專利名稱：宏基因組文庫的保存和篩選方法
宏基因組文庫的保存和篩選方法所屬領(lǐng)域本發(fā)明屬于微生物工程領(lǐng)域，涉及一種快速有效地保存并篩選海量宏 基因組克隆的方法，也就是高效保存和篩選宏基因組文庫的方法。
背景技術(shù)：
宏基因組是指環(huán)境中可培養(yǎng)和未可培養(yǎng)的全部微生物的基因組總和， 宏基因組文庫技術(shù)避開了微生物純培養(yǎng)的瓶頸，是研究和利用微生物、尤其是未可培養(yǎng)微 生物資源的有效途徑。將常規(guī)的基因組文庫技術(shù)用于宏基因組研究中，通過直接提取環(huán)境 樣品中所有微生物的DNA并克隆到合適的載體，即可獲得宏基因組文庫。根據(jù)插入片段大 小，宏基因組文庫可以被分成兩類一是克隆于質(zhì)粒載體或λ噬菌體載體中的小片段文庫 (插入片段小于15000堿基對)；另一類是克隆于粘粒及BAC中的大片段文庫(插入片段大 于30000堿基對)。為了最大程度地涵蓋感興趣的所有微生物，宏基因組文庫的容量通常在 一百萬個克隆以上，對于如此海量的宏基因組文庫克隆群體，有必要發(fā)明一種快速有效的 保存和篩選方法。宏基因組文庫的傳統(tǒng)保存方法包括挑取單個克隆、每8個或更多個單克 隆合并保存，這一方法不僅費時費力，而且需要占用很大的保存空間。此外，基于序列相似 性用探針進(jìn)行分子雜交常用于宏基因組文庫的篩選，但是，對同一張膜 上的DNA模板用不 同探針進(jìn)行多次膜雜交以提高宏基因組文庫篩選效率的方法，還未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服上述已有技術(shù)的局限，提供一種高效保存和篩選 宏基因組文庫的方法。為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案宏基因組文庫的保存和篩選方法，所述宏基因組文庫的保存是用小量的文庫包裝 顆料感染感受態(tài)細(xì)胞，保溫后將其等分成96份或96的整倍數(shù)，振蕩培養(yǎng)，加入甘油保存；所 述宏基因組文庫的篩選是用氫氧化鈉加十二烷基磺酸鈉溶液漂洗雜交膜，去除探針的同時 保留膜上的DNA模板用于不同探針的多次膜雜交。更具體地，本發(fā)明宏基因組文庫的保存和篩選方法中，所述宏基因組文庫的保存 是取1 100微升的文庫包裝顆粒與1 10毫升感受態(tài)細(xì)胞混勻，25 39°C保溫20 60分鐘，將該細(xì)胞混合物等分成96份或96的整倍數(shù)，每份加0. 2-2毫升LB培養(yǎng)液，所述 LB培養(yǎng)液為胰蛋白胨10克/升+酵母提取物5克/升+氯化鈉5克/升，pH7. 0，在28 39°C振蕩培養(yǎng)12 24小時，加入甘油保存；所述宏基因組文庫的篩選是把已進(jìn)行過探針 雜交的雜交膜放入預(yù)熱的0. 2M氫氧化鈉加以重量/體積即克/100毫升為單位的0. 的 十二烷基磺酸鈉溶液中，在37°C、55°C、68°C漂洗兩次，每次10分鐘、20分鐘、30分鐘，然后 用300mM氯化鈉加30mM檸檬酸鈉溶液徹底漂洗，去除探針的同時保留膜上的DNA模板用于 不同探針的多次膜雜交。上述的宏基因組文庫的保存和篩選方法中，所述感受態(tài)細(xì)胞的獲取是挑取前一天 劃線培養(yǎng)的EPI300單克隆至5毫升LB培養(yǎng)基中，37°C下每分鐘200轉(zhuǎn)培養(yǎng)12小時；按 1 10的比例轉(zhuǎn)接至15毫升新鮮添加了 IOmM硫酸鎂的LB培養(yǎng)液中，37°C下每分鐘200轉(zhuǎn) 培養(yǎng)100分鐘使細(xì)胞密度達(dá)到0D_約0. 9，由此獲得感受態(tài)細(xì)胞。上述的宏基因組文庫的保存和篩選方法中，已進(jìn)行過探針雜交的雜交膜分兩次在 68°C中處理30分鐘能完全去除探針，將去除探針的雜交膜用不同探針再進(jìn)行多次雜交。
本發(fā)明的方法，由于一是基于用小量的文庫包裝顆感染一定量的感受態(tài)細(xì)胞，等 分成96份或96的整倍數(shù)，進(jìn)行文庫擴增培養(yǎng)與保存；每個保存孔的平均克隆數(shù)在100 800個，視文庫的滴度而定。因此，無需逐個挑取單克隆，快速而有效地保存了宏基因組文 庫。二是基于用一定溫度的堿性溶液去除雜交膜上的探針，保留在膜上的文庫DNA模板可 多次用于不同探針的膜雜交，從而極大提高了宏基因組文庫的篩選效率。
具體實施例方式下面結(jié)合本發(fā)明的實施例進(jìn)一步來說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本 發(fā)明實施例1:本發(fā)明的宏基因組文庫的高效保存和篩選方法可概括為取1 100微升的文庫 包裝顆粒與1 10毫升感受態(tài)細(xì)胞混勻，25 39°C保溫20 60分鐘，將該細(xì)胞混合物等 分成96份或96的整倍數(shù)，每份加少量培養(yǎng)液在28 39°C振蕩培養(yǎng)12 24小時，加入甘 油保存。多次膜雜交篩選宏基因組文庫，用含0.2M氫氧化鈉加0. 十二烷基磺酸鈉的堿 性溶液在37 70°C漂洗雜交膜兩次，每次10 30分鐘，去除探針的同時保留膜上的DNA 模板用于不同探針的多次膜雜交，從而提高宏基因組文庫的篩選效率。具體地挑取前一天劃線培養(yǎng)的EPI300單克隆至5毫升LB培養(yǎng)基中，37°C下每 分鐘200轉(zhuǎn)培養(yǎng)12小時；按1 10的比例轉(zhuǎn)接至15毫升新鮮LB培養(yǎng)液，再加IOmM硫酸 鎂，37°C下每分鐘200轉(zhuǎn)培養(yǎng)100分鐘使細(xì)胞密度達(dá)到OD6tltl約0. 9，由此獲得感受態(tài)細(xì)胞； 取30微升文庫包裝顆粒與1毫升感受態(tài)細(xì)胞混勻，37°C保溫30分鐘；將細(xì)胞混合物按每份 約10微升分裝成96小份(另取10微升用于稀釋涂布平板計數(shù)克隆)，每份加入2毫升LB 培養(yǎng)液，再加氯霉素12. 5微克/毫升，37°C下每分鐘200轉(zhuǎn)培養(yǎng)18小時；離心收集菌體，用 200微升20%甘油(以體積/體積為單位)，懸浮，對應(yīng)轉(zhuǎn)移到96孔板中，液氮速凍后保存 于零下80°C。通過計數(shù)平板上的克隆，推測文庫每個保存孔的平均克隆數(shù)為244個。實施例2:挑取前一天劃線培養(yǎng)的EPI300單克隆至5毫升LB培養(yǎng)基中，37°C下每分鐘200 轉(zhuǎn)培養(yǎng)15小時；按1 10的比例轉(zhuǎn)接至15毫升新鮮LB培養(yǎng)液，添加IOmM硫酸鎂，37°C下 每分鐘200轉(zhuǎn)培養(yǎng)110分鐘使細(xì)胞密度達(dá)到OD6tltl約1. 0，由此獲得感受態(tài)細(xì)胞；取50微升 文庫包裝顆粒與5毫升感受態(tài)細(xì)胞混勻，30°C保溫60分鐘；將細(xì)胞混合物按每份約50微升 分裝成96小份(另取50微升用于稀釋涂布平板計數(shù)克隆)，轉(zhuǎn)移到每孔含0. 2毫升LB培 養(yǎng)液，添加氯霉素12. 5微克/毫升的96孔培養(yǎng)板，37°C下每分鐘230轉(zhuǎn)培養(yǎng)21小時，加入 甘油至終濃度15% (以體積/體積為單位)，液氮速凍后保存于零下35°C。通過計數(shù)平板 上的克隆，推測文庫每個保存孔的平均克隆數(shù)為526個。對于庫容量為一百萬個克隆的宏基因組文庫，按每孔平均克隆數(shù)333個計算，大 約只需30塊96孔保存板，既節(jié)省超低溫冰箱的保存空間，又無需費時費力地逐個挑取單克 隆，從而達(dá)到了快速有效地保存宏基因組文庫的目的。實施例3:多次膜雜交篩選宏基因組文庫已進(jìn)行過探針雜交的雜交膜放入預(yù)熱的0. 2M氫氧化鈉加0. 十二烷基磺酸鈉溶液中，在37°C、55°C、68°C漂洗兩次，每次10分鐘、20分鐘、30分鐘，然后用300mM氯化鈉 加30mM檸檬酸鈉溶液徹底漂洗。通過檢測不同處理條件下探針洗脫的效果(表1)，發(fā)現(xiàn) 68°C每次30分鐘處理可完全去除探針。將去除探針的雜交膜用同一探針再次雜交，得到相 同的特異顯色點，說明洗脫探針的同時保留了膜上的DNA模板。雜交膜上已有的探針被有 效地去除之后，可對同一張膜用不同探針進(jìn)行多次雜交，從而顯著提高宏基因組文庫的篩 選效率。實驗發(fā)現(xiàn)，同一張膜可進(jìn)行多達(dá)七次的膜雜交篩選，視文庫DNA的濃度而定。表1本發(fā)明洗脫探針的處理條件
溫度 Wm (分鐘)""“是否去除探IF 10; 20; 30^
權(quán)利要求
宏基因組文庫的保存和篩選方法，其特征在于所述宏基因組文庫的保存是用小量的文庫包裝顆料感染感受態(tài)細(xì)胞，保溫后將其等分成96份或96的整倍數(shù)，振蕩培養(yǎng)，加入甘油保存；所述宏基因組文庫的篩選是用氫氧化鈉加十二烷基磺酸鈉溶液漂洗雜交膜，去除探針的同時保留膜上的DNA模板用于不同探針的多次膜雜交。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的宏基因組文庫的保存和篩選方法，其特征在于所述宏基因組 文庫的保存是取1 100微升的文庫包裝顆粒與1 10毫升感受態(tài)細(xì)胞混勻，25 39°C保 溫20 60分鐘，將該細(xì)胞混合物等分成96份或96的整倍數(shù)，每份加0. 2~2ml LB培養(yǎng)液， 所述LB培養(yǎng)液為胰蛋白胨10克/升+酵母提取物5克/升+氯化鈉5克/升，pH7. 0，在 28 39°C振蕩培養(yǎng)12 24小時，加入甘油保存；所述宏基因組文庫的篩選是把已進(jìn)行過 探針雜交的雜交膜放入預(yù)熱的0. 2M氫氧化鈉加以重量/體積即克/IOOml為單位的0. 1% 的十二烷基磺酸鈉溶液中，在37°C、55°C、68°C漂洗兩次，每次10分鐘、20分鐘、30分鐘，然 后用300mM氯化鈉加30mM檸檬酸鈉溶液徹底漂洗，去除探針的同時保留膜上的DNA模板用 于不同探針的多次膜雜交。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的宏基因組文庫的保存和篩選 方法，其特征在于感受態(tài)細(xì)胞的 獲取是挑取前一天劃線培養(yǎng)的EPI300單克隆至5毫升LB培養(yǎng)基中，37°C下每分鐘200轉(zhuǎn)培 養(yǎng)12小時；按1 10的比例轉(zhuǎn)接至15毫升新鮮添加了 IOmM硫酸鎂的LB培養(yǎng)液中，37°C 下每分鐘200轉(zhuǎn)培養(yǎng)100分鐘使細(xì)胞密度達(dá)到OD_約0. 9，由此獲得感受態(tài)細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的宏基因組文庫的保存和篩選方法，其特征在于已進(jìn)行過探針 雜交的雜交膜分兩次在68°C中處理30分鐘能完全去除探針，將去除探針的雜交膜用不同 探針再進(jìn)行多次雜交。
全文摘要
提供一種宏基因組文庫的保存和篩選方法，一是快速有效地保存海量宏基因組克隆的方法，包括用小量的文庫包裝顆感染一定量的感受態(tài)細(xì)胞，等分成96份或96的整倍數(shù)，進(jìn)行文庫擴增培養(yǎng)與保存；二是通過對同一張膜上的文庫DNA模板用不同探針進(jìn)行多次雜交以提高宏基因組文庫篩選效率的方法，包括用一定溫度的堿性溶液去除雜交膜上的探針，同時保留膜上的DNA模板用于不同探針的多次膜雜交，從而提高宏基因組文庫的篩選效率。
文檔編號C40B40/08GK101967683SQ20101029759
公開日2011年2月9日 申請日期2010年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月30日
發(fā)明者付小莉, 曾英, 王浩鑫 申請人:中國科學(xué)院昆明植物研究所