專(zhuān)利名稱(chēng)：小紅參醌及其衍生物,它的制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及小紅參醌及其衍生物，它的制備方法與應(yīng)用。
心肌缺血性疾病目前仍是威脅人類(lèi)健康的主要疾病之一，雖然已有一些臨床治療藥物出現(xiàn)，但效果遠(yuǎn)不理想。小紅參作為一味傳統(tǒng)中藥，已有長(zhǎng)期的民間使用經(jīng)驗(yàn)，且臨床及藥理實(shí)驗(yàn)證實(shí)確實(shí)對(duì)某些心肌缺血性疾病有療效。
1986年王淑仙等(中草藥，7(18)19(1986))以生物發(fā)光法(Biolnmisescemt melnod)測(cè)定了小紅參、茜草和丹參提取物對(duì)小鼠心肌和腦組織中ATP含量的影響，實(shí)驗(yàn)觀察到健康小鼠腹腔注射小紅參IIA5-9mg/只，15-30分鐘內(nèi)可使心腦組織中A77含量增加，小鼠靜脈注射小紅參IIA-6mg/只，10分鐘內(nèi)也可使心肌和腦組織中ATP含量明顯增加。
小紅參提取物雖然經(jīng)初步臨床和藥理證明對(duì)心肌缺血性疾病有療效，但并不清楚什么成分有效，無(wú)法保證有效成分含量，臨床用藥劑量及治療效果，限制了其應(yīng)用和發(fā)展。
本發(fā)明的小紅參醌，為式I的化合物及其甲基化衍生物 (式I)其中，R為H、式II的基團(tuán)或式III的基團(tuán) 式II 式IIIR為H時(shí)的式I化合物是2-甲基-1，3，6-三羥基-9，10蒽醌；R為式II基團(tuán)時(shí)的式I化合物是2-甲基-1，3，6-三羥基-9，10-蒽醌-3-0-β-葡萄糖甙；R為式III基團(tuán)時(shí)的式I化合物是2-甲基-1，3，6-三羥基-9，10-蒽醌-3-0-α-鼠李糖基(1→2)β-葡萄糖甙。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種從中藥小紅參中提取R為H、式II的基團(tuán)或式III的基團(tuán)時(shí)式I化合物的制備方法。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案一種自中藥小紅參中提取小紅參醌的方法，包括以下步驟1)將小紅參(Rubia ynananensis(Franch.)Diels)按重量比為1∶8-12的比例溶解于蒸餾水中，用酸，優(yōu)選濃鹽酸及冰醋酸，調(diào)節(jié)溶液的pH至2.5-3.5，3℃-12℃放置過(guò)夜；2)過(guò)濾，得濾渣及濾液；3)依次用低分子量醇，優(yōu)選甲醇、乙醇或正丁醇，和丙酮回流提取所得濾渣，甲醇和丙酮的體積分別為上述用于溶解小紅參蒸餾水體積的1/3-1/5；4)合并上述所得的甲醇和丙酮提取液，將甲醇-丙酮溶解部分進(jìn)行硅膠柱色譜；5)依次用環(huán)己烷、18-22∶1的氯仿-丙酮、二氯甲烷及丙酮洗脫硅膠柱，循環(huán)12-14次，合并洗脫液；6)3℃-12℃放置過(guò)夜，得到析出的結(jié)晶，即取代基R為H時(shí)的式I化合物；7)收集合并上述第5)步中，依次用環(huán)己烷、18-22∶1的氯仿-丙酮、二氯甲烷及丙酮洗脫硅膠柱第13-16次循環(huán)的洗脫液；8)3℃-12℃放置至結(jié)晶析出，抽濾，得到濾餅；9)用1∶1∶1的甲醇-無(wú)水乙醇-四氫呋喃將濾餅溶解，3℃-12℃放置至結(jié)晶析出；10)抽濾，干燥，將所得的混合物用離心薄層色譜分離，依次用10∶1、8∶1、6∶1和4∶1的二氯甲烷-甲醇洗脫；11)收集離心薄層色譜的第II峰；12)干燥，即得取代基R為式II時(shí)的式I化合物；13)收集上述離心薄層色譜的第III峰，干燥，即得取代基R為式III時(shí)的式I化合物。
在上述方法中，所述步驟3)依次用低分子量醇和丙酮回流提取所得濾渣，所述低分子量醇和丙酮是等體積的，提取至提取液肉眼觀察不到顏色；所述步驟5)合并洗脫液后，進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)；所述步驟6)得到析出的結(jié)晶后，進(jìn)行抽濾，濾餅用無(wú)水乙醇重結(jié)晶，將結(jié)晶用丙酮溶解，活性碳脫色，3℃-12℃放置過(guò)夜，得到析出的結(jié)晶，抽濾并用3℃-12℃的冷丙酮洗滌濾餅，干燥得到結(jié)晶，即取代基R為H時(shí)的式I化合物。所述步驟8)得到的濾餅，將濾餅用3℃-12℃的冷丙酮洗滌后，再進(jìn)入所述第9)步，用1∶1∶1的甲醇-無(wú)水乙醇-四氫呋喃將濾餅溶解后，用活性碳脫色兩次，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，再于3℃-12℃放置至結(jié)晶析出；所述步驟10)抽濾后，用3℃-12℃的冷丙酮洗滌濾餅后再進(jìn)行所述的干燥及離心薄層色譜分離。所述步驟13)收集上述離心薄層色譜的第III峰，干燥后用甲醇重結(jié)晶，再干燥，即得取代基R為式III時(shí)的式I化合物。
取代基R為H的式I化合物，可以采用化學(xué)合成的方法獲得，包括以下步驟1)3，5-二羥基苯甲酸選擇溴代，得2，5-二溴-3，5-二羥基苯甲酸；2)經(jīng)曼尼希反應(yīng)，得2，5-二溴-3，5-二羥基-4-氨甲基苯甲酸；3)在堿液中加入Al-Ni合金進(jìn)行還原反應(yīng)，得到3，5-二羥基-4-甲基苯甲酸；4)在AlCl3存在下，使3，5-二羥基-4-甲基苯甲酸和4-羥基苯甲酸進(jìn)行反應(yīng)，得到取代基R為H的式I化合物。
在上述化學(xué)合成式I化合物的過(guò)程中所述步驟1)的選擇溴代反應(yīng)是在Br2/CHCl3，25℃的條件下進(jìn)行的；所述步驟2)的曼尼希反應(yīng)是在33％二甲基胺(HNMe2)，37％HCHO，(乙醇)EtOH，HAc，25℃的條件下進(jìn)行的；所述步驟3)是在NaOH溶液中進(jìn)行的；所述步驟4)中3，5-二羥基-4-甲基苯甲酸和4-羥基苯甲酸的反應(yīng)是在攪拌，加熱到180-200℃下進(jìn)行的。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供以本發(fā)明的化合物為活性成分的抗心肌缺血藥物。
本發(fā)明的又一目的是提供本發(fā)明的化合物在制備抗心肌缺血藥物方面的用途。
本發(fā)明的藥物含有治療有效量的本發(fā)明的化合物，特別是含有2-甲基-1，3，6-三羥基-9，10蒽醌、2-甲基-1，3，6-三羥基-9，10-蒽醌-3-0-β-葡萄糖甙或2-甲基-1，3，6-三羥基-9，10-蒽醌-3-0-α-鼠李糖基(1→2)β-葡萄糖甙的為優(yōu)選。該藥物用于抗心肌缺血。
在需要的時(shí)候，在上述藥物中還可以含有一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。所述載體包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤(rùn)劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載體、潤(rùn)滑劑等，必要時(shí)還可以加入香味劑、甜味劑等。
本發(fā)明的藥物可以制成片劑、粉劑、粒劑、膠囊、口服液及注射液等多種形式。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。
本發(fā)明化合物的藥用量可根據(jù)患者的年齡、體重、疾病的嚴(yán)重程度進(jìn)行調(diào)整，日劑量一般為5-10mg/kg體重。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明的藥物不僅可以提高小鼠常壓耐缺氧能力，而且在較低濃度(35μM)時(shí)即能顯著地增加冠脈流量，此外，對(duì)心臟也有一定的抑制作用，這對(duì)降低心肌能量代謝和氧代謝，保護(hù)心肌均是有益的。
腦垂體后葉素能使冠狀動(dòng)脈收縮、痙孿從而使冠脈流量下降，引起急性心肌缺血，加之外周阻力增加，導(dǎo)致心臟負(fù)荷加重，在心電圖上呈現(xiàn)缺血性變化。本發(fā)明的藥物不僅在體外能對(duì)抗腦垂體后葉素誘發(fā)的離體豚鼠心臟冠脈流量減少和心率減慢，而且在體內(nèi)也幾乎可以完全對(duì)抗后葉素誘發(fā)的急性心肌缺血性心電改變，表明本發(fā)明的藥物有抗心肌缺血、缺氧的作用。
急性心肌梗死(AMI)的主要死亡原因是嚴(yán)重性心率失常和泵衰竭，其發(fā)生率與心肌梗死范圍密切相關(guān)，而泵衰竭又增加室性心律失常的發(fā)生率。因而尋找有效藥物，在縮小心梗范圍(IS)的同時(shí)改善AMI早期的心泵功能，以期降低AMI死亡率，改善其預(yù)后是AMI治療的關(guān)鍵。本發(fā)明的化合物不僅能顯著縮小急性心肌梗死大鼠的心梗范圍，而且對(duì)心功能也有一定的改善作用。
本發(fā)明對(duì)傳統(tǒng)的中藥小紅參做了全面的，系統(tǒng)的研究，從根本上了解清楚了小紅參在治療心肌缺血性疾病方面的本質(zhì)所在，明確了有效成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)，提供了自中藥小紅參中提取小紅參醌以及用化學(xué)合成的方式合成小紅參醌的方法，并且對(duì)以小紅參醌為活性成分的藥物進(jìn)行了較為深入的研究。本發(fā)明提取、生產(chǎn)小紅參醌的方法簡(jiǎn)單方便，實(shí)用性強(qiáng)，尤其是化學(xué)合成的方法中，巧妙地采用了三氯化鋁為催化劑，操作簡(jiǎn)單快速，產(chǎn)率高，無(wú)需色譜分離，使今后大規(guī)模生產(chǎn)小紅參醌成為可能。
下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作進(jìn)一步介紹。
2)鑒定Rf0.75，系統(tǒng)(1)展開(kāi)。
mp＞300℃元素分析C15H10O5.
理論值 c％， 66.67；H％，3.70
實(shí)測(cè)值 c％， 66.62；H％， 3.74MeOHUVλ nm217，276，312(sh)，322，422maxKBrIRv cm-13420、3411(游離-OH)，3020、3075(締合-OHmax和/或芳-H)，2840、2921(-Me)， 1662(游離＞C＝O)，1621(締合＞C＝O)， 1600、1590(芳環(huán))。
1H-NMR(CD3COCD3)δ(ppm)8.09(1H，d，J＝3.5Hz)，7.50(1H，d，J＝2.4Hz)，725(1H，s)，7.21(1H，dd，J＝0.5，2.4Hz(，0.91(3H，s).
1H-NMR(DMSO)δ(ppm)13.34(1H，s，締合羥基質(zhì)子)，11.12(1H，s，無(wú)鄰位取代羥基質(zhì)子)，11.07(1H，s，有鄰位取代羥基質(zhì)子)，8.11(1H，d，J＝8.5Hz)，7.45(1H，d，J＝2.4Hz)，7.23(1Hs)，7.22(1H，dd，J＝8.5、2.4Hz)，2.07(3H，s).
13C-NMRδ(ppm)185.41(S)，181.66(S)，162.90(S)，162.16(S)，161.91(S)，134.95(S)，131.54(S)，129.07(d)，142.62(S)，120.94(d)，117.29(S)，112.35(d)，108.41(S)，106.97(S)，7.96(S)。
13C(｀H)-NWR LRSD(遠(yuǎn)程選擇質(zhì)子去偶)；見(jiàn)附圖2LR-MS(EI)m/z(％)270(｀100，M+)，252(3.1，M-H2O)，242(11.4，M-CO)，213(6.1，M-2XCO+H)，160(3.0)，(139(7.2)，121(6.9).
HR-MS(EI)M/Z(％)270.0519(100，C15H10O5)，242.0570(10.20，C14H10C4)，213.0560(4.93，C13H9O3)，185.0625(0.61，C12H9O2).
從上述分析鑒定的數(shù)據(jù)可以看出，第1)步中所得到的化合物確為取代基R為H的式I小紅參醌，即2-甲基-1，3，6-三羥基-9，10蒽醌。
實(shí)施例2、取代基R為式II時(shí)的式I小紅參醌的分離和鑒定1)取代基R為式II時(shí)的式I小紅參醌的分離收集實(shí)施例1中MAS部分硅膠柱色譜第15份，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至少量，5℃冰箱放置至結(jié)晶析出，抽濾并用冷丙酮(3×5ml)洗滌濾餅，用甲醇-無(wú)水乙醇一四氫呋喃(1∶1∶1)將濾餅溶解，活性碳脫色兩次，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮溶液至少量，5℃冰箱放置至結(jié)晶析出，抽濾并用冷丙酮(3×5ml)洗滌濾餅，紅外干燥得一橙黃色混合物，將此混合物用離心薄層色譜(CLC)分離，依次用二氯甲烷-甲醇10∶1、8∶1、6∶1和4∶1各500ml洗脫，收集CLC-II峰(如

圖1所示)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，得黃色殘?jiān)瑲堅(jiān)眉状贾亟Y(jié)晶一次，結(jié)晶真空干燥即得取代基R為式II時(shí)的式I小紅參醌300mg，該化合物為黃色針狀結(jié)晶，收率為0.15％。
2)鑒定Rf0.42，系統(tǒng)(1)展開(kāi)。
mp282-283℃(分解)[α]25D(DMSO)3-68.92℃(c＝0.74)[M]25D-297.7℃元素分析C21H28O10·1/2H2O理論值 c％， 57.14％H％，4.76％實(shí)測(cè)值 c％， 57.18％H％，5.05％NeOHUVλnm220，267，300，323，410maxKBrIRvcm-13420(-OH)、2920(-Me)1662(游離＞C＝O)，1630(締max合＞C＝O)，1600 1575(芳環(huán))，1055(甙鍵)。
1H-NMR(CD3COCD3)δ(ppm)8.12(1H，d，J＝8.5Hz)，7.54(1H，d，J＝2.4Hz)，7.48(1H，s)，7.25(1H，dd，J＝8.5，2.4Hz，5.20(1H，d，J＝5.2Hz 3.47-3.85(mH，m)，2.18(3H，s).
1H-NMR(DMSO)δ(ppm)13.18(1H，s，加D2O消失，締合-OH)，11.13(1H，s，加D2O消失，無(wú)鄰位取代羥基質(zhì)子)，8.03(1H，d，J＝8.5Hz)，7.43(1H，d，J＝2.4Hz)，7.38(1Hs)，7.19(1H，dd，J＝8.5，2.4Hz)，5.09(1H，d J＝7.3Hz).3.16-3.72(mH，m)，2.10(3H，s).
13C-NMR δ(ppm)186.37(S)，181.60(S)，163.48(S)，161.32(S)，160.76(S)，135.28(S)，131.97(S)，129.65(d)，124.53(S)，121.42(s)，120.82(d)，112.62(d)，110.56(S)，105.64(d)，190.34(d)，77.33(d)，76.31(d)，73.24(d)，69.38(d)，，60.47(t)，8.47(q)，2Dz-NMR11H-1H COSY 見(jiàn)附圖3LR-MS(EI)m/z(％)270(100，基峰)，252(3，85，B-H2O)，242(10.43，B-CO).213(4.39，B-2XCO+H)，168(2.16)，(139(3.86)，121(5.62).
HR-MS(EI)m/z(％)270.0532(100，C15H10O5)，242.0597(10.43，C14H10O4)，213.0555(5.59，C13H9O3)，185.0609(1.72，C12H9O)，128.0630(1.31，C10H8)
FD-MS m/z(％)866(3.51，2M+2)，434(100，M+2)，(271(6.32，M-161)。
從上述分析鑒定的數(shù)據(jù)可以看出，第1)步中所得到的化合物確為取代基R為式II時(shí)的式I小紅參醌，即2-甲基-1，3，6-三羥基-9，10-蒽醌-3-0-β-葡萄糖甙。
實(shí)施例3、取代基R為式III時(shí)的式I小紅參醌的分離和鑒定1)取代基R為式III時(shí)的式I小紅參醌的分離收集實(shí)施例2中離心薄層色譜分離的CLC-III峰(如圖1所示)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮洗脫液至干，殘?jiān)眉状贾亟Y(jié)晶后真空干燥得黃色粉末狀化合物2mg，即為取代基R為式III時(shí)的式I小紅參醌，收率為0.001％。
為了得到更多的取代基R為式III時(shí)的式I小紅參醌，也可以從小紅參粗提物中直接進(jìn)行分離。
稱(chēng)取小紅參1kg，溶解于10L蒸餾水中，用濃鹽酸酸化至pH3，室溫放置過(guò)夜，抽濾，沉淀拌入適量硅膠，紅外干燥后于沙氏提取器用丙酮提取至提取液顏色極淡，回收丙酮至少量并拌入聚酰胺粉、干燥后進(jìn)行聚酰胺柱色譜(聚酰胺13-40目，柱體，17×30cm)，依次用水，53％乙醇，84％乙醇及丙酮洗脫，84％乙醇洗脫部分，回收乙醇至少量，自然過(guò)濾，濾液濃縮后冰凍干燥，冰凍干燥后的樣品進(jìn)行硅膠柱色譜(硅膠粒度150-250目，柱體0.5×30cm)，依次用乙酸乙酯，乙酸乙酯-丙酮(2∶1)及乙酸乙酯-甲醇(2∶1)洗脫，TLC控制收集與取代基R為式III時(shí)的式I小紅參醌相同的組分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮洗脫液至少量，5℃冰箱放置至沉淀析出，抽濾并用冷丙酮(3×5ml)洗脫濾餅，真空干燥得取代基R為式III時(shí)的式I小紅參醌2g。
此外，自聚酰胺柱色譜丙酮洗脫部分還得到取代基R為H的式I小紅參醌32g，硅膠柱色譜乙酸乙酯-丙酮洗脫部分得到取代基R為式II時(shí)的式I小紅參醌1.5g。
2)鑒定Rf0.20，系統(tǒng)(1)展開(kāi)。
mp262-264℃(分解)[α])25D(DMSO)-57.27℃(C＝1.1)[M]25D-331.0℃元素分析C27H30O14·2H2O理論值c％，52.76％ H％，5.54％實(shí)測(cè)值c％，52.72％ H％，5.24％MeOH
UVλ nm219，273，288，320，410maxKBrIRv cm-13390、3250(-OH)、1680(游離＞C＝O)，1625(締合max ＞C＝O)，1610 1585(芳環(huán))，1056、1049(甙鍵)。
1H-NMR(DMSO)δ(ppm)13.26(1H，s，締合OH)，11.51(1H，s，無(wú)鄰位取代羥基質(zhì)子)，8.09(1H，d，J＝8.5Hz)，7.55(1H，d，J＝2.4Hz)，7.40(1H，s)，7.3 1(1H，dd，J＝8.5，2.4Hz，5.41(1H，d，J＝7.38Hz5.26(1H，6s)，3.17-5.60(mH，m)，2.15(3H，s)，δ1.15(3H，s).
13C-NMR δ(ppm)186.31(S)，181.61(S)，183.51(S)，161.30(S)，160.21(S)，135.26(S)，131.92(d)，129.52(d)，124.52(S)，121.44(s)，120.64(s)，112.60(d)，110.59(S)，105.04(d)，100.22(d，J＝1716Hz)，97.50(d)，77.40(d)，77.40(d)，77.11(d)，76.42(d)，72.00(d)，70.50(d)，70,39(d)，69,55(d)，68.51(d)，60,33(t)，18,08(q)，8.74(q).
LR-MS(EI)m/z(％)270(100，B)，252(4.45，B-H2O)，242(15.65，B-CO，214(3.47，B-2XCO).FD-MS m/s(％)601(100，M123)，270(42.1，M-300)，23(100，Na+).
從上述分析鑒定的數(shù)據(jù)可以看出，第1)步中所得到的化合物確為取代基R為式II時(shí)的式I小紅參醌，即2-甲基-1，3，6-三羥基-9，10-蒽醌-3-0-α-鼠李糖基(1→2)β-葡萄糖甙。
實(shí)施例4、取代基R為H的式I小紅參醌甲基化衍生物的制備取代基R為H的式I小紅參醌165mg溶于MeI34ml，加Ag2O粉6.5mg及甲醇少量，磁力攪拌回流加熱40分鐘，反應(yīng)終止后濾除Ag2O，將MeI旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，殘?jiān)靡宜嵋阴ブ亟Y(jié)晶，抽濾并干燥得黃色針狀結(jié)晶55mg。對(duì)該化合物進(jìn)行下述分析，證實(shí)該化合物為2，5-甲基-1，3，6-三羥基-9，10-蒽醌，即取代基R為H的式I小紅參醌甲基化合物。
mp212-214℃KBrIRvcm-13080、3020(締合-OH和/或芳-H)、1670(游離＞C＝O)，max 1630(締合＞C＝O)，1600 1570(芳環(huán))。
1H-NMR δ(ppm)13.06(1H，s，)，8.16(1H，d，J＝8.6Hz)，7.56(1H，d，J＝2.4Hz)7.44(1H，dd，J＝8.5，2.4Hz，7.30(1H，s，)，3.97(3H，s)，3.35(3H，s)，2.09(3H，s).LR-MS(EI)m/z(％)298(109，M+)，280(43.3，M-H2O)，269(21.9，M-CO+H)，252(10.1M-H2O-CO)。
實(shí)施例5、取代基R為式II時(shí)的式I小紅參醌全甲基化物甲醇解產(chǎn)物的制備取代基R為式II時(shí)的式I小紅參醌200mg，溶于二甲基甲酰胺5ml，加Ag2O0.5g及MeI10ml，混合液磁力攪拌回流加熱4小時(shí)，抽濾，濾液加H2O適量，使沉淀析出，抽濾，得化合物100mg。
上述甲基化物溶于MeOH 10ml，并加濃H2SO42ml，回流加熱4小時(shí)，待反應(yīng)液冷卻后加水適量使沉淀析出，抽濾并用水3×1ml洗滌濾餅，濾液棄去，濾餅再用1NNaOH及H2O反復(fù)洗溶，洗滌液加稀鹽酸酸化使沉淀析出，抽濾，水洗后將濾餅干燥得黃色粉末物，即為取代基R為式II時(shí)的式I小紅參醌全甲基化物甲醇解產(chǎn)物。經(jīng)下面的鑒定分析，斷定其分子式為C17H14O5。
1H-NMR δ(ppm)18.99(1H，s，有鄰位取代的羥基質(zhì)子)，8.07(1H，d，J＝8.7H)，7.40(1H，d，J＝2.9Hz)7.47(1H，s)，7.36(1H，dd，J＝8.7、2.8Hz)，3.92(3H，s)，3.77(3H，s)，2.14(3H，s).
LR-MS(EI)m/z(％)293(109，M+)，281(43.0，M-H2O)，269(29.4，M-CO+H)，252(17.6M-H2O-CO)。
實(shí)施例6、化學(xué)合成取代基R為H的式I小紅參醌(1)合成3，5-二羥基-4-甲基苯甲酸以3，5-二羥基苯甲酸為原料經(jīng)選擇溴代(Br2/CHCl3，25℃，0.5h)得2，6-二溴-3，5-二羥基苯甲酸，2，6-二溴-3，5-二羥基苯甲酸經(jīng)曼尼希反應(yīng)(33％HNNe2，37％HCHO、EtOH，HAc，25℃，25h)得2，6-二溴-3，5-二羥基-4-氨甲基苯甲酸，于2，6-二溴-3，5-二羥基-4-氨甲基苯甲酸的NaOH溶液中加入Al-Ni合金進(jìn)行還原反應(yīng)(25-34℃，16h)脫去溴及氨基得到3，5-二羥基-4-甲基苯甲酸。經(jīng)光譜(MS、NMR)分析，與文獻(xiàn)一致。
(2)合成取代基R為H的式I小紅參醌將3，5-二羥基-4-甲基苯甲酸1g和4-羥基苯甲酸3g的混合物研細(xì)并干燥后加入熔融的AlCl3(20g)-NaCl(4g)-P2O5(2g)混合液中，維持溫度180-200℃(油浴溫度)，反應(yīng)5min，反應(yīng)液放冷后加入冰水80ml和濃鹽酸15ml，120-140℃煮沸10min，冷后即有沉淀生成，將上清液傾入分液漏斗并用乙酸乙酯(2×50ml)萃取，萃取液與上述沉淀合并，依次用5％NaHCO3、飽和NaCl水溶液及水各4×50ml洗滌，洗滌后的乙酸乙酯萃取液用無(wú)水Na2SO4干燥，回收乙酸乙酯至干，殘?jiān)靡宜嵋阴ザ啻沃亟Y(jié)晶，得取代基R為H的式I小紅參醌化合物110mg(產(chǎn)率為7％)。
(3)對(duì)所得化合物進(jìn)行鑒定，其結(jié)果如下mp＞300℃元素分析C15H10O5·H2O理論值 C％62.50％H％ 4.17％實(shí)測(cè)值 C％62.30％H％ 4.14％UV及1R疊譜與天然化合物I完全一致。
實(shí)施例7、本發(fā)明化合物對(duì)常壓缺氧小鼠活存時(shí)間的影響1)藥物分別將2-甲基-1，3，6-三羥基-9，10蒽醌、2-甲基-1，3，6-三羥基-9，10-蒽醌-3-0-β-葡萄糖甙、2-甲基-1，3，6-三羥基-9，10-蒽醌-3-0-α-鼠李糖基(1→2)β-葡萄糖甙溶于等摩爾數(shù)的NaOH溶液，冰凍干燥后生理鹽水稀釋至需要的濃度，分別得到藥物I，藥物II，藥物III；將2，5二甲基-1，3，6-三羥基-9，10蒽醌溶于兩摩爾數(shù)的NaOH溶液，冰凍干燥后生理鹽水稀釋至需要的濃度，得到藥物Ia。
2)實(shí)驗(yàn)方法取健康小鼠98只，隨機(jī)分成10組，小劑量和大劑量各5組(包括對(duì)照組)、小劑量給藥1mg/0.2ml/鼠；大劑量給藥2mg/0.2ml/鼠；對(duì)照組給等體積生理鹽水，均為腹腔給藥，給藥后20分鐘將小鼠密閉于耐缺氧實(shí)驗(yàn)裝置中，記錄動(dòng)物呼吸終止時(shí)間，以給藥組比對(duì)照組活存時(shí)間增加的百分比比較各化合物的藥效。 3)結(jié)果如表1所示，藥物I和藥物II及大劑量藥物Ia均有抗缺氧活性，腹腔注射藥物I 1mg/鼠、2mg/鼠，小鼠活存時(shí)間分別延長(zhǎng)39.5％(P＜0.01)、26.3％(P＜0.01)；腹腔注射藥物II 1mg/鼠、2mg/鼠，小鼠活存時(shí)間分別延長(zhǎng)20.6％(P＜0.01)、39.4％(P＜0.001)，腹腔注射藥物Ia 2mg/鼠，小鼠活存時(shí)間延長(zhǎng)20.0％(P＜0.05)。
藥物III及小劑量藥物Ia與對(duì)照組相比差異不顯著。
表1組別 1毫克/鼠2毫克/鼠存活時(shí)間(分) 增加(％) 存活時(shí)間(分) 增加(％)對(duì)照 13.5±0.98.017.5±0.80.9
(10) (9)化合物I 25.5±1.339.5**22.1±1.126.3**(10) (8)化合物Ia21.2±1.214.621.4±0.520.0*(10) (10)化合物II23.4±1.720.6*24.4±1.539.4***(10) (10)化合物III 21.1±1.214.120.3±1.016.0(10) (11)*P＜0.05**P＜0.01***P＜0.001 數(shù)值＝均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤實(shí)施例8、本發(fā)明化合物對(duì)離體豚鼠心臟的影響1)試劑藥物I，藥物II，藥物III，藥物Ia同實(shí)施例7；腦垂體后葉素為長(zhǎng)沙生化制藥廠生產(chǎn)，批號(hào)861101。
2)實(shí)驗(yàn)方法取豚鼠50只，隨機(jī)分成6組；藥物I、Ia、II及III組，腦垂體后葉素和腦垂體后葉素加藥物I組。
實(shí)驗(yàn)時(shí)，用木錘猛擊豚鼠后腦，趁其昏迷剪開(kāi)胸腔，暴露心臟并立即向心臟內(nèi)注入肝素抗凝，然后取下心臟掛于灌流系統(tǒng)，將心尖通過(guò)蛙心夾連接于微拉力傳感器并通過(guò)多道生理記錄儀記錄心率和心搏幅度，灌流液為氧飽和的洛氏液，溫度35-37℃，灌流壓70mmH2O，用兩套灌流裝置分別灌流洛氏液及藥液，藥液稀釋于洛氏液中，各藥液濃度均為85μM(pH7.5)。
待示波器上心搏穩(wěn)定，冠脈流量恒定后，開(kāi)始記錄連續(xù)兩分鐘內(nèi)每分鐘的心搏及流量，以此作為給藥前的正常對(duì)照值，然后灌流藥液，記錄連續(xù)5分鐘內(nèi)每分鐘的心搏和流量，計(jì)算給藥時(shí)5分鐘比給藥前2分鐘每分種冠脈流量平均增加的百分比，比較藥效。 3)結(jié)果如表2所示，當(dāng)灌流液內(nèi)藥物濃度均為85μM時(shí)，藥物I和藥物Ia均能顯著地增加離體豚鼠心臟冠脈流量，增加百分比分別為94.6％(P＜0.001)和53.7％(P＜0.01)，同濃度的藥物II和藥物III對(duì)冠脈流量無(wú)影響。
各藥物對(duì)心率影響不明顯，除藥物I對(duì)心搏幅度有一定的抑制作用(35.5％，P＜0.05)外，其余各藥物對(duì)心搏幅度均無(wú)明顯影響。
腦垂體后葉素(2×10-3U/ml)能顯著減少離體豚鼠心臟冠脈流量(-36.9％，P＜0.05)。藥物I(85μM)能完全對(duì)抗后葉素誘發(fā)的冠脈流量減少作用。
表2組別 冠脈流量X±SE 增減 心率 X±SE 增減 舒縮性能 X±SE 增減對(duì)照 給藥 (％) 對(duì)照 給藥 (％) 對(duì)照給藥 (％)藥物I(9)5.6±0.5 10.9±0.5 94.6***241±16 248±10 2.9 7.6±0.7 4.9±0.7-35.5*藥物Ia(9) 8.2±0.7 12.6±1.2 53.7**226±16 222±11 -1.8 6.7±0.7 6.4±0.9-4.5藥物II(8) 5.8±0.7 6.0±0.6 3.4252±5250±7 -0.8 12.2±1.3 12.4±1.1 1.6藥物III(6) 7.0±1.1 6.9±1.2 -1.4 220±8206±11 -5.4 5.8±0.5 5.8±0.60.0后葉素(6) 11.1±0.9 7.0±0.8 -36.9*251±10 210±9 -16.3 13.0±1.8 11.0±2.0 -15.4后葉素+I(6) 8.3±0.7 9.9±0.7 19.3 247±4239±4 -3.2 10.0±1.3 6.0±0.9-40.0*P＜0.05**P＜0.01***P＜0.001 數(shù)值＝均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤灌流液樂(lè)氏液 藥物濃度85μM 垂體后葉素濃度2×10-3U/ml實(shí)施例9藥物I對(duì)腦垂體后葉素誘發(fā)的大鼠心肌缺血心電圖的影響1)藥物I、腦垂體后葉素同實(shí)施例72)實(shí)驗(yàn)方法取大鼠22只，雌雄各半，隨機(jī)分成兩組，腦垂體后葉素組和腦垂體后葉素加藥物I組。
大鼠腹腔注射25％烏拉坦(4ml/kg)麻醉后仰臥固定，在四肢皮下插入針狀電極，調(diào)節(jié)心電圖機(jī)定標(biāo)靈敏度1mv＝10mm，紙速50mm/s，記錄正常II導(dǎo)心電圖后，對(duì)照組通過(guò)股靜脈注射生理鹽水0.2ml/鼠，給藥組通過(guò)股靜脈注射藥物150mg/0.2ml/kg，1分鐘后分別注射后葉素0.75U/kg(15秒內(nèi)注射完畢)，分別于即刻，15”、30”、1’、2’、3’、4’和5’重復(fù)記錄II導(dǎo)心電圖。
以注射后葉素后I期(0-30’)心電圖T波高聳且S點(diǎn)抬高超過(guò)0.1mv，II期(30”-5’)心電圖T波壓低且S點(diǎn)下降超過(guò)0.1mv者判斷為陽(yáng)性缺血性心電圖，反之為陰性，比較兩組陰性率差異，X2檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)顯著性。
3)結(jié)果如表3所示大鼠靜注垂體后葉素0.75U/kg，均出現(xiàn)I、II期缺血性心電圖，且有兩例出現(xiàn)病理性Q液，大鼠靜注藥物I50mg/kg能非常有效地對(duì)抗上述I、II期缺血性心電圖改變，也無(wú)病理性Q液出現(xiàn)。
表3藥物I對(duì)腦垂體后葉素誘發(fā)的大鼠心肌缺血心電圖的影響組別動(dòng)物數(shù)I-期陰性數(shù)I-期陰性數(shù)Q液對(duì)照 11 0 1 2給藥 11 9 109P＜0.001 ＜0.001給藥途徑股靜脈給藥劑量對(duì)照組，垂體后葉素0.75U/kg給藥組，化合物I 50mg/kg實(shí)施例10、藥物I對(duì)急性實(shí)驗(yàn)性心肌梗死(AMI)大鼠左心室收縮性能及梗死范圍的影響。
1)藥物I同實(shí)施例72)實(shí)驗(yàn)方法取健康大鼠40只，隨機(jī)分成四組小劑量組、大劑量組、假手術(shù)組和心理鹽水組。
手術(shù)前半小時(shí)給藥一次，然后將全部動(dòng)物在乙醚麻醉下，于左側(cè)3-4肋間心尖搏動(dòng)最明顯處作一長(zhǎng)約2cm的切口，剪開(kāi)皮下筋膜及肌肉，用一彎止血鉗撐開(kāi)肋骨，施加一側(cè)向壓力于胸側(cè)壁及劍突下擠出心臟，以心臟表面靜脈為標(biāo)志，在左心耳根部與肺動(dòng)脈圓錐之間，相當(dāng)于左冠狀動(dòng)脈起始處向下2-3mm處，用3號(hào)絲線結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈主干，假手術(shù)僅穿線而不結(jié)扎，立即送還心臟，押出胸腔內(nèi)氣體，夾緊皮膚切口行人工呼吸，待自主呼吸恢復(fù)后，縫合胸壁，立即記錄動(dòng)物心電圖，無(wú)缺血性心電圖變化者棄去。
給藥組于手術(shù)后第二天開(kāi)始，每日分別腹腔注射藥物I 25mg/kg(小劑量)、50mg/kg(大劑量)；對(duì)照組給同體積生理鹽水；假手術(shù)組什么都不給，連同手術(shù)前一次共給藥8次(8天)。
最后一次給藥后30分鐘，腹腔注射25％烏拉坦(4ml/kg)麻醉大鼠，將大鼠仰臥固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，分離出右頸總動(dòng)脈后，自尾靜脈注射肝素300U抗凝，將心導(dǎo)管導(dǎo)入頸總動(dòng)脈0.5cm，測(cè)定動(dòng)脈壓后再繼續(xù)將導(dǎo)管延伸2.5-3cm，待示波器上顯示出左室內(nèi)壓曲線圖時(shí)，表示導(dǎo)管已進(jìn)入左心室，將導(dǎo)管連同動(dòng)脈壁結(jié)扎固定，5分鐘后測(cè)定左室收縮性能各指標(biāo)，同時(shí)記錄心電圖。
所測(cè)指標(biāo)及測(cè)定條件如下左室內(nèi)壓(LVP)及左室內(nèi)壓峰值(LVSP)曲線；定標(biāo)靈敏度50mmHg/10mm，紙速50mm/s。
左室內(nèi)壓變化速率(dp/dt)曲線，定標(biāo)靈敏度2000mmHg/s/5mm，紙速100mm/s，微分時(shí)間常數(shù)1ms，高頻濾波50Hz。
待上述指標(biāo)測(cè)定結(jié)束后，立即將大鼠開(kāi)胸，取出心臟，除去心房，將心臟橫切成四片，N-BT染色15分鐘，10％甲醛固定，正常心肌染成藍(lán)色，梗死心肌不著色(呈灰白色)，染色后心臟切片梗切面用彩色膠卷照相，沖洗放大3.3倍，用透明塑料薄膜描下照片上左心室梗死區(qū)及非梗死區(qū)界線，剪紙稱(chēng)重法計(jì)算梗死區(qū)橫切面范圍占整個(gè)左心室橫切面范圍的百分比，t檢驗(yàn)求P值。 3)結(jié)果如表4所示大鼠腹腔注射藥物I 50mg/kg/天，連續(xù)8天，心功能明顯好于生理鹽水對(duì)照組(P＜0.05)，與假手術(shù)組差異不顯著，大鼠腹腔注射藥物I25mg/kg/天，連續(xù)8天，心功能也有改善的趨勢(shì)，但與生理鹽水對(duì)照組差異不顯著如表5所示，大鼠腹腔注射藥物I 50mg/kg/天和25mg/kg/天，連續(xù)8天，均能非常顯著地縮小心梗范圍，當(dāng)對(duì)照組心梗范圍為38.5％時(shí)，大劑量和小劑量給藥組心梗范圍僅分別為15.9％(P＜0.001)和11.8％(P＜0.001)。抑制強(qiáng)度分別為58.7％和69.4％。
表4藥物I對(duì)急性心肌梗死大鼠左室心肌收縮性能的影響組別 動(dòng)物數(shù) HR LVSP +dp/dtmax-dp/dtmax(beals/min)(mmHg) (mmHg/sec) (mmHg/sec)X±SEX±SE X±SEX±SE對(duì)照 7429±24104.6±5.39900±5857800±526假手術(shù) 7450±12119.6±6.411917±306*9714±529*藥物I7394±29114.3±5.719886±622 8743±614(25mg/kg)藥物I9400±11111.8±2.611570±388*8533±666(50mg/kg)給藥途徑腹腔給藥次數(shù)每天一次，連續(xù)3天P＜0.05測(cè)定時(shí)間最后一次給藥后30分鐘表5藥物I對(duì)急性心肌梗死大鼠心醒范圍的影響組別動(dòng)物數(shù) 心梗范圍(％LV) 抑制強(qiáng)度(％)P對(duì)照 738.5±2.5 0.0化合物I(25mg/kg) 10 11.2±1.8 69.4 ＜0.001化合物I(50mg/kg)9 15.9±2.558.7＜0.001給藥途徑腹腔 數(shù)值＝均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤給藥次數(shù)每天一次，連續(xù)8天。
由上述實(shí)施例可以看出，藥物I確有較好的抗心肌缺血作用。
權(quán)利要求
1.通式I的化合物及其甲基化衍生物 其中，R為H、式II的基團(tuán)或式III的基團(tuán)
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于該化合物為通式I的化合物，其中，R為H、式II的基團(tuán)或式III的基團(tuán)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的化合物，其特征在于該化合物是R為H時(shí)的式I化合物。
4.權(quán)利要求2化合物的生產(chǎn)方法，包括以下步驟1)將小紅參(Rubia ynananensis(Franch.)Diels)按重量比為1∶8-12的比例溶解于蒸餾水中，用酸，優(yōu)選濃鹽酸及冰醋酸，調(diào)節(jié)溶液的pH至2.5-3.5，3℃-12℃放置過(guò)夜；2)過(guò)濾，得濾渣及濾液；3)依次用低分子量醇，優(yōu)選甲醇、乙醇或正丁醇，和丙酮回流提取所得濾渣，甲醇和丙酮的體積分別為上述用于溶解小紅參蒸餾水體積的1/3-1/5；4)合并上述所得的甲醇和丙酮提取液，將甲醇-丙酮溶解部分進(jìn)行硅膠柱色譜；5)依次用環(huán)己烷、18-22∶1的氯仿-丙酮、二氯甲烷及丙酮洗脫硅膠柱，循環(huán)12-14次，合并洗脫液；6)3℃-12℃放置過(guò)夜，得到析出的結(jié)晶，即取代基R為H時(shí)的式I化合物；7)收集合并上述第5)步中，依次用環(huán)己烷、18-22∶1的氯仿-丙酮、二氯甲烷及丙酮洗脫硅膠柱第13-16次循環(huán)的洗脫液；8)3℃-12℃放置至結(jié)晶析出，抽濾，得到濾餅；9)用1∶1∶1的甲醇-無(wú)水乙醇-四氫呋喃將濾餅溶解，3℃-12℃放置至結(jié)晶析出；10)抽濾，干燥，將所得的混合物用離心薄層色譜分離，依次用10∶1、8∶1、6∶1和4∶1的二氯甲烷-甲醇洗脫；11)收集離心薄層色譜的第II峰；12)干燥，即得取代基R為式II時(shí)的式I化合物；13)收集上述離心薄層色譜的第III峰，干燥，即得取代基R為式III時(shí)的式I化合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述步驟3)依次用低分子量醇和丙酮回流提取所得濾渣，所述低分子量醇和丙酮是等體積的，提取至提取液肉眼觀察不到顏色；所述步驟5)合并洗脫液后，進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)；所述步驟6)得到析出的結(jié)晶后，進(jìn)行抽濾，濾餅用無(wú)水乙醇重結(jié)晶，將結(jié)晶用丙酮溶解，活性碳脫色，3℃-12℃放置過(guò)夜，得到析出的結(jié)晶，抽濾并用3℃-12℃的冷丙酮洗滌濾餅，干燥得到結(jié)晶，即取代基R為H時(shí)的式I化合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述步驟8)得到的濾餅，將濾餅用3℃-12℃的冷丙酮洗滌后，再進(jìn)入所述第9)步，用1∶1∶1的甲醇-無(wú)水乙醇-四氫呋喃將濾餅溶解后，用活性碳脫色兩次，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，再于3℃-12℃放置至結(jié)晶析出；所述步驟10)抽濾后，用3℃-12℃的冷丙酮洗滌濾餅后再進(jìn)行所述的干燥及離心薄層色譜分離。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述步驟13)收集上述離心薄層色譜的第III峰，干燥后用甲醇重結(jié)晶，再干燥，即得取代基R為式III時(shí)的式I化合物。
8.化學(xué)合成權(quán)利要求3所述化合物的方法，包括以下步驟1)3，5-二羥基苯甲酸選擇溴代，得2，5-二溴-3，5-二羥基苯甲酸；2)經(jīng)曼尼希反應(yīng)，得2，5-二溴-3，5-二羥基-4-氨甲基苯甲酸；3)在堿液中加入Al-Ni合金進(jìn)行還原反應(yīng)，得到3，5-二羥基-4-甲基苯甲酸；4)在AlCl3存在下，使3，5-二羥基-4-甲基苯甲酸和4-羥基苯甲酸進(jìn)行反應(yīng)，得到取代基R為H的式I化合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述步驟1)的選擇溴代反應(yīng)是在Br2/CHCl3，25℃的條件下進(jìn)行的；所述步驟2)的曼尼希反應(yīng)是在33％HNMe2，37％HCHO，(乙醇)EtOH，HAc，25℃的條件下進(jìn)行的；所述步驟3)是在NaOH溶液中進(jìn)行的；所述步驟4)中3，5-二羥基-4-甲基苯甲酸和4-羥基苯甲酸的反應(yīng)是在攪拌，加熱到180-200C下進(jìn)行的。
10.以權(quán)利要求1所述的小紅參醌為活性成分的抗心肌缺血藥物。
11.權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)的化合物在制備抗心肌缺血藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明的名稱(chēng)為小紅參醌及其衍生物，它的制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明公開(kāi)了一種通式I的化合物及其甲基化衍生物，其中，R為H、式II的基團(tuán)或式III的基團(tuán)，本發(fā)明還公開(kāi)了從中藥小紅參中提取通式I化合物方法、化學(xué)合成通式I化合物的方法，以及以通式I的化合物為活性成分的抗心肌缺血的藥物。
文檔編號(hào)C07H15/244GK1397541SQ01120320
公開(kāi)日2003年2月19日 申請(qǐng)日期2001年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月20日
發(fā)明者王升啟, 馬立人, 李魯, 任建平, 康利平, 王景霞 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所