專利名稱：檢測銅綠假單胞菌重要耐藥基因的基因芯片及其試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因芯片及包含該芯片的檢測用試劑盒，尤其是涉及一種檢測銅 綠假單胞菌重要耐藥基因的基因芯片及檢測用試劑盒。
背景技術(shù)：
銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是革蘭氏陰性非發(fā)酵機(jī)會致病菌，其易 于在外界生長繁殖，分布廣泛、耐藥性強(qiáng)、傳播途徑多樣，成為當(dāng)今醫(yī)院感染最常見的病原 菌之一。重癥監(jiān)護(hù)區(qū)的感染10%與銅綠假單胞菌有關(guān)，銅綠假單胞菌引起的肺炎、敗血癥顯 示很高的發(fā)病率與死亡率。近年來，銅綠假單胞菌對抗生素的耐藥率逐年增高，多重耐藥銅 綠假單胞菌的檢出率也越來越高。銅綠假單胞菌可通過獲得性抗性或內(nèi)在抗性對抗生素產(chǎn)生耐藥性。其中獲得性抗 性可通過質(zhì)粒、整合子、轉(zhuǎn)座子等移動元件在在同種或不同種屬之間進(jìn)行基因的水平轉(zhuǎn)移， 從而導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性的傳播。因此對獲得性耐藥菌株的監(jiān)控對于控制耐藥基因傳播及預(yù)防 傳染病大爆發(fā)有積極意義。銅綠假單胞菌可獲得多種抗性基因，如β -內(nèi)酰胺酶類基因(tem，shv, oxa, veb, imp，vim)，氨基糖苷修飾酶基因(aac，aad，aph)。前者可導(dǎo)致細(xì)菌對β -內(nèi)酰胺類抗生素抗 性，后者可導(dǎo)致細(xì)菌對氨基糖苷類抗生素抗性，而此二類抗生素都是目前臨床治療銅綠假 單胞菌感染的主要藥物。據(jù)我國臨床檢測數(shù)據(jù)，銅綠假單胞菌常見的重要耐藥基因有tem， carb, oxa group I, oxa groupll, imp, aac (3，) -I, aac (3，) -II, aac (6，) -lb, aac (6，) -II, aadB 等.對各類抗生素耐藥基因進(jìn)行檢測鑒定，能更準(zhǔn)確地對細(xì)菌耐藥性進(jìn)行監(jiān)測并有助 于合理選用抗菌藥物，提高耐藥菌感染的治愈率。一般檢測耐藥性的方法有藥敏試驗(yàn)、Southern blot, PCR，RT-PCR，基因芯片等 方法。傳統(tǒng)的藥敏試驗(yàn)耗時長(3天)，只能判斷出耐藥表型，無法檢測具體耐藥原理；普通 PCR及RT-PCR特異性高，但檢測通量極其有限；Southern blot操作步驟繁瑣；基因芯片基 于PCR技術(shù)，但比PCR更特異靈敏，且具有快速、高通量的優(yōu)點(diǎn)，十分適用于對多重耐藥菌進(jìn) 行相關(guān)耐藥基因的檢測。德 國 的 Weile Jan 等(DNA microarray for genotyping multidrug-resistantPseudomonas aeruginosa clinical isolates,2007, Diagnostic Microbiology andlnfectious Disease)利用基因芯片對97株多重耐藥銅綠假單胞菌臨床 分離株進(jìn)行了基因分型，結(jié)果表明該基因芯片速度快(5h)，準(zhǔn)確率高達(dá)87. 8%)0但該芯片 造價較高，每個樣品檢測成本約50美元，每個靶基因只設(shè)計(jì)了一個探針，容易產(chǎn)生假陽性。目前，國內(nèi)尚未有針對銅綠假單胞菌耐藥基因的檢測芯片的文獻(xiàn)報道或發(fā)明專 利。

發(fā)明內(nèi)容
為了提高檢測速度與精確性，降低成本，更加適于實(shí)際應(yīng)用，本發(fā)明提供了一種針 對銅綠假單胞菌中常見的重要耐藥基因的檢測芯片及其試劑盒。本發(fā)明所述的基因芯片，包括固相載體和固定在該固相載體上的寡聚核苷酸探 針，該寡聚核苷酸探針包含下述DNA片段中的至少一種1)從 carb、tem、imp、oxa group I > oxa groupll、aac(3，) -I > aac(3，)-II、 aac(6，)_Ib、aac(6，) _II、aadB基因和細(xì)菌16S rRNA基因中所選取的至少一種DNA片段;2)從上述1)中選取的至少一種DNA片段的互補(bǔ)DNA片段。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，所述寡核苷酸探針具有SEQ ID NO =I-SEQ IDNO 29所示 的核苷酸序列，或不同于SEQ ID NO=I-SEQ ID NO :29所示的核苷酸序列但編碼的氨基酸序 列與SEQ ID NO=I-SEQ ID NO :29所示核苷酸序列所編碼的氨基酸序列相同的序列，具體的 優(yōu)選序列及功能見表1。本發(fā)明所述的基因芯片用于銅綠假單胞菌耐藥基因carb、tem、，imp、oxa groupl、 oxa groupll、aadB、aac (3，)_I、aac(3，)_II、aac(6，)_Ib、aac(6，)_II 中至少一種的檢測。本發(fā)明還提供使用上述的基因芯片檢測耐藥基因的方法，其主要包含步驟1)根據(jù)銅綠假單胞菌的耐藥基因設(shè)計(jì)并制備出用于PCR擴(kuò)增的引物；2)制備待測樣品的基因組DNA，使用步驟1)中的引物，按一定濃度混合，對待測樣 品基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增并純化PCR產(chǎn)物，制得靶序列；3)標(biāo)記步驟2)中得到的靶序列；4)將步驟3)標(biāo)記后的靶序列與權(quán)利要求1所述的基因芯片雜交；5)用生物芯片掃描儀獲取雜交信號并分析雜交結(jié)果。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，上述步驟1)中使用的PCR引物為SEQ IDNO :30_SEQ ID NO 51所示核苷酸序列中的至少一種，具體如表2，共22條。本發(fā)明還提供一種檢測銅綠假單胞菌耐藥基因的試劑盒，其包含上述的基因芯 片。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，上述的試劑盒包含SEQ ID NO =I-SEQ IDNO 29所示核苷 酸序列或其互補(bǔ)核苷酸序列的探針序列中的至少一種。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，上述的試劑盒還包含SEQ ID NO :30_SEQ IDNO :51所示核 苷酸序列的PCR引物。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，上述的試劑盒還包含雜交盒、雜交液。本發(fā)明上述的試劑盒用于銅綠假單胞菌耐藥基因carb，tem, imp, oxagroupl, oxa groupll, aac(6，)_Ib，aac(6，)_II，aac(3，)_I，aac(3，)_II，aadB 中至少一種的檢測。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明采用上述技術(shù)方案的有益效果在于針對中國境內(nèi)銅綠 假單胞菌的常見重要獲得性耐藥基因，精簡了探針的數(shù)量，成本大大降低；所用引物和探針 均來自特異基因序列，與其他基因親緣性關(guān)系遠(yuǎn)，不易產(chǎn)生交叉，加上嚴(yán)格的篩選，最終每 個靶基因優(yōu)選出2到4條探針，優(yōu)選出的引物及探針均非常特異；經(jīng)靈敏度試驗(yàn)確定了本芯 片的檢出限為Ing DNA ；通過對本試驗(yàn)室收集的50株銅綠假單胞菌臨床分離耐藥株進(jìn)行了 160余次雜交試驗(yàn)，每株重復(fù)雜交2到3次，雜交結(jié)果十分穩(wěn)定，與耐藥表型符合率高；檢測 時間為5小時；在一張片基上可同時檢測8個樣品。綜上所述，本發(fā)明的特點(diǎn)是針對性強(qiáng)，
4特異性強(qiáng)，靈敏度高，穩(wěn)定性好，檢測速度快，通量高，成本較低，非常適合醫(yī)院，疾病預(yù)防控 制機(jī)構(gòu)及其他臨床實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行耐藥基因檢測及耐藥性監(jiān)控。為了讓本發(fā)明的上述和其它目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能更明顯易懂，下文特舉較佳實(shí)施 例，并配合附圖，作詳細(xì)說明如下。


圖1為本發(fā)明的基因芯片結(jié)構(gòu)外形示意圖；圖2為本發(fā)明芯片的單一點(diǎn)陣探針布局示意圖；圖3為利用本發(fā)明的多重PCR I對銅綠假單胞菌臨床分離株基因組及其混合物的 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖，其中1.模板為P. aeruginosa C1595 ；2.模板為P. aeruginosa C2177 ； 3. &為 P. aeruginosa C6049 ；4. &為 P. aeruginosa C7633 ；5. &為 P. aeruginosa C6393 ；6.模板為 P. aeruginosaC1595, C2177, C6049, C7633 等比例混合；M, marker ；圖4為利用本發(fā)明的多重PCR II對銅綠假單胞菌臨床分離株基因組及其混合物 的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖，其中:1.模板為P. aeruginosa C2589 ；2.模板為P. aeruginosa C6049 ； 3.模板為 P. aeruginosa C7633 ；4.模板為 P. aeruginosa C2589, C6049, C7633 等比例混 合；M, marker ；圖5為利用本發(fā)明的基因芯片檢測carb基因的一個實(shí)施例雜交結(jié)果示意圖；圖6為利用本發(fā)明的基因芯片檢測tem基因的一個實(shí)施例雜交結(jié)果示意圖；圖7為利用本發(fā)明的基因芯片檢測imp基因的一個實(shí)施例雜交結(jié)果示意圖；圖8為利用本發(fā)明的基因芯片檢測oxa groupl基因的一個實(shí)施例雜交結(jié)果示意 圖；圖9為利用本發(fā)明的基因芯片檢測oxa groupll基因的一個實(shí)施例雜交結(jié)果示意 圖；圖10圖為利用本發(fā)明的基因芯片檢測aac(6' )_Ib基因的一個實(shí)施例雜交結(jié)果 示意圖；圖11為利用本發(fā)明的基因芯片檢測aac(6' )-II基因的一個實(shí)施例的雜交結(jié)果 示意圖；圖12為利用本發(fā)明的基因芯片檢測aac (3' ) -I基因的一個實(shí)施例雜交結(jié)果示意 圖；圖13為利用本發(fā)明的基因芯片檢測aac(3' )-II基因的一個實(shí)施例雜交結(jié)果示 意圖；圖14為利用本發(fā)明的基因芯片檢測aadB基因的一個實(shí)施例雜交結(jié)果示意圖；圖15為利用本發(fā)明的基因芯片檢測銅綠假單胞菌臨床分離株C1595的一個實(shí)施 例雜交結(jié)果示意圖；圖16為利用本發(fā)明的基因芯片檢測銅綠假單胞菌臨床分離株C2177的一個實(shí)施 例雜交結(jié)果示意圖；圖17為利用本發(fā)明的基因芯片檢測銅綠假單胞菌臨床分離株C4935的一個實(shí)施 例雜交結(jié)果示意圖；圖18為利用本發(fā)明的基因芯片檢測銅綠假單胞菌臨床分離株C6049的一個實(shí)施例雜交結(jié)果示意圖；圖19為利用本發(fā)明的基因芯片檢測銅綠假單胞菌臨床分離株C6393的一個實(shí)施 例雜交結(jié)果示意圖；圖20為利用本發(fā)明的基因芯片檢測銅綠假單胞菌臨床分離株C6933的一個實(shí)施 例雜交結(jié)果示意圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一探針的設(shè)計(jì)和制備1.序列獲得從GenBank公共數(shù)據(jù)庫下載得到銅綠假單胞菌上述耐藥基因的全部基因序列及 細(xì)菌16S rRNA基因典型序列。2.探針設(shè)計(jì)用Clustal X軟件分別比對各個基因的不同序列，根據(jù)比對結(jié)果，選取一條代表序 列，將該序列導(dǎo)入Primer Premier 5軟件中。運(yùn)行程序設(shè)計(jì)探針，選擇長度(25士5)bp，Tm 60V 70°C，GC含量40% 60%，將設(shè)計(jì)好的探針輸入NCBI中作blastn比對，保證該序 列基因內(nèi)保守性和基因間特異性。每個基因設(shè)計(jì)至少4條不同探針，以備后續(xù)篩選。3.探針合成將設(shè)計(jì)好的探針序列經(jīng)5'端polyT加至總長40個核苷酸(正對照 探針加長至49個核苷酸)，5'端氨基化修飾，委托探針合成公司合成，備用。4.探針篩選將合成好的探針溶解于50% DMS0，稀釋至1 μ g/μ 1后用基因芯片 點(diǎn)樣儀點(diǎn)在玻璃片基上制成基因芯片。通過雜交實(shí)驗(yàn)對所設(shè)計(jì)的探針進(jìn)行篩選，最終得到 用于制備本發(fā)明基因芯片的優(yōu)選探針29條，包括28條耐藥基因探針及1條16S rRNA基因 (16S rDNA)正對照探針，如表1。表1 本發(fā)明基因芯片所選用的寡核苷酸探針序列及可檢測的基因
權(quán)利要求
一種用于檢測銅綠假單胞菌重要耐藥基因的基因芯片，包括固相載體和固定在該固相載體上的寡聚核苷酸探針，其特征在于該寡聚核苷酸探針包含下述DNA片段中的至少一種1)從carb、tem、imp、oxa groupI、oxa groupII、aac(3’) I、aac(3’) II、aac(6’) Ib、aac(6’) II、aadB基因和細(xì)菌16S rRNA基因中所選取的至少一種DNA片段；2)從上述1)中選取的至少一種DNA片段的互補(bǔ)DNA片段。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因芯片，其特征在于所述寡核苷酸探針具有SEQID NO I-SEQ ID NO :29所示的核苷酸序列，或不同于SEQ IDNO =I-SEQ ID NO :29所示的核苷酸序 列但編碼的氨基酸序列與SEQ IDNO=I-SEQ ID NO :29所示核苷酸序列所編碼的氨基酸序列 相同的序列。
3.權(quán)利要求1或2所述的基因芯片用于銅綠假單胞菌耐藥基因carb、tem、，imp、oxa groupI> oxa group 11 > aadB > aac (3' ) -I> aac (3' ) -II> aac (6' ) -Ib> aac (6' ) -II ΦΜ^一 種的檢測。
4.使用權(quán)利要求1所述的基因芯片檢測耐藥基因的方法，其特征在于包含步驟1)根據(jù)銅綠假單胞菌的耐藥基因設(shè)計(jì)并制備出用于PCR擴(kuò)增的引物；2)制備待測樣品的基因組DNA，使用步驟1)中的引物，按一定濃度混合，對待測樣品基 因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增并純化PCR產(chǎn)物，制得靶序列；3)標(biāo)記步驟2)中得到的靶序列；4)將步驟3)標(biāo)記后的靶序列與權(quán)利要求1所述的基因芯片雜交；5)用生物芯片掃描儀獲取雜交信號并分析雜交結(jié)果。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述步驟1)中使用的PCR引物為SEQID NO :30-SEQ ID NO :51所示核苷酸序列中的至少一種。
6.一種檢測銅綠假單胞菌耐藥基因的試劑盒，其特征在于包含權(quán)利要求1所述的基因-H-· I I心片。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于還包含SEQIDNO=I-SEQ ID N0:29所示 核苷酸序列或其互補(bǔ)核苷酸序列的探針序列中的至少一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的試劑盒，其特征在于還包含SEQIDNO :30-SEQ ID NO 51 所示核苷酸序列的PCR引物。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于還包含雜交盒、雜交液。
10.權(quán)利要求6所述的試劑盒用于銅綠假單胞菌耐藥基因carb，tem,imp, oxa group I, oxa groupll, aac (6' )_Ib，aac (6' )_II，aac(3' )_I，aac(3' )_II，aadBftW^ 測。
全文摘要
本發(fā)明提供一種檢測銅綠假單胞菌重要耐藥基因的基因芯片及其試劑盒。該基因芯片包括固相載體和固定在該固相載體上的寡聚核苷酸探針，該探針包含從carb，tem，imp，oxa groupI，oxa group II，aac(6’)-Ib，aac(6’)-II，aac(3’)-I，aac(3’)-II，aadB及細(xì)菌16S rRNA基因中選取的DNA片段或其互補(bǔ)DNA片段。利用上述基因芯片及檢測試劑盒可以達(dá)到同時檢測銅綠假單胞菌上述10種耐藥基因的目的，具有針對性強(qiáng)，特異性強(qiáng)，靈敏度高，檢測速度快，重復(fù)性好等特點(diǎn)，適于醫(yī)院、疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)及其他臨床實(shí)驗(yàn)室對銅綠假單胞菌進(jìn)行耐藥基因檢測和耐藥性監(jiān)控。
文檔編號C40B40/06GK101967508SQ20091015207
公開日2011年2月9日 申請日期2009年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月28日
發(fā)明者馮露, 康海蔚, 曹勃陽, 王磊 申請人:天津生物芯片技術(shù)有限責(zé)任公司