日 申請日期2003年12月24日 優(yōu)先權日2002年12月26日
發(fā)明者齋藤烈, 岡本晃充, 吉田安子 申請人:齋藤烈, 日本礙子株式會社