專利名稱：甘露醇和山梨醇衍生物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及包括甘露醇或山梨醇衍生物的化合物，它們可被用于組成寡聚化合物。本發(fā)明還涉及這些寡聚化合物在雜交方面的用途和作為探針的用途。此外，本發(fā)明公開了檢測核酸的方法，其中使用了寡聚化合物。
背景技術：
在分子診斷領域，用聚合酶鏈式反應(PCR)檢測靶核酸起到了重要的作用。常規(guī)篩選血庫中人免疫缺損病毒(HIV)、乙肝病毒(HBV)或丙肝病毒(HCV)是大規(guī)模應用基于PCR的診斷方法的實例。用于基于PCR的分析的自動系統(tǒng)經(jīng)常在PCR過程中使用擴增產(chǎn)物的實時檢測。這種方法的關鍵是使用攜帶報告基團或標記物的被修飾的寡核苷酸。
在其最簡單的形式中，PCR是酶促合成特定核酸序列的體外方法，該方法使用兩個與相對的鏈雜交，并位于靶序列側(cè)翼的寡核苷酸引物，所述特定核酸序列是靶核酸中令人感興趣的區(qū)域。一系列重復的反應步驟，包括模板變性、引物退火、由DNA(脫氧核糖核酸)聚合酶將退火的引物延伸，導致特定的片段指數(shù)性累積，所述片段的末端由引物的5’端限定。
一方面，由PCR方法產(chǎn)生的DNA擴增產(chǎn)物的檢測可在獨立的操作步驟中完成。這些步驟可包括根據(jù)其電泳遷移率表征擴增的片段和/或用雜交探針分析與固體支持物連接的變性的擴增產(chǎn)物。
另一方面，DNA擴增產(chǎn)物的檢測可在所謂“同源(homogeneous)”測試系統(tǒng)中進行?！巴础睖y試系統(tǒng)包括報告分子或標記物，當靶序列被擴增時，報告分子或標記物產(chǎn)生信號?！巴础睖y試系統(tǒng)的一個實例是TaqMan_，US5,210,015、US5,804,375和US5,487,972對其進行了詳細描述。簡單地說，該方法基于雙標記探針和Taq DNA聚合酶的5’-3’核酸外切酶活性。所述探針與待由PCR方法擴增的靶序列互補，并且在每個聚合循環(huán)步驟中位于兩個PCR引物之間。探針具有兩個與之連接的熒光標記物。其中一個是報告染料，例如6-羧基熒光素(FAM)，由于它與第二熒光染料6-羧基-四甲基-若丹明(TAMRA)空間上接近，通過能量轉(zhuǎn)移淬滅(quench)其發(fā)射光譜。在每個擴增循環(huán)的過程中，延長引導的(primed)DNA鏈的過程中Taq DNA聚合酶置換并降解退火的探針，降解是由聚合酶內(nèi)在的5’-3’核酸外切酶活性造成的。該機制也是報告染料從TAMRA的淬滅活性中分離出來。結果，熒光活性隨探針切割的增加而增加，與形成的PCR產(chǎn)物的量成比例。相應地，通過檢測釋放的熒光標記物可測量擴增的靶序列。
用所謂的“分子信標(molecular beacons)”將熒光染料分子之間類似的能量轉(zhuǎn)移原理應用于“同源”測試(US6,103,476)。它們是帶有內(nèi)部淬滅熒光團(internally quenched fluorophore)的發(fā)夾形核酸分子，當它們與靶核酸結合時，會恢復(restore)熒光(US6,103,476)。它們被設計為分子的環(huán)部是探針序列，該探針序列與PCR方法中的靶序列中的區(qū)域互補。通過使探針序列末端的互補臂(arm)序列退火而形成莖部(stem)。熒光部分與一個臂的末端連接，淬滅部分與另一個臂的末端連接。莖部使這兩部分彼此接近，使得熒光團的熒光通過能量轉(zhuǎn)移而淬滅。由于淬滅體(quencher)部分是非熒光生色團，并以熱的形式發(fā)出從熒光團接收的能量，因此探針不發(fā)出熒光。當探針遇到靶靶分子時形成雜交體(hybrid)，該雜交體比莖雜交體更長、更穩(wěn)定，它的剛性和長度阻礙了莖雜交體的同時存在。因此，分子信標進行了驅(qū)使莖部分離的自發(fā)的構象重組，并引起熒光團和淬滅體彼此分離，導致可檢測的熒光恢復。
“同源”測試系統(tǒng)的更多實例以LightCycler_儀器所用的形式提供(見例如US6,174,670)，它們中的一些有時被稱為“親吻探針(kissingprobe)”形式。同樣，原理是基于染料之間的相互作用。然而，染料的特征是供體染料的發(fā)射波長通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移激發(fā)受體染料。一種示例方法使用了兩個修飾的寡核苷酸作為雜交探針，它與PCR方法的靶序列的相鄰內(nèi)部序列(adjacent internal sequences)雜交。位于5’端的修飾的寡核苷酸在其3’端具有作為標記的供體染料。位于3’端的修飾的寡核苷酸在其5’端具有受體染料。在擴增循環(huán)過程中，兩個修飾的寡核苷酸以頭至尾的方向與靶序列退火，隨后供體和受體染料非常接近。通過用單色光脈沖特異性地激發(fā)供體染料，可以檢測受體染料熒光，用于測量形成的PCR產(chǎn)物的量。
在“同源”測試系統(tǒng)中使用的寡聚化合物或修飾的寡核苷酸包括核苷酸或修飾的核苷酸，即單體單元，它與作為報告分子的標記物(例如染料)連接。這樣的單體單元的特征是它們(1)能夠與核酸的糖-磷酸聚合物主鏈連接或整合到其中，(2)不阻遏修飾的寡核苷酸與其互補靶序列配對，(3)提供用于連接一個或幾個標記物的官能團。
此外，TaqMan_形式要求寡聚化合物能夠被模板依賴型DNA聚合酶的5’-3’核酸外切酶活性消化。
用于將單體單元摻入核酸的幾種化合物及其用途是本領域已知的。這樣的化合物提供了用于共價連接報告基團或標記物的官能團和/或連接部分。在寡聚化合物的化學合成過程中，“非核苷酸化合物”或“修飾的核苷酸”的骨架結構與“寡核苷酸”的主鏈連接，例如通過基于亞磷酰胺(phosphoramidite)的化學反應生成磷酸二酯。一種給定的被摻入的化合物代表新生成的“修飾的寡核苷酸”中的修飾的核苷酸。標記物通過連接部分的官能團連接，所述官能團例如但不限于骨架結構本身的(proper)或“連接部分”的氨基官能，所述“連接部分”將骨架與官能團連接。在從待與標記物偶聯(lián)的官能團上除去任選的保護基團之后，標記物可在合成“修飾的寡核苷酸”之前或之后共價連接到化合物上。
EP0135587描述了常規(guī)核苷的修飾，所述常規(guī)核苷攜帶了與核苷堿基的取代基連接的報告基團。EP0313219公開了非核苷試劑，其特征在于帶有可與標記物結合的連接部分或側(cè)基的線性烴骨架結構。EP0313219沒有描述其他類型的骨架結構和它們的特性。US5,451,463描述了三官能的非核苷酸試劑，特別是具有伯氨基基團的基于1，3-二醇的骨架結構。這樣的試劑可用于例如寡核苷酸的3’末端的末端標記。WO97/43451公開了基于碳環(huán)(C5至C7)骨架結構的非核苷酸試劑，優(yōu)選的是取代或未取代的環(huán)己烷。根據(jù)該文獻，這樣的結構提供了將官能部分(例如可與報告基團偶聯(lián)的官能基團)延伸出修飾的寡核苷酸的寡聚物主鏈所必要的剛性。這是合乎需要的，因為在摻入到修飾的寡核苷酸之后，試劑的偶聯(lián)效率提高。Sheng-Hui等，Bioorganic& Medicinal Chem.Lett.7(1997)1639-1644，描述了基于環(huán)己烷骨架結構的非核苷酸化合物，特別是化合物環(huán)己基-4-氨基-1，1-二甲醇。通過在C1位取代甲基殘基的官能團，使整合到寡核苷酸主鏈中成為可能。攜帶標記物的連接部分與氨基基團連接。
也有有關基于山梨醇或甘露醇的修飾的核苷的公開。來源于1，5-內(nèi)醚-2，3-二脫氧-己糖醇的化合物已被幾份文獻公開，然而，這些文獻關注的是己糖醇化合物本身或基于己糖醇的修飾的核苷。這樣的修飾的核苷可用作藥物或用于化學合成，特別是修飾的寡核苷酸的合成。Pravdic，N.等，Croatica Chemica Acta 45(1973)343-356，描述了1，5-內(nèi)醚-2-乙酰氨基-2，3-二脫氧-D-己糖醇，即甘露醇或山梨醇衍生物(化合物XVIII)的合成。該文獻完全沒有描述這樣的化合物除化學合成外的特定用途。JP60016982描述了1，5-內(nèi)醚-3-脫氧-D-山梨醇的合成。該化合物用于抑制葡萄糖接受型神經(jīng)元的活性。WO93/25565，van Aerschot，A.等，Bioorganic & MedicinalChemistry Letters(1993)1013-1018；Verheggen，I.等，J.Med.Chem.36(1993)2033-2040；Verheggen，I.等，J.Med.Chem.38(1995)826-835；和Perez-Perez，M.-J.等，Bioorg. & Med.Chem.Lett.6(1996)1457-1460，描述了1，5-內(nèi)醚-2，3-二脫氧-D-己糖醇的衍生物，其在C2位攜帶羥基殘基或氨基殘基。WO9605213和Hossain，N.等，J.Org.Chem.63(1998)1574-1582描述了分別來源于1，5-內(nèi)醚-2，3-二脫氧-D-山梨醇和甘露醇的修飾的核苷的合成。后兩篇文獻公開了修飾的寡核苷酸的合成，所述寡核苷酸摻入了基于己糖醇的修飾的核苷。
用于將標記物摻入核酸的化合物必須仔細地篩選，因為它們可能(a)干擾堿基配對，(b)不能提供具有足夠剛性的骨架結構，(c)提供很大程度上疏水的結構，導致水溶性低，
(d)僅提供有限的化學修飾可控制性(amenability)，(e)含有對映體混合物。
因此本發(fā)明的一個目的是提供用于將標記物摻入核酸中的新化合物。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及含有甘露醇或山梨醇部分的化合物，具體地說，本發(fā)明涉及含有甘露醇或山梨醇部分的特定化合物，可用于構建寡聚化合物。本發(fā)明還涉及這些寡聚化合物在雜交中的用途和作為探針的用途。此外，本發(fā)明公開了檢測樣品中的核酸的方法，其中使用了寡聚化合物。本發(fā)明還提供了分別和直接合成甘露醇和山梨醇立體異構體的方法，從而避免了分離它們二者的混合物。
1，5-內(nèi)醚-2-氨基-2，3-二脫氧-己糖醇結構提供了具有特別有利的特性的親水骨架結構。此外，己糖醇結構適于進一步的有效化學合成。例如，由于甘露醇或山梨醇結構僅具有單一的伯醇官能，可以有效地在己糖醇的第6位碳原子的羥基氧上選擇性地偶聯(lián)DMT保護基。本發(fā)明化合物的化學合成特別地涉及2-氨基基團，這是特別有利的，因為合成步驟適于選擇性地產(chǎn)生兩種可能的立體異構體中的任一種。因此可以避免繁瑣的分離步驟，同時可以獲得確定的化合物。這對于生產(chǎn)診斷用化合物是有利的。生產(chǎn)診斷用化合物要求很高的質(zhì)量標準，即同樣確定的產(chǎn)物而不是對映體，生產(chǎn)成本也是不可忽視的。為避免熒光標記偶聯(lián)到2-氨基基團，當被摻入核酸或修飾的核酸中時，基于甘露醇或山梨醇的化合物提供了標記物5’或3’方向取向的結構基礎。
本領域公知的分子生物學和核酸化學的常規(guī)技術，在文獻中得到說明。見例如Sambrook等，分子克隆實驗指南，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約，1989；寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)，Gait，M.J.ed.，1984；核酸雜交(Nucleic Acid Hybridization)，Hames，B.D.，andHiggins，S.J.，eds.，1984；以及一系列Method in Enzymology，AcademicPress，Inc.，它們都引入本文作為參考。本文涉及的所有的專利、專利申請和出版物，見上文和下文，被引入本文作為參考。
如本領域已知的，“核苷”是堿基-糖組合。核苷的堿基部分通常是雜環(huán)堿基。兩類最常見的雜環(huán)堿基是嘌呤和嘧啶。
“核苷酸”是進一步包括一個磷酸基團的“核苷”，所述磷酸基團與核苷的糖部分共價連接。對于包含呋喃戊糖的“核苷”，磷酸基團可以連接到糖的2’、3’或5’羥基部分?！昂塑账帷笔恰肮押塑账帷钡摹皢误w單元”，在本文中更一般地表示為“寡聚化合物”，或“多核苷酸”，更為一般地表示為“多聚化合物”。另一種一般的表示是脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。
“修飾的核苷酸”(或“核苷酸類似物”)通過一些修飾而與天然的“核苷酸”不同，但仍由堿基、呋喃戊糖、磷酸部分、堿基樣、呋喃戊糖樣和磷酸樣部分，或它們的組合組成。例如，“標記物”可與“核苷酸”的堿基部分連接，由此得到“修飾的核苷酸”?！昂塑账帷敝械奶烊粔A基也可被例如7-去氮雜嘌呤(desazapurine)置換，由此也得到“修飾的核苷酸”。術語“修飾的核苷酸”或“核苷酸類似物”在本申請中可互換使用?！靶揎椀暮塑铡?或“核苷類似物”)通過一些修飾與天然的核苷不同，其方式由上文“修飾的核苷酸”(或“核苷酸類似物”)中給出。
“非核苷酸化合物”與天然“核苷酸”不同，但在本發(fā)明的含義中，仍(類似于“核苷酸”)是“寡聚化合物”的“單體單元”。因此，“非核苷酸化合物”能夠與“核苷酸”形成“寡聚化合物”。即使“非核苷酸化合物”含有堿基樣、呋喃戊糖樣或磷酸樣部分，但在“非核苷酸化合物”中它們不同時存在。
根據(jù)本發(fā)明，“寡聚化合物”是由“單體單元”組成的化合物，所述“單體單元”可以單獨是“核苷酸”或“非天然的化合物”，更特別地是“修飾核苷酸”(或“核苷酸類似物”)或“非核苷酸化合物”，或它們的組合。在本發(fā)明的上下文中，“寡核苷酸”和“修飾的寡核苷酸”(或“寡核苷酸類似物”)是“寡聚化合物”的亞組(subgroups)。
在本發(fā)明的上下文中，術語“寡核苷酸”是指由大量“核苷酸”作為“單體單元”形成的“多核苷酸”，即“寡核苷酸”屬于具有“單體單元”的核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA)的“寡聚化合物”或“多聚化合物”的特別的亞組。根據(jù)本發(fā)明，術語“寡核苷酸”僅包括由天然存在的核苷酸組成的“寡核苷酸”。磷酸基團通常被指形成“寡核苷酸”的核苷間(intemucleoside)主鏈。
“修飾的寡核苷酸”(或“寡核苷酸類似物”)屬于“寡聚化合物”的另一特別的亞組，其具有一個或幾個“核苷酸”，一個或幾個“非核苷酸化合物”或“修飾的核苷酸”作為“單體單元”。因此，術語“修飾的寡核苷酸”(或“寡核苷酸類似物”)是指功能與“寡核苷酸”基本相似的結構，在本申請中可互換使用。從合成角度來看，“修飾的寡核苷酸”(或“寡核苷酸類似物”)可例如通過“寡核苷酸”的化學修飾制得，所述化學修飾通過磷酸主鏈、核糖單元或核苷酸堿基的適當修飾進行(Uhlmann和Peyman，Chemical Reviews 90(1990)543；Verma，S.，和Eckstein，F(xiàn).，Annu.Rev.Biochem.67(1998)99-134)。代表性的修飾包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸甲酯、磷酸三酯和氨基磷酸酯核苷間連接代替磷酸二酯核苷間連接；脫氮或氮雜嘌呤和嘧啶代替天然嘌呤和嘧啶堿基，在5或6位具有取代基的嘧啶堿基；在2、6或8位具有改變了的取代基的嘌呤堿基，或在7位具有改變了的取代基的嘌呤堿基如7-脫氮嘌呤；在例如2’位具有取代基的糖；或碳環(huán)或無環(huán)糖類似物。與本發(fā)明的精神一致其他修飾是本領域技術人員公知的。對這樣的“修飾的寡核苷酸”(或“寡核苷酸類似物”)的最佳描述是與天然的“寡核苷酸”(或按照天然的排列合成的“寡核苷酸”)在功能上可互換，但在結構上不同。更詳細地，Verma，S.和Eckstein，F(xiàn).，Annu.Rev.Biochem.67(1998)99-134或WO 02/12263公開了例示性的修飾。此外，也可以進行這樣的修飾，其中核苷單元通過基團連接，所述基團取代了核苷間磷酸或糖磷酸連接。這樣的連接包括Verma，S.和Eckstein，F(xiàn).，Annu.Rev.Biochem.67(1998)99-134公開的那些。當使用了不同于磷酸連接的連接方式來連接核苷單元時，這樣的結構也被描述為“寡核苷”。
和“寡核苷酸”和“修飾的寡核苷酸”一樣，本發(fā)明的“寡聚化合物”可用本領域原理性描述的方法和本領域技術人員公知的方法來合成。制備特定序列的寡聚化合物的方法是本領域已知的，包括例如適當序列的克隆和限制性作用(restriction)以及直接化學合成。化學合成可包括例如Narang，S.A.等，Methods in Enzymology 68(1979)90-98描述的磷酸三酯法，Brown，E.L.等，Methods in Enzymology 68(1979)109-151公開的磷酸二酯法，Beaueage等，Tetrahedron Letters 22(1981)1859公開的亞磷酰胺法，Garegg等，Chem.Scr.25(1985)280-282公開的H-膦酸法和US 4,458,066公開的共同支持物法。
如上所述，“核酸”是本領域技術人員已知的“核苷酸”多聚化合物。在本文中，它表示待測樣品中的“核酸”，即它在樣品中是否存在或它在樣品中的含量有待確定。因此，換句話說，“核酸”是靶，可被稱為“靶核酸”。例如，如果需要確定血液中是否含有人免疫缺損病毒，則“靶核酸”就是人免疫缺損病毒的核酸。
本文所用的術語“引物”是本領域技術人員公知的，指的是“寡聚化合物”，主要是“寡核苷酸”，但也可以是能夠“引導(prime)”模板依賴性的DNA聚合酶進行DNA合成的“修飾的寡核苷酸”，所述DNA合成即例如寡核苷酸的3’末端提供游離的3’-OH基團，通過模板依賴性聚合酶將其他“核苷酸”與之連接，形成3’至5’的磷酸二酯鍵，由此使用脫氧核苷三磷酸，釋放焦磷酸。
術語“探針”指的是合成的或生物產(chǎn)生的核酸(DNA或RNA)，通過設計或篩選，它們含有特定的核苷酸序列，使得它們在預定的嚴緊性下與“靶核酸”特異性(即優(yōu)先地(preferentially))雜交。“探針”可以被識別為“俘獲探針”，意味著它“俘獲”靶核酸，使得靶核酸能從妨礙檢測的不需要的物質(zhì)中分離出來。一旦完成分離，可以用適當?shù)姆椒▽Ψ@的“靶核酸”進行檢測?！胺@”探針通常與固相連接。
“烷基”優(yōu)選地選自含有1至10個碳原子的烷基，可以是直鏈的、支鏈的或環(huán)狀的。烷基的實際長度依賴于烷基所處的特定位置的空間排列情況。如果存在空間限制，烷基通常較小，優(yōu)選甲基和乙基。所有的烷基、鏈烯基和炔基可以是未取代的和取代的。如上所述用雜原子取代有助于提高水溶液中的溶解性。
“烯基”優(yōu)選地選自含有2至10個碳原子的烯基。對于選擇而言，可采用針對烷基基團的類似考慮。它們也可以是直鏈的、支鏈的或環(huán)狀的。最優(yōu)選的烯基是乙烯基。在烯基中可以有多于一個的雙鍵。
“炔基”優(yōu)選地具有2至10個碳原子。同樣，這些碳原子可以排列成直鏈、支鏈或環(huán)形。炔基中可以有多于一個的三鍵。
“保護基”是一種化學基團，它與官能部分連接(例如與羥基中的氧、氨基中的氮或巰基中的硫連接，以取代氫)以保護官能團免于發(fā)生不需要的反應。保護基被以下事實進一步限定，即它可在不破壞所形成的分子的生物學活性的條件下被除去。在此，所形成的分子是與化合物結合的核酸。適當?shù)谋Ｗo基是本領域技術人員已知的。本發(fā)明優(yōu)選的保護基是芴基甲氧羰基(FMOC)、二甲氧基三苯甲基(DMT)、單甲氧基三苯甲基、三氟乙?；?、乙酰丙酰基或甲硅烷基。核苷酸或寡核苷酸5’末端的羥基的優(yōu)選保護基例如選自三苯甲基，例如二甲氧基三苯甲基(DMT)。式I中外環(huán)(exocyclic)氨基基團的優(yōu)選保護基?；顑?yōu)選苯甲?；?Bz)、苯氧乙?；⒁阴；蚣柞；?，脒保護基例如N，N-二烷基甲脒基團，優(yōu)選二甲基-、二異丁基-和二-正丁基甲脒。優(yōu)選的O保護基是芳?；?、二苯基氨基甲?；?、酰基和甲硅烷基。在這些基團中最優(yōu)選的是苯甲?；?。優(yōu)選的甲硅烷基是三烷基甲硅烷基，如三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基和叔丁基-二甲基-甲硅烷基。另一種優(yōu)選的甲硅烷基是三甲基甲硅烷基-氧-甲基基團(TOM)(WO99/09044)。此外，優(yōu)選的保護基是鄰硝基芐基、2-(4-硝基苯基)乙氧羰基(NPEOC)，光激活化合物如2-硝基苯基-丙氧基-羰基(NPPOC)(Giegrich等，Nucleosides & Nucleotides 17(1009)1987)和烯丙氧羰基。
“標記物”，通常稱為“報告基團”，是使核酸，特別是本發(fā)明的“寡聚化合物”或“修飾的寡核苷酸”，以及與之結合的任意核酸，從液體多余物(即樣品)中區(qū)別開來的一般基團(與“標記物”連接的核酸也可被稱為標記的核酸結合化合物、標記的探針或被稱為探針)。本發(fā)明的優(yōu)選標記物是熒光標記物，所述熒光標記物例如是熒光染料，如熒光素染料、若丹明染料、花青素染料和香豆素染料。
術語“連接部分”指的是一組原子，它們將待用部分(例如“固相”或“標記物”)與“核苷酸”、“修飾的核苷酸”或“非核苷酸化合物”的連接部位連接起來。這可以是例如“核苷酸”或“修飾的核苷酸”(或在特殊情況下甚至“非核苷酸化合物”)的堿基、糖或磷酸部分，或“非核苷酸化合物”或“修飾的核苷酸”的堿基樣、糖樣或磷酸樣部分?！斑B接部分”可提供柔性(flexibility)，使得本發(fā)明的“寡聚化合物”，特別是“修飾的寡核苷酸”，可與待測“靶核酸”結合，而不受“固相”或“標記物”的顯著影響?！斑B接部分”，特別是非疏水(例如基于連續(xù)的ethylenoxy單元)的那些，例如如DE3943522公開的，是本領域技術人員公知的。
根據(jù)本發(fā)明，“固相”可以是用于寡核苷酸合成的受控多孔玻璃(CPG)、聚苯乙烯或硅膠。
如本文所用的，“熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)關系”和類似的術語指的是用“供體熒光標記物”標記的“寡聚化合物”和用“受體熒光標記物”標記的另一“寡聚化合物”與“靶核酸”相鄰雜交(adjacenthybridization)，使得“供體熒光標記物”能將共振能量轉(zhuǎn)移到“受體熒光標記物”，使“受體熒光標記物”產(chǎn)生可測量的熒光發(fā)射。如果“供體熒光標記物”和“受體熒光標記物”相距太遠，則“供體熒光標記物”不能將共振能量轉(zhuǎn)移到“受體熒光標記物”而使“受體熒光標記物”發(fā)出可測量的熒光，此時“供體熒光標記物”和“受體熒光標記物”沒有處于共振能量轉(zhuǎn)移關系。
“陣列”是指一個裝置上的一些位置的排列，所述位置是可尋址的(見例如US 5,143,854,US 6,022,963，US 6,156,501，WO 90/15070，WO 92/10092)。所述位置可被排列為二維陣列、三維陣列和其他矩陣格式。位置的數(shù)量可以是幾個到至少幾十萬個。最重要地，每個位置代表一個完全獨立的反應位點。每個位置攜帶核酸作為例如“寡聚化合物”，所述核酸可作為另一核酸(特別是靶核酸)的結合伴體。
發(fā)明詳述在本發(fā)明的一個實施方案中提供了式I化合物 (式I)
其中Y選自O、S和NR4，R4是烷基、烯基、炔基、芳基、?；?、保護基或H；X是連接部分，n是0或1；R1獨立于R2、R3和R4，R1選自(1)保護基，(2)標記物，和(3)固相；R2和R3相互獨立，并獨立于R1或R4，R2和R3選自(1)H，(2)保護基，(3)固相和連接部分X，(4)亞磷酰胺，(5)H-膦酸(H-phosphonate)，和(6)三磷酸(triphosphate)；條件是R3而不是R2可以是三磷酸，如果R3是三磷酸，則R1不是固相；R2和R3不都是固相，不都是亞磷酰胺，不都是H-膦酸、不都是-H，不都是保護基，不是亞磷酰胺和H-膦酸，不是固相和亞磷酰胺，或不是固相和H-膦酸；當選自R1、R2或R3的一個殘基是固相時，選自R1、R2或R3的其他兩個殘基不是固相。
在最優(yōu)選的實施方案中，Y是O。
在另一個優(yōu)選實施方案中，R1獨立于R2、R3和R4，R1選自保護基和標記物，最優(yōu)選R1是標記物。
本發(fā)明特別優(yōu)選的是用于合成本發(fā)明的寡聚化合物的化合物。因此，在優(yōu)選實施方案中，R2和R3彼此獨立，并獨立于R1或R4，R2選自固相和連接部分X、亞磷酰胺和H-膦酸，R3是-H或保護基，優(yōu)選R3是保護基。在更優(yōu)選的實施方案中，R2和R3彼此獨立，并獨立于R1或R4，R2是固相和連接部分X，R3是-H。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，R2和R3彼此獨立，并獨立于R1或R4，R2是亞磷酰胺或H-膦酸，優(yōu)選R2是亞磷酰胺，R3是保護基，R1是標記物或保護基，優(yōu)選R1是標記物。在此情況下，優(yōu)選X是連接部分，n是1。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，X是連接部分，n是1。在另一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的化合物的連接部分X包含碳和氧原子。在更優(yōu)選的實施方案中，連接部分X包含-(CH2)m或-(CH2CH2O)m部分，m是0和10之間的整數(shù)，優(yōu)選1和10之間的整數(shù)。在更優(yōu)選的實施方案中，連接部分X選自(1)-CO-(CH2)m-Z-(2)-CO-(CH2CH2O)m-CH2CH2-Z-其中m是0和10之間的整數(shù)，優(yōu)選1和10之間的整數(shù)，Z選自NH、CO、O和S。在本發(fā)明非常優(yōu)選的實施方案中，Z是NH或CO。在一個實施方案中，連接物是草?；苌?，即X是-CO-CO-，這意味著-CO-(CH2)m-Z-中Z＝CO并且m＝0。然而，更優(yōu)選地，m是2或3。因此最優(yōu)選地，連接物是琥珀酸衍生物，即X是-CO-(CH2)2-CO-，這意味著-CO-(CH2)m-Z-中Z＝CO并且m＝2。在另一優(yōu)選實施方案中，連接物是戊二酸衍生物，即X是-CO-(CH2)3-CO-，這意味著-CO-(CH2)m-Z-中Z＝CO并且m＝3。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，保護基選自-芴基甲氧羰基，-二甲氧基三苯甲基，-單甲氧基三苯甲基，-三氟乙?；?，-乙酰丙?；?levulinyl)，和-甲硅烷基。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，R1是標記物，優(yōu)選熒光標記物，如選自下列的熒光染料-熒光素染料，-若丹明染料，-花青素染料，和-香豆素染料。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案中，化合物是下式1，5-內(nèi)醚-2-氨基-2，3-二脫氧-D-山梨醇的衍生物
或是下式1，5-內(nèi)醚-2-氨基-2，3-二脫氧-D-甘露醇的衍生物 本發(fā)明特別優(yōu)選的實施方案是下式的山梨醇-FAM-亞磷酰胺化合物
本發(fā)明另一特別優(yōu)選的實施方案是下式的甘露醇-FAM-亞磷酰胺化合物 本發(fā)明另一特別優(yōu)選的實施方案是下式化合物(保護基FMOC9-芴基-甲氧羰基) 在本發(fā)明的特別優(yōu)選的實施方案中，寡聚化合物包含式II的單體單元
(式II)其中Y選自O、S和NR4，R4是烷基、烯基、炔基、芳基、酰基、保護基或H；X是連接部分，n是0或1；R7獨立于R4、R5和R6，R7選自(1)-H，(2)保護基，(3)標記物，(4)寡核苷酸，和(5)固相，R5和R6彼此獨立，并且獨立于R4或R7，R5和R6選自(1)-H，(2)固相和連接部分X，(3)磷酸，和(4)帶有核苷酸、修飾的核苷酸、寡核苷酸和修飾的寡核苷酸的磷酸二酯，條件是R5和R6不都是-H，都是固相和連接部分X，都是磷酸，或是-H和磷酸；當選自R5、R6或R7的一個殘基是固相時，選自R5、R6或R7的其他殘基不是固相。
在優(yōu)選實施方案中，Y是O。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案中，單體單元是下式1，5-內(nèi)醚-2-氨基-2，3-二脫氧-D-山梨醇的衍生物
或是下式1，5-內(nèi)醚-2-氨基-2，3-二脫氧-D-甘露醇的衍生物 在另一優(yōu)選實施方案中，R7獨立于R4、R5和R6，R7選自-H、固相、保護基和標記物，最優(yōu)選R7是-H或標記物，更優(yōu)選R7是標記物。
在另一優(yōu)選實施方案中，R5和R6彼此獨立，并且獨立于R7或R4，R5和R6選自-H、磷酸、帶有寡核苷酸或修飾的寡核苷酸的磷酸二酯。在另一優(yōu)選實施方案中，R5和R6彼此獨立，并且獨立于R4或R7，R5和R6是帶有寡核苷酸或修飾的寡核苷酸的磷酸二酯。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，X是連接部分，n是1。在另一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的寡聚化合物的連接部分X含有碳和氧原子。在更優(yōu)選實施方案中，連接部分X包含-(CH2)m或-(CH2CH2O)m部分，m是0和10之間的整數(shù)，優(yōu)選1和10之間的整數(shù)。在更優(yōu)選的實施方案中，連接部分X選自(1)-CO-(CH2)m-Z-(2)-CO-(CH2CH2O)m-CH2CH2-Z-其中m是0和10之間的整數(shù)，優(yōu)選1和10之間的整數(shù)，Z選自NH、CO、O和S。在本發(fā)明非常優(yōu)選的實施方案中，Z是NH或CO。在一個實施方案中，連接物是草?；苌铮碭是-CO-CO-，這意味著-CO-(CH2)m-Z-中Z＝CO并且m＝0。然而，更優(yōu)選地，m是2或3。因此最優(yōu)選地，連接物是琥珀酸衍生物，即X是-CO-(CH2)2-CO-，這意味著-CO-(CH2)m-Z-中Z＝CO并且m＝2。在另一優(yōu)選實施方案中，連接物是戊二酸衍生物，即X是-CO-(CH2)3-CO-，這意味著-CO-(CH2)m-Z-中Z＝CO并且m＝3。
在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的寡聚化合物的保護基選自(1)芴基甲氧羰基，(2)二甲氧基三苯甲基，(3)單甲氧基三苯甲基，(4)三氟乙?；?，(5)乙酰丙?；?6)甲硅烷基。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的寡聚化合物的R7是標記物，優(yōu)選熒光標記物(或熒光染料)，優(yōu)選選自(1)熒光素染料，(2)若丹明染料，(3)花青素染料，和(4)香豆素染料。
最優(yōu)選的熒光標記物是熒光素或若丹明染料。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的寡聚化合物包含一種單體單元，它是(1)與核苷酸的堿基、糖或磷酸部分連接的第二標記物，優(yōu)選第二熒光標記物，更優(yōu)選帶有第二熒光標記物的連接部分，或(2)與修飾的核苷酸或非核苷酸化合物連接的第二標記物，優(yōu)選第二熒光標記物，更優(yōu)選帶有第二熒光標記物的連接部分。
第二熒光標記物優(yōu)選是熒光素染料、若丹明染料、花青素染料或香豆素染料。最優(yōu)選的第二熒光標記物是若丹明染料或花青素染料。
只有在存在第二標記物或熒光標記物的情況下，為清楚起見，標記物或熒光標記物也可被表示為第一標記物或第一熒光標記物。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的寡聚化合物包含一種單體單元，它是(1)與核苷酸的堿基、糖或磷酸部分連接的被保護的連接部分，(2)帶有與修飾的核苷酸或非核苷酸化合物連接的保護基的連接部分。
在本發(fā)明的另一實施方案中，本發(fā)明的寡聚化合物的修飾的寡核苷酸包含一種單體單元，它包含選自下列的部分(1)環(huán)己烷-1，1-二甲醇(如US 6,130,323所述)，(2)1，3-丙二醇(如US 5,451,463所述)，(3)2，2-二-(3-氨基丙基)-1，3-二羥基丙烷(如EP0313219)，和(4)1，5-內(nèi)醚-2-氨基-2，3-二脫氧-己糖醇。
優(yōu)選地，本發(fā)明的寡聚化合物的修飾的寡核苷酸包含一種單體單元，它包含本發(fā)明的1，5-內(nèi)醚-2-氨基-2，3-二脫氧-己糖醇部分。
為了以LightCycler_Instrument所用的形式使用，本發(fā)明的化合物在合成過程中優(yōu)選地指向寡聚化合物的3’或5’末端。
優(yōu)選地為了以TaqMan_形式使用，與本發(fā)明的寡聚化合物連接的標記物R7在本發(fā)明的寡聚化合物內(nèi)部合成之后，可位于本發(fā)明的寡聚化合物的5’末端或3’末端。標記物優(yōu)選地是熒光標記物，優(yōu)選熒光素或若丹明染料。本發(fā)明的寡聚化合物可進一步包含其他標記物，其中標記物之一的發(fā)射波長與另一標記物的吸收波長重疊。優(yōu)選地，寡聚化合物還包含用作淬滅劑的第二標記物，其淬滅熒光標記物(可以是熒光素)的熒光發(fā)射。優(yōu)選的淬滅劑是熒光若丹明或花青素染料或非熒光標記物如dabcyl(“暗淬滅物”)。
在最優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的寡聚化合物不能酶促延伸，以用作TaqMan_形式中的探針，如US 5,210,015、US 5,478,972或US5,804,375原理性指出的。優(yōu)選地，寡聚化合物3’末端的單體單元是2’，3’-二脫氧核苷酸或3’-磷酸化核苷酸。優(yōu)選地為了用于TaqMan_形式，帶有標記物(優(yōu)選熒光標記物)的本發(fā)明的單體單元，以及帶有另一標記物(優(yōu)選第二熒光標記物)的第二單體單元，可位于本發(fā)明的寡聚化合物的內(nèi)部，或位于本發(fā)明的寡聚化合物的5’末端和/或3’末端。
本領域技術人員會認識到本發(fā)明的化合物或本發(fā)明的寡聚化合物的己糖醇環(huán)可攜帶其他取代基，并仍能在本發(fā)明的方法中起作用。具體地說，己糖醇和連接部分可進一步攜帶鹵素或烷基、烯基、炔基、任選含有雜原子的芳基或任選被已標出的取代基取代的雜芳基取代基。通過例如1.5.中、LightCycler_instrument或TaqMan_所用的測試方式中、利用亞磷酰胺或與固相連接的化合物的本發(fā)明的化學合成方法中描述的與互補寡核苷酸的簡單雜交實驗，可以檢測這些化合物是否可用于本發(fā)明的方法或用途。
在進一步的實施方案中，本發(fā)明的化合物，其中R2是亞磷酰胺或帶有連接部分X的固相，R3是保護基，被本發(fā)明的修飾的寡核苷酸的化學合成。在另一實施方案中，本發(fā)明的寡聚化合物被用于與核酸的雜交反應。這也可以用所謂陣列方式進行。在本發(fā)明的另一實施方案中，本發(fā)明的寡聚化合物被用作引物、探針或俘獲探針。
本發(fā)明的寡聚化合物可用本領域原理性描述的和本領域技術人員已知的方法合成。特別優(yōu)選的結構單元(building blocks)是本發(fā)明的化合物。制備寡聚化合物，如特定序列的寡核苷酸和修飾的寡核苷酸的方法，是本領域已知的，包括例如適當序列的克隆和限制性處理，以及直接化學合成?；瘜W合成方法可包括例如Narang，S.A.等，Methods inEnzymology 68(1979)90-98描述的磷酸三酯法，Brown，E.L.等，Methods in Enzymology 68(1979)109-151公開的磷酸二酯法，Beaucage等，Tetrahedron Letters 22(1981)1859公開的亞磷酰胺法，Garegg等，Chem.Scr.25(1985)280-282公開的H-磷酸酯法，和US4,458,066公開的固體支持物法。特別優(yōu)選的是亞磷酰胺法。因此，在本發(fā)明的另一實施方案中，提供了本發(fā)明的寡聚化合物的化學合成方法，其包括以下步驟(a)提供本發(fā)明的化合物，其中R2是亞磷酰胺，R3是保護基，(b)提供通過3’-OH基團與固相結合的核苷或修飾的核苷的5’-OH基團，或提供通過3’-OH基團與固相結合的寡核苷酸或修飾的核苷的5’-OH基團，所述3’-OH基團是寡核苷酸或修飾的寡核苷酸的3’末端的核苷酸或修飾的核苷酸的3’-OH基團，(c)將亞磷酰胺的磷原子與5’-OH基團反應，形成亞磷酸酯，將亞磷酸酯氧化為磷酸三酯，(d)任選地在下面步驟中將步驟(c)中任意的未反應的5’-OH基團與另一化合物反應，以避免步驟(c)中未反應的5’-OH基團發(fā)生進一步的反應(“加帽(Capping)”反應)，(e)任選地在除去本發(fā)明的化合物的保護基后，用核苷或修飾的核苷的亞磷酰胺衍生物重復步驟(a)至(d)，(f)從固相上切下寡聚化合物，除去保護基，由此將磷酸三酯轉(zhuǎn)變?yōu)榱姿岫ィ?g)分離寡聚化合物。
本發(fā)明的優(yōu)選實施方案涉及合成本發(fā)明的化合物的方法，包括以下步驟(a)提供式III化合物，式III 其中R8和R9表示第一和第二O-保護基或一起形成苯亞甲基殘基，其亞甲基與式III的兩個氧原子相連；(b)將式III化合物與離去基團如對甲苯磺酰氯反應，得到式IV衍生物，式IV Tosyl表示對甲苯磺酰殘基；(c)將式IV化合物與疊氮化物反應，得到式V化合物；式V
(d)在式V化合物的4位和6位氧原子上去保護，得到式VI化合物；式VI (e)用4，4’-二甲氧基三苯甲基殘基保護6-OH部分，得到式VII化合物，式VII DMT表示4，4’-二甲氧基三苯甲基殘基；(f)用還原劑如三苯基膦(triphenylphosphane)還原疊氮官能團，得到式VIII化合物；式VIII (g)將殘基R1或任選帶有連接部分X的殘基R1與2氨基官能團偶聯(lián)，得到式IX化合物，其中n是0或1，式IX (h)將亞磷酰胺官能團加到4位氧上，得到式X化合物，其中n
是0或1，式X (i)分離化合物。
本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案涉及合成本發(fā)明的化合物的方法，包括以下步驟(a)提供式III化合物，式III (b)R8和R9表示第一和第二O-保護基或一起形成苯亞甲基殘基，其亞甲基與式III的兩個氧原子相連；(c)將式III化合物與離去基團如對甲苯磺酰氯反應，得到式IV衍生物，式IV Tosyl表示對甲苯磺酰殘基；(d)將式IV化合物與另一離去基如溴化物反應，得到式XI化合物；
式XI (e)將式XI化合物與疊氮化物反應，得到式XII化合物；式XII (f)在式XII化合物的4位和6位氧原子上去保護，得到式XIII化合物；式XIII (g)用4，4’-二甲氧基三苯甲基殘基保護6-OH部分，得到式XIV化合物，式XIV DMT表示4，4’-二甲氧基三苯甲基殘基；(h)用還原劑如三苯基膦還原疊氮官能團，得到式XV化合物；
式XV (i)將殘基R1或任選帶有連接部分X的殘基R1與2氨基官能團偶聯(lián)，得到式XVI化合物，其中n是0或1，式XVI (j)將亞磷酰胺官能團加到4’位氧上，得到式XVII化合物，其中n是0或1，式XVII (k)分離化合物。
在本發(fā)明的另一實施方案中，試圖(contemplate)用末端轉(zhuǎn)移酶將本發(fā)明的化合物轉(zhuǎn)變?yōu)槎嗪塑账峄蚬押塑账帷Ｖ饕姆椒ㄊ潜绢I域技術人員已知的。在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了酶促合成本發(fā)明的多聚或寡聚化合物的方法，其包括以下步驟(a)將本發(fā)明的化合物，其中所述化合物的R3是三磷酸酯，(b)在末端轉(zhuǎn)移酶存在下，與多核苷酸、寡核苷酸或修飾的寡核苷酸的3’末端的核苷酸或修飾的核苷酸的3’-OH基團溫育，使化合物與3’-OH基團連接，釋放焦磷酸化物，并(c)釋放多聚或寡聚化合物。
在另一實施方案中，試圖進行本發(fā)明的寡聚化合物的在后標記(post-labelling)。因此，在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了將標記物與本發(fā)明的寡聚化合物連接的方法，其中寡聚化合物的R7是保護基，所述方法包括以下步驟-除去保護基R7，并-將寡聚化合物的去保護部分與標記物反應。
去保護部分是NH2、OH或SH部分，優(yōu)選NH2部分。
進行這些反應步驟的方法是本領域技術人員已知的。
在本發(fā)明的另一實施方案中，提供了檢測樣品中靶核酸的方法，包括以下步驟(a)提供懷疑含有靶核酸的樣品，(b)提供本發(fā)明的寡聚化合物，其與靶核酸的一部分或全部基本上互補，(c)任選地用模板依賴型DNA聚合酶和引物擴增靶核酸，(d)在使寡聚化合物和靶核酸結合的條件下，使樣品和寡聚化合物接觸，(e)確定靶核酸和寡聚化合物之間的結合產(chǎn)物或雜交程度，作為靶核酸存在、不存在或它的含量的量度。
優(yōu)選地，本發(fā)明的寡聚化合物含有兩個標記物，優(yōu)選兩個熒光標記物。
擴增反應優(yōu)選地用聚合酶鏈式反應進行，其特異性地將靶核酸擴增到可檢測的量。其他可能的擴增反應是連接酶鏈式反應(LCR；Wu，D.Y.和Wallace，R.B.，Genomics 4(1989)560-569；和Barany，F(xiàn).，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88(1991)189-193)；聚合酶連接酶鏈式反應(Barany，F(xiàn).，PCR Methods and Applic.1(1991)5-16)；Gap-LCR(WO90/01069)；修復鏈反應(EP 0439182A2)，3SR(Kwoh，D.Y.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)1173-1177；Guatelli，J.C.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87(1990)1874-1878；WO 92/08808)和NASBA(US5,130,238)。此外，還有鏈取代擴增(SDA)，轉(zhuǎn)錄介導的擴增(TMA)和Qβ擴增(綜述見Whelen，A.C.和Persing，D.H.，Annu.Rev.Microbiol.50(1996)349-373；Abramson，R.D.和Myers，T.W.，Current Opinion inBiotechnology 4(1993)41-47)。
優(yōu)選的模板依賴型DNA聚合酶是Taq聚合酶。
在方法的優(yōu)選實施方案中，試圖用TaqMan_測試所用的形式，其中本發(fā)明的寡聚化合物被用作探針。因此，本發(fā)明的寡聚化合物包含標記物如R7，其優(yōu)選是熒光標記物，優(yōu)選熒光素。本發(fā)明的寡聚化合物還可包含其他熒光標記物，其中熒光標記物中的一個的發(fā)射波長與另一熒光標記物的吸收波長重疊。優(yōu)選地，寡聚化合物還包含作為淬滅劑的第二熒光標記物，其淬滅熒光標記物(可以是熒光素)的熒光發(fā)射。優(yōu)選淬滅劑是熒光若丹明和花青素。淬滅劑也可以是非熒光化合物或染料如dabcyl(“暗淬滅物”)。本發(fā)明的寡聚化合物不能酶促延伸，以用作TaqMan_形式中的探針，如US 5,210,015、US5,478,972或US 5,804,375原理性指出的。優(yōu)選地，寡聚化合物3’末端的單體單元是2’，3’-二脫氧核苷酸或3’-磷酸化核苷酸。優(yōu)選地為了用于TaqMan_形式，帶有標記物的本發(fā)明的化合物，以及帶有標記物的第二化合物，可位于本發(fā)明的修飾的寡核苷酸的內(nèi)部，或位于本發(fā)明的修飾的寡核苷酸的5’末端和/或3’末端。作為TaqMan_測試所用形式的結果，在方法的測定步驟中，熒光標記物和第二標記物(即淬滅劑)的空間關系在雜交之后發(fā)生改變，優(yōu)選地通過模板依賴型DNA聚合酶(優(yōu)選Taq聚合酶)對核酸結合化合物進行核酸外切酶水解來進行；作為核酸外切酶水解的結果，標記物得到釋放。本發(fā)明的寡聚化合物和核酸之間雜交的程度由雜交之后從本發(fā)明的寡聚化合物中釋放的標記物的量來確定。因此，本發(fā)明的優(yōu)選實施方案是在步驟(d)中，雜交的程度是由從與核酸雜交的寡聚化合物中釋放的標記物的量確定的，所述釋放是通過模板依賴型DNA聚合酶的核酸外切酶水解進行的。
在本發(fā)明的與TaqMan_測試密切相關的非常優(yōu)選的實施方案中，提供了檢測樣品中靶核酸的方法，包括以下步驟(a)使含有單鏈核酸的樣品與寡核苷酸和寡核苷酸以及本發(fā)明的寡聚化合物接觸，所述寡核苷酸含有與靶核酸的一個區(qū)域互補的序列，本發(fā)明的寡聚化合物中R7是熒光標記物，寡聚化合物含有第二熒光標記物，所述寡聚化合物含有與相同靶核酸序列鏈的第二區(qū)域互補的序列，但不包含寡核苷酸所限定的序列；在雜交條件下產(chǎn)生雙鏈混合物，所述雙鏈含有與寡核苷酸和寡聚化合物退火的靶核酸，使得第一寡核苷酸的3’末端位于寡聚化合物5’末端的上游；(b)使步驟(a)的混合物保持有5’至3’核酸酶活性，所用的條件足以使聚合酶的5’至3’核酸酶活性切割退火的寡聚化合物，釋放標記的片段；(c)檢測和/或測量標記的片段的釋放情況。
在本發(fā)明的另一實施方案中，提供了用于LightCycler_Instrument的形式，如US 6,174,670所描述的。為用于LightCycler_Instrument的形式，本發(fā)明的化合物優(yōu)選在合成寡聚化合物之后位于寡聚化合物的3’或5’末端，即3’或5’末端的單體單元。這些形式應用了熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(見例如美國專利4,996,143、5,565,322、5,849,489和6,162,603)，并基于這樣一個事實，即當供體和相應的受體熒光標記物處于一定距離之內(nèi)時，在兩個熒光標記物之間會發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，這可被看到或檢測到和/或量化。如本文所用的，兩個探針(各自含有熒光標記物，其中至少一個是本發(fā)明的寡聚化合物)可以在特定位置與擴增產(chǎn)物雜交，所述特定位置是通過探針與靶核酸的互補性確定的。本發(fā)明的寡聚化合物的熒光標記物可以是供體或受體熒光標記物。通過探針與擴增產(chǎn)物在適當位置的雜交，產(chǎn)生了FRET信號?？捎美绻庾佑洈?shù)epifluorescent顯微系統(tǒng)(包括適當?shù)亩早R和濾鏡，以監(jiān)測特定范圍內(nèi)的熒光發(fā)射)、光子記數(shù)光倍增系統(tǒng)或熒光計，進行熒光分析。可用氬離子激光、高亮度水銀(Hg)弧燈、纖維光學光源或其他高亮度光源來進行起始能量轉(zhuǎn)移的激發(fā)，所述光源經(jīng)過適當過濾以在所需范圍內(nèi)進行激發(fā)。關于本文所用的供體和相應的受體熒光標記物，“相應的”是指受體熒光標記物具有與供體熒光標記物的發(fā)射光譜重疊的激發(fā)光譜。相應地，在兩者之間可產(chǎn)生有效的非輻射能量轉(zhuǎn)移。優(yōu)選的熒光標記物是以熒光素作為供體熒光標記物，受體熒光標記物是若丹明，但優(yōu)選花青素染料，優(yōu)選US 6,174,670描述的Cy5。
因此，在本發(fā)明的實施方案中，提供了檢測樣品中靶核酸是否存在的方法，包括以下步驟進行至少一個循環(huán)步驟，其中循環(huán)步驟包括擴增步驟和雜交步驟，其中擴增步驟包括將樣品與引物接觸，如果樣品中存在靶核酸，則產(chǎn)生擴增產(chǎn)物；雜交步驟包括將樣品與一對探針接觸，探針對中的成員在彼此不超過5個核苷酸的條件下與擴增產(chǎn)物雜交，其中探針對中的第一探針用供體熒光標記物標記，探針對中的第二探針用相應的受體熒光標記物標記；檢測所述第一探針的供體熒光標記物和所述第二探針的受體熒光標記物之間是否存在熒光共振能量轉(zhuǎn)移，其中FRET存在表明樣品中存在靶核酸，F(xiàn)RET不存在表明樣品中不存在靶核酸。
因此，在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，提供了檢測樣品中靶核酸的方法，包括以下步驟在兩個核酸探針存在下通過聚合酶鏈式反應擴增核酸，探針是本發(fā)明的寡聚化合物，與靶核酸的相鄰區(qū)域雜交，探針中的一個用受體熒光標記物標記，另一探針用熒光能量轉(zhuǎn)移對的供體熒光標記物標記，使得兩個探針與靶核酸雜交之后，供體和受體熒光標記物彼此在25個核苷酸之內(nèi)；所述聚合酶鏈式反應包括以下步驟向樣品中加入熱穩(wěn)定聚合酶、核苷酸和靶核酸引物，在至少一個變性溫度和一個延伸溫度之間使樣品熱循環(huán)，用被供體熒光標記物吸收的一定波長的光激發(fā)生物樣品，檢測來自熒光能量轉(zhuǎn)移對的熒光發(fā)射。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案中，提供了檢測樣品中靶核酸的方法，包括以下步驟在兩個核酸探針存在下通過聚合酶鏈式反應擴增核酸，探針是本發(fā)明的寡聚化合物，與核酸的相鄰區(qū)域雜交，探針中的一個用受體熒光標記物標記，另一探針用熒光能量轉(zhuǎn)移對的供體熒光標記物標記，使得兩個探針與靶核酸雜交之后，供體和受體熒光標記物彼此在25個核苷酸之內(nèi)；所述聚合酶鏈式反應包括以下步驟向樣品中加入熱穩(wěn)定聚合酶、核苷酸和靶核酸引物，在至少一個變性溫度和一個延伸溫度之間使樣品熱循環(huán)，用被供體標記物吸收的一定波長的光激發(fā)生物樣品，監(jiān)測來自熒光能量轉(zhuǎn)移對的溫度依賴性熒光。
在另一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明試圖保護部件的試劑盒，試劑盒包括具有3’至5’核酸外切酶活性的溫度依賴型聚合酶，優(yōu)選Taq聚合酶，一組引物，核苷酸和本發(fā)明的寡聚化合物。本領域已知這樣的試劑盒還包括可在擴增過程中使用的塑料器皿，例如96或384孔微量滴定板，或者由例如Eppendorf、Hamburg、Germany制造的普通反應管，以及所有其他用于完成本發(fā)明方法的試劑。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案中，試劑盒包括用于分離核酸的其他試劑。因此，試劑盒可另外包括對核酸有親和性的材料，對核酸有親和性的材料優(yōu)選地包括有二氧化硅表面的材料。有二氧化硅表面的材料優(yōu)選地是玻璃。最優(yōu)選地，對核酸有親和性的材料是如WO96/41811或WO 01/37291中描述的含有磁性玻璃顆粒的組合物。試劑盒可另外包括使細胞裂解的裂解緩沖液，所述緩沖液含有例如離液劑(chaotropic agents)、去污劑、醇或它們的混合物；以及獨立的蛋白酶，例如蛋白酶K，用于酶解不需要的蛋白。本發(fā)明的試劑盒的這些組分可在管或貯存容器中分別提供。根據(jù)組分的特性，它們甚至可在單一的管或貯存容器中提供。試劑盒可另外包括洗滌溶液，其適用于當DNA或RNA與磁性玻璃顆粒結合時洗滌磁性玻璃顆粒的步驟。洗滌溶液可在一種或幾種緩沖液中含有乙醇和/或離液劑，所述緩沖液是酸性pH的，不含乙醇和/或如上文所述的離液劑。洗滌溶液或其他溶液通常以貯存液形式提供，在使用前稀釋。試劑盒可另外包括洗脫液或洗脫緩沖液，即將與磁性玻璃顆粒結合的DNA或RNA洗脫下來的溶液或緩沖液(例如10mM Tris，1mM EDTA，pH8.0)或純水。此外還可以有用于純化核酸(即DNA或RNA)的其他試劑或緩沖液。
提供以下實施例、參考文獻、序列表和附圖以幫助理解本發(fā)明，本發(fā)明的實際保護范圍由所附權利要求書給出。應理解在不背離本發(fā)明精神的條件下，可以對本發(fā)明的方法進行修改。


圖1基于1，5-內(nèi)醚-3-脫氧-D-甘露醇(8)和山梨醇(15)的熒光素標記的亞磷酰胺的合成。
圖2得自Biogenex的標記試劑FAM-和HEX-cx-亞磷酰胺(FAM熒光素；HEX六氯熒光素)。
圖36-O-DMT-1，5-內(nèi)醚-2，3-二脫氧-2-(N-Fmoc-6-氨基己?；被?-D-甘露醇-4-亞磷酰胺(17)的合成。
圖4用修飾的寡核苷酸進行的雜交實驗，所述修飾的寡核苷酸通過來源于己糖醇的本發(fā)明的化合物摻入了FAM殘基(Flu＝FAM-本發(fā)明的甘露醇化合物，F(xiàn)AM表示通過連接部分與甘露醇部分連接的熒光素)。
1.實施例1.1制備實施例-合成的一般性描述新的結構單元8和15的合成由商業(yè)上可得到的4，6-O-苯亞甲基-1，5-內(nèi)醚-3-脫氧-D-山梨醇1起始，如圖1所示。首先，2-羥基以89％的產(chǎn)率被甲苯磺?；玫?，其作為最終甘露醇異構劑(isomeric reagent)的中間體。為了得到相應的山梨醇衍生物，C-2的構型必須轉(zhuǎn)變。這通過用溶于吡啶的溴化鋰進行SN2型親核取代反應來完成，以66％的產(chǎn)率得到9。中間體2和9與溶于DMF的疊氮鈉反應，通過SN2型親核取代反應再次轉(zhuǎn)變C-2的構型，分別以97％和66％的產(chǎn)率得到甘露醇異構體2-疊氮基衍生物3和山梨醇異構體2-疊氮基衍生物10。用80％乙酸幾乎定量地進行苯亞甲基的去保護，得到4(93％)和11(98％)。其后，以77％的產(chǎn)率加入二甲氧基三苯甲基基團，得到中間體5和12。通過Staudinger反應還原疊氮基團，分別以93％和91％的產(chǎn)率得到2-氨基衍生物6和13。6和13與6-羧基熒光素二新戊酰(dipivaloate)(其被溶于DMF和N-甲基嗎啉的氯甲酸異丁酯原位激活)反應，以75％的產(chǎn)率得到化合物7和14。與溶于二氯甲烷的2-氰基乙氧基-二異丙基氨基-氯-膦和Hünigs堿反應，分別以81％的產(chǎn)率得到甘露醇構型(8)的相應的熒光素標記的亞磷酰胺，以88％的產(chǎn)率得到山梨醇構型(15)的相應的熒光素標記的亞磷酰胺。
從4，6-O-苯亞甲基-1，5-內(nèi)醚-3-脫氧-D-山梨醇1起始，可以得到總產(chǎn)率為34.9％的二新戊酰基(dipivaloyl)保護的用6-羧基熒光素標記的甘露醇構型的亞磷酰胺8，對相應的山梨醇構型的亞磷酰胺15而言總產(chǎn)率為17.6％，該產(chǎn)率比Biogenex連接物合成途徑(US 6,130,323)的總產(chǎn)率高。
用1H-NMR、31P-NMR和HPLC表征FAM標記的亞磷酰胺8和15。與Biogenex衍生物相比，新的單體除了在合成的方便性和產(chǎn)率方面具有出色的合成可達性(accessibility)之外，還具有其他優(yōu)點。通過使用甘露醇構型(8)或山梨醇構型(15)的結構單元，可以容易地使寡核苷酸中的標記物分子朝向5’方向或3’方向。這對于一些FRET應用是有利的。在使用親脂標記物時，在己糖醇環(huán)中加入醚官能團對溶解性來說是有利的。
1.2制備實施例-合成的詳細描述1.2.1 1，5-內(nèi)醚-2-O-甲苯磺?；?4，6-O-亞芐基-3-脫氧-D-山梨醇(2)將15g(63.8毫摩爾)1，5-內(nèi)醚-4，6-O-亞芐基-3-脫氧-D-山梨醇(CMS化學公司)和16.6g(86.2毫摩爾)對甲苯磺酰氯溶解于80毫升的吡啶中，室溫下攪拌過夜。然后加入300毫升的水，使產(chǎn)物結晶。反應混合物在+4℃下攪拌5小時，使結晶完全。過濾出固體，用冷水清洗，在高真空下用示藍(blue-indication)硅凝膠干燥，得到22.0g(88％)的無色固體。
1H-NMR(DMSO-d6，in ppm)7.86(d，2H，Tos)，7.51(d，2H，Tos)，7.41-7.34(m，5H，苯亞甲基)，5.56(s，1H，苯亞甲基-CH)，4.56(m，1H，山梨醇-C-2)，4.18/4.14(dd，1H，山梨醇-CH)，3.84/3.80(dd，1H，山梨醇-CH)，3.62-3.53(m，2H，山梨醇-CH)，3.43-3.37(m，1H，山梨醇-CH)，3.31-3.25(m，1H，山梨醇-CH)，2.43(s，3H，CH3)，2.14(m，1H，山梨醇-C-3-H)，1.75(q，1H，山梨醇-C-3-H)1.2.2 1，5-內(nèi)醚-2-疊氮基-4，6-O-亞芐基-2，3-二脫氧-D-甘露醇(3)將10g(25.0毫摩爾)1，5-內(nèi)醚-2-O-甲苯磺酰基-4，6-O-亞芐基-3-脫氧-D-山梨醇(2)和6.5g(100毫摩爾)疊氮鈉溶解于250毫升的DMF中，130℃下攪拌4.5小時。然后蒸發(fā)掉DMF。殘余物溶解于400毫升乙酸乙酯中，用200毫升0.1M的pH7.5的磷酸緩沖液清洗兩次。分離出有機層，用Na2SO4干燥，過濾并蒸發(fā)。殘余物溶解于25毫升的乙酸乙酯中，通過快速(flash)層析用硅凝膠純化(正己烷/乙酸乙酯2∶3)。將產(chǎn)物級分合并，在高真空下蒸發(fā)并干燥，得到6.5g(97％)的無色固體。
1H-NMR(DMSO-d6，in ppm)7.43-7.35(m，5H，苯亞甲基)，5.65(s，1H，苯亞甲基-CH)，4.17-4.12(m，2H，甘露醇-CH)，3.90-3.80(m，2H，甘露醇-CH)，3.72-3.65(m，2H，甘露醇-CH)，3.39-3.32(m，1H，甘露醇-C-2-H)，2.12-2.07(m，1H，甘露醇-C-3-H)，1.93 1.84(m，1H，甘露醇-C-3-H)1.2.3 1，5-內(nèi)醚-2-疊氮基-2，3-二脫氧-D-甘露醇(4)將13g(49.9毫摩爾)1，5-內(nèi)醚-2-疊氮基-4，6-O-亞芐基-2，3-二脫氧-D-甘露醇(3)溶解于700毫升80％的乙酸中，80℃下攪拌1小時。然后將反應混合物冷卻至室溫，蒸發(fā)至干燥。將殘余物溶解于50毫升的乙酸乙酯中，加入250毫升的正己烷。將反應瓶在4℃下保存過夜。移出上清，將油性的殘余物在高真空下干燥，得到8.0g(93％)的黃色油。
1H-NMR(DMSO-d6，in ppm)4.98(sb，1H，OH)，4.58(sb，1H，OH)，3.81-3.77(m，1H，甘露醇-CH)，3.70-3.65(m，1H，甘露醇-CH)，3.57-3.37(m，3H，甘露醇-CH)，3.04-2.99(m，1H，甘露醇-C-2-H)，2.09-2.02(m，1H，甘露醇-C-3-H)，1.66-1.58(m，1H，甘露醇-C-3-H)1.2.4 6-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-1，5-內(nèi)醚-2-疊氮基-2，3-二脫氧-D-甘露醇(5)將7.6g(44毫摩爾)1，5-內(nèi)醚-2-疊氮基-2，3-二脫氧-D-甘露醇(4)與3×40毫升的吡啶共蒸發(fā)，然后溶于120毫升的吡啶。在攪拌下于1小時之內(nèi)室溫下加入溶于120毫升吡啶的19.6g(53.3毫摩爾)的4，4’-二甲氧基三苯甲基氯。在室溫下將反應混合物再攪拌2小時。蒸發(fā)掉吡啶，將殘余物溶于800毫升的乙酸乙酯，用400毫升5％的碳酸氫鈉溶液清洗2次。分離出有機層，用硫酸鈉干燥，過濾并蒸發(fā)至干燥。將殘余物溶于30毫升的乙酸乙酯中，通過快速層析用硅凝膠純化(正己烷/乙酸乙酯/1％三乙胺梯度)。將產(chǎn)物級分合并，在高真空下蒸發(fā)并干燥，得到15.8g(77％)的淡黃色泡沫。
1H-NMR(DMSO-d6，in ppm)7.41(d，2H，DMT)，7.32-7.18(m，7H，DMT)，6.87(d，4H，DMT)，4.86(d，1H，OH)，3.89(m，2H，甘露醇-C-1-H)，3.73(s，6H，OCH3)，3.60-3.55(m，1H，甘露醇-CH)，3.48-3.43(m，1H，甘露醇-CH)，3.34-2.27(m，2H，甘露醇-C-6-H)，2.99(m，1H，甘露醇-C-H-2)，2.09-2.04(m，1H，甘露醇-C-3-H)，1.68-1.59(m，1H，甘露醇-C-3-H)1.2.5 6-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-1，5-內(nèi)醚-2-氨基-2，3-二脫氧-D-甘露醇(6)將6.5g(13.7毫摩爾)6-O-DMT-1，5-內(nèi)醚-2-疊氮基-2，3-二脫氧-D-甘露醇(5)溶于70毫升吡啶和50毫升32％氨水中，然后加入6.1g(23.3毫摩爾)三苯基膦。反應混合物在室溫下攪拌18小時。然后蒸發(fā)反應混合物。將殘余物溶于400毫升的乙酸乙酯，用200毫升5％的碳酸氫鈉溶液清洗2次。分離出有機層，用硫酸鈉干燥，過濾并蒸發(fā)至干燥。將殘余物溶于10毫升的乙酸乙酯中，通過快速層析用硅凝膠純化(乙酸乙酯/甲醇/1％三乙胺梯度)。將產(chǎn)物級分合并，在高真空下蒸發(fā)并干燥，得到5.7g(93％)的無色泡沫。
1H-NMR(CDCl3，in ppm)7.42(d，2H，DMT)，7.34-7.19(m，7H，DMT)，6.84(d，4H，DMT)，3.89-3.80(m，1H，甘露醇-CH)，3.79(s，6H，OCH3)，3.69-3.65(m，1H，甘露醇-CH)，3.52-3.46(2m，2H，甘露醇-CH)，3.32-3.26(m，2H，甘露醇-C-H-1)，3.13(m，1H，甘露醇-C-H-2)，2.10-1.90(m，4H，甘露醇-C-3-H，NH2，OH)，1.68-1.59(m，1H，甘露醇-C-3-H)1.2.6 6-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2-(O，O’-二新戊?；?熒光素基-6-甲酰氨基)-1，5-內(nèi)醚-2，3-二脫氧-D-甘露醇(7)將0.76g(1.27毫摩爾)6-羧基熒光素-二新戊酰和155微升(1.4毫摩爾)N-甲基嗎啉在氬氣氛下溶于15毫升DMF中。將反應混合物冷卻至-25℃，加入170微升(1.3毫摩爾)氯甲酸異丁酯。在-25℃下攪拌反應混合物30分鐘后，于15分鐘內(nèi)加入溶于10毫升DMF的0.56g(1.27毫摩爾)6-O-DMT-1，5-內(nèi)醚-2-氨基-2，3-二脫氧-D-甘露醇(6)和140微升(1.3毫摩爾)N-甲基嗎啉。在-25℃下攪拌反應混合物1小時。然后蒸發(fā)DMF。將殘余物溶于200毫升乙酸乙酯，用100毫升0.1M的pH7.5的磷酸鈉溶液清洗2次。分離出有機層，用硫酸鈉干燥，過濾并蒸發(fā)至干燥。將殘余物溶于5毫升的乙酸乙酯中，通過快速層析用硅凝膠純化(正己烷/乙酸乙酯/1％三乙胺梯度)。將產(chǎn)物級分合并，在高真空下蒸發(fā)并干燥，得到0.92g(75％)的無色固體。
1H-NMR(CDCl3，in ppm)8.09(d，1H，熒光素)，7.93(d，1H，熒光素)，7.56(s，2H，熒光素)，7.41(d，2H，DMT)，7.33-7.25(m，7H，DMT)，7.09(s，2H，熒光素)，6.85-6.79(m，8H，4H來自DMT，4H來自熒光素)，6.55(d，1H，NH)，4.35(m，1H，甘露醇-CH)，3.91-3.70(2m，2H，甘露醇-CH)，3.81(s，6H，OCH3)，3.64-3.60(m，1H，甘露醇-CH)，3.52-3.46(m，1H，甘露醇-CH)，3.36-3.30(m，2H，甘露醇-CH)，2.88(m，1H，甘露醇-CH)，2.39(m，1H，甘露醇-C-3-H)，1.70-1.60(m，2H，甘露醇-C-3-H，OH)，1.37(s，18H，叔丁基)1.2.7 6-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2-(O，O’-二新戊?；?熒光素基-6-甲酰氨基)-1，5-內(nèi)醚-2，3-二脫氧-D-甘露醇-4-O-[N，N-二異丙基-(2-氰乙基)]-亞磷酰胺(8)在氬氣氛下將0.92g(0.94毫摩爾)6-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2-(O，O’-二新戊?；?熒光素基-6-甲酰氨基)-1，5-內(nèi)醚-2，3-二脫氧-D-甘露醇(7)溶于30毫升二氯甲烷中。然后加入285微升(1.67毫摩爾)N-乙基二異丙基胺，并在15分鐘內(nèi)加入溶于15毫升二氯甲烷的氯-2-氰乙氧基-二異丙基胺-膦。反應混合物在室溫下攪拌1小時。然后加入150毫升的二氯甲烷。用100毫升0.1M的pH7.5的磷酸鈉緩沖液清洗反應混合物2次。分離出有機層，用硫酸鈉干燥，過濾并蒸發(fā)至干燥。將殘余物溶于5毫升的正己烷/丙酮1∶1溶液中，通過快速層析用硅凝膠純化(正己烷/丙酮梯度)。將產(chǎn)物級分合并，在高真空下蒸發(fā)并干燥，得到0.9g(81％)的無色泡沫。
1H-NMR(CDCl3，in ppm)8.02-6.76(m，23H，13H來自DMT，9H來自熒光素，NH)，4.35-3.12(m，11H，CH2OP，7H來自甘露醇，CH(iPr))，3.80/3.79(2s，6H，OCH3)，2.47(t，2H，CH2CN)，2.35-2.13(m，1H，甘露醇-C-H-3)，1.85-1.72(m，1H，甘露醇-C-3-H)，1.37/1.32(3s，18H，叔丁基)，1.07-0.84(3d，12H，CH3來自iPr)31P-NMR(CDCl3，in ppm)150.1/148，21.2.8 1，5-內(nèi)醚-2-溴-4，6-O-亞芐基-2，3-二脫氧-D-甘露醇(9)將30g(7.8毫摩爾)1，5-內(nèi)醚-2-O-甲苯磺?；?4，6-O-亞芐基-3-脫氧-D-山梨醇(2)和2.2g(25毫摩爾)溴化鋰溶于60毫升吡啶中，60℃下攪拌7天。然后蒸發(fā)吡啶。將殘余物溶于5毫升的乙酸乙酯中，通過快速層析用硅凝膠純化(正己烷/乙酸乙酯梯度)。將產(chǎn)物級分合并，在高真空下蒸發(fā)并干燥，得到1.5g(64％)的無色固體。
1H-NMR(DMSO-d6，in ppm)7.44-7.34(m，5H，苯亞甲基)，5.72(s，1H，苯亞甲基-CH)，4.80(m，1H，甘露醇-CH)，4.17(m，1H，甘露醇-CH)，4.08(m，1H，甘露醇-CH)，3.94(m，2H，甘露醇-CH)，3.75(t，1H，甘露醇-CH)，3.46-3.39(m，1H，甘露醇-CH)，2.29-2.18(m，2H，甘露醇-C-3-H)1.2.9 1，5-內(nèi)醚-2-疊氮基-4，6-O-亞芐基-2，3-二脫氧-D-山梨醇(10)將1.45g(4.85毫摩爾)1，5-內(nèi)醚-2-溴-4，6-O-亞芐基-3-脫氧-D-甘露醇(9)和1.26g(19.4毫摩爾)疊氮鈉溶于30毫升DMF中，在90℃下攪拌7天。然后蒸發(fā)反應混合物，通過快速層析用硅凝膠純化(正己烷/乙酸乙酯6∶1)。將產(chǎn)物級分合并，在高真空下蒸發(fā)并干燥，得到0.83g(66％)的無色固體。
1H-NMR(DMSO-d6，in ppm)7.44-7.36(m，5H，苯亞甲基)，5.62(s，1H，苯亞甲基-CH)，4.20-4.15(m，1H，山梨醇-CH)，4.00-3.96(m，1H，山梨醇-CH)，3.86-3.59(2m，3H，山梨醇-CH)，3.32-3.21(m，2H，山梨醇-CH)，2.42-2.38(m，1H，山梨醇-C-3-H)，1.59(q，1H，山梨醇-C-3-H)1.2.10 1，5-內(nèi)醚-2-疊氮基-2，3-二脫氧-D-山梨醇(1 1)將0.8g(3.1毫摩爾)1，5-內(nèi)醚-2-疊氮基-4，6-O-亞芐基-2，3-二脫氧-D-山梨醇(10)溶于80毫升80％乙酸中，80℃下攪拌1小時。反應混合物冷卻至室溫，蒸發(fā)至干燥。將殘余物溶于4毫升乙酸乙酯中，加入40毫升正己烷。移出上清，在高真空下干燥油性殘余物，得到0.52g(98％)無色的油。
1H-NMR(DMSO-d6，in ppm)5.02(db，1H，OH)，4.52(tb，1H，OH)，3.90-3.85(m，1H，山梨醇-CH)，3.67-3.58(m，2H，山梨醇-CH)，3.40-3.31(m，2H，山梨醇-CH)，3.05-2.92(2m，2H，山梨醇-CH)，2.28(m，1H，山梨醇-C-3-H)，1.32(q，1H，甘露醇-C-3-H)1.2.11 6-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-1，5-內(nèi)醚-2-疊氮基-2，3-二脫氧-D-山梨醇(12)將0.52g(3.0毫摩爾)1，5-內(nèi)醚-2-疊氮基-2，3-二脫氧-D-山梨醇(11)溶于9毫升吡啶中。在攪拌下于30分鐘之內(nèi)室溫下加入溶于9毫升吡啶的1.1g(3.2毫摩爾)4，4’-二甲氧基三苯甲基氯。反應混合物在室溫下再攪拌3小時。然后蒸發(fā)吡啶，將殘余物溶于100毫升乙酸乙酯中，用60毫升5％的碳酸氫鈉溶液清洗兩次。分離出有機層，用硫酸鈉干燥，過濾并蒸發(fā)至干燥。將殘余物溶于5毫升的乙酸乙酯中，通過快速層析用硅凝膠純化(正己烷/乙酸乙酯/1％三乙胺梯度)。將產(chǎn)物級分合并，在高真空下蒸發(fā)并干燥，得到1.1g(77％)的無色泡沫。
1H-NMR(DMSO-d6，in ppm)7.40(d，2H，DMT)，7.32-7.18(m，7H，DMT)，6.87(d，4H，DMT)，4.99(d，1H，OH)，3.99-2.98(m，7H，山梨醇-CH)，3.73(s，6H，OCH3)，2.30(m，1H，山梨醇-C-3-H)，1.34(m，1H，山梨醇-C-3-H)1.2.12 6-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-1，5-內(nèi)醚-2-氨基-2，3-二脫氧-D-山梨醇(13)將1.1g(2.3毫摩爾)6-O-DMT-1，5-內(nèi)醚-2-疊氮基-2，3-二脫氧-D-山梨醇(12)溶于11毫升吡啶和9毫升32％氨水中，然后加入1.0g(3.9毫摩爾)三苯基膦。反應混合物在室溫下攪拌18小時。蒸發(fā)反應混合物。將殘余物溶于180毫升乙酸乙酯中，用100毫升5％的碳酸氫鈉溶液清洗2次。分離出有機層，用硫酸鈉干燥，過濾并蒸發(fā)至干燥。將殘余物溶于5毫升的乙酸乙酯中，通過快速層析用硅凝膠純化(乙酸乙酯/甲醇/1％三乙胺梯度)。將產(chǎn)物級分合并，在高真空下蒸發(fā)并干燥，得到0.94g(91％)的無色泡沫。
1H-NMR(DMSO-d6，in ppm)7.40(d，2H，DMT)，7.31-7.12(m，7H，DMT)，6.87(d，4H，DMT)，4.67(sb，1H，OH)，3.77(m，1H，山梨醇-CH)，3.72(s，6H，OCH3)，3.50-3.06(m，5H，3H山梨醇-CH，NH2)，2.96(dd，1H，山梨醇-CH)，2.82(t，1H，山梨醇-CH)，2.63(m，1H，山梨醇-CH)，2.06(m，1H，山梨醇-C-3-H)，1.07(q，1H，山梨醇-C-3-H)1.2.13 6-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2-(O，O’-二新戊?；?熒光素基-6-甲酰氨基)-1，5-內(nèi)醚-2，3-二脫氧-D-山梨醇(14)將1.22g(2.0毫摩爾)6-羧基熒光素-二新戊酰和255微升(2.25毫摩爾)N-甲基嗎啉在氬氣氛下溶于25毫升DMF中。將反應混合物冷卻至-25℃，加入289微升(2.1毫摩爾)氯甲酸異丁酯。在-25℃下攪拌反應混合物30分鐘后，于30分鐘內(nèi)加入溶于20毫升DMF的0.90g(2.0毫摩爾)6-O-DMT-1，5-內(nèi)醚-2-氨基-2，3-二脫氧-D-山梨醇(13)和225微升(2.0毫摩爾)N-甲基嗎啉。在-25℃下攪拌反應混合物1小時。然后蒸發(fā)DMF。將殘余物溶于150毫升乙酸乙酯，用100毫升0.1M的pH7.5的磷酸鈉溶液清洗2次。分離出有機層，用硫酸鈉干燥，過濾并蒸發(fā)至干燥。將殘余物溶于10毫升的乙酸乙酯中，通過快速層析用硅凝膠純化(正己烷/乙酸乙酯/1％三乙胺梯度)。將產(chǎn)物級分合并，在高真空下蒸發(fā)并干燥，得到1.44g(75％)的無色固體。
1H-NMR(CDCl3，in ppm)8.09(d，2H，熒光素)，7.42(d，2H，DMT)，7.33-7.22(m，8H，7H來自DMT，1H來自熒光素)，7.06(d，2H，熒光素)，6.85-6.77(m，8H，4H來自DMT，4H來自熒光素)，6.33(d，1H，NH)，4.18(m，1H，山梨醇-CH)，4.03-3.98(m，1H，山梨醇-CH)，3.79(s，6H，OCH3)，3.75(m，1H，山梨醇-CH)，3.46(m，1H，山梨醇-CH)，3.31-3.26(m，2H，山梨醇-CH)，3.14-3.03(m，2H，山梨醇-CH)，2.31(m，1H，甘露醇-C-3-H)，1,62(m，1H，甘露醇-C-3-H)，1,40(b，1H，OH)，1,38(s，18H，叔丁基)1.2.14 6-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2-(O，O’-二新戊酰基-熒光素基-6-甲酰氨基)-1，5-內(nèi)醚-2，3-二脫氧-D-山梨醇-4-O-[N，N-二異丙基-(2-氰乙基)]-亞磷酰胺(15)在氬氣氛下將0.48g(0.49毫摩爾)6-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2-(O，O’-二新戊?；?熒光素基-6-甲酰氨基)-1，5-內(nèi)醚-2，3-二脫氧-D-山梨醇(14)溶于15毫升二氯甲烷中。然后加入1 60微升(0.89毫摩爾)N-乙基二異丙基胺，并在15分鐘內(nèi)加入溶于7毫升二氯甲烷的170mg(0.67毫摩爾)氯-2-氰乙氧基-二異丙基胺-膦。反應混合物在室溫下攪拌1小時。然后加入100毫升的二氯甲烷。用50毫升0.1M的pH7.5的磷酸鈉緩沖液清洗反應混合物2次。分離出有機層，用硫酸鈉干燥，過濾并蒸發(fā)至干燥。將殘余物溶于5毫升的正己烷/丙酮1∶1溶液中，通過快速層析用硅凝膠純化(正己烷/丙酮梯度)。將產(chǎn)物級分合并，在高真空下蒸發(fā)并干燥，得到0.51g(88％)的無色固體。
1H-NMR(CDCl3，in ppm)8.12(m，2H，熒光素)，7.52-7.21(m，10H，9H來自DMT，1H來自熒光素)，7.08(m，2H，熒光素)，6.86-6.78(m，8H，4H來自DMT，4H來自熒光素)，6.51/6.39(2d，1H，NH)，4.30-3.17(m，11H，CH2OP，7H來自山梨醇，CH(iPr))，3.80/3.79(2s，6H，OCH3)，2.54/2.36(t，2H，CH2CN)，2.45(m，1H，山梨醇-C-H-3)，1.78-1.60(m，1H，山梨醇-C-3-H)，1.38/1.37(2s，18H，叔丁基)，1.11-0.88(4d，12H，CH3來自iPr)31P-NMR(CDCl3，in ppm)148.9/147.7
1.2.15 6-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2-[N-(9-芴基甲氧羰基)-6-氨基己酰酰胺]-1，5-內(nèi)醚-2，3-二脫氧-D-甘露醇(16)將0.87g(2.8毫摩爾)N-Fmoc-6-氨基己酸和300微升(3.0毫摩爾)N-甲基嗎啉在氬氣氛下溶于25毫升DMF中。將反應混合物冷卻至-25℃，加入350微升(2.8毫摩爾)氯甲酸異丁酯。在-25℃下攪拌反應混合物30分鐘后，于15分鐘內(nèi)加入溶于15毫升DMF的1.12g(2.5毫摩爾)6-O-DMT-1，5-內(nèi)醚-2-氨基-2，3-二脫氧-D-甘露醇(6)和270微升(2.5毫摩爾)N-甲基嗎啉。在-25℃下攪拌反應混合物1小時。然后蒸發(fā)DMF。將殘余物溶于200毫升乙酸乙酯，用100毫升0.1M的pH7.5的磷酸鈉溶液清洗2次。分離出有機層，用硫酸鈉干燥，過濾并蒸發(fā)至干燥。將殘余物溶于10毫升的正己烷/乙酸乙酯1∶4溶液中，通過快速層析用硅凝膠純化(正己烷/乙酸乙酯梯度)。將產(chǎn)物級分合并，在高真空下蒸發(fā)并干燥，得到1.35g(70％)的無色泡沫。
1H-NMR(CDCl3，in ppm)7.76(d，2H，F(xiàn)moc)，7.58(d，2H，F(xiàn)moc)，7.43-7.17(m，13H，9H來自DMT，4H來自Fmoc)，6.84(d，4H，DMT)，5.93(d，1H，NH)，4.89(tb，1H，NH)，4.37(d，2H，F(xiàn)moc)，4.20(m，2H，1H來自甘露醇-CH，1H來自Fmoc)，3.79-3.67(m，1H，甘露醇-CH)，3.77(s，6H，OCH3)，3.56-3.01(5m，7H，5H甘露醇-CH，CH2N)，2.25(m，1H，甘露醇-C-3-H)，2.17(t，2H，CH2CO)，1.65-1.33(3m，8H，甘露醇-C-3-H，OH，CH2來自己酰基)1.2.16 6-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2-[N-(9-芴基甲氧羰基)-6-氨基己酰酰胺]-1，5-內(nèi)醚-2，3-二脫氧-D-甘露醇-4-O-[N，N-二異丙基-(2-氰乙基)]-亞磷酰胺(17)在氬氣氛下將1.3g(1.69毫摩爾)6-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2-[N-(9-芴基甲氧羰基)-6-氨基己酰酰胺]-1，5-內(nèi)醚-2，3-二脫氧-D-甘露醇(16)溶于45毫升二氯甲烷中。然后加入550微升(3.07毫摩爾)N-乙基二異丙基胺，并在15分鐘內(nèi)加入溶于20毫升二氯甲烷的590mg(2.31毫摩爾)氯-2-氰乙氧基-二異丙基胺-膦(phosphane)。反應混合物在室溫下攪拌1小時。然后加入100毫升的二氯甲烷。用100毫升0.1M的pH7.5的磷酸鈉緩沖液清洗反應混合物2次。分離出有機層，用硫酸鈉干燥，過濾并蒸發(fā)至干燥。將殘余物溶于10毫升的正己烷/丙酮1∶1溶液中，通過快速層析用硅凝膠純化(正己烷/丙酮梯度)。將產(chǎn)物級分合并，在高真空下蒸發(fā)并干燥，得到1.5g(90％)的無色泡沫。
1H-NMR(CDCl3，in ppm)7.77(d，2H，F(xiàn)moc)，7.61(d，2H，F(xiàn)moc)，7.50(d，2H，F(xiàn)moc)，7.43-7.19(m，11H，9H來自DMT，2H來自Fmoc)，6.82(d，4H，DMT)，6.31(d，1H，NH)，4.90(t，1H，NH)，4.38(d，2H，F(xiàn)moc)，4.22-3.10(5m，14H，7H來自甘露醇-CH，1H來自Fmoc，CH2OP，CH2N，CH(iPr))，3.78(s，6H，OCH3)，2.78/2.58(2t，2H，CH2CN)，2.35(m，1H，甘露醇-C-3-H)，2.19(m，2H，CH2CO)，1.78-1.27(2m，7H，甘露醇-C-3-H，CH2來自己?；?，1.06/0.89(2d，12H，CH3(iPr))31P-NMR(CDCl3，in ppm)150.0/148.31.3用亞磷酰胺合成修飾的寡核苷酸用自動寡核苷酸合成技術和亞磷酰胺途徑可以將FAM-甘露醇-(8)或FAM-山梨醇-(15)-亞磷酰胺摻入寡核苷酸中，并與例如FAM-cx-Biogenex連接物(圖2)比較?？梢杂脴藴史椒▽Σ煌问?format)中的不同探針進行檢測，并根據(jù)背景信號、信號增益和cT值(例如在TaqMan_形式中)進行比較。
1.4用在后標記(postlabelling)合成修飾的寡核苷酸為了具有在合成后摻入標記物的機會，將用Fmoc保護的6-氨基己?；B接部分與甘露醇結構單元6偶聯(lián)，然后，用上述的類似物反應條件(1.2.15和1.2.16)以優(yōu)良的產(chǎn)率將中間體16轉(zhuǎn)變成相應的6-O-DMT-1，5-內(nèi)醚-2，3-二脫氧-2-[N-Fmoc-6-氨基己酰酰胺]-D-甘露醇-4-亞磷酰胺(17)(圖3)。用1H-NMR、31P-NMR和HPLC表征化合物17。單體17可以以高偶聯(lián)產(chǎn)率摻入寡核苷酸。在從合成支持物上切割并去保護之后，成功地摻入了幾個標記物(香豆素、若丹明、花青素等)。
1.5修飾的寡核苷酸的雜交實驗如上所述(1.3)合成圖4中公開的寡核苷酸和修飾的寡核苷酸，通過用標準方法確定熔化溫度來檢測它們在PCR緩沖液(50mM Tris，3mM氯化鎂)中的雜交情況。熔化溫度的測定是用Uvikon 931光度計(Kontron Instruments)在260nm下進行的。每種寡核苷酸鏈在Tm緩沖液中的終濃度是1μM。溫度方案15℃-95℃于160分鐘內(nèi)(加熱和冷卻)；時間斜率(ramp time)0.5℃/min。
可以看出，修飾的寡核苷酸保持了與互補寡核苷酸雜交的能力(見圖4)。
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<223>人工序列的描述寡核苷酸<400>1caccccgtgc tgctgaccga 20<210>2<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸
<400>2gggcctcggt cagcagcacg gggtg25<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸<220>
<223>第21位的N表示本發(fā)明的FAM-甘露醇化合物，其中FAM表示通過連接部分與甘露醇部分連接的熒光素<400>3caccccgtgc tgctgaccga n21<210>4<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸<400>4gggcctcggt cagcagcacg gggtg25<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸<220>
<223>第11位的N表示本發(fā)明的FAM-甘露醇化合物，其中FAM表示通過連接部分與甘露醇部分連接的熒光素
<400>5caccccgtgc ngctgaccga 20<210>6<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述；寡核苷酸<400>6gggcctcggt cagcagcacg gggtg 2權利要求
1.式I化合物(式I) 其中Y選自O、S和NR4，R4是烷基、烯基、炔基、芳基、?；⒈Ｗo基或H；X是連接部分，n是0或1；R1獨立于R2、R3和R4，R1選自(1)保護基，(2)標記物，和(3)固相；R2和R3相互獨立，并獨立于R1或R4，R2和R3選自(1)-H，(2)保護基，(3)固相和連接部分X，(4)亞磷酰胺，(5)H-膦酸，和(6)三磷酸；條件是R3而不是R2可以是三磷酸，如果R3是三磷酸，則R1不是固相；R2和R3不都是固相，不都是亞磷酰胺，不都是H-膦酸、不都是-H，不都是保護基，不是亞磷酰胺和H-膦酸，不是固相和亞磷酰胺，或不是固相和H-膦酸；當選自R1、R2或R3的一個殘基是固相時，選自R1、R2或R3的其他兩個殘基不是固相。
2.權利要求1的化合物，其特征在于連接部分X包含碳和氧原子。
3.權利要求1或2的化合物，其特征在于連接部分X包含-(CH2)m或-(CH2CH2O)m部分，其中m是1和10之間的整數(shù)。
4.權利要求1至3中任一項的化合物，其特征在于，連接部分X選自(1)-CO-(CH2)m-Z-(2)-CO-(CH2CH2O)m-CH2CH2-Z-其中m是0和10之間的整數(shù)，Z選自NH、CO、O和S。
5.權利要求4的化合物，其特征在于Y是0。
6.權利要求1至5中任一項的化合物，其特征在于保護基選自(1)芴基甲氧羰基，(2)二甲氧基三苯甲基，(3)單甲氧基三苯甲基，(4)三氟乙?；?5)乙酰丙?；?6)甲硅烷基。
7.權利要求1至6中任一項的化合物，其特征在于標記物選自(1)熒光素染料，(2)若丹明染料，(3)花青素染料，和(4)香豆素染料。
8.權利要求1至7中任一項的化合物，其特征在于該化合物是1，5-內(nèi)醚-2-氨基-2，3-二脫氧-D-甘露醇或1，5-內(nèi)醚-2-氨基-2，3-二脫氧-D-山梨醇的衍生物。
9.一種寡聚化合物，其包含式II單體單元 式II其中Y選自O、S和NR4，R4是烷基、烯基、炔基、芳基、?；?、保護基或H；X是連接部分，n是0或1；R7獨立于R4、R5和R6，R7選自(1)-H，(2)保護基，(3)標記物，(4)寡核苷酸，和(5)固相，R5和R6彼此獨立，并且獨立于R4或R7，R5和R6選自(1)-H，(2)固相和連接部分X，(3)磷酸，和(4)帶有核苷酸、修飾的核苷酸、寡核苷酸和修飾的寡核苷酸的磷酸二酯，條件是R5和R6不都是-H，都是固相和連接部分X，都是磷酸，或是-H和磷酸；當選自R5、R6或R7的一個殘基是固相時，選自R5、R6或R7的其他殘基不是固相。
10.權利要求9的寡聚化合物，其特征在于連接部分X包含碳和氧原子。
11.權利要求9或10的寡聚化合物，其特征在于連接部分X包含-(CH2)m或-(CH2CH2O)m部分，其中m是1和10之間的整數(shù)。
12.權利要求9至11中任一項的寡聚化合物，其特征在于，連接部分X選自(1)-CO-(CH2)m-Z-(2)-CO-(CH2CH2O)m-CH2CH2-Z-其中m是0和10之間的整數(shù)，Z選自NH、CO、O和S。
13.權利要求12的寡聚化合物，其特征在于Z是NH并且Y是O。
14.權利要求9至13中任一項的寡聚化合物，其特征在于保護基選自(1)芴基甲氧羰基，(2)二甲氧基三苯甲基，(3)單甲氧基三苯甲基，(4)三氟乙?；?，(5)乙酰丙?；?，和(6)甲硅烷基。
15.權利要求9至14中任一項的寡聚化合物，其特征在于標記物是熒光標記物。
16.權利要求9至15中任一項的寡聚化合物，其特征在于修飾的寡核苷酸包括一種單體單元，它是(1)帶有與核苷酸連接的第二標記物的連接部分，或(2)帶有與修飾的核苷酸或非核苷酸化合物連接的第二標記物的連接部分。
17.權利要求16的寡聚化合物，其特征在于第二標記物是第二熒光標記物。
18.權利要求15至17中任一項的寡聚化合物，其特征在于熒光標記物或第二熒光標記物選自(1)熒光素染料，(2)若丹明染料，(3)花青素染料，和(4)香豆素染料。
19.權利要求9至18中任一項的寡聚化合物，其特征在于寡聚化合物不能被酶促延伸。
20.權利要求19的寡聚化合物，其特征在于寡聚化合物3’末端的單體單元是2’，3’-二脫氧-核苷酸或3’-磷酸化核苷酸。
21.權利要求1至8中任一項的化合物在化學合成權利要求9至20中任一項的寡聚化合物中的用途，化合物中R2是帶有連接部分X的亞磷酰胺或固相，R3是保護基。
22.權利要求9至20中任一項的寡聚化合物在與核酸的雜交反應中的用途。
23.權利要求9至20中任一項的寡聚化合物作為引物、探針或俘獲探針的用途。
24.一種化學合成權利要求9至20中任一項的寡聚化合物的方法，其包括以下步驟(a)提供權利要求1至8中任一項的化合物，其中R2是亞磷酰胺，R3是保護基，(b)提供通過3’-OH基團與固相結合的核苷或修飾的核苷的5’-OH基團，或提供通過3’-OH基團與固相結合的寡核苷酸或修飾的核苷的5’-OH基團，所述3’-OH基團是寡核苷酸或修飾的寡核苷酸的3’末端的核苷酸或修飾的核苷酸的3’-OH基團，(c)將亞磷酰胺的磷原子與5’-OH基團反應，形成亞磷酸酯，將亞磷酸酯氧化為磷酸三酯，(d)任選地在下面步驟中將步驟(c)中任意的未反應的5’-OH基團與另一化合物反應，以避免步驟(c)中未反應的5’-OH基團發(fā)生進一步的反應，(e)任選地在除去權利要求1至8中任一項的化合物的保護基后，用核苷或修飾的核苷的亞磷酰胺衍生物重復步驟(a)至(d)，(f)從固相上切下寡聚化合物，除去保護基，由此將磷酸三酯轉(zhuǎn)變?yōu)榱姿岫ィ?g)分離寡聚化合物。
25.一種酶促合成權利要求9至20中任一項的多聚化合物或寡聚化合物的方法，其包括以下步驟(a)將權利要求1至8中任一項的化合物，其中所述化合物的R3是三磷酸，在末端轉(zhuǎn)移酶存在下，與多核苷酸、寡核苷酸或修飾的寡核苷酸的3’末端的核苷酸或修飾的核苷酸的3’-OH基團溫育，使化合物與3’-OH基團連接，釋放焦磷酸，并(b)分離多聚或寡聚化合物。
26.一種將標記物與權利要求9至20中任一項的寡聚化合物連接的方法，寡聚化合物的R7是保護基，所述方法包括以下步驟(a)除去保護基R7，(b)將寡聚化合物的去保護部分與標記物反應。
27.一種檢測樣品中的靶核酸的方法，其包括以下步驟(a)提供懷疑含有靶核酸的樣品，(b)提供權利要求9至20中任一項的寡聚化合物，其與靶核酸的一部分或全部基本上互補，(c)任選地用模板依賴型DNA聚合酶和引物擴增靶核酸，(d)在使寡聚化合物和靶核酸結合的條件下，使樣品和寡聚化合物接觸，(e)確定靶核酸和寡聚化合物之間的結合產(chǎn)物或雜交程度，作為靶核酸存在、不存在或它的含量的量度。
28.權利要求27的方法，其中寡聚化合物是權利要求15至20中任一項的寡聚化合物。
29.權利要求27或28的方法，其中步驟(d)中的雜交程度是通過從與靶核酸雜交的寡聚化合物釋放的第一或第二熒光標記物的量確定的，所述釋放是通過模板依賴型DNA聚合酶進行核酸外切酶水解而完成的。
30.一種檢測樣品中是否存在靶核酸的方法，其包括以下步驟進行至少一個循環(huán)步驟，其中循環(huán)步驟包括擴增步驟和雜交步驟，其中擴增步驟包括將樣品與引物接觸，如果樣品中存在靶核酸，則產(chǎn)生擴增產(chǎn)物；雜交步驟包括將樣品與一對探針接觸，探針中的至少一個是權利要求9至20中任一項的寡聚化合物，其中R7是標記物，探針對中的成員在彼此不超過5個核苷酸的條件下與擴增產(chǎn)物雜交，其中探針對中的第一探針用供體熒光標記物標記，探針對中的第二探針用相應的受體熒光標記物標記；檢測所述第一探針的供體熒光標記物和所述第二探針的受體熒光標記物之間是否存在熒光共振能量轉(zhuǎn)移，其中熒光共振能量轉(zhuǎn)移存在表明樣品中存在靶核酸，熒光共振能量轉(zhuǎn)移不存在表明樣品中不存在靶核酸。
31.部件的試劑盒，其包括-具有3’至5’核酸外切酶活性的模板依賴型聚合酶；-一組引物，-核苷酸，和-權利要求9至20中任一項的寡聚化合物，其中R7是標記物。
全文摘要
本發(fā)明涉及包括甘露醇或山梨醇衍生物的化合物，它們可被用于組成寡聚化合物。本發(fā)明還涉及這些寡聚化合物在雜交方面的用途和作為探針的用途。此外，本發(fā)明公開了檢測核酸的方法，其中使用了寡聚化合物。
文檔編號C07D335/02GK1513849SQ200310123130
公開日2004年7月21日 申請日期2003年12月19日 優(yōu)先權日2002年12月20日
發(fā)明者F·伯格曼, F 伯格曼, H·馮德埃爾茨, 擄６ , C·賽德爾, 露, K·溫德爾 申請人:霍夫曼-拉曼奇有限公司