專利名稱：結核分枝桿菌琥珀酰輔酶a合成酶基因及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術領域，涉及結核分枝桿菌琥珀酰輔酶A合成酶基因及其用途，尤其是在琥珀酰輔酶A合成酶活性調控分子篩選、利用琥珀酰輔酶A合成酶的結核病預防性疫苗和結核病診斷試劑方面的用途。
背景技術：
結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)耐藥性日趨嚴重，結核菌和HIV病毒聯(lián)合感染，嚴重威脅人類健康。因此，開發(fā)新的抗結核藥物迫在眉睫。結核菌H37Rv和CDC1551基因組序列的測定和注釋工作的完成，加速了結核菌致病機理的研究，由此發(fā)現了大量與結核菌致病相關的因子，這為抗結核藥物的開發(fā)提供了大量的候選藥物靶標。本實驗室的前期研究，利用雙向電泳技術，對貓爪草提取物作用前后的結核分枝桿菌臨床分離株的全細胞蛋白表達圖譜進行差異比較和分析，結果表明琥珀酰輔酶A合成酶基因(Rv0951)在藥物處理前后表達下調，并首次報道了其參與結核分枝桿菌的重要生理活動。
從琥珀酰輔酶A合成酶出發(fā)，有可能開發(fā)治療潛伏性結核病的新藥，以及以其作為預防性疫苗，或者作為潛伏性結核病的診斷試劑的組分。
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供，1.一種重組表達結核菌琥珀酰輔酶A合成酶的工程菌；2.獲得大量純化的琥珀酰輔酶A合成酶，進行抗體制備；3.利用含有琥珀酰輔酶A合成酶的工程菌作為藥物靶標研發(fā)新的藥物的模型；4.含有琥珀酰輔酶A合成酶的DNA疫苗或者亞單位疫苗的構建及其應用。
本發(fā)明的技術方案如下采用本領域技術人員熟知的技術，從結核菌基因組擴增琥珀酰輔酶A合成酶基因，在大腸桿菌等適宜的宿主表達，純化表達產物，進行抗體制備，亞單位疫苗制備以及DNA疫苗制備并檢測效果。
實現上述目的的基本技術路線為總體技術方案是克隆包括提取結核菌基因組，利用合適的載體和限制性內切酶片段，構建轉化載體，將基因組DNA克隆到合適的大腸桿菌宿主細胞。
1.基因模板提取將待克隆菌株在LB培養(yǎng)基或YE培養(yǎng)基或者Middlebrook 7H9、sauton等分枝桿菌能夠生長的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)到合適的菌體濃度，按照本領域一般技術人員熟悉的步驟、試劑和方法提取菌體DNA。
2.工程菌的構建按照本領域一般技術人員熟悉的步驟、試劑和方法，將基因組DNA克隆到適當的載體，轉化適當的宿主菌，通過一定的選擇標記，收集獲得的工程菌。
3.功能基因的篩選按照本領域一般技術人員熟悉的步驟、試劑、完全可以從商業(yè)途徑獲得的載體、限制性內切酶和方法，將目標基因克隆到載體，轉化宿主細胞，篩選轉化子。分別根據已知的結核菌入侵人體和動物模型可能遭遇的不利環(huán)境，進行人工模擬，從基因組表達文庫篩選相應的轉化子，并進一步驗證。
4.利用含有功能基因的重組菌，進行功能基因抑制劑或激活劑的篩選。
發(fā)明效果利用本技術方案涉及的方法，得到了1.一種重組表達結核菌琥珀酰輔酶A合成酶的工程菌；2.獲得大量純化的琥珀酰輔酶A合成酶，進行抗體制備；3.利用含有琥珀酰輔酶A合成酶的工程菌作為藥物靶標研發(fā)新的藥物的模型；4.含有琥珀酰輔酶A合成酶的DNA疫苗或者亞單位疫苗的構建及其應用。
圖1.結核分枝桿菌琥珀酰輔酶A合成酶PCR產物。
圖2.重組表達的結核分枝桿菌琥珀酰輔酶A合成酶產物。
具體實施例方式
1材料和方法1.1材料1.1.1菌株與載體結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，以下簡稱MTB)H37Rv(重慶市肺科醫(yī)院提供)；大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)和載體pET-32a(+)由本實驗室保存。
1.1.2主要試劑Taq DNA Polymerase，DNA marker DL2000購自北京天為時代科技有限公司；DNA純化試劑盒為BioFlux產品；限制性內切酶(EcoRI和HindIII)，T4DNA連接酶和dNTP購自TaKaRa公司；IPTG購自北京鼎國生物技術有限公司；氨芐西林購自BBI公司；其余化學試劑均為分析純。
1.1.3儀器電泳槽DYCP-31D和DYCZ-24D，電泳儀DYYU-8C為北京六一儀器廠產品；PCR儀為Bio-Rad產品；Ni Sepharose和KTAprime為Amersham Biosciences公司產品；全波長掃描儀SpectraMax190為Molecular Device公司產品。
1.2方法1.2.1SCS-beta基因的系統(tǒng)進化分析在NCBI上調取Aspergillus、candida、E.coli、homo sapiens、legionella、neurospora、shigella、yeast、Mycobacterium屬菌株的SCS-beta基因序列，通過ClustalX(1.83)軟件進行了分析。
1.2.2目的基因PCR擴增根據GenBank登錄的MTB H37Rv sucC編碼序列(GeneID885434)設計引物(Invitrogen公司合成)，序列以及酶切位點如下f-primer；5′-GGGGAATTCATGGATCTTTTCGAGT-3′(下劃線為EcoRI酶切位點)；r-primer5′-TGTTCGAATGAGTCATGGGTCCTTTC-3′(下劃線為HindIII酶切位點)PCR反應體系及條件PCR反應體系(25μl)10×PCR Buffer(含Mg2+)2.5μl，dNTP 2μl，引物P(10μM)各1.5μl，模板2μl，Taq 0.5μl。
PCR反應條件95℃ 5min；95℃ 1min，56℃ 45s，72℃ 2min，35個循環(huán)；72℃ 10min。電泳檢測，純化PCR產物。
1.2.3目的基因的克隆與鑒定用EcoRI和HindIII雙酶切PCR產物和pET32a(+)載體，瓊脂糖電泳純化，回收酶切的基因片段和載體，然后用T4DNA連接酶16℃連接過夜，產物轉化E.coli DH5α(CaCl2法)，涂布于LB平板(含100μg/ml氨芐青霉素)上，37℃培養(yǎng)。挑取陽性克隆培養(yǎng)并抽提質粒，PCR和酶切鑒定重組質粒。將獲得的重組質粒pSCS-pET32a(+)送上海英駿生物技術有限公司測序。
1.2.4目的基因的表達與鑒定從含pSCS-pET32a(+)質粒的DH5a菌株中抽提質粒，轉化E.coliBL21(DE3)(CaCl2法)，涂布于LB平板(含100μg/ml氨芐青霉素)上，37℃培養(yǎng)。挑取陽性克隆培養(yǎng)菌落PCR鑒定重組質粒。
將原核表達重組克隆接種于5mL(含100μg/mL氨芐青霉素)的LB培養(yǎng)基中，37℃200rpmin培養(yǎng)過夜。取400ul接種于20mL LB培養(yǎng)基中，37℃200 rpmin培養(yǎng)至OD600為0.1，加IPTG至1mmol/L誘導表達，4小時后取樣。以同樣的方法誘導含空質粒pET32a(+)的E.coliBL21(DE3)作對照。
1.2.5SDS-PAGE分析取菌液1.0mL，12000rpm離心2min，沉淀菌體中加入90μL 5×SDS louding buffer和10ulβ-巰基乙醇，，混勻后，于沸水中煮沸5min，12000rpmin離心10min，取上清15μL進行10％SDS-PAGE。
權利要求
1.結核分枝桿菌琥珀酰輔酶A合成酶基因，其特征是表達結核菌琥珀酰輔酶A合成酶的重組工程菌、純化的重組酶以及利用純化的酶或工程菌進行結核分枝桿菌琥珀酰輔酶A合成酶調節(jié)分子的篩選。
2.權利要求1所述的結核分枝桿菌琥珀酰輔酶A合成酶在結核病診斷和藥物治療效果監(jiān)控中的用途，其特征是利用重組表達的琥珀酰輔酶A合成酶的抗體或者抗體類似分子進行免疫檢測。
3.權利要求1所述的結核分枝桿菌琥珀酰輔酶A合成酶在DNA疫苗或者亞單位疫苗中的應用，其特征是利用結核分枝桿菌琥珀酰輔酶A合成酶及其產物，作為疫苗組分，預防結核病。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及結核分枝桿菌琥珀酰輔酶A合成酶基因及其用途，尤其是在琥珀酰輔酶A合成酶活性調控分子篩選、利用琥珀酰輔酶A合成酶的結核病預防性疫苗和結核病診斷試劑方面的用途。利用本技術方案涉及的方法，得到了一種重組表達結核菌琥珀酰輔酶A合成酶的工程菌；獲得大量純化的琥珀酰輔酶A合成酶，進行抗體制備；利用含有琥珀酰輔酶A合成酶的工程菌作為藥物靶標研發(fā)新的藥物的模型；含有琥珀酰輔酶A合成酶的DNA疫苗或者亞單位疫苗的構建及其應用。
文檔編號C40B30/04GK1995354SQ20061009534
公開日2007年7月11日 申請日期2006年12月25日 優(yōu)先權日2006年12月25日
發(fā)明者謝建平, 楊文秀, 王洪海 申請人:西南大學