專利名稱：一種佐劑DC－Chol、其脂質(zhì)體、制備方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種佐劑DC-Chol、其制備方法及其用途，以及由DC-Chol佐劑制備的正電荷脂質(zhì)體、其制備方法及其在提高治療性疫苗細(xì)胞免疫方面的用途。
目前世界上大多采用Al(OH)3作為免疫佐劑，以氫氧化鋁為佐劑的疫苗，雖然安全有效，但存在有部分人使用后不產(chǎn)生抗體的缺點(diǎn)。因此開發(fā)無(wú)毒、簡(jiǎn)單、穩(wěn)定、具有提高細(xì)胞免疫作用的免疫佐劑具有重要意義。
本發(fā)明的再一目的在于提供一種由DC-Chol佐劑制備的正電荷脂質(zhì)體及其制備方法，該脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、安全無(wú)毒；所述方法簡(jiǎn)單，且DC-Chol佐劑脂質(zhì)體與疫苗的結(jié)合率在80％以上。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種由DC-Chol佐劑制備的正電荷脂質(zhì)體作為新一代佐劑在治療性疫苗方面上的用途。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種脂質(zhì)體佐劑DC-Chol(N’，N’-二甲基乙二胺基氨甲酰基膽固醇，3-β[N-(N′，N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholester)，分子式為C32H56N2O2，分子量為500.7道爾頓，元素分析C 76.47％，H 10.96％，N 5.48％。具有如下結(jié)構(gòu) 分子式為C32H56N2O2本發(fā)明所述脂質(zhì)體佐劑DC-Chol的制備方法為攪拌下，將1mol氯甲酰基膽固醇溶解在無(wú)水溶劑中，滴加到至少為1.1mol的N’，N’-二甲基乙二胺的堿性無(wú)水溶劑中，室溫下反應(yīng)至氯甲酰基膽固醇完全反應(yīng)，經(jīng)后處理得到DC-Chol。
其中所述的無(wú)水溶劑為氯仿、二氯甲烷、四氯化碳、苯、甲苯或THF；所述的堿性條件所用試劑為吡啶。
所述的后處理為在低于60℃的溫度下將反應(yīng)混合物除去溶劑，加入溶劑溶解后水洗、收集有機(jī)層，再經(jīng)過水洗，收集有機(jī)層，用無(wú)水硫酸鈉干燥，除掉有機(jī)溶劑后，用無(wú)水乙醇重結(jié)晶，干燥器至恒重。產(chǎn)率至少為67％，DC-Chol純度為99％。
反應(yīng)式為。
本發(fā)明所述的DC-Chol脂質(zhì)體是通過下述方法制備的脂質(zhì)體將DC-Chol溶解于氯仿，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋轉(zhuǎn)蒸干成膜后干燥；用水或緩沖溶液將膜溶解，氮?dú)夥障聰嚢?0-30小時(shí)，水浴中超聲或采用儀器(Microfluidics M-110S microfiuidizer)制成正電荷脂質(zhì)體；所述脂質(zhì)體的粒徑分布為50-300nm，平均粒徑160-200nm。
所述脂質(zhì)體的制備過程中，進(jìn)一步包括將攪拌后的溶液用(MicrofluidicsM-110S microfiuidizer)經(jīng)過20-80個(gè)循環(huán)，制成正電荷脂質(zhì)體，所述脂質(zhì)體的粒徑分布為300-700nm。
所述脂質(zhì)體的制備過程中，20mg干燥成膜的DC-Chol在5ml 20mM TrisHCl 150mMNaCl緩沖溶液中溶解，攪拌24小時(shí)，在水浴中超聲30分鐘，12000rpm離心20分鐘，過濾并烘干沉淀物，稱重為2mg加2ml上述緩沖液制成粒徑分布為50-300nm的正電荷脂質(zhì)體。超聲儀DL-720，浙江象山儀器廠。
上述制備過程中，攪拌是在4℃，通氮?dú)庀逻M(jìn)行的。
本發(fā)明的DC-Chol脂質(zhì)體帶有正電荷，而將帶負(fù)電荷的疫苗吸附于其表面，增加了抗原提呈細(xì)胞吞噬抗原及提呈抗原的功能，通過將帶負(fù)電的核酸吸附于其表面可以將基因?qū)爰?xì)胞達(dá)到轉(zhuǎn)移基因的目的。最終達(dá)到增強(qiáng)疫苗的免疫原性的目的。經(jīng)0，30，40％蔗糖非連續(xù)梯度離心結(jié)合ELISA法測(cè)定，疫苗與本發(fā)明脂質(zhì)體的結(jié)合率在80％以上。因此本發(fā)明的DC-Chol脂質(zhì)體可以作為疫苗的佐劑，增強(qiáng)疫苗的免疫原性。本發(fā)明的DC-Chol脂質(zhì)體經(jīng)與基因工程乙肝疫苗或DNA疫苗合用后表明正電荷脂質(zhì)體佐劑DC-Chol無(wú)論對(duì)蛋白質(zhì)疫苗還是DNA疫苗都有免疫增強(qiáng)作用。
經(jīng)BALB/c動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，DC-Chol脂質(zhì)體與基因工程乙肝表面抗原聯(lián)合應(yīng)用能顯著地提高特異性抗體IgG1，IgG2a的水平，同時(shí)Th1及Th2類細(xì)胞因子的水平也得到顯著地提高，因此DC-Chol可以同時(shí)激活Th1及Th2免疫反應(yīng)。本發(fā)明的DC-Chol脂質(zhì)體經(jīng)與DNA疫苗合用后表明本發(fā)明的DC-Chol脂質(zhì)體能特異性地提高細(xì)胞免疫功能，小鼠脾細(xì)胞IFN-γ，IL-2，IL-5三種細(xì)胞因子水平也較無(wú)佐劑組高。所以本發(fā)明的DC-Chol脂質(zhì)體將有可能在乙肝疫苗及其它疫苗，其中包括DNA疫苗、治療性疫苗、粘膜疫苗以及聯(lián)合疫苗等的應(yīng)用中起到一種很好的免疫佐劑作用。由于正電荷脂質(zhì)體佐劑成分簡(jiǎn)單、制備方便、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、安全無(wú)毒。不僅適用于蛋白質(zhì)疫苗，也適用于DNA疫苗，因此，通用性強(qiáng)?？赏麨閭鹘y(tǒng)疫苗、治療性疫苗以及DNA疫苗的研究及應(yīng)用提供一種新型的免疫佐劑。
實(shí)施例中原料N′，N′-二甲基乙二胺，氯甲?；懝檀假?gòu)自ACROS公司。吡啶，二氯甲烷，氯仿，無(wú)水乙醇等試劑及溶劑為國(guó)產(chǎn)分析純。乙肝表面抗原HBsAg為深圳康泰公司生產(chǎn)。測(cè)乙肝表面抗原試劑盒(上?？迫A公司)。
實(shí)施例中所用儀器旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器為天津玻璃儀器廠生產(chǎn)，冷凍高速離心機(jī)為3K30德國(guó)sigma公司，元素分析儀為德國(guó)ELEMENTAR公司，透射式電子顯微鏡為日本H600，酶標(biāo)儀為芬蘭MK2。


圖1.本發(fā)明脂質(zhì)體的電鏡照片實(shí)施例1DC-Chol合成方法1.量取5ml N’，N’二甲基乙二胺，加12ml預(yù)先用烘干的無(wú)水硫酸鈉干燥的二氯甲烷和12ml預(yù)先用氫氧化鈉干燥的吡啶于250ml三口燒瓶中。另稱取4g氯甲?；懝檀加?50ml滴液漏斗中加12ml二氯甲烷溶解，逐滴加入三口燒瓶中，同時(shí)開動(dòng)攪拌，反應(yīng)2小時(shí)。
2.將反應(yīng)液轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的燒瓶，上旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓蒸發(fā)至干，水浴溫度不超過60℃。
3.用100ml二氯甲烷重新溶解，加50ml蒸餾水，充分混勻于分液漏斗靜置使其分層，收集有機(jī)層，重復(fù)水洗兩次。
4.有機(jī)相加烘干的無(wú)水硫酸鈉徹底除去水份，轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的250ml燒瓶，上旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓蒸干。
5.用無(wú)水乙醇重結(jié)晶，過濾，置干燥器抽真空使其揮盡殘余乙醇。
6.稱重，計(jì)算得率，分子量為500.7道爾頓，用德國(guó)ELEMENTAR公司vario BL元素分析儀檢測(cè)C、H、N含量，理論值C76.8％，H 11.2％，N5.6％，實(shí)測(cè)值C76.47％，H10.96％，N5.48％。經(jīng)計(jì)算得率為67％，純度99％。用乙酸雙氧鈾UO2(CH3COO)22H2O負(fù)染用日本產(chǎn)H600電子顯微鏡觀察其粒徑在50～300nm，平均粒徑180nm。如圖1所示。
實(shí)施例2DC-Chol脂質(zhì)體的制備方法1.精確稱取DC-Chol 20mg于100ml圓底燒瓶加氯仿2ml使其完全溶解，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在室溫下，30rpm，0.09Mpa旋轉(zhuǎn)蒸干后成膜后繼續(xù)旋轉(zhuǎn)10分鐘2.置干燥器抽真空15分鐘，放置約12小時(shí)。
3.加緩沖液(20mM TrisHCl 150mM NaCl)8ml溶解。
4.4℃，通氮?dú)?，磁力攪?4小時(shí)。
5.再用Microfluidics M-110S microfluidizer經(jīng)過35個(gè)循環(huán)，制成正電荷脂質(zhì)體，脂質(zhì)體的粒徑分布為300-600nm。
實(shí)施例3參照實(shí)施例2的方法，所不同的是將旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀干燥的DC-Chol在8ml水中溶解，4℃，通氮?dú)?，磁力攪?0小時(shí)，在水浴中超聲20分鐘，制成粒徑分布為50-200nm正電荷脂質(zhì)體。
實(shí)施例4參照實(shí)施例2的方法，所不同的是用Microfluidics M-110S microfluidizer經(jīng)過80個(gè)循環(huán)，制成粒徑分布為300-700nm正電荷脂質(zhì)體。
實(shí)施例5參照實(shí)施例3的方法，所不同的是將旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀干燥的DC-Chol在5ml 20mMTrisHCl 150mM NaCl緩沖溶液中溶解，4℃，通氮?dú)猓帕嚢?4小時(shí)，在水浴中超聲30分鐘，12000rpm離心20分鐘，過濾并烘干沉淀物，稱重為2mg加2ml上述緩沖液制成粒徑分布為50-300nm的正電荷脂質(zhì)體。
所述正電荷脂質(zhì)體在4℃放置1-3周無(wú)沉淀，穩(wěn)定性好。
實(shí)施例6乙肝表面抗原HBsAg與DC-Chol脂質(zhì)體結(jié)合率的測(cè)定。
取66.7ulHBsAg(60ug/ml)加640ul DC-Chol(2.5mg/ml)，再加293.3ul生理鹽水，混勻后取100ul作為1#樣品和標(biāo)準(zhǔn)品。剩余900ul做15000rpm離心1小時(shí)，小心移出上清液，用生理鹽水補(bǔ)充體積至900ul作為2#樣品，沉淀用生理鹽水調(diào)體積至900ul 3#樣品。取50ul標(biāo)準(zhǔn)品將其濃度稀釋到0、6.25、12.5、25、50、100ng/ml做標(biāo)準(zhǔn)曲線。為了減小誤差，將1#樣品和3#樣品稀釋到70、140、280倍，將2#樣品稀釋到7、14、28倍。為減小脂質(zhì)體對(duì)結(jié)果的影響，稀釋劑采用0.5％NP40的生理鹽水溶液，按測(cè)乙肝表面抗原試劑盒說明書要求操作，用酶標(biāo)儀在450nm讀出各樣品濃度，依此計(jì)算結(jié)合率。
用上海科華的測(cè)乙肝表面抗原試劑盒對(duì)DC-Chol脂質(zhì)體和HBsAg結(jié)合后的1#樣和離心后的上清2#樣、沉淀校正體積后的3#樣同時(shí)測(cè)濃度，計(jì)算游離HBsAg含量和結(jié)合后的HBsAg含量與離心前的HBsAg含量。由于游離HBsAg和結(jié)合的HBsAg之和與離心前的HBsAg含量不相吻合，所以計(jì)算結(jié)合率的方法有三種，即①沉淀中的HBsAg量/離心前的HBsAg量，②(離心前的HBsAg量一上清中HBsAg量)/離心前的HBsAg量，③沉淀中的HBsAg量/(上清中HBsAg量+沉淀中的HBsAg量)。三次檢測(cè)結(jié)果如表1。
表1 DC-Chol·HBsAg結(jié)合率檢測(cè)結(jié)果 注三次實(shí)驗(yàn)使用的HBsAg、DC-Chol、試劑盒分別為同一批產(chǎn)品，HBsAg和DC-Chol混合物為三次配制。
從表1結(jié)果可以看出DC-Chol脂質(zhì)體與HBsAg(質(zhì)量比為400∶1)的結(jié)合率至少為80％，一般為90％左右。
DC-Chol正電荷脂質(zhì)體以其高效、通用性，合成、制備工藝簡(jiǎn)單的優(yōu)勢(shì)即將取代Al(OH)3作為免疫佐劑的地位。研究DC-Chol脂質(zhì)體與HBsAg的結(jié)合率尤為重要，由于游離的HBsAg濃度極低，所以只有采用酶免疫法(ELISA法)進(jìn)行檢測(cè)，而ELISA包被反應(yīng)板孔與孔之間誤差很大，采用多稀釋度做平行樣的方法可減小誤差。本實(shí)驗(yàn)采用三個(gè)稀釋倍數(shù)，每個(gè)稀釋倍數(shù)兩個(gè)平行孔，剔除反常數(shù)據(jù)，計(jì)算平均數(shù)求出結(jié)合率。本實(shí)驗(yàn)制定了DC-Chol脂質(zhì)體和HBsAg的結(jié)合率的具體檢測(cè)方法，對(duì)其他DC-Chol脂質(zhì)體藥物的結(jié)合率測(cè)定有一定的參考價(jià)值。
測(cè)定時(shí)的操作步驟在10ml高速離心管中加3ml40％蔗糖液，在其上小心沿管壁加3ml30％蔗糖液，最后在上面小心覆蓋1ml待分離的HBsAg DC-Chol脂質(zhì)體樣品。25000rpm離心10分鐘。收集最上層上清測(cè)HBsAg濃度。收集30％和40％蔗糖溶之間的沉淀，用緩沖液校正體積至1ml測(cè)HBsAg濃度。
將疫苗與脂質(zhì)體混合后4℃放置一個(gè)月測(cè)定其結(jié)合率不變，說明HBsAg DC-Chol脂質(zhì)體結(jié)合非常穩(wěn)定性。
實(shí)驗(yàn)例1一.特異性IgG抗體及亞類抗體應(yīng)答1.動(dòng)物雄性BALB/C鼠18只，鼠齡4-6周，隨意分為A、B、C三組，每組6只，安靜條件下飼養(yǎng)一周。A組為HBsAg免疫刺激，B組為鋁佐劑HBsAg免疫刺激，C組為脂質(zhì)體佐劑HBsAg免疫刺激。
2.動(dòng)物免疫每只小鼠皮下注射0.25ml免疫藥物，其中A組HBsAg，1ug；B組鋁佐劑HBsAg，1ug；C組脂質(zhì)體佐劑、HBsAg分別為0.5mg、1ug。免疫兩次，間隔3周。初次免疫后3周及6周定期尾尖采血分離血漿，-20℃保存待測(cè)。
3.特異性IgG抗體及亞類抗體的檢測(cè)采用上海實(shí)業(yè)科華生物技術(shù)有限公司產(chǎn)試劑盒檢測(cè)標(biāo)本中特異性IgG、IgG1、IgG2a的滴度。見表1。(說明書中沒有)4.結(jié)果初次免疫后3周，IgG2a抗體水平檢測(cè)結(jié)果表明，HBsAg與鋁佐劑HBsAg均不能促進(jìn)IgG2a的應(yīng)答，而脂質(zhì)體佐劑HBsAg可以顯著地提高IgG2a的應(yīng)答水平。初次免疫后6周，IgG2a抗體水平檢測(cè)結(jié)果表明，鋁佐劑組IgG2a的應(yīng)答水平較前提高，但與HBsAg組差別不大，而脂質(zhì)體佐劑組是鋁佐劑組的5倍。脂質(zhì)體佐劑HBsAg組經(jīng)二次刺激后產(chǎn)生的IgG抗體較HBsAg組高100倍，較鋁佐劑組高4倍。
二促Th1及Th2類細(xì)胞因子的提高1、動(dòng)物雄性BALB/C鼠48只，鼠齡4-6周，隨意分為A、B、C、D四組，每組12只，安靜條件下飼養(yǎng)一周。
2、組別A組為生理鹽水，B組為HBsAg免疫刺激，C組為鋁佐劑HBsAg免疫刺激，D組為脂質(zhì)體佐劑HBsAg免疫刺激。每只小鼠皮下注射0.25ml免疫藥物，其中A組生理鹽水；B組HBsAg，1ug；C組鋁佐劑疫苗，1ug；D組脂質(zhì)體佐劑、HBsAg分別為0.5mg、1ug。免疫一次，一周后殺鼠分離脾細(xì)胞，配成5×105/ml懸液，在24孔板上加入抗原刺激，濃度為5mg/ml，以含10％小牛血清1640液培養(yǎng)于37℃，5％C02條件下培養(yǎng)，48小時(shí)后收集上清，-20℃保存待測(cè)。
3.免疫小鼠脾細(xì)胞分泌IFN-r和IL-2、IL-4檢測(cè)用晶美生物制品公司產(chǎn)試劑盒進(jìn)行定量檢測(cè)。
4.結(jié)果a.測(cè)定IL-2水平結(jié)果表明，HBsAg和鋁佐劑HBsAg組差別不大，而脂質(zhì)體佐劑HBsAg誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞分泌IL-2水平顯著提高16倍。
b.測(cè)定IFN-r水平結(jié)果表明，HBsAg和鋁佐劑HBsAg組差別不大，而脂質(zhì)體佐劑HBsAg誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞分泌IFN-r水平顯著提高20倍。
c.測(cè)定IL-4水平結(jié)果表明，HBsAg和鋁佐劑HBsAg組差別不大，而脂質(zhì)體佐劑HBsAg誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞分泌IL-4水平顯著提高4倍。表2.不同佐劑疫苗免疫小鼠血清IgG亞類抗體水平組別一次免疫后三周 二次免疫后三周 二次免疫后六周IgG1 IgG2a IgG1 IgG2aIgG1 IgG2aHBsAg0.088±0.042 0.035±0.021 0.329±0.194 0.106±0.052 0.258±0.080 0.061±0.023HBsAg鋁劑0.179±0.086 0.037±0.008 0.521±0.465 0.118±0.069 0.540±0.450 0.116±0.087HBsAg脂質(zhì)體 1.054±0.450 1.400±0.028 1.263±0.148 2.293±0.737 1.305±0.361 2.013±0.662實(shí)驗(yàn)例21.質(zhì)粒DNApcDNAI/Amp購(gòu)于Invitrogen。以我國(guó)流行的adr型HBV克隆為模板，PCR擴(kuò)增獲得HBVS基因片段，將其插入pcDNAI/Amp，構(gòu)建成pcDNA/HBs真核表達(dá)質(zhì)粒。
2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雌性BALB/C小鼠，體重18～20g，購(gòu)于第一軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。小鼠用戊巴比妥(75mg/kg)麻醉后，經(jīng)雙側(cè)前肌注射免疫原。
3.pcDNA/HBsDNA質(zhì)粒，100μg/只。
4.pcDNA/HBs DNA質(zhì)粒，100μg/只，DC-Chol脂質(zhì)體0.5mg/只，注射前將質(zhì)粒DNA與脂質(zhì)體混合，每組6只小鼠，初次免疫8周后以相同劑量和途徑加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)免疫3周后取血檢測(cè)抗-HBs或加強(qiáng)免疫后1周取小鼠脾臟淋巴細(xì)胞培養(yǎng)。
結(jié)果(1)誘生特異性IgG亞類的分析初次免疫11周時(shí)，檢測(cè)到IgG1，IgG2a但脂質(zhì)體組的IgG2a/IgG1的比值為1.5，較無(wú)佐劑組的0.70高，說明本發(fā)明的DC-Chol脂質(zhì)體能特異性地提高細(xì)胞免疫功能。
(2)小鼠脾細(xì)胞IFN-γ，IL-2，IL-5水平研究取免疫小鼠脾分離細(xì)胞成1×107/ml，用HBsAg5μg/ml刺激培養(yǎng)48小時(shí)，取上清用ELISA檢測(cè)三種細(xì)胞因子，結(jié)果表明本發(fā)明的DC-Chol脂質(zhì)體組較無(wú)佐劑組高，具體數(shù)值從幾倍到幾十倍不等。
權(quán)利要求
1.一種佐劑DC-Chol，其特征在于分子量為500.7，分子式為C32H56N2O2，元素分析C 76.47％，H 10.96％，N 5.48％，純度為99％，它具有如下所示結(jié)構(gòu)
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述佐劑DC-Chol的制備方法，其特征在于，攪拌下，將1mol氯甲酰基膽固醇溶解在無(wú)水溶劑中，滴加到至少為1.1mol的N’，N’-二甲基乙二胺的堿性無(wú)水溶劑中，室溫下反應(yīng)至氯甲?；懝檀纪耆磻?yīng)，經(jīng)后處理得到DC-Chol。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述佐劑DC-Chol的制備方法，其特征在于，其中所述的無(wú)水溶劑為氯仿、二氯甲烷、四氯化碳、苯、甲苯或THF；所述的堿性條件所用試劑為吡啶；所述的后處理為在低于60℃的溫度下將反應(yīng)混合物除去溶劑，加入溶劑溶解后水洗、收集有機(jī)層，再經(jīng)過水洗，收集有機(jī)層，用無(wú)水硫酸鈉干燥，除掉有機(jī)溶劑后，用無(wú)水乙醇重結(jié)晶，干燥器至恒重。
4.一種DC-Chol佐劑正電荷脂質(zhì)體，其特征在于，所述脂質(zhì)體的粒徑分布為50-300nm。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述DC-Chol佐劑正電荷脂質(zhì)體，其特征在于，所述脂質(zhì)體的粒徑分布為50-300nm，平均粒徑160-200nm。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述DC-Chol佐劑正電荷脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于，將DC-Chol溶解于氯仿，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器旋轉(zhuǎn)蒸干成膜后干燥；用水或緩沖溶液將膜溶解，氮?dú)夥障聰嚢?0-30小時(shí)，水浴中超聲或采用儀器Microfluidics M-110Smicrofiuidizer制成正電荷脂質(zhì)體。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述DC-Chol佐劑正電荷脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于，20mg干燥成膜的DC-Chol在5ml 20mM TrisHCl 150mM NaCl緩沖溶液中溶解，攪拌24小時(shí)，在水浴中超聲30分鐘，12000rpm離心20分鐘，過濾并烘干沉淀物，稱重2mg加2ml上述緩沖液制成粒徑分布為50-300nm的正電荷脂質(zhì)體。
8.根據(jù)權(quán)利要求6-7任何一項(xiàng)所述的DC-Chol佐劑正電荷脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于，攪拌是在4℃，通氮?dú)庀逻M(jìn)行的。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的DC-Chol佐劑正電荷脂質(zhì)體作為佐劑在治療性疫苗上的應(yīng)用，其中DC-Chol佐劑正電荷脂質(zhì)體與治療性疫苗的結(jié)合率至少為80％。
全文摘要
本發(fā)明公開了由N′，N′－二甲基乙二胺和氯甲?；懝檀甲鳛榍绑w合成的佐劑DC－Chol、其制備方法及其用途，以及由DC－Chol佐劑制備的正電荷脂質(zhì)體、其制備方法及其在提高治療性疫苗細(xì)胞免疫方面的用途。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將佐劑DC－Chol成膜、水化，超聲或輔以離心、再水化制成正電荷脂質(zhì)體，脂質(zhì)體的粒徑分布為50－300nm，疫苗與脂質(zhì)體的結(jié)合率在80％以上。經(jīng)BALB/c動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明DC－Chol與基因工程乙肝表面抗原聯(lián)合應(yīng)用能顯著地提高特異性抗體IgG1，IgG2a和Th1及Th2類細(xì)胞因子的水平，與DNA疫苗聯(lián)合應(yīng)用能顯著地提高IgG1，IgG2a IFN－γ，IL－2，IL－5的水平。
文檔編號(hào)C07J9/00GK1442425SQ0210376
公開日2003年9月17日 申請(qǐng)日期2002年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月4日
發(fā)明者易學(xué)瑞, 張宜俊, 孔祥平, 祖萍, 袁有成 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第四五八醫(yī)院