一種構(gòu)建dna高通量測序文庫的方法及其配套試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種構(gòu)建DNA高通量測序文庫的方法及其配套試劑盒，具體地，本發(fā)明提供了一種基于核酸樣品構(gòu)建測序文庫的方法，所述方法包括：對用于構(gòu)建測序文庫的核酸樣品進行變性處理使其解鏈為單鏈核酸，將其與第一銜接子進行退火反應(yīng)和連接反應(yīng)，從而形成“第一銜接子-單鏈核酸”復(fù)合物；將所述復(fù)合物吸附于磁珠，與第二銜接子進行退火反應(yīng)和連接反應(yīng)，從而形成吸附有“第一銜接子-單鏈核酸-第二銜接子”復(fù)合物的磁珠，將經(jīng)清洗的磁珠進行PCR反應(yīng)，獲得擴增產(chǎn)物，用于構(gòu)建測序文庫。
【專利說明】一種構(gòu)建DNA高通量測序文庫的方法及其配套試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，更具體地，涉及一種構(gòu)建DNA高通量測序文庫的方法及其配套試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著高通量測序技術(shù)的不斷普及，已經(jīng)出現(xiàn)了針對不同形式核酸樣品的各種高通量測序文庫構(gòu)建方法，其中包括雙鏈DNA (Bentley, D.R.，et al.，Accuratewhole human genome sequencing using reversible terminator chemistry.Nature, 2008.456(7218):p.53-9) > 單鏈 DNA (Smith, D.J.and 1.ffhitehouse, Intrinsiccoup ling of I agging-strand synthesis to chromatin assembly.Nature,2012.483 (7390): p.434-8.)、RNA(Mortazavi, A., et al., Mapping andquantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq.Nat Methods, 2008.5(7):p.621-8)以及小RNA(Zhang, H.，et al., Genome-wide analysis of small RNA and novel MicroRNAdiscovery in human acute lymphoblastic leukemia based on extensive sequencingapproach.PLoS One, 2009.4(9):p.e6849)等。這些方法通常都要求較大的樣品起始量,一般是200ng以上。然而，當起始樣品量較少時(少至50pg)，由于分子碰撞幾率降低以及雜質(zhì)干擾，連接和擴增反應(yīng)的難度都會大大增加。
[0003]因此，本領(lǐng)域尚缺乏一種專門針對少量DNA樣品的高通量測序文庫構(gòu)建方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種專門針對少量DNA樣品的高通量測序文庫構(gòu)建方法。
[0005]本發(fā)明的第一方面，提供了一種基于核酸樣品構(gòu)建測序文庫的方法，所述方法包括步驟:
[0006](a)提供一用于構(gòu)建測序文庫的核酸樣品；
[0007](b)對所述核酸樣品進行變性處理，使所述核酸解鏈為單鏈核酸；
[0008](c)將所述單鏈核酸與第一銜接子(adaptor)進行退火反應(yīng)，從而使得第一銜接子捕獲所述單鏈，并進行連接反應(yīng)，從而形成“第一銜接子-單鏈核酸”復(fù)合物，其中所述第一銜接子為雙鏈，正鏈的5’端連接有生物素并且3’端具有呈單鏈形式的、用于捕獲單鏈核酸的第一捕獲序列，而負鏈為與正鏈互補的序列；
[0009](d)將“第一銜接子-單鏈核酸”復(fù)合物與表面包被有親和素的磁珠進行混合，從而將所述的“第一銜接子-單鏈核酸”復(fù)合物吸附于所述磁珠；
[0010](e)對上一步驟獲得的磁珠進行清洗，獲得經(jīng)清洗的、吸附有“第一銜接子-單鏈核酸”復(fù)合物的磁珠；
[0011](f)將上一步驟獲得的、經(jīng)清洗的且吸附有“第一銜接子-單鏈核酸”復(fù)合物的磁珠與第二銜接子進行退火反應(yīng)，從而使得第二銜接子結(jié)合于所述單鏈的游離端，并進行連接反應(yīng)，從而形成吸附有“第一銜接子-單鏈核酸-第二銜接子”復(fù)合物的磁珠，[0012]其中所述第二銜接子為雙鏈，正鏈的5’端具有呈單鏈形式的、用于結(jié)合于單鏈核酸的第二捕獲序列，而負鏈為與正鏈互補的序列；
[0013](g)對上一步驟獲得的磁珠進行清洗，獲得經(jīng)清洗的、吸附有“第一銜接子-單鏈核酸-第二銜接子”復(fù)合物的磁珠；
[0014](h)將上一步驟獲得的經(jīng)清洗的磁珠，用特異性結(jié)合于第一銜接子的第一引物和特異性結(jié)合于第二銜接子的第二引物，進行PCR反應(yīng)，獲得第一擴增產(chǎn)物，用于構(gòu)建測序文庫。
[0015]在另一優(yōu)選例中，所述核酸樣品的總量為10_200pg。
[0016]在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括: [0017](i)以第一擴增產(chǎn)物為模板，用第三引物和第四引物進行PCR擴增，從而獲得第二擴增產(chǎn)物，其中所述的第二擴增產(chǎn)物的兩端引入了測序接頭序列。
[0018]在另一優(yōu)選例中，所述的第三引物的5’端含有測序接頭序列且3’端含有部分或全部第一引物序列；而所述的第四引物與第二引物相同。
[0019]在另一優(yōu)選例中，所述的第一銜接頭的結(jié)構(gòu)如下，從5’至3’端:
[0020]生物素標記物-雙鏈互補區(qū)-單鏈捕獲區(qū)
[0021]其中，雙鏈互補區(qū)的長度為15-100bp ;而單鏈捕獲區(qū)的長度為5-10bp。
[0022]在另一優(yōu)選例中，所述的核酸樣品的總量為20_100pg。
[0023]在另一優(yōu)選例中，所述的核酸樣品包括DNA樣品、RNA樣品。
[0024]在另一優(yōu)選例中，所述的捕獲序列為5-8個堿基的隨機序列。
[0025]在另一優(yōu)選例中，
[0026]所述的第一銜接子的正鏈雙鏈區(qū)序列如SEQ ID NO:1所示；
[0027]所述的第一銜接子的反鏈雙鏈區(qū)序列如SEQ ID NO:2所示；
[0028]所述的第二銜接子的正鏈雙鏈區(qū)序列如SEQ ID NO:3所示；
[0029]所述的第二銜接子的反鏈雙鏈區(qū)序列如SEQ ID N0:4所示。
[0030]在另一優(yōu)選例中，所述第一引物的序列如SEQ ID N0:5所示。
[0031]在另一優(yōu)選例中，所述第二引物的序列如SEQ ID N0:6所示。
[0032]在另一優(yōu)選例中，所述第三引物的序列如SEQ ID N0:7所示。
[0033]在另一優(yōu)選例中，所述陽性對照序列如SEQ ID N0:8所示。
[0034]在另一優(yōu)選例中，所述的核酸樣品的總量為20_100pg。
[0035]在另一優(yōu)選例中，第一銜接子的負鏈的5’端是磷酸化的。
[0036]在另一優(yōu)選例中，第一銜接子的負鏈的3’端是氨基封閉的。
[0037]在另一優(yōu)選例中，第一銜接子的負鏈的3’端是氨基封閉的。
[0038]在另一優(yōu)選例中，第一銜接子的雙鏈部分的長度為15-100bp，較佳地為20_80bp。
[0039]在另一優(yōu)選例中，在步驟(a)中，額外提供一對照核酸樣品，或者所述核酸樣品中含有對照核酸序列。
[0040]在另一優(yōu)選例中，所述核酸樣品中對照核酸序列的數(shù)量為10_200pg，較佳地20-100pgo
[0041]在另一優(yōu)選例中，所述的測序為Solexa高通量測序。
[0042]本發(fā)明的第二方面，提供了一種基于核酸樣品構(gòu)建測序文庫的試劑盒，所述試劑盒包括:
[0043]一第一銜接子，所述第一銜接子為雙鏈，正鏈的5’端連接有生物素標記物并且3’端具有呈單鏈形式的、用于捕獲單鏈核酸的第一捕獲序列，而負鏈為與正鏈互補的序列；
[0044]—第二銜接子，所述的第二銜接子為雙鏈，正鏈的5’端具有呈單鏈形式的、用于結(jié)合于單鏈核酸的第二捕獲序列，而負鏈為與正鏈互補的序列；
[0045]一磁珠，所述磁珠表面包被有親和素；
[0046]和說明書，所 述的說明書記載了使用方法。
[0047]在另一優(yōu)選例中，所述的使用方法包括:用如本發(fā)明第一方面所述的方法構(gòu)建測序文庫。
[0048]在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒還包括:特異性結(jié)合于第一銜接子的第一引物；和特異性結(jié)合于第二銜接子的第二引物。
[0049]在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還包括一對照核酸樣品。
[0050]在另一優(yōu)選例中，所述對照核酸序列的數(shù)量為10_200pg，較佳地20_100pg。
[0051]應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0052]圖1為用本發(fā)明方法基于50pg單鏈DNA構(gòu)建DNA測序文庫的電泳圖；
[0053]圖2為用本發(fā)明方法基于500ng單鏈DNA構(gòu)建DNA測序文庫的電泳圖；
[0054]圖3為用本發(fā)明方法基于Ilng酵母岡崎片段構(gòu)建DNA測序文庫的電泳圖；
[0055]圖4顯示了本發(fā)明一個優(yōu)選例中第一銜接子和第二銜接子的結(jié)構(gòu)；
[0056]圖5為用本發(fā)明的一種優(yōu)選實施例中，用本發(fā)明方法構(gòu)建DNA測序文庫的示意圖；其中，“primer”為引物，“Adaptor”為銜接子，第四引物與第二引物相同。
【具體實施方式】
[0057]本發(fā)明人經(jīng)過長期而深入的研究，意外開發(fā)出了一種能夠用于構(gòu)建DNA高通量測序文庫的方法，使用所述方法，能夠基于極少量(200pg以下)的核酸樣本建立測序文庫?；谏鲜霭l(fā)現(xiàn)，發(fā)明人完成了本發(fā)明。
[0058]構(gòu)建DNA高通量測序文庫的方法
[0059]本發(fā)明提供了一種基于核酸樣品構(gòu)建測序文庫的方法，所述方法包括步驟:
[0060](a)提供一用于構(gòu)建測序文庫的核酸樣品；
[0061](b)對所述核酸樣品進行變性處理，使所述核酸解鏈為單鏈核酸；
[0062](c)將所述單鏈核酸與第一銜接子(adaptor，或譯為“接頭”)進行退火反應(yīng)，從而使得第一銜接子捕獲所述單鏈，并進行連接反應(yīng)，從而形成“第一銜接子-單鏈核酸”復(fù)合物；
[0063](d)將“第一銜接子-單鏈核酸”復(fù)合物與表面包被有親和素的磁珠進行混合，從而將所述的“第一銜接子-單鏈核酸”復(fù)合物吸附于所述磁珠；
[0064](e)對上一步驟獲得的磁珠進行清洗，獲得經(jīng)清洗的、吸附有“第一銜接子-單鏈核酸”復(fù)合物的磁珠；
[0065](f)將上一步驟獲得的、經(jīng)清洗的且吸附有“第一銜接子-單鏈核酸”復(fù)合物的磁珠與第二銜接子進行退火反應(yīng)，從而使得第二銜接子結(jié)合于所述單鏈的游離端，并進行連接反應(yīng)，從而形成吸附有“第一銜接子-單鏈核酸-第二銜接子”復(fù)合物的磁珠；
[0066](g)對上一步驟獲得的磁珠進行清洗，獲得經(jīng)清洗的、吸附有“第一銜接子-單鏈核酸-第二銜接子”復(fù)合物的磁珠；
[0067](h)將上一步驟獲得的經(jīng)清洗的磁珠作為模板，用特異性結(jié)合于第一銜接子的第一引物和特異性結(jié)合于第二銜接子的第二引物，進行PCR反應(yīng)，獲得第一擴增產(chǎn)物，作為測序文庫。
[0068]其中，所述的第一銜接子為雙鏈，正鏈的5’端連接有生物素標記物并且3’端具有呈單鏈形式的、用于捕獲單鏈核酸的第一捕獲序列，而負鏈為與正鏈互補的序列；所述第二銜接子為雙鏈，正鏈的5’端具有呈單鏈形式的、用于結(jié)合于單鏈核酸的第二捕獲序列，而負鏈為與正鏈互補的序列。
[0069]本發(fā)明的方法中，還可以任選地包括以下步驟:以第一擴增產(chǎn)物為模板，用第三引物和第四引物進行PCR擴增，從而獲得第二擴增產(chǎn)物，其中所述的第二擴增產(chǎn)物的兩端引入了測序接頭序列。
[0070]其中，一種優(yōu)選的所述的第三引物的5’端含有測序接頭序列且3’端含有部分或全部第一引物序列。一種優(yōu)選的所述的第四引物與第二引物相同。
[0071]在另一優(yōu)選例中，所述的第一銜接頭的結(jié)構(gòu)如下，從5’至3’端:
[0072]生物素標記物-雙鏈互·補區(qū)-單鏈捕獲區(qū)
[0073]其中，雙鏈互補區(qū)的長度為15-100bp ;而單鏈捕獲區(qū)的長度為5-10bp。
[0074]所述的核酸樣品的總量可以為< 200pg，優(yōu)選地，所述核酸樣品的總量為10-200pg。在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，所述的核酸樣品的總量為20-100pg。
[0075]在另一優(yōu)選例中，所述的核酸樣品包括DNA樣品、RNA樣品。
[0076]在另一優(yōu)選例中，所述的捕獲序列為5-8個堿基的隨機序列。
[0077]在另一優(yōu)選例中，所述的第一銜接子的正鏈雙鏈區(qū)序列如SEQ ID NO:1所示。
[0078]在另一優(yōu)選例中，所述的第一銜接子的反鏈雙鏈區(qū)序列如SEQ ID N0:2所示。
[0079]在另一優(yōu)選例中，所述的第二銜接子的正鏈雙鏈區(qū)序列如SEQ ID N0:3所示。
[0080]在另一優(yōu)選例中，所述的第二銜接子的反鏈雙鏈區(qū)序列如SEQ ID N0:4所示。
[0081]在另一優(yōu)選例中，所述第一引物的序列如SEQ ID N0:5所示。
[0082]在另一優(yōu)選例中，所述第二引物的序列如SEQ ID N0:6所示。
[0083]在另一優(yōu)選例中，所述第三引物的序列如SEQ ID N0:7所示。
[0084]在另一優(yōu)選例中，所述陽性對照序列如SEQ ID N0:8所示。
[0085]在另一優(yōu)選例中，所述的核酸樣品的總量為20_100pg。
[0086]在另一優(yōu)選例中，第一銜接子的負鏈的5’端是磷酸化的。
[0087]在另一優(yōu)選例中，第一銜接子的負鏈的3’端是氨基封閉的。
[0088]在另一優(yōu)選例中，第一銜接子的負鏈的3’端是氨基封閉的。
[0089]在另一優(yōu)選例中，第一銜接子的雙鏈部分的長度為15-100bp，較佳地為20_80bp。
[0090]在另一優(yōu)選例中，在步驟(a)中，額外提供一對照核酸樣品，或者所述核酸樣品中含有對照核酸序列。
[0091]在另一優(yōu)選例中，所述核酸樣品中對照核酸序列的數(shù)量為10_200pg，較佳地20-100pgo
[0092]在另一優(yōu)選例中,所述的測序為Solexa高通量測序。
[0093]基于微量核酸樣品構(gòu)建測序文庫的試劑盒
[0094]本發(fā)明還提供了一種用上述方法構(gòu)建測序文庫的試劑盒，所述試劑盒包括:
[0095]一第一銜接子，所述第一銜接子為雙鏈，正鏈的5’端連接有生物素標記物并且3’端具有呈單鏈形式的、用于捕獲單鏈核酸的第一捕獲序列，而負鏈為與正鏈互補的序列；
[0096]一第二銜接子，所述的第二銜接子為雙鏈，正鏈的5’端具有呈單鏈形式的、用于結(jié)合于單鏈核酸的第二捕獲序列，而負鏈為與正鏈互補的序列；
[0097]一磁珠，所述磁珠表面包被有親和素；
[0098]和說明書，所述的說明書記載了使用方法。
[0099]在另一優(yōu)選例中，所述的使用方法包括:用本發(fā)明的方法構(gòu)建測序文庫。
[0100]所述試劑盒還可以任選地包括其他組件，如PCR反應(yīng)單元、磁珠分離單元等。在一個優(yōu)選例中，所述的試劑盒還包括:特異性結(jié)合于第一銜接子的第一引物；和特異性結(jié)合于第二銜接子的第二引物。
[0101]在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還包括一對照核酸樣品。
[0102]在另一優(yōu)選例中，所述對照核酸序列的數(shù)量為10_200pg，較佳地20_100pg。
[0103]一種優(yōu)選的試劑盒包括:
[0104]第一銜接子(5 μ L，I μ M)，正鏈雙鏈區(qū)序列如SEQ ID NO:1所示，5’端連接有生物素標記物，3’端具有5-10個隨機堿基(第一捕獲序列)；反鏈雙鏈區(qū)序列如SEQ ID NO: 2所示，5’端磷酸化以便捕獲，3’端為氨基(NH2)封閉。
[0105]第二銜接子(5 μ L，10 μ Μ)，正鏈雙鏈區(qū)序列如SEQ ID NO: 3所示，5’端具有5-10個隨機堿基(第二捕獲序列)，3’端為氨基(NH2)封閉；反鏈雙鏈區(qū)序列如SEQ ID NO: 4所示；
[0106]Τ4 多聚核苷酸激酶(20 μ L，IOU/ μ L)；
[0107]T4DNA 連接酶(90 μ L，400U/ μ L)
[0108]快速連接酶緩沖液(2X,132mMTris-HCl, pH7.6,20mM MgCl2, 2mM ATP,2mM DTT，15%PEG6000,400y L)；
[0109]第一引物(5μ L，10 μ Μ)，序列如 SEQ ID NO:5 所示；
[0110]第二引物(10μ L，10 μ Μ)，序列如 SEQ ID NO:6 所示；
[0111]第三引物(5 μ L，10 μ Μ)，序列如SEQ ID NO: 7所示；
[0112]陽性對照DNA(5ng)，序列如SEQ ID NO:8所示；
[0113]MyOne鏈霉親和素磁珠(200 μ L)。
[0114]本發(fā)明的主要優(yōu)點包括:
[0115](I)本方法利用生物素和磁珠的親和反應(yīng)，將少量的DNA樣品連接到磁珠上進行后續(xù)的連接和擴增處理，便于去除雜質(zhì)和多余的接頭，得到的產(chǎn)物純度高，且已包含雙向測序接頭，可以直接用于高通量測序。
[0116](2)與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明最大程度去除了雜質(zhì)，通過反復(fù)清洗磁珠，減少了多余接頭對后續(xù)擴增的影響，使用Pfu酶通過兩輪放大，引入測序接頭的同時能夠準確放大目標樣品。
[0117](3)本發(fā)明適合于各種DNA構(gòu)建高通量測序文庫，且所需都是常規(guī)實驗技術(shù)以及容易購買到的試劑和藥品，條件易得，且操作簡便，一般實驗技術(shù)人員皆可操作完成。
[0118]下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。
[0119]實施例1DNA高通量測序文庫的構(gòu)建
[0120]1.將DNA樣品溶于8 μ LlOmM Tris-HCl (ρΗ7.5)，于95°C加熱5分鐘后立刻插冰上使之迅速冷卻。
[0121]2.加入2yL T4多聚核苷酸激酶、10yL2XT4DNA快速連接酶緩沖液(132mMTris-HCl, pH7.6,20mM MgCl2, 2mM ATP,2mM DTT，15%PEG6000)。
[0122]3.37V反應(yīng)4小時后于70°C加熱15分鐘使酶失活。
[0123]4.加入5.1 μ L ddH20后于95°C加熱5分鐘使之完全變性，然后立刻插于冰上使之冷卻。
[0124]5.加入0.5 μ LI μ M的第一銜接子(見圖4。正鏈雙鏈區(qū)序列如SEQ ID NO:1所示，5’端連接有生物素標記物，3’端具有5-10個隨機堿基；反鏈雙鏈區(qū)序列如SEQ ID NO: 2所示，5’端磷酸化以便捕獲，3’端為胺基封閉。)后于37°C溫育10分鐘。
[0125]6.加入3 μ L T4連接酶、10 μ L2X快速連接酶緩沖液后混勻。
[0126]7.于 16°C 反應(yīng) 8h。
[0127]8.取出20 μ L MyOne鏈霉親和素磁珠(Life Technology公司，美國;貨號65001)后用 40μ L2XBinding&Washing 緩沖液(IOmM Tris-HCl (pH7.5), ImM EDTA, 2.0M NaCl)清洗3次并最終重懸于40 μ L2 X Binding & Washing緩沖液中。
[0128]9.將步驟8中的MyOne鏈霉親和素磁珠加至步驟7中得到的連接產(chǎn)物后于室溫連接8小時，期間置旋轉(zhuǎn)混勻儀。
[0129]10.用 100 μ LI XBinding&Washing 緩沖液清洗 3 次。
[0130]11.再用20 μ LI X快速連接酶緩沖液清洗一次后將磁珠重懸于20 μ LI X快速連接酶緩沖液。
[0131]12.加入0.5 μ LlO μ M的第二銜接子(正鏈雙鏈區(qū)序列如SEQ ID NO: 3所示，5’端具有5-10個隨機堿基，3’端為胺基封閉；反鏈雙鏈區(qū)序列如SEQ ID Ν0:4所示)后于55°C孵育2分鐘，然后立刻插入冰中使之迅速冷卻。
[0132]13.加入2yL T4連接酶后于16°C連接反應(yīng)8小時，期間置旋轉(zhuǎn)混勻儀。
[0133]14.吸去上清后加入20 μ LI X快速連接酶緩沖液與0.5 μ LlO μ M的接頭2后于55°C旋轉(zhuǎn)2分鐘，然后立刻插入冰中使之迅速冷卻。
[0134]15.加入2 μ L T4連接酶后于16°C再旋轉(zhuǎn)混勻5小時。
[0135]16.用 100 μ LI XBinding&Washing 緩沖液清洗 3 次后再用 100 μ L Washing 緩沖液(IOmM Tris-HCl (pH7.5), 2mM EDTA, 50mM KC1,0.02%Triton X-100)清洗 5 次，最后重懸于 20 μ LI X Binding&ffashing 緩沖液中。
[0136]17.PCR擴增，反應(yīng)體系及PCR程序如下所示:[0137]
【權(quán)利要求】
1.一種基于核酸樣品構(gòu)建測序文庫的方法，其特征在于，包括步驟: (a)提供一用于構(gòu)建測序文庫的核酸樣品； (b)對所述核酸樣品進行變性處理，使所述核酸解鏈為單鏈核酸； (C)將所述單鏈核酸與第一銜接子(adaptor)進行退火反應(yīng)，從而使得第一銜接子捕獲所述單鏈，并進行連接反應(yīng)，從而形成“第一銜接子-單鏈核酸”復(fù)合物，其中所述第一銜接子為雙鏈，正鏈的5’端連接有生物素并且3’端具有呈單鏈形式的、用于捕獲單鏈核酸的第一捕獲序列，而負鏈為與正鏈互補的序列； (d)將“第一銜接子-單鏈核酸”復(fù)合物與表面包被有親和素的磁珠進行混合，從而將所述的“第一銜接子-單鏈核酸”復(fù)合物吸附于所述磁珠； (e)對上一步驟獲得的磁珠進行清洗，獲得經(jīng)清洗的、吸附有“第一銜接子-單鏈核酸”復(fù)合物的磁珠； (f)將上一步驟獲得的、經(jīng)清洗的且吸附有“第一銜接子-單鏈核酸”復(fù)合物的磁珠與第二銜接子進行退火反應(yīng)，從而使得第二銜接子結(jié)合于所述單鏈的游離端，并進行連接反應(yīng)，從而形成吸附有“第一銜接子-單鏈核酸-第二銜接子”復(fù)合物的磁珠， 其中所述第二銜接子為雙鏈，正鏈的5’端具有呈單鏈形式的、用于結(jié)合于單鏈核酸的第二捕獲序列，而負鏈為與正鏈互補的序列； (g)對上一步驟獲得的磁珠進行清洗，獲得經(jīng)清洗的、吸附有“第一銜接子-單鏈核酸-第二銜接子”復(fù)合物的磁珠； (h)將上一步驟獲得 的經(jīng)清洗的磁珠，用特異性結(jié)合于第一銜接子的第一引物和特異性結(jié)合于第二銜接子的第二引物，進行PCR反應(yīng)，獲得第一擴增產(chǎn)物，用于構(gòu)建測序文庫。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法還包括: (i)以第一擴增產(chǎn)物為模板，用第三引物和第四引物進行PCR擴增，從而獲得第二擴增產(chǎn)物，其中所述的第二擴增產(chǎn)物的兩端引入了測序接頭序列。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的第三引物的5’端含有測序接頭序列且3’端含有部分或全部第一引物序列；而所述的第四引物與第二引物相同。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第一銜接頭的結(jié)構(gòu)如下，從5’至3’端: 生物素標記物-雙鏈互補區(qū)-單鏈捕獲區(qū) 其中，雙鏈互補區(qū)的長度為15-100bp ;而單鏈捕獲區(qū)的長度為5-10bp。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的核酸樣品的總量為20-100pg。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的核酸樣品包括DNA樣品、RNA樣品。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的捕獲序列為5-8個堿基的隨機序列。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于， 所述的第一銜接子的正鏈雙鏈區(qū)序列如SEQ ID NO:1所示； 所述的第一銜接子的反鏈雙鏈區(qū)序列如SEQ ID N0:2所示； 所述的第二銜接子的正鏈雙鏈區(qū)序列如SEQ ID NO:3所示； 所述的第二銜接子的反鏈雙鏈區(qū)序列如SEQ ID N0:4所示。
9.一種基于核酸樣品構(gòu)建測序文庫的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括: 一第一銜接子，所述第一銜接子為雙鏈，正鏈的5’端連接有生物素標記物并且3’端具有呈單鏈形式的、用于捕獲單鏈核酸的第一捕獲序列，而負鏈為與正鏈互補的序列； 一第二銜接子，所述的第二銜接子為雙鏈，正鏈的5’端具有呈單鏈形式的、用于結(jié)合于單鏈核酸的第二捕獲序列，而負鏈為與正鏈互補的序列； 一磁珠，所述磁珠表面包被有親和素； 和說明書，所述的說明書記載了使用方法。
10.如權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括:特異性結(jié)合于第一銜接子的第一引物；和特 異性結(jié)合于第二銜接子的第二引物。
【文檔編號】C40B50/06GK103668471SQ201310706375
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月19日
【發(fā)明者】李鑫輝, 楊文超, 邵志峰 申請人:上海交通大學