專利名稱：N－乙酰半乳糖胺－4－硫酸酯酶前體,使用所述酶治療的方法以及生產(chǎn)和純化所述酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及臨床醫(yī)學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明描述了治療VI型粘多糖貯積癥的治療物和方法以及制造這種治療物的生產(chǎn)和純化過程。
背景技術(shù)：
MPS VI(VI型粘多糖貯積癥，或Maroteaux-Lamy綜合征)是一種溶酶體貯存疾病，其中受影響的患者缺乏N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(ASB)。該酶代謝粘多糖(GAG)硫酸皮膚素的硫酸鹽部分(見Scriver等主編的《遺傳疾病代謝基礎(chǔ)》(TheMetabolic Basis of Inherited Disease，New YorkMcGraw-Hill，1989)第1565-1587頁Neufeld等所著“粘多糖貯積癥”(The mucopolysaccharidoses)部分)。在該酶缺失的情況下，硫酸皮膚素的逐步降解受到阻礙，并且該底物在多種組織的溶酶體中發(fā)生細胞內(nèi)積累。這樣的積累導(dǎo)致由多種器官和組織參與的逐漸的功能紊亂，其中患嬰在出生時表現(xiàn)正常，但通常在青春期之前死亡。通常在出生6-24個月時對MPS VI作出診斷，此時小孩逐漸表現(xiàn)出生長減速、肝和脾擴大、骨骼畸形、面部特征粗糙、上呼吸道堵塞以及關(guān)節(jié)畸形。MPS VI患兒中可能發(fā)生角膜的逐漸混濁、交通性腦積水或心臟疾病。死亡通常源自呼吸道感染或心臟疾病。與MPS I不同，MPS VI通常不與漸進的精神狀態(tài)損害相聯(lián)系，雖然身體上的限制可能影響學(xué)習(xí)和發(fā)育。雖然大部分MPS VI患者具有該疾病的重癥形式，通常在十幾歲之前死亡，已經(jīng)描述了可以存活幾十年的輕度患者。
多種出版物對MPS VI的發(fā)病率進行了估計。Lowry等(Lowry等，Human Genet85389-390(1990))1990年公開的對不列顛哥倫比亞所有1952年到1986年之間出生情況的調(diào)查估計發(fā)病率為1∶1,300,000。澳大利亞1980-1996年之間出生情況的調(diào)查發(fā)現(xiàn)了18名患者，發(fā)病率為1∶248,000。北愛爾蘭的調(diào)查(Nelson等，Hum.Genet.101355-358(1997))估計了發(fā)病率為1∶840,000。最后，荷蘭對1970-1996年的調(diào)查計算出每100,000中0.24的新生發(fā)病率(Poorthuis等，Hum.Genet.105151-156(1999))。在這些調(diào)查的基礎(chǔ)上，估計在美國有50到300名患者被診斷為所述病癥的各種形式。
雖然有些患者已經(jīng)從骨髓移植(BMT)中受益(Krivit等，N.Engl.J.Med.311(25)1606-11(1984)；Krivit等，Int.Pediat.747-52(1992))，還沒有針對MPS VI的令人滿意的治療方法。由于缺乏適當?shù)墓w并且與較高的發(fā)病率和死亡率相連，BMT不是可以通用的方法。歐洲骨髓移植小組報道了在63例溶酶體功能紊亂的移植中存在10％(HLA一致的)到20-25％(HLA錯配的)的與移植相關(guān)的死亡率(Hoogerbrugge等，Lancet 3451398-1402(1995))。除了BMT，大部分患者接受針對具體問題的對癥治療作為其唯一的護理方式。本發(fā)明的一個目標是用重組的人N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(rhASB)提供一種酶替代療法。還沒有用rhASB治療病人的嘗試。同樣地，沒有提供過可接受的臨床劑量或藥物配方。在貓科動物MPS VI模型上進行過幾次酶替代試驗。
發(fā)明概述本發(fā)明包括含高純度前體形式的N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶的組合物的生產(chǎn)、純化與使用。所述前體形式的DNA和編碼的氨基酸序列分別表示在SEQ ID NO1和2中。預(yù)測的信號序列是SEQ ID NO2的1-38個氨基酸，并且重組生產(chǎn)導(dǎo)致了從SEQ ID NO2的第39或40個氨基酸殘基開始的產(chǎn)物。
本發(fā)明的第一各方面描述了治療完全或部分由N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(ASB)的缺乏而引起的疾病的新方法。一種方法包括用有效量的藥物組合物對需要這種治療的個體給藥。在優(yōu)選的實施方案中，所述藥物組合物包含單獨或與制藥上適當?shù)妮d體組合的高純度的前體形式N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶，或其生物活性片段、突變體或類似物。所述個體遭受完全或部分由N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶的缺乏而引起的疾病的折磨。在其他實施方案中，這一方法的特征在于將編碼完整或部分N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(ASB)或其生物活性突變體或類似物體內(nèi)轉(zhuǎn)移到一個或多個宿主細胞中。優(yōu)選的實施方案包括按照所要治療的生物體(優(yōu)選哺乳動物或人)的要求對劑量進行優(yōu)化以有效地改善疾病癥狀。在優(yōu)選的實施方案中，所述疾病是VI型粘多糖貯積癥(MPS VI)或Maroteaux-Lamy綜合征。
通過用治療上有效量的人ASB(優(yōu)選的是重組的人ASB)進行給藥，本發(fā)明的所述第一個方面明確提供了治療遭受完全或部分由ASB活性缺乏所引起的疾病折磨的患者的方法。因此，本發(fā)明包括了在制備治療ASB活性缺失的藥物中人ASB的使用以及含用于治療ASB活性缺失的人ASB的藥物組合物。ABS活性缺失可以進行觀察，例如如果與ABS活性的正常水平相比活性水平為50％或更低、25％或更低、或10％或更低，并可以表明粘多糖貯積癥，例如VI型粘多糖貯積癥(MPS VI)或Maroteaux-Lamy綜合征。治療上有效量是足以為患者提供有益作用的數(shù)量并且優(yōu)選提供以下任何一種癥狀的改善主觀上或客觀上的關(guān)節(jié)靈活性、疼痛、或僵硬；運動耐量或耐久性，如通過行走或攀登能力測量的；肺功能，例如通過FVC、FEV1或FET；視敏度；或日常生活的活動性，例如通過從坐姿站立、穿上或脫下衣服或撿起小物體的的能力測量的。人ASB優(yōu)選以如這里所述的高度純化的重組制劑的形式給藥。優(yōu)選的制劑含通過反相HPLC測量的純度大于95％、96％、97％、98％、99％、99.2％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％的rhASB。優(yōu)選的制劑也含高純度的ASB的前體形式，所以在考馬斯亮藍染色的SDS-PAGE凝膠上檢測不到ASB的加工過的形式。最優(yōu)選地，前體形式ASB的純度如通過大小排阻色譜(SEC)-HPLC測量的大于95％、95％、96％、97％、98％、99％、99.2％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％。人ASB還優(yōu)選與如這里所述的表面活性劑或非離子去垢劑配伍，任選排除與0.001％的聚山梨酯20或80配伍。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)用劑量低于1毫克/千克每周(例如每周0.2毫克/千克)的rhASB給藥具有有益的效果。本發(fā)明包括了每周至少0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.5mg/kg、0.75mg/kg、1mg/kg或1.5mg/kg的劑量，并且可以上升到每周2mg/kg、4mg/kg、5mg/kg或更高的劑量。優(yōu)選的劑量是每周1mg/kg/。這樣的劑量優(yōu)選每周輸遞一次輸遞，但可任選分為如每周兩次或每日一次更頻繁的時間區(qū)間上的相等量。設(shè)想了多種包括口服、透皮、透粘膜系統(tǒng)、肺內(nèi)(包括噴霧)、肌內(nèi)、皮下或靜脈內(nèi)的注射或非注射的輸遞相當劑量的給藥途徑。還具體設(shè)想了通過直接向關(guān)節(jié)或CSF集合藥團注射或灌注的給藥方式，諸如鞘內(nèi)藥物輸送、顱內(nèi)藥物輸送、心室內(nèi)藥物輸送、經(jīng)腰椎穿刺或經(jīng)小腦延髓池給藥。本領(lǐng)域內(nèi)已知多種實現(xiàn)這樣的鞘內(nèi)給藥的方法，這包括泵入、貯器、分流或植入。優(yōu)選地，劑量通過延續(xù)1、2或4小時的靜脈內(nèi)灌注輸遞，最優(yōu)選延續(xù)4小時，但也可以通過靜脈內(nèi)集合藥團輸遞。
也設(shè)想了提高人體內(nèi)ASB活性的其他方法，這包括使患者瞬時或永久提高外源或內(nèi)源ASB表達的基因治療方法。外源hASB基因或增強內(nèi)源hASB基因表達的啟動子的轉(zhuǎn)移可以通過多種本領(lǐng)域已知的方法進行，這包括病毒載體、同源重組或直接的DNA注射。
本發(fā)明的第二個方面描述了包含N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(ASB)、或其生物活性片段、突變體或類似物的用于治療完全或部分由N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(ASB)缺陷所引起的疾病的新的藥物組合物。在優(yōu)選的實施方案中，所述N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶是N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前體。這樣的組合物可以適用于多種給藥方式，例如注射、局部用藥、鼻內(nèi)給藥、吸入或口服給藥。這一方面的范圍內(nèi)包括描述編碼完整或部分N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(ASB)的核酸序列的實施方案，這樣的核酸序列可以對受N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(ASB)缺陷影響的細胞進行體內(nèi)給藥。
本發(fā)明的第三個方面描述了生產(chǎn)能夠用于酶法治療量的N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(ASB)或其生物活性片段、突變體或類似物的方法。在一般的實施方案中，該方法包括由編碼完整或部分N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(ASB)或其生物活性突變體或類似物的cDNA轉(zhuǎn)染適于其表達的細胞的步驟。在優(yōu)選的實施方案中，所述細胞在恒定的或連續(xù)的培養(yǎng)條件下或灌注條件下生長。在另一種實施方案中，所述細胞在不含G418的培養(yǎng)基中生長。在有些實施方案中，使用了編碼完整N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(ASB)(優(yōu)選的是人的N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶)的cDNA。然而，在有些實施方案中，可以使用編碼其生物活性片段或突變體的cDNA。具體而言，可以進行一個或多個氨基酸置換，同時保持或增強酶的生物學(xué)活性。在其他優(yōu)選的實施方案中，使用了表達載體以將cDNA轉(zhuǎn)入適當?shù)挠糜诒磉_的細胞或細胞系。在一種尤其優(yōu)選的實施方案中，所述cDNA轉(zhuǎn)入CHO(中國倉鼠卵細胞)細胞，如CHO-K1細胞系。在還有其他優(yōu)選的實施方案中，生產(chǎn)工藝包括以下步驟(a)用編碼完整人的N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶或其生物活性片段或突變體的DNA轉(zhuǎn)染的細胞在適當?shù)纳L培養(yǎng)基中生長至適當密度，(b)將轉(zhuǎn)染的細胞導(dǎo)入生物反應(yīng)器，(c)向生物反應(yīng)器提供合適的生長培養(yǎng)基，以及(d)將轉(zhuǎn)染的細胞與含所述酶的培養(yǎng)基分離。
本發(fā)明的第四個方面提供了轉(zhuǎn)染的細胞系，其特征在于能產(chǎn)生可以用于酶法治療量的N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(ASB)。在優(yōu)選的實施方案中，所述N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶是N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前體。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明描述了如CHO K1細胞系的重組CHO細胞系，該細胞系穩(wěn)定可靠地產(chǎn)生能用于酶法治療量的N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(ASB)或其生物活性片段、突變體或類似物。特別優(yōu)選的是稱為CSL4S-342的轉(zhuǎn)基因CHO-K1細胞系。在有些優(yōu)選的實施方案中，該轉(zhuǎn)基因細胞系含有一個或多個拷貝的表達構(gòu)件。優(yōu)選所述轉(zhuǎn)基因細胞系含約10個或更多拷貝的表達構(gòu)件。在更優(yōu)選的實施方案中，該細胞系以至少每天每107個細胞約20-40毫克的量表達重組N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(ASB)或其生物活性片段、突變體或類似物。
本發(fā)明的第五個方面提供了適于產(chǎn)生能夠用于酶法治療量的N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(ASB)或其生物活性片段、突變體或類似物的新的載體。
本發(fā)明的第六個方面提供了按照本發(fā)明的方法產(chǎn)生的并且因而以能用于酶法治療的量存在的新的N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(ASB)或其生物活性片段、突變體或類似物。按照本發(fā)明的N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(ASB)的具體活性優(yōu)選介于20-90單位/毫克蛋白，并且更優(yōu)選大于約50單位/毫克蛋白。在優(yōu)選的實施方案中，所述N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶是N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前體。
本發(fā)明的第七個方面描述了純化N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(ASB)或其生物活性片段、突變體或類似物的方法。按照第一種實施方案，轉(zhuǎn)染的細胞量增長并去除留下重組酶。外源原料通常應(yīng)該與粗提物中分開以避免堵塞層析柱。優(yōu)選地，含重組酶的生長培養(yǎng)基經(jīng)過超濾步驟。在另一種優(yōu)選的實施方案中，純化N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前體的方法包括(a)獲得含N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前體的液體；(b)降低所述液體中能切割N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前體的蛋白酶的蛋白水解活性，其中所述的降低不損害所述的N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前體；(c)將液體與Cibracon藍染料相互作用層析樹脂接觸；(d)將液體與銅螯合層析樹脂接觸；(e)將液體與苯基疏水相互作用層析樹脂接觸；(f)回收所述的N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前體。優(yōu)選地，步驟(c)、(d)和(e)可以連續(xù)進行。精通本領(lǐng)域的人員很容易認識到，在本發(fā)明范圍內(nèi)可以省略或置換一個或多個層析步驟，或可以改變所述層析步驟的順序。在其他優(yōu)選的實施方案中，最后層析柱的洗脫液進行超濾/滲濾，并且進行適當?shù)牟襟E以去除任何殘留的病毒。最終，可以如所述進行適當?shù)臏缇襟E。


圖1提供了按照本發(fā)明用于生產(chǎn)人的N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(ASB)的方法的流程圖。
圖2提供了按照分批處理方法(表14)用于純化人的N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(ASB)的方法的流程圖。
圖3提供了按照灌流處理方法(表14和15)用于純化人的N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(ASB)的方法的流程圖。
圖4A-4C描述了對Blue Sepharose柱(圖4A)、Copper Chelating Sepharose柱(圖4B)和Phenyl Sepharose柱(圖4C)所獲得的結(jié)果。
圖5描述了展示灌流處理純化方法(表14和15)的銀染SDS-PAGE結(jié)果的4-20％聚丙烯酰胺梯度凝膠。
圖6A-6F描述了4-20％聚丙烯酰胺梯度SDS凝膠上以下樣品的結(jié)果泳道1，NEB寬范圍預(yù)染分子量標準(分子量單位kDa)；泳道2，5微克來自批次AS60001(陳舊的分批處理)的ASB；泳道3，5微克來自批次AP60109 UF4(灌流處理)的ASB；泳道4，5微克來自批次AP60109 UF10(灌流處理)的ASB；泳道5，5微克來自批次AP60109 UF15(灌流處理)的ASB；泳道6，5微克來自批次AP60109 AUF18(灌流處理)的ASB；泳道7，5微克來自批次AP60109 AUF22(灌流處理)的ASB；泳道8，5微克來自批次AP60109 AUF25(灌流處理)的ASB；以及泳道9，5微克來自批次AP60109 AUF27(灌流處理)的ASB。凝膠用考馬斯亮藍R-250或銀染染色。
圖7A描述了銀染的4-20％聚丙烯酰胺梯度SDS凝膠上的結(jié)果。圖7B描述了考馬斯亮藍染色的4-20％聚丙烯酰胺梯度SDS凝膠上的結(jié)果。泳道1，批次AP60202UF4；泳道2，批次AP60202 UF10；泳道3，批次AP60202 UF18；泳道4，批次AP60202(BMK)；泳道5，批次102PD0139x B3；泳道6，批次102PD0139x B5；泳道7，灌流對照標準品rhASB-202-002；泳道8，批次102PD0139P1；泳道9，批次102PD0139P2；以及泳道10，Mark 12標準(分子量單位kDa)。
圖8A-8C描述了對Blue Sepharose柱(圖8A)、Copper Chelating Sepharose柱(圖8B)和Phenyl Sepharose柱(圖8C)所得到的色譜圖。圖8B中組織蛋白酶活性用紅線表示。
圖9A描述了銀染的4-20％聚丙烯酰胺梯度SDS凝膠的結(jié)果。圖9B描述了從圖9A的凝膠轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜并用抗rhASB抗體探測的蛋白的結(jié)果。圖9C描述了從圖9A的凝膠轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜并用抗組織蛋白酶抗體探測的蛋白的結(jié)果。BioLabPreStain表示分子量標準(分子量單位kDa)。
圖10表示人體1/2期臨床研究中用rhASB治療96周后的血清抗ASB抗體水平。
圖11表示人體1/2期臨床研究中用rhASB治療96周后全尿GAG水平的降低。
圖12表示用rhASB治療的人體內(nèi)第96周的尿GAG水平與同年齡相適應(yīng)的正常水平的比較。
圖13表示人體1/2期臨床研究中用rhASB治療96周后6分鐘步行測試結(jié)果的提高。
圖14表示人體2期臨床研究中治療48周后的血清抗ASB抗體水平。
圖15表示人體2期臨床研究中治療48周后全尿GAG水平的降低。
圖16表示用rhASB治療的人體內(nèi)第48周的尿GAG水平與同年齡相適應(yīng)的正常水平的比較。
圖17表示人體2期臨床研究中治療48周后12分鐘步行測試結(jié)果的提高。
圖18表示人體2期臨床研究中治療48周后3分鐘爬樓梯結(jié)果的提高。
圖19表示人體2期臨床研究中治療48周后延長時間的起立并行走測試結(jié)果。
圖20和21分別表示人體2期臨床研究中治療48周后關(guān)節(jié)疼痛和關(guān)節(jié)僵直問卷的結(jié)果。
發(fā)明詳述本發(fā)明包括含高度純化的前體形式N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶的組合物生產(chǎn)、純化與使用。如通過反相HPLC法所測定的，前體形式N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶的純度至少等于或高于總蛋白的95、96、97或98％。優(yōu)選地，該純度至少等于或高于99％。更優(yōu)選地，該純度至少等于或高于99.1、99.2、99.3或99.4％。甚至更優(yōu)選地，該純度至少等于或高于99.5、99.6、99.7或99.8％。甚至更優(yōu)選地，該純度至少等于或高于99.9％。N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前體的純度使用反相HPLC法(見實施例9)測量。N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前體的純度是該組合物基本不含任何可通過反相HPLC法檢測的污染的細胞蛋白或降解的或成熟的或加工過的N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶的原因。所有百分比純度建立在通過反相HPLC法測定的總蛋白的基礎(chǔ)上。使用這里所公開的純化工藝可以始終獲得可重復(fù)的高純度，這使得用每次治療(例如每周)進行給藥的高純度rhASB制劑治療那些需要長期持續(xù)治療的患者成為可能。因此，本發(fā)明設(shè)想了長時期(例如12周、24周、48周、96周或更長)用這樣高純度的前體rhASB給藥。
本發(fā)明的第一個方面描述了治療完全或部分由N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(ASB)缺陷引起的疾病的新方法。在一種實施方案中，該方法描述了用單獨或與制藥上適當?shù)妮d體組合的重組N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶，或其生物活性片段、突變體或類似物給藥。在其他的實施方案中，該方法描述了編碼完整或部分N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(ASB)或其生物活性突變體的核酸體內(nèi)轉(zhuǎn)移入一個或多個宿主細胞。優(yōu)選的實施方案包括按所治療生物體(優(yōu)選哺乳動物或人)的要求對劑量進行優(yōu)化以有效改善疾病癥狀。在優(yōu)選的實施方案中，所述疾病是VI型黏多糖貯積癥(MPS VI)，Maroteaux-Lamy綜合征。
N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前體的純度是組合物基本不含任何污染的細胞蛋白的原因，這些蛋白會引起N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前體給藥的個體的免疫或過敏反應(yīng)。一種組合物基本上不含這樣的污染的宿主細胞蛋白，如果對個體給藥時不會引起任何免疫或過敏反應(yīng)。N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前體的高純度對于避免個體對存在于藥物組合物中的雜質(zhì)產(chǎn)生免疫或過敏反應(yīng)來說是至關(guān)重要的。尤其是對于從中純化N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前體的細胞的蛋白而言。當在CHO細胞中表達并從中純化重組N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前體時，CHO蛋白能引起個體的免疫或過敏反應(yīng)(例如蕁麻疹)。避免這種類型的反應(yīng)的唯一方法是確保N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前體足夠純，這樣污染的CHO蛋白的量不足以引起這樣的反應(yīng)。由于個體包括患MPS VI的患者并由此已經(jīng)是缺乏免疫力的，所述藥物組合物的純度尤其重要。
同樣優(yōu)選地，N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前體的純度使得組合物僅含有痕量加工過的或降解的形式。存在于宿主細胞中的蛋白酶將N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶分割成更低分子量的形式。雖然有些這樣的形式也可以具有酶活性，對于細胞攝取和溶酶體靶向優(yōu)選前體形式，因此希望在最終的制劑中具有更高量的未加工的前體ASB。而且，藥品中ASB的降解形式也可能造成更高的發(fā)病率或更大量針對ASB自身的抗體，這在需要對患者進行長期治療的情況下是非常不希望的。如通過SDS-PAGE、RPHPLC和SEC-HPLC組合所檢測的，這里所述的灌流純化工藝導(dǎo)致獲得基本不含污染的宿主細胞蛋白或加工的/聚合形式的ASB的高純度的制劑。對人體給藥時，通過這一工藝生產(chǎn)的產(chǎn)品看來具有更長的半壽期。
重組的人N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(rhASB)的指征是MPS VI(也稱作Maroteaux-Lamy綜合征)的治療。按照優(yōu)選的實施方案，向遭受N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶缺陷折磨的患者提供1mg/kg(約50U/kg)的初始劑量。優(yōu)選地，N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶每周通過注射給藥。按照其他優(yōu)選的實施方案，初始劑量約3個月內(nèi)沒有表現(xiàn)出尿粘多糖排泄降低至少50％的患者改為2mg/kg(約100U/kg)的劑量。優(yōu)選地，只要疾病的顯著臨床癥狀持續(xù)存在，每周一次在約4小時的時間內(nèi)用N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(rhASB)或其生物活性片段、突變體或類似物進行靜脈內(nèi)給藥。同樣優(yōu)選地，通過置于頭靜脈或其他適當?shù)撵o脈內(nèi)的靜脈內(nèi)導(dǎo)管以約30cc/小時開始將N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(rhASB)隨鹽溶液灌注進行給藥。進一步，優(yōu)選地是將N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(rhASB)稀釋于約250cc普通鹽溶液中。
本發(fā)明的第二個方面描述了含人的N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(rhASB)或其生物活性片段、突變體或類似物的用于治療N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶缺陷的藥物組合物。除了上述的優(yōu)選實施方案以外，該重組酶可以通過多種方式給藥，例如注射給藥、局部給藥、鼻內(nèi)給藥、吸入給藥或口服給藥。本發(fā)明的另一個方面通過與藥學(xué)上可接受的載體(可以是固體、半固體或液體或可吸收的膠囊)設(shè)計而提供該酶的給藥途徑。藥物組合物的例子包括片劑、滴劑(如滴鼻劑)、用于局部使用的組合物(如油膏、凝膠劑、乳膏和懸液)、用于吸入的噴劑、鼻噴劑、脂質(zhì)體。通常組合物包括重量0.05-99％或0.5-99％之間的重組酶，例如，用于注射的組合物含0.5-20％，用于口服給藥的組合物含0.1-50％。
為生產(chǎn)用于口服的含治療性酶的這一劑量單位形式的藥物組合物，酶可以與固體粉末狀載體混合，例如乳糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、諸如馬鈴薯淀粉、玉米淀粉、支鏈淀粉等淀粉、海帶粉、柑桔果肉粉、纖維素衍生物或明膠，并且也可以包含如硬脂酸鎂或硬脂酸鈣或碳蠟(Carbowax)或其他聚乙烯二醇蠟等潤滑劑并壓縮以形成片劑或糖丸核心。如果需要糖丸，核心可以用例如可能含阿拉伯樹膠、滑石粉和/或二氧化鈦的濃縮糖溶液或另外用溶于易揮發(fā)的有機溶劑或有機溶劑混合物中的成膜物質(zhì)進行包被?？梢栽谶@些包衣中添加染料，例如用以區(qū)分不同活性物質(zhì)包含物。對于由明膠和例如作為可塑劑的甘油構(gòu)成的軟膠囊或類似的封閉的膠囊，活性物質(zhì)可以與碳蠟或適當?shù)挠?例如如芝麻油、橄欖油或落花生油)混合。硬膠囊可以包含活性物質(zhì)顆粒以及固體的粉末狀載體(諸如乳糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、如馬鈴薯淀粉、玉米淀粉或支鏈淀粉的淀粉、纖維素衍生物或明膠)，并也可以包含硬脂酸鎂或硬脂酸作為滑潤劑。
本發(fā)明的治療性的酶也可以通過單一注射或泵灌注或通過皮下植入持續(xù)釋放采用諸如皮下、肌肉或靜脈注射等注射方式給藥，并且治療性的酶也可以通過吸入給藥。在皮下、肌肉和靜脈注射中，治療性酶(活性成分)可以溶解或散布在液態(tài)載體媒介上。對于注射給藥，活性成分可以與允許的媒介(優(yōu)選如花生油、棉花籽油等等的多種植物油)適當混合。也可以使用其他的注射媒介，如使用胂羧(solketal)、甘油、甲酸的有機組合物以及水性注射劑型。
對于通過注射的非腸道應(yīng)用，組合物可以包括與本發(fā)明相應(yīng)的活性酸的藥學(xué)上可接受的水溶鹽(希望濃度0.5-10％)的水溶液，以及任選水溶液中的穩(wěn)定劑和/或緩沖物質(zhì)。溶液的劑量單位可以方便地附在安瓿上。
當治療性酶以皮下植入的方式給藥時，所述化合物懸浮或分散在精通本領(lǐng)域的人員所知的緩釋材料中，或通過使用如滲透泵等恒定推力的裝置緩慢釋放活性物質(zhì)進行給藥。在這樣的情況下給藥時間可能延長。
對于局部應(yīng)用，藥物組合物的適當形式是油膏、細胞、懸液、乳膏等等?；钚晕镔|(zhì)的量可以是變化的，例如重量比0.05-20％之間的活性物質(zhì)。這樣的局部應(yīng)用的藥物組合物可以通過將活性物質(zhì)與諸如異丙醇、甘油、石蠟、硬脂醇、聚乙二醇等等已知的載體原料混合的已知方式進行制備。藥學(xué)上可接受的載體也可以包括已知的化學(xué)吸收促進劑。吸收促進劑的例子有，例如二甲基乙酰胺(美國專利3,472,931)、三氯乙醇或三氟乙醇(美國專利3,891,757)、某些醇及其混合物(英國專利1,001,949)。英國專利說明書1,464,975中也描述了一種在完整皮膚上局部使用的載體材料，該說明書公開了由含40-70％(v/v)異丙醇和0-60％(v/v)甘油的溶劑和如果存在則不多于溶劑總體積40％的惰性成分稀釋劑作為平衡液構(gòu)成的載體材料。
含藥物組合物的治療性酶的給藥劑量可以在寬廣的區(qū)間內(nèi)變化并且應(yīng)取決于如疾病嚴重度、患者年齡等等多種因素，并且可以進行個體化調(diào)節(jié)。提到的可以每日給藥的治療性酶量的可能的區(qū)間從約0.1毫克到約2000毫克或從約1毫克到約2000毫克。
含治療性酶的藥物組合物可以是適當劑型的，從而它們提供了這些區(qū)間內(nèi)作為單一劑量單位或多種劑量單位的劑量。除了含治療性酶之外，所述劑型可以含一種或多種參與由組合物中治療性酶催化反應(yīng)的底物或輔助因子。含治療性酶的組合物也可以含一種以上治療性酶。同樣地，治療性酶可以以與另一個部分(例如PEG)結(jié)合的偶聯(lián)形式存在。此外，治療性酶可以含一個或多個靶向部分或轉(zhuǎn)運肽以幫助向感興趣的組織、器官或細胞器傳送。
所述方法和組合物中所使用的重組酶也可以通過用編碼N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶或其生物活性片段、突變體或類似物的核酸轉(zhuǎn)化患者細胞的方式進行給藥。如此編碼的核酸序列可以結(jié)合在載體上用以轉(zhuǎn)化所治療患者的細胞。這里描述了這樣的載體的優(yōu)選實施方案。載體可以設(shè)計成整合入主體染色體(例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體)或在宿主細胞中自我復(fù)制。含編碼N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶核苷酸序列的載體可以如此設(shè)計以實現(xiàn)酶的持續(xù)或可控表達。此外，編碼所述酶的遺傳載體可以設(shè)計成穩(wěn)定整合入細胞基因組或只是瞬時存在。常規(guī)遺傳治療的通用方法可以用于編碼N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶的寡核苷酸序列。常規(guī)遺傳治療技術(shù)的綜述可以參見Friedman，Science2441275-1281(1989)；Ledley，J.Inherit.Aletab.Dis.13587-616(1990)；以及Tososhev等，Curt Opinions Biotech.155-61(1990)。
重組酶給藥的尤其優(yōu)選的方法是靜脈給藥。尤其優(yōu)選的組合物包括重組N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶、標準鹽溶液、維持pH約5-7的磷酸緩沖液和人白蛋白。組合物可以另外包含如聚山梨醇酯20或80(Tween-20或Tween-80)等聚氧乙烯山梨聚糖以提高穩(wěn)定性并延長保存期。另外，組合物可以包括本領(lǐng)域已知的表面活化劑或非離子去垢劑，這包括但不限于聚氧乙烯山梨聚糖40或60；聚氧乙烯脂肪酸酯；聚氧乙烯山梨聚糖單異硬脂酸；聚醚，如聚醚188或聚醚407；辛苯聚糖-9或辛苯聚糖40。
優(yōu)選地，表面活化劑或非離子去垢劑存在的濃度至少是0.0001％、或至少是0.0005％、或至少是0.001％、0.002％、0.003％、0.004％或0.005％(w/v)。優(yōu)選地，該濃度是達到希望的穩(wěn)定性的最低的必須量，不過可以達到0.005％、0.006％、0.007％、0.008％、0.009％、0.01％或0.02％(w/v)。最優(yōu)選地，該組合物包括濃度為0.005％±0.003％(例如0.002％到0.008％)的聚山梨醇酯。這些組合物成分可以優(yōu)選地以以下的量提供N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶1-5mg/ml or 50-250units/ml氯化鈉溶液 IV袋中150mM，50-250cc總體積磷酸鈉緩沖液 10-100mM，pH5.8，優(yōu)選10mM人白蛋白(可選) 1mg/mlTween20或Tween80 0.001％-0.005％(w/v)在優(yōu)選的實施方案中，ASB劑型是150mM NaCl、10mM NaPO4，pH5.8、0.005％聚山梨醇酯80中1mg/ml ASB。
本發(fā)明的第三個方面描述了生產(chǎn)滿足酶治療量的N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(ASB)或其生物活性片段、突變體或類似物的方法。在一般的實施方案中，該方法包括將編碼完整或部分N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶或其生物活性突變體或類似物的cDNA轉(zhuǎn)染適于其表達的細胞的步驟。在有些實施方案中，使用了編碼完整N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(優(yōu)選人的N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶)的cDNA。然而，在其他實施方案中，可以使用編碼其生物活性片段或突變體的cDNA。具體而言，可以進行一個或多個氨基酸置換，同時保持或增強酶的生物學(xué)活性。
在其他優(yōu)選的實施方案中，使用表達載體以將cDNA轉(zhuǎn)移至適于其表達的細胞或細胞系。在一種尤其優(yōu)選的實施方案中，將cDNA轉(zhuǎn)染中國倉鼠卵細胞(如CHO-K1細胞系)。在還有其他優(yōu)選的實施方案中，生產(chǎn)工藝包括以下步驟(a)用編碼完整人的N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶或其生物活性片段或突變體的DNA轉(zhuǎn)染的細胞在適當?shù)纳L培養(yǎng)基中生長至適當密度，(b)將轉(zhuǎn)染的細胞導(dǎo)入生物反應(yīng)器，(c)向生物反應(yīng)器提供合適的生長培養(yǎng)基，(d)收獲所述含重組酶的培養(yǎng)基，以及(e)將轉(zhuǎn)染的細胞與所收獲的培養(yǎng)基充分分離。
適于轉(zhuǎn)染細胞生長的培養(yǎng)基是補充了L-谷氨酸、葡萄糖和次黃嘌呤/胸苷、可選地含或不含G418的JRH Excell 302培養(yǎng)基。在一種優(yōu)選的培養(yǎng)基中，所述JRHExcell 302培養(yǎng)基進一步補充了葉酸、絲氨酸、以及天冬酰胺酸，并且培養(yǎng)基中不存在G418。使用這一優(yōu)選的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞與使用補充了G418但不含葉酸、絲氨酸和天冬酰胺酸的培養(yǎng)基相比提供了更高純度的前體rhASB(見圖6泳道2)。優(yōu)選地，細胞在這樣的培養(yǎng)基中生長達到細胞密度約1×107細胞/毫升導(dǎo)致獲得10-40mg/ml活性酶。而且，轉(zhuǎn)染細胞優(yōu)選地在生物反應(yīng)器中生長約5到15天，更優(yōu)選約9天。優(yōu)選地，使用灌流處理并收集策略使轉(zhuǎn)染細胞在生物反應(yīng)器中生長持續(xù)到35天。更優(yōu)選地，使用灌流處理并收集策略使轉(zhuǎn)染細胞在生物反應(yīng)器中生長持續(xù)到45天。甚至更優(yōu)選地，使用灌流處理并收集策略使轉(zhuǎn)染細胞在生物反應(yīng)器中生長持續(xù)到60天。較之更優(yōu)選地，使用灌流處理并收集策略使轉(zhuǎn)染細胞在生物反應(yīng)器中生長持續(xù)到90天。
按照優(yōu)選的實施方案，通過經(jīng)連續(xù)的膜(如10μm膜，隨后1μm膜，隨后0.2μm膜)過濾可以將轉(zhuǎn)染細胞與生物反應(yīng)器上清液充分分離。過濾前可以丟棄任何剩余的收獲的培養(yǎng)基。
重組的人N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶可以在中國倉鼠卵細胞中生產(chǎn)(Peters等，J.Biol.Chem.2653374-3381)。其攝取由大部分(如果不是全部)細胞所表達的高親和甘露糖-6-磷酸受體介導(dǎo)(Scriver等主編的《遺傳疾病代謝基礎(chǔ)》(TheMetabolic Basis of Inherited Disease.New YorkMcGraw-Hill(1989))一書1565-1587頁Neufeld等所著“黏多糖貯積癥”(The mucopolysaccharidoses))。一旦與甘露糖-6-磷酸受體結(jié)合，該酶經(jīng)表面的凹陷內(nèi)吞并轉(zhuǎn)運至溶酶體。在溶酶體的pH值下，該酶具有活性并開始從累積的硫酸皮膚素上去除硫酸殘基。在MPS VI成纖維細胞中，酶儲備的清除是迅速的并在酶暴露的92小時之內(nèi)得以簡單地展示(Anson等，J.Clin.Invest.99651-662(1997))。按照符合圖1描述的流程圖的過程，可以以10升發(fā)酵規(guī)模(約90升工作體積)進行重組酶的生產(chǎn)重組酶可以使用下列如表1A-C中所示的方法進行生產(chǎn)。
表1A通過分批補料方法的細胞培養(yǎng)過程


在一種實施方案中，轉(zhuǎn)染細胞在細胞培養(yǎng)過程中生長，該過程是一種具有收集步驟的持續(xù)35天或更多天的灌流方法，收集速度是從110升反應(yīng)器中每天收集約400升。優(yōu)選地，收集速度是從110升反應(yīng)器中每天收集約800升。表1B中說明了比較灌流細胞培養(yǎng)方法和分批細胞培養(yǎng)方法的流程圖。表1C中概述了與分批補料方法的比較以及實現(xiàn)基于灌流的細胞培養(yǎng)方法的具體該動的細節(jié)。
表1B分批補料與灌流方法細胞培養(yǎng)過程比較

表1C分批補料與灌流方法之間差異的綜合描述


對于分批補料和灌流方法來說，用于放大過程的接種體制備是相同的。在一種實施方案中，通過從工作細胞庫中復(fù)蘇一管細胞并將其內(nèi)容物(約1毫升)移到T75cm2細胞培養(yǎng)瓶約25毫升EX-CELL 302培養(yǎng)基中(改進的含L-谷氨酸，不含苯酚紅)開始rhASB細胞培養(yǎng)。在每個放大步驟中，孵育細胞培養(yǎng)物直到活細胞計數(shù)達到約0.8×106細胞每毫升。每個細胞放大步驟用細胞生長(細胞密度)和活力(通過臺盼藍染色排除法)進行監(jiān)測。所有的EX-CELL 302培養(yǎng)基(改進的含L-谷氨酸，不含苯酚紅)的添加和細胞轉(zhuǎn)移在無塵操作柜無菌條件下進行。細胞培養(yǎng)物依次從T75cm2燒瓶放大到250毫升搖瓶、到兩個250毫升搖瓶、到兩個3升搖瓶并最后放大到兩個8升搖瓶。整個放大過程持續(xù)約14天。當兩個8升搖瓶達到至少1.0×106細胞每毫升的密度時，搖瓶作為110升反應(yīng)器的種子。
對于rhASB表達或生產(chǎn)或制造的反應(yīng)器操作優(yōu)選采用基于灌流的細胞培養(yǎng)過程。優(yōu)選地，相比于使用分批補料方法的每毫升4-5百萬個細胞，使用灌流方法的反應(yīng)器可以控制細胞密度達到每毫升3千7百萬個細胞。
灌流方法(35天)比分批補料方法(11-12天)運行時間更長并產(chǎn)生比分批補料方法(每次運行190升)更大體積的收獲的細胞培養(yǎng)液(以每天5倍導(dǎo)管體積的灌流速度每天約400升)。優(yōu)選地，直到35天進行收獲，總共收集約8400升上清液。
細胞生產(chǎn)的結(jié)束(EPC)按照ICH指導(dǎo)評價其遺傳穩(wěn)定性、一致性、無菌性和外來物污染。優(yōu)選地，從在cGMP條件下生產(chǎn)的AC60108為期35天的反應(yīng)器運行得到的EPC結(jié)果表明沒有生長或陰性結(jié)果，或沒有檢測到細菌和真菌、支原體、外來病毒污染、小鼠病毒或其他污染物或顆粒的存在。
本發(fā)明的第四個方面提供了轉(zhuǎn)基因細胞系，其特征是能產(chǎn)生能滿足酶治療量的N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(ASB)或其生物活性片段、突變體或類似物。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明描述了穩(wěn)定可靠產(chǎn)生滿足酶治療量的N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(ASB)的重組中國倉鼠卵細胞系(如CHO K1)。尤其優(yōu)選稱為CSL4S-342的CHO-K1細胞系。在有些優(yōu)選的實施方案中，該細胞系含一個或多個表達構(gòu)件。更優(yōu)選地，該細胞系含約10個或更多拷貝的表達構(gòu)件。在甚至更優(yōu)選的實施方案中，該細胞系每107個細胞每天表達至少約20-80或40-80毫克的量的重組N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(ASB)。
由稱為CSL4S-342的穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染CHO-K1細胞系可以產(chǎn)生重組人N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(rhASB)。文獻中對該細胞系進行了描述(Crawley，J.Clin Invest.99651-662(1997))。主要細胞庫(MCB)和工作細胞庫(WCB)在TektagenInc.(Malvern，PA)制備。這些細胞庫按照ICH對重組哺乳動物細胞系的建議指導(dǎo)進行了特征描述。
本發(fā)明的第五個方面提供了適于生產(chǎn)滿足酶治療量的人N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(ASB)或其生物活性片段、突變體或類似物的新的載體。
本發(fā)明的第六個方面按照本發(fā)明的方法提供了新的N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(ASB)或其生物活性片段、突變體或類似物，并滿足使用酶治療所需的量。按照本發(fā)明，N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(ASB)優(yōu)選的具體活性是約20-90單位，更優(yōu)選每毫克蛋白大于50單位。優(yōu)選地，該酶具有去糖基化分子量約55-56kDa，最優(yōu)選約55.7kDa。優(yōu)選地，該酶具有糖基化分子量約63-68kDa，最優(yōu)選約64-66kDa。本發(fā)明也包括了含天然的人N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶的截短分子、類似物和突變體的生物活性片段。
由人的cDNA預(yù)測N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶是含41個氨基酸的信號肽的533個氨基酸組成的蛋白質(zhì)(Peters等，J.Biol.Chem.2653374-3381)。去除信號肽后預(yù)測的分子量是約55.9kDa。由于糖基化修飾，重組酶在SDS-PAGE上的表觀分子量是64kDa。預(yù)測的蛋白序列含6個N-相連的寡聚糖修飾位點，基于2kDa的平均分子量和預(yù)測的與表觀分子量之間8kDa的差異，可以使用其中4個位點。胞內(nèi)蛋白的成熟形式是3個由半胱氨酸鍵連接的肽。最大的肽的分子量是47kDa；其他兩個分子量分別是6和7kDa。
表2提供了按照本發(fā)明的方法生產(chǎn)并純化的藥物的描述。
表2藥物初步說明

*對由反應(yīng)器收獲的上清液進行檢測(通過過濾去除細胞以后)本發(fā)明的第七個方面描述了純化N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(ASB)或其生物活性片段、突變體或類似物的新方法。按照第一種實施方案，培養(yǎng)并去除轉(zhuǎn)染的細胞量從而留下重組酶。通常應(yīng)將外源材料與粗提物分離以防止堵塞層析柱。優(yōu)選地，含重組酶的生長培養(yǎng)基經(jīng)過超濾和滲濾步驟。在一種方法中，過濾的溶液流經(jīng)DEAESepharose色譜柱，隨后Blue Sepharose色譜柱，隨后Cu++Chelating Sepharose色譜柱，以及隨后的Phenyl Sepharose色譜柱。這樣的包括依次使用DEAESepharose、Blue Sepharose、Cu++Chelating Sepharose和Phenyl Sepharose的四步柱層析導(dǎo)致獲得特別高度純化的重組酶。精通本領(lǐng)域的人員認識到，在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以省略或置換一個或多個層析步驟或可以改變這些步驟的順序。在另一種優(yōu)選的實施方案中，對來自最后一個色譜柱的洗脫液進行超濾/滲濾，并且進行適當?shù)牟襟E以去除任何殘留的病毒。最后，可以按需要進行適當?shù)臏缇襟E。重組酶可以按照圖2所述的過程進行純化。對于患者來說重組酶的質(zhì)量是關(guān)鍵的。通過這一方法生產(chǎn)的rhASB是足夠純的(＞95％)。
在一種優(yōu)選的實施方案中，采用約10mM的磷酸鈉溶液和約100mM的氯化鈉溶液在pH約7.3的條件下進行超濾/滲濾。在另一種實施方案中，DEAE Sepharose層析步驟在pH約7.3的條件下進行，其中洗脫液用適當?shù)木彌_液(優(yōu)選氯化鈉和磷酸鈉緩沖液)進行調(diào)節(jié)。在另外的優(yōu)選實施方案中，Blue Sepharose層析步驟在pH約5.5的條件下進行，其中洗脫液用適當?shù)木彌_液(優(yōu)選氯化鈉和醋酸鈉緩沖液)進行調(diào)節(jié)。同樣地，在優(yōu)選的實施方案中，Cu++Chelating Sepharose層析步驟用含氯化鈉和醋酸鈉的洗脫緩沖液進行。在特別優(yōu)選的實施方案中，對來自層析的洗脫液(其中重組酶在如氯化鈉和磷酸鈉緩沖液(pH約5.5-6.0，最優(yōu)選pH5.8)的劑型緩沖液中濃縮至濃度約1mg/ml)進行第二次超濾/滲濾。由于磷酸鹽緩沖液能防止酶的嚴重降解并提高其穩(wěn)定性，磷酸鹽緩沖液是所述過程中優(yōu)選使用的緩沖液。
表3中顯示了對本發(fā)明范圍內(nèi)尤其優(yōu)選的純化方法的更詳細的描述。
表3純化過程綜述


調(diào)配的原料藥物質(zhì)可以在100級無塵操作柜中經(jīng)0.04微米或優(yōu)選2微米濾器滅菌裝入1型玻璃瓶。使用半自動充液器可以裝滿這些小瓶至終體積約5毫升。隨后這些小瓶可以手工加蓋、密封并標記。
純化N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶的更優(yōu)選的方法包括(a)獲得含N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前體的液體；(b)降低所述液體中能切割N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前體的蛋白酶的蛋白水解活性，其中所述的降低不損害所述的N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶；(c)將該液體與Cibracon藍染料相互作用層析樹脂接觸；(d)將該液體與銅螯合層析樹脂接觸；(e)將該液體與苯基疏水相互作用層析樹脂接觸；以及(f)回收所述N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前體。優(yōu)選地，步驟(c)、(d)和(e)依次進行。這一方法要求不多于3個層析步驟或?qū)游鲋?。為了獲得高度純化的N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前體，不需要另外的層析步驟或?qū)游鲋?。這一方法不包括將液體與DEAE Sepharose樹脂接觸?；厥盏腘-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前體具有至少等于或大于99％的純度。整體的回收率可以達到至少約40-60％。
優(yōu)選地，獲得含N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前體的液體包括使用編碼N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶的基因轉(zhuǎn)化的細胞培養(yǎng)物生長；優(yōu)選地，該基因編碼人的N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶。優(yōu)選地，所述細胞是哺乳動物細胞。更優(yōu)選地，所述哺乳動物細胞是中國倉鼠卵細胞。該獲得步驟可以進一步包括由所述細胞培養(yǎng)物收獲該液體。該獲得步驟可以進一步包括將所述液體濃縮約20倍。
這一方法的一個特征是蛋白酶活性與N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前體的早期分離。這一分離可以包括(1)蛋白酶活性的降低、抑制或滅活，或(2)蛋白酶與N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前體的物理分離。優(yōu)選地，在純化過程中這一分離盡可能早地發(fā)生。其目的是使切割成成熟或加工形式和/或其他降解形式的N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前體的分子數(shù)量達到最低。由于其更容易被目標組織吸收并更易于隨后靶向溶酶體，相比于成熟或加工形式，N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶的前體形式是優(yōu)選的形式。蛋白酶活性更早或更快地與N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前體分離，可能切割成成熟或加工形式的前體分子的數(shù)量就越少。
通過將液體pH值調(diào)節(jié)到約4.8-8.0之間降低或抑制蛋白酶活性。優(yōu)選地，該pH值介于約4.8-5.5之間。更優(yōu)選地，該pH值介于約4.8-5.2之間。希望降低的具體蛋白酶活性是將前體形式N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶特異性切割成成熟或加工形式的蛋白酶活性。在一種或多種半胱氨酸蛋白酶中發(fā)現(xiàn)了這樣的蛋白酶活性。組織蛋白酶L是一種特異性切割N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前體的半胱氨酸蛋白酶。這一組織蛋白酶L的無活性形式具有約36kDa的分子量，當暴露在低于5.0的pH值時，它轉(zhuǎn)化成大小21-29kDa的活性形式(見圖9C)?？梢詫H值調(diào)節(jié)為任何值，使得該蛋白酶不由其無活性形式轉(zhuǎn)化成活性形式并且需要的N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前體或其生物學(xué)活性不受損害或不可逆的損害。
優(yōu)選地，步驟(c)包括該液體流經(jīng)Cibracon藍染料相互作用層析柱。更優(yōu)選地，該Cibracon藍染料相互作用層析柱是Blue Sepharose 6 Fast Flow層析柱。優(yōu)選地，步驟(d)包括該液體流經(jīng)銅螯合層析柱。更優(yōu)選地，該銅螯合層析柱是Chelating Sepharose Fast Flow層析柱。優(yōu)選地，步驟(e)包括該液體流經(jīng)苯基疏水相互作用層析柱。更優(yōu)選地，該苯基疏水相互作用層析柱是Phenyl Sepharose 6Fast Flow High Sub層析柱。優(yōu)選地，步驟(c)、(d)和(e)的時間順序是步驟(c)、步驟(d)和步驟(c)。
回收步驟可以包括該液體的超濾以及/或滲濾?；厥湛梢园ㄟ^濾該液體以去除DNA以及/或過濾該液體以去除病毒。用于去除病毒的過濾步驟可以包括將所述液體流經(jīng)0.02微米的濾器。
這一方法也可以用于純化N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶或其生物活性片段、類似物或突變體。
使用基于疏水性差異分離蛋白質(zhì)的反相高效液相色譜(RP-HPLC)測量或確定rhASB的純度。這一檢測法使用C4色譜柱(Phenomenex Jupiter)作為固定相和水乙腈梯度作為流動相。蛋白樣品最初注入水中的色譜柱；在這些條件下，所有蛋白質(zhì)會與柱結(jié)合。隨后在柱中注入逐步提高的乙腈濃度。這一乙腈梯度將流動相的疏水性提高到個別蛋白質(zhì)在流動相內(nèi)成為可溶的并從柱上洗脫的臨界點。這些洗脫時間對于一種混合物的每種蛋白是可以精確重現(xiàn)的。蛋白質(zhì)通過210納米處的紫外吸收作為色譜圖上的峰進行檢測。計算每個峰的面積，樣品純度可以通過色譜圖上rhASB峰面積與所有峰的總面積的比率進行計算。RP-HPLC是一種確定rhASB純度的經(jīng)證明高分辨率、可重復(fù)的方法。
本申請之前的研究表明，通過進行雜質(zhì)蛋白ELISA確定了ASB純度。這一使用雜質(zhì)蛋白ELISA(其細節(jié)沒有公開)可能使用了針對可能的宿主細胞雜質(zhì)蛋白混合物的抗體。ELISA應(yīng)當通過使用用于產(chǎn)生所述抗體的可能雜質(zhì)蛋白的相同混合物的標準曲線得以進行。待測樣品應(yīng)當對相對于標準混合物的雜質(zhì)水平進行定量。這些檢測法是蛋白純化中有用的工具，但是出于以下原因，用于確定產(chǎn)物純度時不如RP-HPLC精確在RP-HPLC檢測中，rhASB和雜質(zhì)的比例都通過相同的測量方法(UV吸收)確定。在ELISA中，雜質(zhì)濃度通過抗體結(jié)合確定，而目標蛋白含量通過另一種檢測法(通常是UV吸收或Bradford)確定?！凹兌劝俜直取敝祽?yīng)當通過具有相同單位、通過相同方法實驗確定的數(shù)量的比率進行計算。
為了使ELISA工作良好，由抗體檢測的樣品應(yīng)當與標準品具有相同的蛋白組成。這在雜質(zhì)蛋白ELISA的情形中不太可能實現(xiàn)。此類檢測的標準品應(yīng)當是針對其產(chǎn)生所述抗體的許多獨立蛋白的混合物。然而，在純化的rhASB產(chǎn)物中應(yīng)當只存在其中一小部分雜質(zhì)蛋白。因此，所述抗體試劑現(xiàn)在在檢測蛋白質(zhì)的不同混合物，并且相對標準品的反應(yīng)可能會是完全非線性的。當這樣的情況發(fā)生時，該檢測法對每個樣品稀釋度產(chǎn)生不同的凈值，這樣就不知道哪種稀釋度(如果存在)給出了正確值。
此外，在如兔等用于產(chǎn)生抗體的動物體內(nèi)，不是所有可能的雜質(zhì)蛋白具有免疫原性或相同的免疫原性。而且，通過ELISA確定的雜質(zhì)水平可能僅反應(yīng)了存在于純化的產(chǎn)物中一部分雜質(zhì)。完全可能在產(chǎn)物中存在一種或多種完全無法檢測的主要雜質(zhì)。相反，由于UV吸收是蛋白質(zhì)分子的普遍性質(zhì)，RP-HPLC對所有蛋白質(zhì)進行檢測。
最后，在純化的藥物中存在兩類雜質(zhì)產(chǎn)物不相關(guān)雜質(zhì)(如上所述的宿主細胞蛋白)和產(chǎn)物相關(guān)雜質(zhì)(包括加工形式和聚合物在內(nèi)的降解產(chǎn)物)。后者不能通過雜質(zhì)ELISA進行檢測，卻可以通過RP-HPLC方便地進行檢測。
因此，由雜質(zhì)蛋白ELISA獲得的實際數(shù)字是存有疑問的，并且RP-HPLC的數(shù)字是更為可信的。
此外，SDS-PAGE分析允許對宿主細胞雜質(zhì)和所需藥物蛋白產(chǎn)物的加工或降解的形式進行檢測。當與免疫印跡組合使用時，可以將來自宿主細胞污染的產(chǎn)物不相關(guān)雜質(zhì)與產(chǎn)物相關(guān)雜質(zhì)進行區(qū)分。最后，由于其能檢測不同分子量的雜質(zhì)(包括該蛋白較低分子量的加工的或降解的形式，以及單體、二聚體和其他多聚體)，SEC-HPLC可以對產(chǎn)物相關(guān)的雜質(zhì)水平進行定量。
表4中描述了這一純化方法的一種實施方案。
表4純化方法



表5中展示了由此獲得的藥物產(chǎn)品的成分。本發(fā)明范圍內(nèi)的藥物產(chǎn)品組合物的成分展示在表6中。
表5藥物產(chǎn)品成分

表6藥物產(chǎn)品組合物

已經(jīng)對本發(fā)明進行了描述，提供了以下實施例以通過舉例來說明本發(fā)明，而不是對本發(fā)明的限制。
實施例1對重組人N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶的臨床評價概述重組人N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(rhASB)是針對MPS VI(也稱為Maroteaux-Lamy綜合征)的治療的。我們計劃了一項rhASB臨床發(fā)展計劃，該計劃包括最初的公開標記臨床試驗，該試驗?zāi)芴峁γ恐芄嘧⒃撁傅陌踩浴⑺幋鷦恿W(xué)以及對受試者和明確的臨床終點的反應(yīng)的評估。這一試驗應(yīng)進行至少3個月以收集對5位評估患者充分的安全性信息。在這一時期，如果最初1mg/kg的劑量不能產(chǎn)生過量的尿液粘多糖的合理降低或產(chǎn)生明顯的直接臨床效果，該劑量應(yīng)加倍并保持另外3個月以確定安全性并評估進一步的功效。
目標我們的主要目標是證實在最少3個月的時間內(nèi)對MPS VI患者每周灌注rhASB的安全性。安全性的測量應(yīng)包括有害情況、免疫反應(yīng)和過敏反應(yīng)(針對重組酶的補體激活和抗體形成)、完整的臨床化學(xué)分析(腎和肝功能)、尿樣分析以及分類全血計數(shù)(CBC with differential)。
我們的次要目標是通過監(jiān)測已知受MPS VI影響的幾個指標的變化來評估功效。這些指標包括6分鐘步行(作為運動耐量的度量)、完整肺功能(PFT)評估、尿液粘多糖和肝腫大水平的降低(作為腎和肝GAG儲存的度量)、生長速率、關(guān)節(jié)運動范圍、兒童健康評估問卷(CHAQ)、視敏度、心臟功能、睡眠研究以及兩種不同的綜合評估一種有研究者進行，一種由患者/護理者進行。第二個次要目標是使用白細胞和口腔組織作為組織來源，確定灌注的藥物在循環(huán)中的藥代動力學(xué)參數(shù)、大體分布以及細胞內(nèi)酶的半衰期。基于輸遞到細胞溶酶體的酶水平，預(yù)期這些測量能幫助建立劑量與臨床反應(yīng)的關(guān)系。
方法我們將進行單中心、公開標記的研究以證實安全性并評估對MPS VI患者用rhASB治療的臨床指標?；颊邞?yīng)允許進行兩周的基線評估，這應(yīng)包括病史和體檢、心理測試、耐久性測試(踏車)、一整套常規(guī)的臨床實驗室測試(CBC，Panel 20，CH50，UA)、身體的和磁共振或CT掃描(肝和脾體積測定、骨和骨髓評估以及淋巴結(jié)和扁桃體腺大小)、心臟檢測(超聲波心動圖、EKG、CXR)、氣管評估(肺功能測試)、睡眠研究以評估睡眠中的干擾事件、關(guān)節(jié)限制性分析(應(yīng)測量肘部和指骨間關(guān)節(jié)處運動范圍)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)壓力、以及生化檢測(兩種情況下的口腔N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶活性、兩種情況下的白細胞N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶活性、三種情況下的尿液GAG、血清生成抗rhASB抗體的ELISA以及24小時尿液肌酐清除)。除了上述評估以外，對每位患者進行的一些諸如嘗試將其手舉過頭頂和步行的身體運動進行拍照和錄影?；颊呖捎每菇M胺劑滴定，在灌注酶之前可以有效地用這些物質(zhì)進行這樣的預(yù)處理。建議的1mg/kg(50U/kg)的人劑量可以通過4小時靜脈灌注每周給藥。最初兩周患者留院觀察，隨后在隨后的4周留在家里。最后6周的治療應(yīng)在患者家附近的機構(gòu)內(nèi)進行。3個月時患者應(yīng)返回醫(yī)院進行全面評估。如果劑量需要增加到2mg/kg，患者應(yīng)在最初的12周內(nèi)遵守上述計劃。在任何一種情況下，從開始試驗起的6個月也應(yīng)該進行完整評估。安全性的監(jiān)測應(yīng)貫穿于整個試驗。只要安全性和功效條件許可，完成試驗的患者應(yīng)繼續(xù)按照長期方案進行治療，直到BLA認可。
患者數(shù)量和參加率在試驗開始時一名患者參加，一個月后另兩名患者參加，兩周后又有兩名患者參加，這樣以防止任何與治療有關(guān)的無法預(yù)料的并發(fā)癥。如果任何參加的患者病危，或兒童需要對威脅生命或有害狀況進行緊急臨床處理，可以允許另外的患者參加。
診斷和包含/排除標準患者可以是男性或女性，年齡在5歲或以上，具有通過可測量的MPS VI臨床癥狀證實的、并且由降低的成纖維細胞或白細胞ASB酶活性水平所支持的MPS VI的書面診斷。具有分娩可能的女性患者必須在每次給藥之前具有陰性的懷孕測試結(jié)果(尿液β-hCG)并且必須建議在整個研究過程中使用醫(yī)學(xué)上允許的避孕方法。如果患者先前接受過骨髓移植、正在懷孕或在哺乳期、在參加研究之前30日內(nèi)服用過試驗藥物、或者具有疾病狀態(tài)、嚴重并發(fā)癥或其他可能顯著降低研究順應(yīng)性的情況，這樣的患者排除在這一研究之外。
劑量、給藥途徑和規(guī)則在本研究的最初3個月，患者應(yīng)接受劑量為1mg/kg(約50U/kg)的rhASB。在過量的尿液GAG沒有得到合理地降低并且沒有觀察到臨床效果的情況下，應(yīng)對劑量加倍。只有當所有5名患者接受了3個月的治療以后，可以增加劑量。這一rhASB劑量形式應(yīng)當在約4小時的時間內(nèi)每周一次通過靜脈內(nèi)給藥并延續(xù)至少連續(xù)12周。外周靜脈導(dǎo)管可以置入頭靜脈或其他適當?shù)撵o脈，并且以30cc/小時開始鹽溶液灌注。在試驗前完成的滴定實驗的基礎(chǔ)上，可以對患者用1.25mg/kg以內(nèi)的二苯羥基胺(diphenyhydramine)靜脈內(nèi)給藥進行術(shù)前用藥。rhASB可以稀釋到100cc補充了1mg/ml人白蛋白的標準鹽溶液中。稀釋的酶可以以1mg/kg(約50單位每千克)的劑量在4小時內(nèi)進行灌注，并用心肺和脈搏血氧計進行監(jiān)測。對患者可以進行臨床監(jiān)測并對任何對灌注的不良反應(yīng)進行監(jiān)測。如果觀察到任何不尋常的癥狀(包括但不限于不適、呼吸短促、血氧不足、高血壓、心動過速、惡心反胃、寒戰(zhàn)、發(fā)熱以及腹痛)，應(yīng)當立即終止灌注。根據(jù)臨床癥狀和表征，可以采用另外劑量的苯海拉明、氧氣面具、靜脈內(nèi)液體的集合藥團或其他諸如類固醇治療等適當?shù)呐R床干預(yù)手段。如果發(fā)生急性反應(yīng)，應(yīng)當對血清中補體消耗的評估進行檢測。第二個靜脈內(nèi)位置可以用于藥代動力學(xué)分子所要求的取樣。
可評估的患者只要在12周的治療中沒有錯過多于兩次的非連續(xù)的灌注，來自任何患者的數(shù)據(jù)應(yīng)認為是可評估的。必須完成最初的、中點的和最后的評價。
安全性如果沒有發(fā)生不能通過改變該酶的給藥速度、或緊急使用抗組胺或類固醇得以防止的顯著的急性反應(yīng)，這樣的酶治療應(yīng)被確定為安全的。如果在臨床檢查、臨床實驗室分析或其他適當?shù)难芯恐杏^察到顯著的異常，該酶的長期給藥應(yīng)確定為安全的。抗體的存在或補體激活本身不能認為是不安全的，但這樣的抗體需要通過ELISA進行監(jiān)測，并通過臨床研究評估可能的免疫復(fù)合病。
功效本研究的一個目的是評價關(guān)鍵試驗設(shè)計可能的終點。作為酶輸遞和從體內(nèi)清除粘多糖儲存的結(jié)果，預(yù)計了受試者和臨床終點的改進。如果過量尿液粘多糖水平的平均值在3個月內(nèi)沒有降低合理的數(shù)量并且在3個月后沒有觀察到顯著的臨床效果，應(yīng)當增加劑量。希望所述改善與在最近完成的MPS I臨床試驗中觀察到的結(jié)果具有可比性，并且應(yīng)包括改善的氣管指標或睡眠呼吸暫停的消退、改善的關(guān)節(jié)運動性和提高的耐久力。
實施例2下面展示了對患MPS VI的貓科動物以及相關(guān)藥理學(xué)和毒物學(xué)研究的有用信息的全面回顧酶替代療法已經(jīng)成為針對諸如Gaucher病、Fabry病和I型粘多糖貯存癥等多種遺傳的代謝紊亂的有前途的治療方法。在有些所述的功能紊亂中，天然動物模型提供了臨床前試驗中預(yù)測人類治療的臨床功效的能力。這在MPS I(犬類模型)中是正確的。帶著這樣的想法，在開始這一疾病的人體研究之前對患MPS VI的貓科動物進行了研究。存在的充分的安全性和功效數(shù)據(jù)支持在人類MPS VI患者中繼續(xù)進行臨床試驗。
對患MPS VI的貓的rhASB研究指出，沒有貓因為給藥而死亡。正如所預(yù)測的，對患MPS VI的貓的研究說明，rhASB攝取取決于甘露糖-6-磷酸修飾的糖類側(cè)鏈的存在。也已經(jīng)表明，患MPS VI的貓中的rhASB能從多種主要器官中清除存儲物并適度地改變骨密度。長期的劑量范圍的功效研究說明，每周1mg/kg的劑量是能觀察到顯著的臨床功效的最低濃度。也進行了集合藥團和緩慢灌注(2小時)后酶分布比較、組織粘多糖儲存的清除、以及尿粘多糖水平降低的研究。進展中的研究繼續(xù)評價在患MPS VI的貓中1mg/kg的rhASB的計劃臨床劑量每周灌注的安全性。20世紀70年代對暹羅貓的多個家族中自然產(chǎn)生的MPS VI進行了鑒定(Jezyk，Science 198834-36(1977))，并且公開了這些動物中病理學(xué)改變的詳細報告(Haskins等，Am.J.Pathol.101657-674(1980)；Haskins等.J.Am.Vet.Med.Assoc.182983-985(1983)；Konde等，Vet.Radiol.28223-228(1987))。雖然這些貓的臨床表現(xiàn)有所不同，它們都具有文獻中已有報道的常規(guī)變化(Jezyk等，Science 198834-36(1977)；Konde等，Vet.Radiol.28223-228(1987)；Crawley的《VI型粘多糖貯積癥的貓科動物模型中的酶替代治療》，澳大利亞阿德萊德大學(xué)博士論文，1998)。從這些來源構(gòu)建的表7提供了人們可能在未治療的患MPS VI的貓中預(yù)期觀察到的“平均”改變。
表7患MPS VI的貓的模型

其他的生化/形態(tài)學(xué)確定說明，在35天內(nèi)未治療的貓的器官具有組織中最高的粘多糖儲備(Crawley等，J.Clin.Invest.99651-662(1997))。正常的和患MPS VI貓的尿粘多糖水平在出生時均有提高，但是約40天后，正常的貓具有降低的水平?；糓PS VI貓的尿粘多糖保持高水平或繼續(xù)提高直到在約5個月后達到穩(wěn)定狀態(tài)。
臨床表現(xiàn)的可變性可以在受疾病侵襲的一胎出生的小貓中發(fā)現(xiàn)。除了具體異常的發(fā)作時間的一些可變性，一些臨床和病理學(xué)改變的發(fā)展的時間過程也是可變的。一般而言，骨損害通常是逐步發(fā)展的(Konde等，Vet.Radiol.28223-228(1987))，而角膜混濁則不是。此外，有些癱瘓的貓被注意到癥狀隨時間改善為嚴重的局部癱瘓。個別貓中的疾病發(fā)展的詳細研究局限于臨床(或X光片)觀察。其中有些具有明顯不同的病理學(xué)相關(guān)性，諸如相對于胸腰部骨組織增殖來說是次要的神經(jīng)系統(tǒng)缺陷和脊髓壓縮(Haskins等，J.Am.Vet.Med.Assoc.182983-985(1983))。
在新生患MPS VI貓中進行了使用重組貓ASB的酶替代療法的為期6個月的功效研究。這是由于觀察到幾只經(jīng)治療的MPS VI貓發(fā)展了針對人類的酶的抗體(參見6.5部分)。這些抗體可能改變酶的攝取和穩(wěn)定性(Brooks等，Biochim.Biophys.Acta 1361203-216(1997))。貓的酶每周1mg/kg進行灌注。這一研究的主要結(jié)論是相對于在先前研究中使用的相同劑量的人的重組酶，改善了尿GAG、體重/生長狀況、骨形態(tài)測量以及從多個組織清除儲備的材料；在正常貓中觀察到的范圍之外沒有檢測到抗體；以及在面對面的比較中，劑量為1mg/kg的貓的酶在逆轉(zhuǎn)疾病方面與劑量為5mg/kg的人的酶具有可比性(Bielicki等，J.Biol.Chem.，27436335-43(1999))。這些研究表明，當對貓給予貓源酶的情況下，終點和免疫原性的遞增改善是可能的。這為用每周1mg/kg的人的酶對患者給藥提供了另外的支持。表8中展示了這一研究的結(jié)果。
表8在新生患MPS VI的貓中每周CHO來源重組的貓的ASB的集合藥團注射的功效


表9提供了在MPS VI貓模型中使用重組的人ASB所進行的所有研究的匯總。
表9rhASB研究結(jié)果

實施例3分布和可行性進行了最初的研究以說明酶的攝取和分布，并作為對進一步功效研究可能的終點的引導(dǎo)研究(Crawley等，J.Clin.In.vest.91，864-1873(1996))。重組的人ASB每周一次或每兩周一次以0.5-1.5mg/kg的劑量通過集合藥團注射對受疾病侵襲的貓進行給藥。對一只未經(jīng)治療的MPS VI貓(Cat D)以及一只提供了與之進行比較的數(shù)值的正常的貓進行了評價。來自未經(jīng)治療的貓的數(shù)據(jù)進一步得到了另外38只未經(jīng)治療的貓的歷史評估數(shù)據(jù)的支持。使用允許在存在正常貓的酶的條件下檢測人的ASB的免疫測定法對正常的貓進行了靈敏的酶攝取和分布研究。
這些研究的主要結(jié)論說明了該酶的廣泛攝取，其中如在MPS動物模型的其他酶替代研究中所觀察到的肝臟和脾臟在攝取方面具有預(yù)期的顯著優(yōu)勢。攝取效率取決于該酶的甘露糖-6-磷酸修飾的糖類側(cè)鏈的存在。該酶的半衰期確定為2-4天。在治療上，該酶的確從多種組織中清除了溶酶體儲存物并且的確適度地改變了骨密度。在年老的MPS VI貓中，角膜、骨形態(tài)以及軟骨缺陷沒有得到有效治療。研究結(jié)果匯總在表10中。
表10MPS VI貓中酶分布/可行性研究


實施例4在從出生開始進行治療的MPS VI貓中的功效在從出生開始進行長時期劑量范圍治療的MPS VI貓進行了功效研究(Crawley等，J.Clin.Invest.99651-662(1997))，并將結(jié)果匯總在表11中。從出生開始每周用0.2、1和5毫克/千克rhASB通過集合藥團靜脈內(nèi)注射對MPS VI貓進行了治療。共對9只貓進行了5、6或11個月的治療。此外，12只MPS VI和9只正常的貓作為未經(jīng)治療的對照。主要的結(jié)論是，0.2mg/kg的劑量在一只研究的貓中沒有改變疾病進程，并且唯一證明的臨床功效是肝臟枯否細胞中儲存物的降低。在較高劑量組中，在試驗過程中尿GAG水平減少到接近正常。除了主要器官中的改善以外，從出生開始的較高治療劑量能夠防止或改善脊椎的骨畸形和許多骨骼的異常形態(tài)。在1和5毫克/千克組之間存在著L-5脊椎骨鈣化體積、骨小梁厚度以及骨表面密度改善上的劑量依賴效果，雖然兩者在ERT5到6個月時改善骨形成上是等價的(Byers等，Bone 21425-431(1997))。二尖瓣和主動脈是劑量依賴的，并且在1mg/kg劑量時降低并不完全但在5mg/kg劑量時基本完全降低。每任何劑量下沒有觀察到軟骨和角膜中儲存物的改善。這一研究表明，每周1mg/kg的劑量是觀察到明顯臨床效果的最低濃度。研究結(jié)果匯總在表11中。
表11新生MPS VI貓中CHO來源的重組人ASB每周集合藥團注射的功效(PC-BM102-002研究)


實施例5新出生的MPS VI貓中每周兩次重組人ASB灌注的功效在新生貓中進行了為期6個月的研究以評估每周兩次0.5mg/kg灌注的功效。此外，這一研究中使用的酶專門來自CSL-4S-342細胞系。這一研究的主要結(jié)論包括，與先前所報道的每周一次1mg/kg的劑量相比，本項研究在身體、生化、神經(jīng)和放射學(xué)指標中產(chǎn)生了類似的改善。最顯著的差異是稍差的頸椎屈伸性以及在如心臟瓣膜和大動脈等致密結(jié)締組織中溶酶體儲存物的較少清除。結(jié)果匯總在表12中。
表12新生MPS VI貓中每周兩次CHO來源的重組人ASB的集合藥團注射的功效

實施例6MPS VI貓中作為酶灌注速度的函數(shù)的酶攝取和分布的評估本研究的主要目標是在相同的1mg/kg劑量的集合藥團灌注或緩慢灌注(2小時)后比較酶分布、組織GAG儲存的清除以及尿GAG水平的降低。緩慢給藥計劃是建立在α-L-艾杜糖醛酸苷酶治療MPS I的臨床前和臨床研究經(jīng)驗的基礎(chǔ)上的。此外，本研究提供了在BioMarin從CSL-4S-342細胞系生產(chǎn)的酶具有生物學(xué)活性并是安全的的最初數(shù)據(jù)。本研究的主要結(jié)論包括，本發(fā)明中處理的全部4只貓(每組兩只)對緩慢或快速灌注沒有表現(xiàn)出急性不良反應(yīng)和酶重復(fù)灌注的有害結(jié)果。然而，集合藥團灌注導(dǎo)致了非優(yōu)選的高度肝臟攝取。緩慢灌注提供了更好的組織分布因而是臨床試驗的優(yōu)選方法。
本發(fā)明獲得的rhASB組織分布說明，2小時灌注可以提高除肝臟以外其他器官中的酶水平，這包括大腦中酶活性的提高。緊接著第一次獲第二次灌注之后，觀察到了尿GAG水平降至未治療MPS VI貓中所觀察到的范圍以下的水平。5次灌注之后，在網(wǎng)狀內(nèi)皮組織細胞中觀察到了、在一些成纖維細胞中(心臟瓣膜)和平滑肌細胞(大動脈)中觀察到了非常溫和的溶酶體儲存物的改善。每組中都沒有觀察到其他對灌注的顯著的臨床反應(yīng)，然而由于本研究較短的持續(xù)時間以及由于治療開始于已經(jīng)發(fā)生了明顯的疾病改變之后，這樣的結(jié)果并不令人意外。相對于先前研究中所使用的短時間方案，延長的2小時灌注是安全的并具有良好耐受性?；诳捎糜谠u價的貓的酶組織分布數(shù)據(jù)，所述2小時灌注可以提供酶分布上的改進。
實施例7MPS VI貓中為期6個月的重組人N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶的安全性評價使用按照本發(fā)明的制造過程生產(chǎn)的酶在MPS VI貓中啟動了兩個為期6個月的研究。這些研究的目的是評價在患MPS VI的貓中設(shè)計的人的臨床劑量rhASB每周灌注的安全性和功效。研究6包括最初在3-5月大小時開始給藥的小貓。研究7包括從出生開始用每周灌注設(shè)計的人的臨床劑量rhASB治療的小貓。這些研究是為了獲取潛在的毒理學(xué)指標。對重組酶灌注過程中貓的行為的變化進行觀察以評估可能的免疫反應(yīng)。監(jiān)測血清中的補體消耗以及重組酶抗體的形成。通過全面臨床化學(xué)檢測(腎和肝功能)、尿分析以及分類全血計數(shù)監(jiān)測全面的器官功能。尿粘多糖水平在與酶灌注有關(guān)的每周指定時間進行監(jiān)測。應(yīng)記錄疾病臨床改善的證據(jù)。這些數(shù)據(jù)能提供治療潛在功效的額外評估并能證實該酶的體內(nèi)活性和攝取。這些研究已經(jīng)并應(yīng)當以盡可能與GLP法規(guī)的原則和實踐相一致的方式進行。
第一個研究的初步結(jié)果表明，rhASB的給藥沒有對任何一只實驗動物造成任何有害的影響，體重和臨床化學(xué)通常保持在參照范圍以內(nèi)。然而，具有顯著提高的抗體滴度的兩種貓在灌注過程中均發(fā)展出了異常的臨床癥狀，雖然一旦酶灌注結(jié)束兩只動物行為正常并似乎沒有遭受長時期的疾病影響。延長的灌注時間(4小時)和提高的抗組胺劑術(shù)前用藥使得在貓身上進行持續(xù)治療而沒有任何異常癥狀成為可能。尿GAG水平的溫和降低說明，治療在降低組織或循環(huán)中儲存的粘多糖方面的一些功效，雖然隨時間不同而觀察到的這些水平的波動使得難以解釋這些結(jié)果。沒有一只貓表現(xiàn)出對于ERT反應(yīng)的明顯的臨床改善，但這會要求基于以前研究基礎(chǔ)上的至少6個月的治療。5只貓中的4只中發(fā)展出了抗體滴度，ERT 2個月以后觀察到滴度的明顯提高。這些貓中的兩只在2或3個月后發(fā)展出顯著提高的滴度。
實施例8用rhASB治療的MPS VI貓的安全性特征進行了由出生24小時以內(nèi)進行治療的患病的貓參加的研究。使用rhASB對41只MPS VI貓進行了治療。在對貴重的患病的貓進行治療之前，用酶對1到2只正常的貓給藥以驗證新的批次的急性安全性?？偟貋碚f，沒有貓由于給藥而死亡，雖然4只貓死于病毒感染牛或潛在的先天異常。研究中的酶按照本發(fā)明的生產(chǎn)方法進行生產(chǎn)。初步數(shù)據(jù)顯示在表13中。
表13從Hopwood實驗室的MPS VI貓的功效研究匯總


實施例8A緩慢灌注的組織分布使用長時間(2小時)或短時間(10到15分鐘)灌注方案(ASB-PC-004)為比較在年輕MPS VI貓(開始時小于10周)中rhASB的攝取速度和組織分布進行了單獨研究。給7只正常的貓(12-24月大)服用鎮(zhèn)定劑并植入股動脈套管以允許血液取樣。1.0mg/kg或7.3mg/kg劑量的rhASB以40毫升體積40秒內(nèi)注入頭靜脈。給藥后約2、4、6、8、10、20、30、40、60和120分鐘后獲得連續(xù)的肝素化動脈血樣品。
通過離心收集血漿凍存直到用于分析。4小時后，對動物實行安樂死并收集組織，稱重并凍存直到用于分析。
在單獨的研究中，3只正常的貓(8-66個月大)接受7毫升劑量體積的1.0mg/kgIV集合藥團劑量的rhASB。給藥后2、4、7天在每個時間點對一只貓實施安樂死。收集、稱重并凍存選擇的組織直到用于分析。對另外一只正常的沒有接觸rhASB的貓實施安樂死以提供用于分析對比的組織中貓的ASB的水平。使用ELISA測定技術(shù)對血漿和組織中的rhASB或貓的ASB進行定量。樣品中的rhASB吸附于固定的抗rhASB單克隆抗體上，貓的rhASB吸附于與貓的ASB交叉反應(yīng)的多克隆抗rhASB抗體上。隨后使用熒光底物對吸附的ASB進行定量。
血漿濃度分析表明，1.0mg/kg劑量的rhASB的t1/2是13.7±3.2分鐘，并且7.3mg/kg劑量的約為45分鐘。在肝臟、脾臟、肺部、腎臟和心臟中1.0mg/kg劑量給藥后的組織t1/2介于2.4-4.2天。給藥后7天內(nèi)在這些組織中(除了心臟)能觀察到很低但仍可檢測的水平。1.0mg/kg ASB給藥4小時后，主要劑量運送至肝臟，能在除軟骨和角膜的所有其他組織中測量到藥物水平，而大部分位于肝臟中。除了大腦和小腦以外，藥物水平比未治療的對照貓中貓的ASB的水平高4(動脈)到495(肝臟)倍。本研究中確定的組織半衰期(1.0mg/kg劑量時2.4-4.2天)支持每周臨床給藥的頻率。
本研究的主要目的是評價灌注速度對酶分布、組織GAG儲存的清除以及尿GAG水平降低的影響。10周齡的MPS VI貓的實驗組(n＝2/組)按每周1.0mg/kg的劑量短時間(10-15分鐘)或長時間(2小時)灌注rhASB 5周。最后一次灌注2天后對動物實施安樂死并收集挑選的組織(肝臟、脾臟、心臟、肺、腎、皮膚、動脈、大腦、小腦、軟骨、角膜和淋巴結(jié))以確定ASB濃度并進行組織病理學(xué)評價。分析之前凍存組織。本研究使用如上所述(ASB-PC-001)相同的免疫測定法來確定組織ASB水平。2小時灌注組中的一只貓與其他經(jīng)處理的貓相比具有降低的組織酶水平。最后一次灌注后在導(dǎo)管插入位置附近檢測到高的酶水平，而在對側(cè)肢體中發(fā)現(xiàn)低的酶水平。這些結(jié)果表示，導(dǎo)管過早地從這只動物移走并導(dǎo)致了在組織中發(fā)現(xiàn)的ASB的低組織水平。其余3只貓中酶活性的比較表明2小時灌注的貓相對于10分鐘灌注的實驗動物，在肝臟、肺、腎臟、大腦和小腦中酶活力提高以及在腸膜淋巴結(jié)中酶活力的降低。在皮膚、軟骨和角膜中沒有發(fā)現(xiàn)該酶。雖然來自本研究的數(shù)據(jù)有局限性，本研究的發(fā)現(xiàn)表明，相對于10分鐘灌注，2小時灌注可以導(dǎo)致組織中(除肝臟以外)酶的水平的提高，這表示延長灌注時間提供了更好的組織分布。
實施例9生產(chǎn)和純化方法(灌流過程)表14中提供了比較分批補料和灌流細胞培養(yǎng)純化過程的過程流程圖。表15中匯總了與分批補料純化過程的比較以及對灌流過程材料進行純化所實行的具體變化的詳細描述。表16描述了用于灌流細胞培養(yǎng)的純化方法。
表14分批和灌流過程之間純化過程的比較

表15純化步驟改變的匯總描述




表16rhASB純化方法(灌流過程)


如表15和16中所示，所有純化層析柱在使用前進行再生，使用后進行清潔并保存在適當?shù)木彌_液中。
純化原材料所有材料均由合格的供應(yīng)商提供。
表17用于純化的原材料


所采用的甘油由合成工藝獲得。所有使用的原材料符合名為《經(jīng)人的和獸醫(yī)醫(yī)學(xué)產(chǎn)品傳播動物海綿狀腦病物質(zhì)風(fēng)險最小化》(Minimising the Risk ofTransmitting Animal Spongiform Encephalopathy Agents Via Human andVeterinary Medicinal Products)的最新版CPMP/CVMP指導(dǎo)注意事項，其中通過包括高溫和高壓條件或已知最終消滅瘋牛病(BSE)物質(zhì)的化學(xué)反應(yīng)生產(chǎn)的如甘油和脂肪酸等動物脂衍生物認為不太可能具有傳染性。因此，認為由甘油傳播BSE的風(fēng)險是低的。
rhASB的病毒安全性通過組合運用供應(yīng)商選擇和資格認定、原材料檢測、細胞庫性質(zhì)研究、病毒清除研究以及rhASB純化過程的滅活能力、以及日常批次放行檢測進行證實。參考了相關(guān)的美國、歐盟以及ICH法規(guī)和指導(dǎo)方針以保證rhASB的病毒安全性。
柱層析、DNA清除以及病毒過濾現(xiàn)在使用一系列層析和過濾步驟純化rhASB。發(fā)酵液通過超濾濃縮20倍、調(diào)節(jié)pH、過濾并上樣于Blue Sepharose Fast Flow層析柱(45cm×16cm)。BlueSepharose Fast Flow洗脫液過濾后上樣于Copper Chelating Sepharose層析柱。銅螯合柱洗脫液經(jīng)過濾后上樣于Phenyl Sepharose Fast Flow High Sub層析柱。所有3個柱層析步驟以結(jié)合/洗脫方式進行。Phenyl Sepharose柱洗脫液經(jīng)陰離子交換過濾和病毒清除過濾后通過超濾進行濃縮和緩沖液交換。
病毒清除/滅活研究為評估改進的rhASB純化過程的病毒清除能力進行了兩個研究。使用兩種模式病毒系統(tǒng)(異嗜性小鼠白血病病毒(XMuLV)和小鼠微體病毒(MMV))在BioReliance(Rockville，MD)進行了研究。XMuLV是一種對物理化學(xué)滅活具有低抗性的具有包膜的單鏈RNA逆轉(zhuǎn)錄病毒。MMV是一種微小的、沒有包膜的對物理化學(xué)試劑具有高抗性的單鏈DNA病毒。
這些研究評價了rhASB純化過程中使用的兩個層析步驟(Copper ChelatingSepharose FF以及Phenyl Sepharose FF High Sub)以及病毒過濾(0.02微米)。使用這些工藝步驟的小規(guī)模形式進行了摻入和回收研究。所保持的重要參數(shù)是保留時間和基質(zhì)-溶液相互作用。這通過復(fù)制緩沖液、線性流速和柱高度但調(diào)節(jié)柱直徑實現(xiàn)。研究中使用的材料(產(chǎn)物和緩沖液)從實際的全規(guī)模生產(chǎn)中收集。
裝好層析柱(Copper Chelating Sepharose以及Phenyl Sepharose)并用典型的rhASB樣品(空白)或摻入病毒的緩沖液樣品預(yù)先運行然后運至BioReliance。將存在病毒緩沖液條件下的色譜圖和產(chǎn)物得率與空白對照相比較。相同的柱載樣量摻入XMuLV或MMV隨即進行層析。每個評價步驟的病毒下降量通過比較上樣量和洗脫液中的病毒載量進行測定。本研究的結(jié)果匯總在表18中表示。
表18XMuLV和MMV下降倍數(shù)

過程檢測貫穿整個過程進行過程檢測并在圖3中進行了說明。表19和20中描述了發(fā)酵液和純化中間體的過程檢測。
表19發(fā)酵液的過程檢測

1在生產(chǎn)過程細胞培養(yǎng)物收集階段的多個時間點進行取樣。檢測了細胞培養(yǎng)過程結(jié)束前取得的最后一個樣品并且陰性結(jié)果對于批次放行是必需的。
表20純化中間體的過程檢測

1按照標準的操作程序?qū)Τ^行動水平的結(jié)果進行研究。
2如果結(jié)果超過行動水平，F(xiàn)BDS應(yīng)經(jīng)0.2微米濾器濾至合適的無菌存儲容器，并隨后進行檢疫以等待允許運送至填充點。
灌流方法純化前體rhASB的結(jié)果表21提供了使用表15和16中所述方法獲得的rhASB的純度數(shù)據(jù)。“RP-HPLC純度”欄表示針對前體和成熟形式rhASB組合量所獲得的純度。
表21rhASB批次放行結(jié)果


*“+”表示在調(diào)配的原料藥物質(zhì)中存在加工的形式(估計1-15％)；“-”表示沒有加工過的形式存在。
圖4A-4C提供了灌流純化方法(表16)的3個層析步驟的代表性的層析圖。表22提供了這3個層析步驟中每一個的前體rhASB平均回收率。圖5提供了每個層析步驟過程中的樣品和純化的最終產(chǎn)品(前體rhASB)的純度分析數(shù)據(jù)。
表22純化回收率匯總

當對使用批處理和灌流處理所獲得的純化產(chǎn)物進行比較時，灌流處理明顯產(chǎn)生了更純的前體rhASB。即便是通過選擇不同的洗滌組分或改變條件對批處理進行進一步優(yōu)化不能導(dǎo)致可由灌流處理獲得的始終純的產(chǎn)品。灌流處理能夠產(chǎn)生穩(wěn)定的純度99％或更高的前體rhASB，而批處理則不能(表21)。圖6提供了使用其中細胞培養(yǎng)物用補充了G418并且沒有補充葉酸、絲氨酸和天冬酰胺酸的培養(yǎng)基培養(yǎng)的傳統(tǒng)批處理方法所獲得的產(chǎn)物(泳道2)與使用灌流處理純化的純化產(chǎn)物(泳道3-9)之間的比較。rhASB樣品在含還原劑的SDS中變性并經(jīng)4-20％PAGE在SDS運行緩沖液中進行電泳。批處理純化的產(chǎn)物比灌流處理純化的產(chǎn)物明顯包含多得多的雜質(zhì)(特別是在48kDa附近)。批處理rhASB看來含可檢測量的酶加工過的形式(估計1-15％)(泳道2)。灌流處理純化的批次相互之間具有高可比性并比批處理純化的rhASB標準品成分明顯更簡單，這表示灌流處理的材料具有更高的純度。
表23提供了使用灌流處理純化方法純化的前體rhASB的純度百分比。
表23最終產(chǎn)物的純度

ND＝未確定表24提供了使用灌流處理純化方法純化的前體rhASB批次的純度百分比，其中純度通過RP-HPLC和SEC-HPLC(允許對諸如經(jīng)加工的形式或多聚體等不同分子量的雜質(zhì)進行定量)進行了評價。
表24經(jīng)RP-HPLC和SEC-HPLC測定的純度

*未確定灌流處理中蛋白酶的去除在180升每個批次的規(guī)模下，每個批次需要進行兩個相對巨大的24L DEAESepharose層析。灌流處理產(chǎn)生10倍更大的發(fā)酵液體積，這對于實際的大規(guī)模純化需要利用嚴重不切實際的DEAE Sepharose層析柱尺寸和緩沖液體積。因此，對尤其難以使用的DEAE Sepharose步驟的取消進行了評價以簡化新的灌流純化順序。其結(jié)果是，3個層析柱的順序(如表16中所述)克服了這一大規(guī)模生產(chǎn)的障礙。
批處理(表15中所述)中的DEAE Sepharose層析步驟主要用于去除總蛋白(包括蛋白酶)和pH指示劑染料苯酚紅。后一個問題在新的工藝中通過從302培養(yǎng)基配方中去除苯酚紅得以解決。通過DEAE sepharose步驟去除總蛋白導(dǎo)致了pH5.5時Blue sepharose更高的容量。在新的工藝中，需要確定Blue Sepharose的條件以平衡高rhASB容量同時限制蛋白酶活性。低pH值下，容量和蛋白水解均得以增強。此外，蛋白酶的清除應(yīng)明顯提高隨后的銅螯合層析步驟的效率，其中蛋白酶(組織蛋白酶)的清除在批處理中已發(fā)現(xiàn)是有問題的。通過在低pH下進行加樣、而洗滌和洗脫條件在更高的pH值下進行，發(fā)現(xiàn)了產(chǎn)生需要結(jié)果的條件，有效去除蛋白酶(組織蛋白酶)的條件具有可接受的0.8mg rhASB/ml樹脂的載量。圖8的色譜圖中證明了蛋白酶活性(例如組織蛋白酶)的去除。
使用新的工藝(沒有DEAE FT層析)或傳統(tǒng)批處理純化工藝(PS洗脫液(OP))由灌流操作純化的rhASB(102PD0055)的比較表明，正如通過銀染凝膠上額外的條帶所說明的并由抗ASB抗體所檢測到的(見圖9)，相同的反應(yīng)器運行中傳統(tǒng)工藝純化的材料(使用批處理方法)(泳道PS Eluate(OP))具有明顯更高的蛋白水解水平。與傳統(tǒng)批處理相比，新工藝的產(chǎn)物純度更高。組織蛋白酶通過Blue層析得以去除。使用新工藝，在藍染料層析的洗離組分中發(fā)現(xiàn)了抗組織蛋白酶交叉反應(yīng)的物質(zhì)。
在以下實施例11中所描述的藥代動力學(xué)結(jié)果表示，更純的rhASB制劑導(dǎo)致比先前的常規(guī)批處理產(chǎn)物更長的半衰期。
實施例10表面活性劑對顆粒形成的影響實行實驗方案以確定聚山梨醇酯80對使用新的灌流細胞培養(yǎng)工藝制備的rhASB在小瓶中顆粒形成的影響。使用了視覺觀察和顆粒計數(shù)方法以確定顆粒生成的程度。此外，進行了活性檢測、聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)、免疫印跡以及分子排阻層析(SEC)以證實在存在聚山梨醇酯80和/或晃動條件下相對于未經(jīng)處理的對照品的產(chǎn)品質(zhì)量。用于批處理rhASB的小瓶和瓶塞(Old，Wheaton 5ml，2905-B24B/WestS-127(4401/45))也與建議用于源于灌流材料的小瓶和瓶塞(New，Wheaton 5ml，2905-B8BA/West S-127(4432/50))進行了比較。
rhASB經(jīng)0.2微米濾器過濾后使用10毫升一次性移液管填充小瓶。每種含rhASB的待測樣品填充兩個小瓶。兩者都用于視覺測定，其中一個用于顆粒計數(shù)，另一個用于其余的測定法。只填充了一個緩沖液對照小瓶/待測樣品。由于裝配、樣品操作、過濾或填充幾乎沒有引起顆粒形成。視覺觀察和顆粒計數(shù)分析表明(結(jié)果展示在下面的表25A-C和26A-C中)，相對于僅含緩沖液的對照品，在含配制藥物的未晃動小瓶中，第0、1和14天沒有檢測到明顯的微粒形成。4℃晃動18小時后，在兩個僅含配制緩沖液(10mM磷酸鈉，150mM氯化鈉，pH5.8)不含聚山梨醇酯的rhASB小瓶中觀察到了明顯的顆粒增加。可以清楚地看到細屑。使用HIAC/ROYCOModel 9703顆粒計數(shù)器進行了顆粒計數(shù)。該液體顆粒計數(shù)器可以對介于2微米到150微米的顆粒進行大小排列并計數(shù)。每個不少于5毫升的3個試樣量放入不透光度感應(yīng)器。2到3次運行的平均顆粒計數(shù)以每毫升顆粒數(shù)的形式進行報告。基于大小10微米顆粒的HIAC-Royko定量，傳統(tǒng)和新的小瓶設(shè)置中的計數(shù)分別是每毫升2069和1190個顆粒。在存在0.001％聚山梨醇酯80的條件下，觀察到了明顯更低的計數(shù)值，分別是每毫升21和49個顆粒。在0.005％聚山梨醇酯80濃度下，晃動和未晃動的小瓶之間基本上檢測不到差異。
在不含聚山梨醇酯80的傳統(tǒng)的小瓶/密封劑中，振動以后的的1到14天每毫升顆粒計數(shù)意外地從2069降到268。視覺觀察測定表明，其中發(fā)現(xiàn)了更低計數(shù)的相同的14天的小瓶中存在更大的碎屑；可能是這些更大的碎屑干擾了HIAC-Royko測定法，或傳統(tǒng)的小瓶設(shè)置通過最終的聯(lián)合和聚合成體積更大的、雖然數(shù)量更少的顆粒引起顆粒形成的提高。
進行了另外的測試以證實振動之后蛋白質(zhì)的完整性。特異活性沒有發(fā)生改變。尺寸排阻色譜(能夠檢測可能受到機械振蕩影響的蛋白質(zhì)聚合的變化的方法)顯示，沒有更大分子量類型的增加。為了檢測分解的產(chǎn)物，rhASB的SDS-PAGE凝膠用銀染或轉(zhuǎn)至硝酸纖維素并用抗rhASB抗體進行免疫印跡。任何一個樣品中沒有檢測到額外的條帶。
表25A視覺測定。第0天

表25B視覺測定。第1天

表25C視覺測定。第14天

視覺測定未見沉淀 -介于兩者之間，觀察結(jié)果不確定 +/-少量細小沉淀 +明顯沉淀，混濁 ++非?；鞚?，大碎屑沉淀 +++表26A微粒分析，HIAC-Royko(顆粒/毫升)。第0天

表26B微粒分析，HIAC-Royko(顆粒/毫升)。第1天

實施例26C微粒分析，HIAC-Royko(顆粒/毫升)。第14天

結(jié)果表明，無論劑型如何，手工填充過程幾乎不產(chǎn)生顆粒。以180rpm持續(xù)劇烈振蕩后，在含未與聚山梨醇酯80配制的rhASB的小瓶中顆粒明顯可見。
聚山梨醇酯80的存在對于抑制機械晃動引起的顆粒形成具有很好的效果。這一保護作用是引人注目的，0.001％和0.005％的聚山梨醇酯80能將搖瓶中顆粒計數(shù)降至接近于本底水平。0.005％的聚山梨醇酯80的濃度在降低顆粒計數(shù)方面表現(xiàn)出略好于0.001％聚山梨醇酯80濃度的改善。
正如通過活性、蛋白濃度、純度或聚合百分比所評價的，沒有觀察到振蕩或劑型會引起任何產(chǎn)物的不穩(wěn)定性。
實施例11人體臨床研究使用按照這里所述的批處理所生產(chǎn)的藥物在患有VI型粘多糖貯積癥(MPS VI)或Maroteaux-Lamy綜合征的患者中進行了重組人N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(rhASB)的1/2期、隨機雙盲臨床試驗。濃度1mg/ml的rhASB的劑型是pH5.8，9mM單價堿磷酸鈉·1H2O1mM二價堿磷酸鈉·7H2O，150mM氯化鈉。對患者給藥時，rhASB通過在靜脈袋中用標準鹽溶液室溫下稀釋到適當量的藥物溶液進行制備。所有患者在灌注前用抗組胺劑進行術(shù)前用藥以降低灌注相關(guān)反應(yīng)的可能性。
本研究的目標是對作為酶替代療法的rhASB的兩個劑量在MPS VI患者中的安全性、有效性和藥代動力學(xué)情況進行評價?；颊咭噪p盲方式隨機分成兩個劑量組(0.2和1.0mg/ml)。藥物通過4小時VI灌注每周給藥一次。安全性指標包括生化全套、尿樣分析、分類全血計數(shù)以及AE跟蹤。對所有患者進行了免疫反應(yīng)和灌注相關(guān)反應(yīng)、補體激活和抗體形成的評估。有效性參數(shù)包括了運動忍耐力/耐受性(6分鐘步行檢測)、呼吸容量(肺功能檢測)、關(guān)節(jié)運動范圍(JROM)、功能狀態(tài)(兒童健康評估問卷[CHAQ])、尿GAG水平以及肝腫大的變化、視敏度、心臟功能以及睡眠呼吸暫停。
在灌注過程的第1、2、12、24周進行藥代動力學(xué)評價并隨后在灌注過程中及以后定期測量抗原(酶)水平。藥代動力學(xué)評價也在本研究的公開標記延伸期的第83、84和96周進行，此時患者從84周開始轉(zhuǎn)而服用與0.005％聚山梨醇酯80配制的新的灌流工藝純化的rhASB。共有7名患者參加臨床試驗，并包括了與病情快速發(fā)展及適度發(fā)展相一致的特征范圍內(nèi)的患者。一名患者在第3周出于個人原因退出試驗并進行了替代。對于其他6名患者在完成24周的治療以后進行了粗略的臨時分析。來自第24周臨時分析的數(shù)據(jù)說明，rhASB具有良好的耐受性，并且1.0mg/kg的劑量看來產(chǎn)生了更好的臨床效果并且其安全性特征與0.2mg/kg劑量的安全性具有可比性。
低劑量組的患者以1.0mg/kg的劑量水平繼續(xù)治療。兩名患者在48周以后的期間(59和69周)開始較高劑量水平的治療。通過96周治療的患者接受了計劃的rhASB灌注的大部分。在整個試驗期間沒有患者錯過兩次以上灌注。治療最初24周、隨后48周過程中進行的安全性評估顯示，用0.2或1.0mg/kg劑量rhASB每周治療具有良好的耐受性并且這兩個劑量組之間沒有明顯的差異。較長時期1.0mg/kg每周的治療(經(jīng)96周)也是良好耐受的。
抗rhASB抗體形成和補體水平進行藥物研究的所有6名患者在30周發(fā)展出了針對rhASB的抗體。6名患者中的4名的抗體水平保持相對較低并在60周從峰值下降。發(fā)展出比其余4名患者更高抗體水平的兩名患者中，一名患者的抗體水平在24周從峰值下降，另一名患者的水平在60周從峰值水平快速下降。在96周治療過程中，沒有觀察到CH50、C3或C4補體水平的穩(wěn)定變化。幾名患者具有CH50水平的斷續(xù)降低；然而，沒有注意到補體消耗的證據(jù)或這些低水平和灌注相關(guān)癥狀之間的關(guān)聯(lián)。圖10顯示了96周治療過程中的抗體水平。
尿液粘多糖尿液GAG水平是MPS患者中溶酶體儲存物水平的生化標記。在24周左右，高劑量組中尿液GAG平均下降70％相對于低劑量組中的55％。類似地，MPS VI主要儲存產(chǎn)物DS的百分比分別下降44％和18％。作為對治療的周數(shù)函數(shù)的GAG的尿液排出物中的變化的時間過程顯示了高劑量組中6周左右的總體尿液GAG更顯著的降低。這些數(shù)據(jù)證明，較高的劑量在尿液GAG和DS中產(chǎn)生了更大的改變。對于兩個劑量組中留在本研究中的患者而言，在96周中尿液GAG持續(xù)降低。圖11顯示了96周中總尿液GAG水平的降低，圖12顯示了96周時的水平與相應(yīng)年齡正常水平的比較。需要注意，0.2mg/kg劑量組中留在本研究中的的兩名患者(患者41和45)，其劑量分別在69和59周轉(zhuǎn)為1.0mg/kg。在96周時，這兩名患者GAG篩查降低85％和63％。這與整個96周1.0mg/kg治療的患者中所觀察到的降低相似?；颊?2、43和44分別經(jīng)篩查降低64％、77％和86％。在兩個劑量組中，具有較高基線GAG水平的患者比GAG水平更接近正常范圍(小于正常值上限的5倍，即平均值加2SD)的患者具有更高的下降百分比。
耐久性6分鐘步行檢測作為耐久性的主要臨床指標。接受1.0mg/kg研究藥物的開始時不能步行超過100米的兩名隨機患者(#43和#44)在24周左右在步行距離方面有了巨大進步。除了發(fā)展出C1-C2脊髓壓迫的#44以外，所有患者在48周和96周左右表現(xiàn)出行走距離的改善。圖13顯示了治療96周的6分鐘步行檢測結(jié)果。
有效性的其他指標在96周研究藥物治療過程中觀察到了多種其他有效性參數(shù)的適度改善。在第24周，肩運動范圍，尤其是關(guān)節(jié)彎曲，在6名研究患者中的5名中得到了改善。4名患者中的3名(#41、43和45)在96周的評估中持續(xù)表現(xiàn)出肩彎曲的改善。在96周時，在4名患者中的3名中也觀察到了呼吸功能、用力肺活量(FVC)和1秒鐘用力吐氣量(FEV1)等指標的輕度改善。6名參加的患者中的4人測量的視敏度，其中3人提高了1條或更多譜線，雖然1名患者在此期間更改了其處方鏡片。通過CT掃描測量的肝腫大，雖然不是該疾病的顯著特征，也發(fā)生了適度降低，尤其在那些開始時具有較大肝臟的患者。
在其余有效性參數(shù)中幾乎沒有觀察到改變，這些參數(shù)包括經(jīng)ECG檢測的心臟功能、抓力和握力、CHAQ問卷、身高和體重、骨骼礦物質(zhì)密度以及睡眠研究。貫穿96周治療期沒有觀察到任何這些參數(shù)的明顯退化。
藥代動力學(xué)在雙盲研究的1、2、12和24周以及公開標記延伸研究的83、84和96周進行了藥代動力學(xué)評價。從84周開始，患者開始接受通過實施例9中所述的灌流工藝制造的rhASB。
在灌注過程的0，15，30，60，90和180分鐘，灌注結(jié)束時的240分鐘，以及灌注后5，10，15，30，45，60，90，120和240分鐘，收集血樣。使用非房室方法計算rhASB的藥代動力學(xué)參數(shù)。無限延伸的血漿濃度-時間曲線下的面積和第一時間使用線性梯形方法進行計算直到具有定量的合格界限之上濃度的最后時間點。
對于每周0.2mg/kg給藥的患者，從第1周到24周的AUC0-t平均值是相對穩(wěn)定的(第1周10,009±5,107，第2周11,232±3,914，第12周13,812±9,230，以及第24周13,812±9,230)。對于每周1.0mg/kg給藥的患者，AUC平均值是第1周94,476±13,785，第2周180,909±46,377，第12周157,890±45,386以及第24周251,907±201,747。對于這一每周1.0mg/kg組，AUC0-t和AUC∞值的提高以及大的標準偏差是由于該組中一名患者的AUC比其他兩名患者高約2倍。
每周0.2和1.0mg/kg組群之間AUC0-t平均值的比較顯示了超出劑量提高5倍以上的提高，這表示在這一劑量范圍內(nèi)rhASB藥代動力學(xué)不是線性的。
下面的表27中展示了83、84和96周的藥代動力學(xué)參數(shù)。
表27

除了作為中位數(shù)的Tmax以外，公布了算術(shù)平均數(shù)和標準偏差。如果n＜3公布了20名單獨患者的值。
83周的參數(shù)與從第2周到24周獲得的數(shù)據(jù)具有可比性(除了一名具有高AUC的患者)，這說明在約18個月內(nèi)每周接觸后rhASB藥代動力學(xué)的一致性。從83周到84周，AUC平均值提高約25％，同時總體的體內(nèi)清除下降約25％。從83到84周，半衰期從約8.5分鐘]提高到17-19分鐘。96周的參數(shù)與84周所獲得的數(shù)據(jù)具有可比性。雖然這一藥代動力學(xué)數(shù)據(jù)來自少量患者并存在單獨值的實質(zhì)重疊，這些結(jié)果表明從實施例9中所述的改進工藝獲得的高純度rhASB制劑比最初的rhASB制劑具有更長的半衰期。
實施例12人體中進一步的臨床研究使用按照實施例9中所述的新的灌流工藝生產(chǎn)的藥物在患有VI型粘多糖貯積癥(MPS VI)或Maroteaux-Lamy病的患者中進行了重組人N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(rhASB)的2期公開標記臨床試驗。濃度1mg/ml的rhASB的劑型是pH5.8，9mM單價堿磷酸鈉·1H2O，1mM二價堿磷酸鈉·7H2O，150mM氯化鈉，0.005％聚山梨醇酯80。
研究的目標是對每周IV灌注1.0mg/kg rhASB的安全性、有效性和藥代動力學(xué)進行評價。本研究的包含標準進行了修改以包括相對統(tǒng)一的具有削弱的耐久性的患者組?；颊咴陂_始時需要能步行至少1米但在12分鐘步行檢測的前6分鐘行走不多于250米。其他的包含和排除標準與1/2期研究中所采用的相似，其中患者需要至少5歲大并具有書面證明的生化或遺傳診斷。除了步行檢測以外，本研究包括了多個在MPS患者中先前沒有研究的終點。
安全性指標包括了臨床實驗室評價、尿樣分析、分類全血計數(shù)、ECG和AE跟蹤。對所有患者進行灌注相關(guān)反應(yīng)以及補體消耗和抗體形成的評估。有效性參數(shù)包括了耐久性和運動性測量，這包括12分鐘步行檢測、延時起立行走檢測、3分鐘爬樓梯檢測和身體活力。主觀效果，如關(guān)節(jié)痛和關(guān)節(jié)僵直，用問卷進行評估，并且也評估了其他丹佛發(fā)育衡量指標，如系鞋帶的時間、摸頭頂、翻轉(zhuǎn)毛線衫、以及揀起硬幣并將其放入杯子里。其他的有效性指標包括了視敏度測量、骨密度研究、抓力和握力評估、肩運動范圍、功能狀態(tài)、肺功能、尿GAG排泄、視覺檢查、心臟功能以及睡眠過程的氧飽和度。灌注過程中在1、2、12、24周進行了藥代動力學(xué)評價以測量灌注過程中和之后的抗原(酶)水平。有10名患者參加-5名在美國5名在澳大利亞。所有患者完成了24周的治療。沒有死亡或中止的情況。所有患者接受了全部24次研究藥物的灌注；因此，所有患者包含在安全性和有效性分析之內(nèi)。
如1/2期研究一樣，參加2期研究的MPS VI患者中間存在疾病嚴重程度的廣泛差異。幾名患者還具有該疾病的神經(jīng)學(xué)特征，這包括交通性腦積水、頸椎不穩(wěn)定和脊椎盤疾病。
臨床實驗室評定24周期間在這些患者中沒有觀察到臨床上顯著的實驗室指標異常。
抗rhASB抗體和補體研究24周左右，10名患者中有8名發(fā)展出了抗rhASB抗體。在3名發(fā)展出比其他患者更高抗體水平的患者中，2名患者的抗體水平在24周以后繼續(xù)上升但在48周左右似乎得以穩(wěn)定。這兩名患者或是“空缺”基因型或是在推測的ASB的主要抗原位置具有突變。與其他患者相比，這兩名患者尿液GAG降低量較少。圖14顯示了48周治療過程中的抗體水平。
在24周，1名患者在12周灌注前和灌注后均具有減少的C4和CH50值，這被研究者認為是臨床上顯著的。灌注之前C4和CH50略微低于正常值的下限并在灌注后顯示出更大程度的減少。雖然這些結(jié)果提示了補體消耗的可能性，沒有觀察到與這樣的消耗相一致的臨床表征或癥狀。在本研究中任何其他的患者中沒有觀察到臨床上顯著的補體水平異常。
尿粘多糖尿粘多糖水平的平均下降是快速的，在第6周達到最低點并從第6周到24周保持相對恒定。在24周左右，尿GAG平均降低71％，并且在48周左右，尿GAG平均降低76％。所有10名患者顯示出24周治療后尿GAG水平減少至接近正常范圍。這些數(shù)據(jù)與1/2期研究中針對7名患者所發(fā)現(xiàn)的結(jié)果相一致。圖15顯示了48周中總體尿液GAG水平的降低，圖16顯示了48周時該水平與相應(yīng)年齡的正常水平的比較。
耐久性指標開始時以及隨后每6周在針對所有患者的12分鐘步行檢測中評定了行走距離。距離以每次評價時兩次獨立的測量的平均數(shù)的形式進行記錄并確定6分鐘和12分鐘的距離。
開始時，6分鐘和12分鐘行走的平均距離分別是152.4(±75.0)米和264.0(±161.7)米。在24周，6分鐘步行的平均距離已經(jīng)提高了57.3(±59.0)米(每位患者62％)，而12分鐘步行的平均距離已經(jīng)平均提高了155米(每位患者98％)。所有患者提高了其12分鐘行走距離，并且除1名患者外的所有患者提高了其步行前面6分鐘的距離。在48周，12分鐘步行檢測的平均提高是212米(每名患者138％)。圖17顯示了48周中12分鐘步行檢測結(jié)果的提高。
3分鐘爬樓梯是檢測的耐久性的第二個指標。開始時，10名患者能爬平均50.3(±29.5)級樓梯。24周左右，所攀爬樓梯的平均數(shù)已提高為98.1(±62.5)級樓梯，每名患者提高48級臺階或110％(±116％)。48周左右，所攀爬樓梯的平均數(shù)已經(jīng)提高了61達到總共111級樓梯，每名患者147％的提高。圖18顯示了48周中3分鐘爬樓梯結(jié)果的改進?；颊咴谒逝赖臉翘輸?shù)方面變化很大，并且開始時的表現(xiàn)并不一定與24周時的改進程度相關(guān)聯(lián)。
其他有效性指標本發(fā)明的最初24周內(nèi)對多種其他有效性參數(shù)進行了評價。延時起立并行走檢測用作綜合功能能力的量度。總的說來，這一檢測所需總的時間在開始時與第24周時之間沒有顯著降低，但在48周左右具有不大的改進。圖19顯示了48周治療中延時起立并行走檢測的結(jié)果。
進行了用力呼氣時間(FET)、FVC和FEV1檢測以評定肺功能。下面的表28展示了開始時、24周和48周時的肺功能值并且也顯示了48周時身高和臟器腫大方面的改善。在24周時期內(nèi)沒有發(fā)現(xiàn)這些參數(shù)的明顯變化。在第48周時，5/10名患者在FVC和FEV1方面有所改進，其中3名雖然發(fā)育狀況變化小于2％，仍表現(xiàn)出改善。在第48周時，用力呼氣時間(＞1秒)上也表現(xiàn)出平均43％的改善。
表28肺功能相對于生長和臟器腫大

1粗體值表示代表臨床上有意義的提高的FVC值2表示開始時的肝臟大小是681.6±118cc3表示開始時的脾臟大小是146.8±40cc*開始時肝臟體積超出按體重調(diào)整的年齡的極限的95％，在第48周位于正常范圍內(nèi)+在開始時和第48周肝臟體積超出按體重調(diào)整的年齡的極限的95％表29肩部運動范圍

對主動和被動的肩運動范圍(彎曲、伸展、轉(zhuǎn)動)進行了評估。對于該組總的來說，在主動和被動運動范圍中均發(fā)現(xiàn)了適度百分比的提高；然而，有些病人在24周表現(xiàn)出某些指標的下降。在48周時，由于存在幾個無關(guān)項導(dǎo)致了結(jié)果中高度的可變性；然而，發(fā)現(xiàn)尤其在開始時彎曲小于90°的患者中肩運動范圍的持續(xù)改善。上面的表29顯示了在開始時、第24和48周時肩運動范圍的度數(shù)。
使用問卷評估了疼痛和關(guān)節(jié)僵直。雖然2名患者沒有疼痛值的改變，7名患者在24周左右表現(xiàn)出疼痛狀況的改善(1名患者沒有開始時的評價)。所有評價的9名患者在第24周表現(xiàn)出僵硬癥狀的改善。通過使用問卷對疼痛和僵硬的評價在48周左右持續(xù)改善。治療48周中的關(guān)節(jié)疼痛問卷和關(guān)節(jié)僵直問卷結(jié)果分別表示在圖20和21中。
在整個患者組中均發(fā)現(xiàn)了抓力的顯著進步。7名患者單手或雙手的抓力都有改善。在24周的期間內(nèi)幾乎沒有觀察到握力檢測中的變化。除了在48周時靈巧度和感官能力有適度改善(通過撿硬幣檢測測得)以外，在其他的生活質(zhì)量評估中幾乎沒有發(fā)現(xiàn)顯著變化。
使用附有帶子的ActiTrac裝置測量了活動水平。沒有觀察到活動水平的顯著變化。
在心臟功能評估(ECG)中或站立高度和仰臥長度上沒有觀察到顯著變化。在一部分患者中進行的睡眠研究沒有表現(xiàn)出臨床上顯著的變化。
雖然參照所展示的優(yōu)選實施方案對本發(fā)明進行了描述，應(yīng)當理解到，可以作出各種改進而沒有脫離本發(fā)明的精神。相應(yīng)地，本發(fā)明只受以下權(quán)利要求的限制。
序 列 表<110>生物馬林藥物股份有限公司(BIOMARIN PHARMACEUTICAL，INC.)<120>N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前體，使用所述酶治療的方法以及生產(chǎn)和純化所述酶的方法<130>30610/30011A<150>US 10/290,908<151>2002-11-07<160>22<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>1656<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(45)..(1643)<400>1tagctacagt cggaaaccat cagcaagcag gtcattgttc caac atg ggt ccg cgc56Met Gly Pro Arg1ggc gcg gcg agc ttg ccc cga ggc ccc gga cct cgg cgg ctg ctc ctc104Gly Ala Ala Ser Leu Pro Arg Gly Pro Gly Pro Arg Arg Leu Leu Leu5 10 15 20ccc gtc gtc ctc ccg ctg ctg ctg ctg ctg ttg ttg gcg ccg ccg ggc152Pro Val Val Leu Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Pro Pro Gly25 30 35tcg ggc gcc ggg gcc agc cgg ccg ccc cac ctg gtc ttc ttg ctg gca200Ser Gly Ala Gly Ala Ser Arg Pro Pro His Leu Val Phe Leu Leu Ala40 45 50gac gac cta ggc tgg aac gac gtc ggc ttc cac ggc tcc cgc atc cgc248Asp Asp Leu Gly Trp Asn Asp Val Gly Phe His Gly Ser Arg Ile Arg55 60 65
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85 90 95Gln Leu Leu Thr Gly Arg Tyr Gln Ile Arg Thr Gly Leu Gln His Gln100 105 110Ile Ile Trp Pro Cys Gln Pro Ser Cys Val Pro Leu Asp Glu Lys Leu115 120 125Leu Pro Gln Leu Leu Lys Glu Ala Gly Tyr Thr Thr His Met Val Gly130 135 140Lys Trp His Leu Gly Met Tyr Arg Lys Glu Cys Leu Pro Thr Arg Arg145 150155 160Gly Phe Asp Thr Tyr Phe Gly Tyr Leu Leu Gly Ser Glu Asp Tyr Tyr165 170 175Ser His Glu Arg Cys Thr Leu Ile Asp Ala Leu Asn Val Thr Arg Cys180 185 190Ala Leu Asp Phe Arg Asp Gly Glu Glu Val Ala Thr Gly Tyr Lys Asn195 200 205Met Tyr Ser Thr Asn Ile Phe Thr Lys Arg Ala Ile Ala Leu Ile Thr210 215 220Asn His Pro Pro Glu Lys Pro Leu Phe Leu Tyr Leu Ala Leu Gln Ser225 230 235 240Val His Glu Pro Leu Gln Val Pro Glu Glu Tyr Leu Lys Pro Tyr Asp245 250 255Phe Ile Gln Asp Lys Asn Arg His His Tyr Ala Gly Met Val Ser Leu260 265 270Met Asp Glu Ala Val Gly Asn Val Thr Ala Ala Leu Lys Ser Ser Gly275 280 285Leu Trp Asn Asn Thr Val Phe Ile Phe Ser Thr Asp Asn Gly Gly Gln290 295 300Thr Leu Ala Gly Gly Asn Asn Trp Pro Leu Arg Gly Arg Lys Trp Ser305 310 315 320Leu Trp Glu Gly Gly Val Arg Gly Val Gly Phe Val Ala Ser Pro Leu325 330 335Leu Lys Gln Lys Gly Val Lys Asn Arg Glu Leu Ile His Ile Ser Asp
340 345 350Trp Leu Pro Thr Leu Val Lys Leu Ala Arg Gly His Thr Asn Gly Thr355 360 365Lys Pro Leu Asp Gly Phe Asp Val Trp Lys Thr Ile Ser Glu Gly Ser370 375 380Pro Ser Pro Arg Ile Glu Leu Leu His Asn Ile Asp Pro Asn Phe Val385 390 395 400Asp Ser Ser Pro Cys Pro Arg Asn Ser Met Ala Pro Ala Lys Asp Asp405 410 415Ser Ser Leu Pro Glu Tyr Ser Ala Phe Asn Thr Ser Val His Ala Ala420 425 430Ile Arg His Gly Asn Trp Lys Leu Leu Thr Gly Tyr Pro Gly Cys Gly435 440 445Tyr Trp Phe Pro Pro Pro Ser Gln Tyr Asn Val Ser Glu Ile Pro Ser450 455 460Ser Asp Pro Pro Thr Lys Thr Leu Trp Leu Phe Asp Ile Asp Arg Asp465 470 475 480Pro Glu Glu Arg His Asp Leu Ser Arg Glu Tyr Pro His Ile Val Thr485 490 495Lys Leu Leu Ser Arg Leu Gln Phe Tyr His Lys His Ser Val Pro Val500 505 510Tyr Phe Pro Ala Gln Asp Pro Arg Cys Asp Pro Lys Ala Thr Gly Val515 520 525Trp Gly Pro Trp Met530
權(quán)利要求
1.一種包含人N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前體的組合物，其特征在于，以蛋白質(zhì)總量計，所述N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前體的純度至少等于或大于99％，其中所述純度用反相HPLC(RP-HPLC)法測量。
2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，以蛋白質(zhì)總量計，所述人N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前體的純度至少等于或大于99.2％，其中所述純度用反相HPLC法測量。
3.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述人N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前體是糖基化的。
4.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述純度等于或大于99.8％。
5.如權(quán)利要求4所述的組合物，其特征在于，所述純度等于或大于99.9％。
6.如權(quán)利要求1-5中任一所述的組合物，其特征在于，所述人N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前體是重組的N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前體。
7.如權(quán)利要求1-5中任一所述的組合物，其特征在于，以蛋白質(zhì)總量計，所述N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前體的純度至少等于或大于99％，其中所述純度用尺寸排阻色譜-HPLC(SEC-HPLC)法測量。
8.如權(quán)利要求7所述的組合物，其特征在于，所述經(jīng)SEC-HPLC測定的純度等于或大于99.5％。
9.如權(quán)利要求7所述的組合物，其特征在于，所述經(jīng)RP-HPLC測定的純度等于或大于99％并且所述經(jīng)SEC-HPLC測定的純度等于或大于99.5％。
10.一種藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物包含如權(quán)利要求1所述的組合物和藥學(xué)上可接受的載體。
11.如權(quán)利要求9所述的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物進一步包含氯化鈉溶液和非離子去垢劑。
12.如權(quán)利要求9所述的藥物組合物，其特征在于，所述N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前體以約1-5mg/ml或每毫升約50-250單位的濃度存在。
13.如權(quán)利要求9所述的藥物組合物，其特征在于，所述緩沖液是濃度約10-50mM的磷酸鈉緩沖液。
14.如權(quán)利要求9所述的藥物組合物，其特征在于，所述溶液的pH維持在約5.8。
15.如權(quán)利要求9所述的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物進一步包含聚氧乙烯山梨糖醇。
16.如權(quán)利要求15所述的藥物組合物，其特征在于，所述聚氧乙烯山梨糖醇是聚氧乙烯山梨糖醇20或80并且所述聚氧乙烯山梨糖醇20或80的濃度是約0.005％(重量/體積)。
17.一種用于治療完全或部分由N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶缺陷引發(fā)的疾病的方法，其特征在于，所述方法包括給予需要這種治療的受試者有效量的如權(quán)利要求1-16中任一所述的組合物的步驟。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述疾病是粘多糖貯積癥。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述疾病是MPS VI。
20.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述疾病是Maroteaux-Lamy綜合征。
21.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述患者具有約10％或更低的正常N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶活性。
22.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，每周給予所述患者至少約50單位/千克或至少約1毫克/千克的所述N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前體。
23.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，每周給予所述患者至少約100單位/千克或2.0毫克/千克的所述N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前體。
24.一種生產(chǎn)重組N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前體的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟(a)使用編碼完整人N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶或其生物活性片段或突變體的DNA轉(zhuǎn)染的細胞生長；(b)將轉(zhuǎn)染的細胞引入生物反應(yīng)器；(c)向生物反應(yīng)器提供生長培養(yǎng)基；(d)收獲含所述酶的培養(yǎng)基；以及(e)從所述收獲的培養(yǎng)基中充分去除轉(zhuǎn)染細胞。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，所述細胞是哺乳動物細胞。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于，所述哺乳動物細胞是中國倉鼠卵細胞。
27.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)染細胞在含補充了選自L-谷氨酸、葡萄糖、次黃嘌呤/胸苷、絲氨酸、天冬酰胺酸和葉酸中一種或多種物質(zhì)的JRH Excell 302培養(yǎng)基的生長培養(yǎng)基中生長。
28.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，所述生長培養(yǎng)基不含G418。
29.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)染細胞在生物反應(yīng)器中生長至多45天。
30.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)染細胞在生物反應(yīng)器中生長至多90天。
31.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)染細胞經(jīng)連續(xù)的濾膜與含所述酶的培養(yǎng)基充分分離。
32.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，所述連續(xù)濾膜標定為4.0-0.75微米、0.45微米以及0.2微米。
33.一種用可操作的DNA轉(zhuǎn)染以產(chǎn)生重組N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶或其生物活性片段、類似物或突變體的細胞系，其特征在于，所述酶由該細胞系分泌或保留在細胞系內(nèi)。
34.如權(quán)利要求33所述的細胞系，其特征在于，所述轉(zhuǎn)染細胞是中國倉鼠卵細胞。
35.如權(quán)利要求34所述的細胞系，其特征在于，所述中國倉鼠卵細胞是CHO-K1細胞。
36.如權(quán)利要求35所述的細胞系，其特征在于，所述轉(zhuǎn)染細胞是CSL4S-342細胞。
37.一種純化N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前體的方法，其特征在于，所述方法包括(a)獲得含N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前體的液體；(b)降低所述液體中能切割N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前體的蛋白酶的蛋白水解活性，其中所述降低不會損害所述的N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前體；(c)將該液體與Cibracon藍染料相互作用層析樹脂接觸；(d)將該液體與銅螯合層析樹脂接觸；(e)將該液體與苯基疏水相互作用層析樹脂接觸；(f)回收所述N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前體。
38.如權(quán)利要求37所述的方法，其特征在于，所述獲得包括使用編碼N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶的基因轉(zhuǎn)化的細胞培養(yǎng)物生長。
39.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，所述基因編碼人的N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶。
40.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，所述細胞是哺乳動物細胞。
41.如權(quán)利要求40所述的方法，其特征在于，所述哺乳動物細胞是中國倉鼠卵細胞。
42.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，所述獲得進一步包括從所述細胞培養(yǎng)物中收獲液體。
43.如權(quán)利要求37所述的方法，其特征在于，所述獲得進一步包括將所述液體濃縮約20倍。
44.如權(quán)利要求37所述的方法，其特征在于，所述降低包括將液體的pH調(diào)節(jié)到等于或低于8.0。
45.如權(quán)利要求44所述的方法，其特征在于，所述降低包括將液體的pH調(diào)節(jié)到約4.8-5.5。
46.如權(quán)利要求45所述的方法，其特征在于，所述降低包括將液體的pH調(diào)節(jié)到約4.8-5.2。
47.如權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于，步驟(c)包括使液體流經(jīng)Cibracon藍染料相互作用色譜柱。
48.如權(quán)利要求47所述的方法，其特征在于，所述Cibracon藍染料相互作用色譜柱是Blue Sepharose 6 Fast Flow柱。
49.如權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于，其中步驟(d)包括使液體流經(jīng)銅螯合層析柱。
50.如權(quán)利要求49所述的方法，其特征在于，所述銅螯合層析柱是ChelatingSepharose Fast Flow柱。
51.如權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于，其中步驟(e)包括使液體流經(jīng)苯基疏水相互作用層析柱。
52.如權(quán)利要求51所述的方法，其特征在于，所述苯基疏水相互作用層析柱是Phenyl Sepharose 6 Fast Flow High Sub柱。
53.如權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于，其中步驟(c)、(d)和(e)的時間順序是步驟(c)、步驟(d)和步驟(e)。
54.如權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于，所述回收包括液體的滲濾。
55.如權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于，所述回收包括過濾液體以去除DNA。
56.如權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于，所述回收包括過濾液體以去除病毒。
57.如權(quán)利要求56所述的方法，其特征在于，所述過濾包括使所述液體流經(jīng)0.2微米的濾膜。
58.如權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于，所述回收的N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前體的純度至少等于或大于99％。
59.如權(quán)利要求58所述的方法，其特征在于，所述純度使用反相HPLC法測量。
60.如權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于，所述液體不與DEAE Sepharose樹脂接觸。
61.一種組合物，其特征在于，所述組合物包含用權(quán)利要求36所述方法純化的純度至少等于或大于99％的N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前體。
62.一種純化N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶或其生物活性片段、類似物或突變體的方法，其特征在于，所述方法包括(a)獲得含所述N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶或其生物活性片段、類似物或突變體的液體；(b)降低所述液體中能切割所述N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶或其生物活性片段、類似物或突變體的任何蛋白酶的蛋白水解活性，其中所述降低不損害所述N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶或其生物活性片段、類似物或突變體；(c)將該液體與Cibracon藍染料相互作用層析樹脂接觸；(d)將該液體與銅螯合層析樹脂接觸；(e)將該液體與苯基疏水相互作用層析樹脂接觸；(f)回收所述N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶或其生物活性片段、類似物或突變體；其中，步驟(c)、(d)和(e)可以任何時間順序進行。
63.一種藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物包含N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶前體和濃度介于約0.002％-0.008％(重量/體積)的聚氧乙烯山梨糖醇。
64.如權(quán)利要求63所述的藥物組合物，其特征在于，所述聚氧乙烯山梨糖醇是濃度0.005％(重量/體積)的聚氧乙烯山梨糖醇80。
65.一種治療完全或部分由N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶缺陷引起的疾病的方法，其特征在于，所述方法包括給予需要這種治療的人類受試者有效量的含重組人N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(rhASB)的組合物的步驟。
66.如權(quán)利要求65所述的方法，其特征在于，所述rhASB的量可有效提供一種或多種選自關(guān)節(jié)活動性、關(guān)節(jié)痛、關(guān)節(jié)僵直、運動耐量、運動耐久性、肺功能、視敏度以及日常生活活動性的有益效果。
67.一種治療VI型粘多糖貯積癥(MPS VI)的方法，其特征在于，所述方法包括給予需要這種治療的患者有效量的含重組人N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(rhASB)的組合物的步驟。
68.如權(quán)利要求67所述的方法，其特征在于，所述rhASB的量可有效提供一種或多種選自關(guān)節(jié)活動性、關(guān)節(jié)痛、關(guān)節(jié)僵直、運動耐量、運動耐久性、肺功能、視敏度以及日常生活活動性的有益效果。
69.如權(quán)利要求65或67所述的方法，其特征在于，所述rhASB以至少每周0.2mg/kg的劑量給藥。
70.如權(quán)利要求69所述的方法，其特征在于，所述rhASB以至少每周1.0mg/kg的劑量給藥。
71.如權(quán)利要求65或67所述的方法，其特征在于，所述rhASB每周一次經(jīng)2-4小時的灌注進行給藥。
72.如權(quán)利要求71所述的方法，其特征在于，所述rhASB每周一次經(jīng)4小時的灌注進行給藥。
73.重組人N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(rhASB)在制備用于治療遭ASB活性缺陷侵襲的人的藥物中的應(yīng)用。
74.重組人N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(rhASB)在制備用于治療遭MPS VI侵襲的人的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了高純度的重組人N－乙酰半乳糖胺－4－硫酸酯酶前體和其生物學(xué)活性突變體、片段和類似物以及包含高純度重組人N－乙酰半乳糖胺－4－硫酸酯酶前體的藥物組合物。本發(fā)明也提供了用于治療完全或部分由人N－乙酰半乳糖胺－4－硫酸酯酶缺陷引起的包括MPS VI在內(nèi)的疾病的方法以及生產(chǎn)并將重組前體酶純化為高純度形式的方法。
文檔編號C07H21/04GK1726046SQ200380105922
公開日2006年1月25日 申請日期2003年11月7日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月7日
發(fā)明者M·秦, J·M·亨斯蘭德, G·N·澤切爾勒, D·J·文特, W-P·占, L·陳, P·A·菲茨帕特里克, C·M·斯塔爾, S·斯韋德勒 申請人:生物馬林藥物股份有限公司