專利名稱：用于樣品中被分析物的分離和maldi分析的設(shè)備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于分離液體樣品中的至少 一 種被分析物并進(jìn) 一 步通 過(guò)激光解吸/電離(LDI)質(zhì)譜法分析所述被分析物的設(shè)備。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及設(shè)備用于分離液體樣品中的至少 一種被分析物 并隨后通過(guò)LDI檢測(cè)來(lái)測(cè)定所述至少一種被分析物的存在和/或數(shù)量的 用途。
本發(fā)明還涉及用于分離液體樣品中至少 一種被分4斤物和隨后通過(guò) LDI質(zhì)譜法確定所述至少一種被分析物的存在和/或數(shù)量的方法。
背景技術(shù)：
生物分析(bioassays)被用于探測(cè)生物樣品中凈皮分析物的存在和/或數(shù) 量。這些生物分析的典型應(yīng)用是體外診斷方法，其近年來(lái)變得更為常見(jiàn)， 并且越來(lái)越被用于補(bǔ)充或甚至代替更為傳統(tǒng)的診斷方法，如觸診、維管 形成(vasculation)、診斷成4象、內(nèi)窺鏡4企查和活沖全采集。
同樣在體外診斷領(lǐng)域中，當(dāng)今通常使用的許多生物分析是所謂的基 于表面的分析?；诒砻娴姆治龅膶?shí)例有例如DNA微陣列、基于微量 滴定板的ELISA或放射免疫沉淀分析，等等。
這些和其他生物分析中的主要障礙仍然是樣品制備。樣品的制備所 需的、常常費(fèi)事的方法通常包括大量關(guān)鍵步驟，例如，比如細(xì)胞樣品的 裂解、蛋白質(zhì)的變性，等等，其對(duì)于所述分析的敏感性和精確性可能潛 在地具有消極影響。例如，對(duì)于DNA微陣列和基于微量滴定板的ELISA 來(lái)說(shuō)，來(lái)自樣品制備的噪聲影響在驗(yàn)證體外診斷測(cè)試時(shí)仍然是要考慮的 因素。
對(duì)于某些應(yīng)用，質(zhì)譜方法作為可選的方法越來(lái)越多地代替其他的生 物分析。改善基于質(zhì)譜法的分析的敏感性和處理能力的努力已經(jīng)導(dǎo)致了 用于生物學(xué)相關(guān)樣品分析的多種質(zhì)譜儀形式的發(fā)展。除了質(zhì)譜技術(shù)方面 的革新(激光源、基質(zhì)材料、檢測(cè)單元)之外，已經(jīng)嘗試了更有效地和 特異性地吸收被分析物的基底，并改進(jìn)了早期的設(shè)計(jì)。
質(zhì)鐠法最初進(jìn)行的生物分子的直接激光解吸/電離 一般引起大的生物分子例如多肽和核酸的斷裂。為了實(shí)現(xiàn)幾十到幾百kDa的完整生物分 子的解吸/電離，已經(jīng)使用了各種技術(shù)。
通常被稱為基質(zhì)輔助激光解吸/電離質(zhì)譜法(MALDI-MS)的一種特 別適合的方法利用在溶液中與能量吸收有機(jī)分子(EAM)混合的生物分 子，所述能量吸收有機(jī)分子被稱為基質(zhì)材料。 一般地，所述基質(zhì)被容許 在質(zhì)譜探針上結(jié)晶，所述質(zhì)譜探針捕獲在基質(zhì)之內(nèi)的生物分子。
在MALDI-MS中， 一般是生物分子的被分析物然后與含有基質(zhì)的 溶液混合， 一滴所述液體置于探針的表面上。然后基質(zhì)溶液與所述生物 分子共結(jié)晶。探針被插入到質(zhì)譜儀中，然后激光能量被導(dǎo)向所述探針表 面，在此處它解吸并電離所述生物分子而不顯著地?cái)嗔阉鼈?。?MALDI-MS的其他實(shí)施方式中，基質(zhì)首先結(jié)晶為薄膜，生物分子稍后添 加，或反之亦然。然而，MALDI-MS作為分析工具有局限性。它因而沒(méi) 有提供將樣品分級(jí)的手段，復(fù)雜的生物學(xué)液體例如血液在沒(méi)有先期的準(zhǔn) 備步驟的情況下不適合于MALDI-MS。
進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)，例如表面增強(qiáng)的激光解吸/電離質(zhì)譜法(SELDI-MS ) 已經(jīng)部分地解決了這些難題。
在SELDI-MS中，探針表面被修飾，使得它在樣品制備過(guò)程中形成 主動(dòng)參與者。在一個(gè)變體中，例如，表面用選擇性結(jié)合目標(biāo)被分析物的
親和試劑衍生化。在另一個(gè)變體中，表面用結(jié)合樣品分子的亞群的層析 部分來(lái)衍生化。在又一種變體中，表面用當(dāng)激光探測(cè)時(shí)不解吸的能量吸 收分子來(lái)衍生化。在又另一種變體中，表面用分子衍生化，所述分子結(jié) 合被分析物，并且含有在應(yīng)用激光時(shí)被斷裂的光解鍵。
因而SELDI是選擇性表面MS靶(target)與MALDI-MS的組合。然 而，SELDI不一定包括MS靶上的固定的基質(zhì)-這種變體一般稱為 SEND。
例如，在美國(guó)專利No. 5,118,937、 US 5,045，694、 US 5,719,060和 US 2002/0060290 Al中詳細(xì)地提出了 MALDI和SELDI的原理。
SELDI技術(shù)已經(jīng)由Ciphergen Biosystems Inc.以所謂的ProteinChip 平臺(tái)的形式商品化。可以得自ProteinChip⑧的應(yīng)用指南的是，生物樣品 的平行分析是可能的，因?yàn)閱为?dú)的層析芯片被容納在專門(mén)的支架中來(lái)實(shí) 現(xiàn)微量滴定樣的板形式。在樣品在芯片上培養(yǎng)之后，未結(jié)合的分子被除 去，例如，通過(guò)緩沖液洗滌，并且直接在層析表面上進(jìn)行MALDI-MS
7測(cè)量?；|(zhì)可以作為MS測(cè)量之前的最后的步驟來(lái)添加，或早已經(jīng)共價(jià)
結(jié)合到芯片表面上。
雖然以上描述的SELDI和MALDI方法構(gòu)成了關(guān)于生物樣品的高處 理量多因素分析的主要進(jìn)步，但是對(duì)于開(kāi)發(fā)可靠的、基于質(zhì)譜的體外診 斷方法仍然存在著應(yīng)當(dāng)被克服的障礙。
如開(kāi)始時(shí)所指出的，大多數(shù)當(dāng)今的難題涉及樣品處理和制備，以及 多因素分析的相當(dāng)復(fù)雜的自動(dòng)化要求。
例如，如果在SELDI技術(shù)中要進(jìn)行多因素分析，必需產(chǎn)生不同的親 和表面，其必需用不同的樣品單獨(dú)地探測(cè)。這意味著方便的多通道化是 不可能的。進(jìn)一步的，樣品制備和分析靠近(在時(shí)間和空間上)；險(xiǎn)測(cè)單 元進(jìn)行，并通常需要濕化學(xué)環(huán)境。
由于不同的表面樣點(diǎn)(spots)必須被單獨(dú)地探測(cè)，所以SELDI技術(shù)通 常還需要許多洗滌步驟以及相應(yīng)理想地顯著的自動(dòng)化程度。.
鑒于這種情況，對(duì)于這樣的設(shè)備和方法存在著持續(xù)的需求，所述設(shè) 備和方法容許以方便的方式組合被分析物從生物樣品中的分離、而不需 要大量的構(gòu)造元件(extensive constructive elements)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種設(shè)備(device),其可以用于分離液體樣 品中的纟皮分析物，并且其可以直接用于通過(guò)質(zhì)譜方法例如MALDI-MS 來(lái)分析所述被分析物的存在和/或數(shù)量。
本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的目的是提供方法，用于從液體樣品分離被分 析物并且通過(guò)質(zhì)譜方法例如MALDI-MS測(cè)定所述被分析物的存在和/或 數(shù)量。
本發(fā)明的這些和其他目的，它們根據(jù)接下來(lái)的說(shuō)明將變得顯而易 見(jiàn)，通過(guò)獨(dú)立權(quán)利要求的主題得以解決。從屬權(quán)利要求涉及本發(fā)明的優(yōu) 選的實(shí)施方式。
在 一 方面本發(fā)明涉及用于分離液體樣品中至少 一種被分析物的設(shè) 備，包括具有下列的至少一個(gè)基底
-用于加載液體樣品的至少一個(gè)區(qū)域；
國(guó)用于轉(zhuǎn)運(yùn)(transporting)所述液體樣品的至少一個(gè)區(qū)域；
-用于從所述液體樣品的其他成分中分離所述至少 一種被分析物的至少一個(gè)區(qū)域；和
-用于激光解吸電離(LDI)質(zhì)譜檢測(cè)的至少一個(gè)區(qū)域；
其中所述至少一個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域包括隆起結(jié)構(gòu)(elevated structures)的陣
列，所述隆起結(jié)構(gòu)具有一定的形狀、尺寸和所述隆起結(jié)構(gòu)之間的間隔，
從而實(shí)現(xiàn)了從所述加載區(qū)域通過(guò)所述分離區(qū)域到所述LDI檢測(cè)區(qū)i或的所
述樣品的毛細(xì)力驅(qū)動(dòng)的流動(dòng)。
所述隆起結(jié)構(gòu)可以具有不同的形狀，包括圓形、圓柱形、矩形、三
角形，等等。
這些隆起結(jié)構(gòu)的高度一般將高于約1 pm和低于1000 pm。
這些隆起結(jié)構(gòu)的寬度和長(zhǎng)度一般將是所述高度乘以因子0.5-1,例如 對(duì)于10 高結(jié)構(gòu)為5-10 pm。
在用作LDI的平臺(tái)的所述檢測(cè)區(qū)域上，基柱(pillars)—般將是高度 <50pm,以不損害飛行時(shí)間MS測(cè)量中的質(zhì)量分辨率。
在可具有基柱樣外觀的這些隆起結(jié)構(gòu)之間的間隔^皮選擇，以確保從 所述加載區(qū)域通過(guò)所述分離區(qū)域到所述LDI4全測(cè)區(qū)域的液體樣品的毛細(xì) 力驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)運(yùn)。所述間隔一般將在大約0.1到大約1000jim的范圍內(nèi)。
所述分離區(qū)域可以鄰近于所述加載區(qū)域、所述專爭(zhēng)運(yùn)區(qū)域和/或所述 LDI檢測(cè)區(qū)域和/或處于所述加載區(qū)域、所述轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域和/或所述LDI檢 測(cè)區(qū)域中。所述分離區(qū)域可以提供物理、化學(xué)和/或生物學(xué)功能性 (functionality)以容許從所述液體樣品的其他成分中分離所述至少 一種被 分析物。
物理功能性可以通過(guò)與在轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域中使用的隆起結(jié)構(gòu)類型相同的 隆起結(jié)構(gòu)的形狀、尺寸和/或間隔以及分布構(gòu)形(topography)來(lái)提供。
化學(xué)功能性可以通過(guò)例如不同的涂層來(lái)提供。因而，化學(xué)功能性可 以通過(guò)疏水的聚合物涂層來(lái)提供。做為選擇和/或另外地，化學(xué)功能性可 以通過(guò)離子聚合物涂層例如聚陰離子交換涂層來(lái)提供。
生物學(xué)功能性將通過(guò)所有類型的、將確保與要分離的樣品成分的特 異性生物相互作用的分子來(lái)提供。因而，生物學(xué)功能性包括抗體、受體 分子、核酸分子和/或小分子抑制物，其被涂覆在所述分離區(qū)域中，例如 在基柱樣結(jié)構(gòu)上。
用于LDI檢測(cè)的區(qū)域包含至少一種金屬和/或能夠在基質(zhì)輔助的激 光解吸電離質(zhì)譜法(MALDI-MS)中用作基質(zhì)材料的至少一種能量吸收分子(EAM)和/或至少一種校準(zhǔn)物(calibrant)。
所述LDI檢測(cè)區(qū)域?qū)饘倩蚝辖?，?yōu)選選自包括銀、金、鉑 (platin)、釔、鉻、鈦和銅的組，具有例如鉻和/或鈦的粘附層。
做為選擇和/或另外地，所述LDI檢測(cè)區(qū)域?qū)芰课辗肿?(EAM),因?yàn)樗鼈?一般在MALDI-MS檢測(cè)中用作基質(zhì)材料。因而， 這些分子可以選自包含苯曱酸、肉桂酸和相關(guān)芳香化合物的衍生物的 組，例如，2,5-二羥基苯甲酸(2,5-DHB或龍膽酸)、a-氰基-4-羥基肉 桂酸(CHCA)、 3,5-二曱氧基-4-羥基肉桂酸(芥子酸，芥子酸或SPA)、 煙酸、吡咬曱酸、反式-3-甲氧基-4-羥基肉桂酸(阿魏酸)、2- (4-羥基 苯基偶氮)-苯曱酸(HABA) 、 6-氮雜-2-硫代胸腺嘧啶(ATT) 、 3-HPA、 丁二酸、甘油、4-羥基吡啶曱酸、酒石酸、甘油、2,4,6-三羥基苯乙酮、 3-羥基吡啶曱酸、3-氨基喹啉、1,8,9-三羥基-蒽(蒽三酚)、激光染料香 豆素120、取代的嘧啶、吡啶和苯胺，例如對(duì)硝基苯胺。
所述校準(zhǔn)物可以是通常在MALDI-MS中用于參考和校準(zhǔn)目的任何 分子種類。
所述液體樣品可以是環(huán)境樣品、取自動(dòng)物或人的樣品、來(lái)自供應(yīng)品 (provisions)/食品或來(lái)自植物。進(jìn)一 步的細(xì)節(jié)在以下給出。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及測(cè)定樣品中至少 一種被分析物的 存在和/或數(shù)量的方法，包括步驟
a) 提供用于分離液體樣品中至少一種被分析物的設(shè)備，其包含具有 以下的至少一個(gè)基底
-用于加載液體樣品的至少一個(gè)區(qū)域； -用于轉(zhuǎn)運(yùn)所述液體樣品的至少一個(gè)區(qū)域；和 -用于從所述液體樣品的其他成分中分離所述至少 一種被分析物的 至少一個(gè)區(qū)域；
其中所述至少一個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域包括隆起結(jié)構(gòu)的陣列，所述隆起結(jié)構(gòu)具 有一定形狀、尺寸和所述隆起結(jié)構(gòu)之間的間隔，從而實(shí)現(xiàn)了從所述加載 區(qū)域通過(guò)所述分離區(qū)域的所述樣品的毛細(xì)力驅(qū)動(dòng)的流動(dòng)；
b) 將液體樣品加載到步驟a)的所述設(shè)備的加載區(qū)域上；
c) 利用a)的所述設(shè)備從所述樣品的其他成分中分離所述至少一種 被分析物；
d) 通過(guò)LDI測(cè)定所述至少一種被分析物的存在和/或數(shù)量。要注意的是，在本發(fā)明的這個(gè)實(shí)施方式中，所述設(shè)備不必要包含LDI檢測(cè)區(qū)域，所述LDI檢測(cè)區(qū)域具有至少一種金屬和/或能夠在基質(zhì)輔助的激光解吸電離質(zhì)譜法(MALDI-MS)中用作基質(zhì)材料的至少一種能量吸收分子(EAM)和/或至少一種校準(zhǔn)物。盡管如此，然而上面描述的這種LDI ;險(xiǎn)測(cè)區(qū)域的存在可以構(gòu)成本發(fā)明的 一種優(yōu)選的實(shí)施方式。
所述分離區(qū)域可以同樣鄰近于所述加載區(qū)域、所述轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域和/或所述LDI檢測(cè)區(qū)域和/或處于所述加載區(qū)域、所述轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域和/或所述LDI檢測(cè)區(qū)域中，如果所述LDI檢測(cè)區(qū)域存在的話。當(dāng)然，如上所述所述分離區(qū)域可以被物理地、化學(xué)地或生物學(xué)地功能化。
所述樣品的性質(zhì)也可以與上文的描述相同。
根據(jù)本發(fā)明的方法可以用于沿著所述轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域來(lái)轉(zhuǎn)運(yùn)液體樣品并在所述至少一個(gè)分離區(qū)域中分離它。然后，通過(guò)將所述設(shè)備直接插入到相應(yīng)的質(zhì)譜儀中，被分析物的存在和/或數(shù)量通過(guò)基于LDI的質(zhì)譜法，例如MALDI-MS被測(cè)定。
本發(fā)明還涉及前文描述的設(shè)備的用途，用于分離液體樣品內(nèi)的被分析物并通過(guò)基于LDI的質(zhì)語(yǔ)法例如MALDI-MS測(cè)定存在和/或數(shù)量。所述設(shè)備最少包括用于加載所述液體樣品的區(qū)域、用于轉(zhuǎn)運(yùn)所述液體樣品的區(qū)域和用于從所述液體樣品的其他成分分離至少 一種被分析物的區(qū)域。所述轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域的特征在于它包含隆起結(jié)構(gòu)的陣列，所迷隆起結(jié)構(gòu)具有一定形狀、尺寸和在所述隆起結(jié)構(gòu)之間的間隔，/人而實(shí)現(xiàn)/人所述加載區(qū)域通過(guò)所述分離區(qū)域的所述液體樣品的毛細(xì)力驅(qū)動(dòng)的流動(dòng)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中這種設(shè)備可以包含用于基于激光解吸/電離的質(zhì)量分離和檢測(cè)的區(qū)域，該區(qū)域的特征在于存在至少 一種金屬成分和/或能夠在基質(zhì)輔助的激光解吸電離質(zhì)譜法(MALDI-MS)中用作基質(zhì)材料的至少一種能量吸收分子(EAM)。
因而本發(fā)明還涉及這些設(shè)備在生物分析中，優(yōu)選用于體外診斷方法
用途，所述體液例如血液、血清、血漿和/或尿液，特別的興趣是指示疾病例如癌癥的標(biāo)志物(markers)或蛋白質(zhì)組沖莫式(proteomic patterns)的檢測(cè)。
以及根據(jù)在此要求保護(hù)和描述的方法和設(shè)備預(yù)先純化樣品之后，通過(guò)MALDI-MS進(jìn)行的該血液樣品的分析。


附圖1描繪了轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域的隆起結(jié)構(gòu)的不同的橫切面形狀。
附圖2描繪了相同形狀的但是在結(jié)構(gòu)之間具有不同間隔的隆起結(jié)構(gòu) 可以如何在轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域中進(jìn)行布置。特定的構(gòu)形產(chǎn)生了毛細(xì)力驅(qū)動(dòng)的流 動(dòng)。同時(shí)，建立了沿著箭頭的過(guò)濾效果。
附圖3顯示了根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備的示意性的設(shè)置(outlay)。顯示了加 載區(qū)域、轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域和LDI檢測(cè)區(qū)域。分離區(qū)域通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域的表面修飾 和物理設(shè)置來(lái)形成。
附圖4顯示了根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備的示意性的設(shè)置。顯示了加載區(qū)域、 轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域和LDI檢測(cè)區(qū)域。分離區(qū)域通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域的表面修飾和物理設(shè) 置來(lái)形成。轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域被分成不同的流動(dòng)路徑。通過(guò)不同的流動(dòng)路徑內(nèi)隆 起結(jié)構(gòu)的不同的形狀、尺寸、間隔和分布，在不同的流動(dòng)路徑內(nèi)可以實(shí) 現(xiàn)不同的流動(dòng)速度。
附圖5顯示了與附圖3類似的設(shè)置。同樣存在加載區(qū)域、轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域 和LDI檢測(cè)區(qū)域。通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域的表面修飾和物理設(shè)置形成 一 個(gè)分離區(qū) 域。存在另外的分離或阻擋區(qū)域，其可以通過(guò)抗體或?qū)游鐾繉觼?lái)功能化。
附圖6顯示了與附圖4類似的設(shè)置。存在有加載區(qū)域、轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域和 LDI檢測(cè)區(qū)域。通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域的表面修飾和物理設(shè)置來(lái)形成一個(gè)分離區(qū) 域。存在另外的分離區(qū)域，其可以通過(guò)抗體或?qū)游鐾繉觼?lái)功能化。轉(zhuǎn)運(yùn) 區(qū)域被分成不同的流動(dòng)路徑。通過(guò)不同的流動(dòng)路徑內(nèi)隆起結(jié)構(gòu)的不同的 形狀、尺寸、間隔和分布，在不同的流動(dòng)路徑內(nèi)可以實(shí)現(xiàn)不同的流動(dòng)速 度。
附圖7顯示了與附圖5類似的設(shè)置。同樣存在加載區(qū)域、轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域 和LDI檢測(cè)區(qū)域。通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域的表面修飾和物理設(shè)置來(lái)形成 一 個(gè)分離 區(qū)域。存在兩個(gè)或一個(gè)另外的分離區(qū)域，其可以通過(guò)例如抗體涂層、陽(yáng) 離子交換、陰離子交換或IMAC樹(shù)脂來(lái)功能化。
附圖8顯示了與附圖6類似的設(shè)置。存在加載區(qū)域、轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域和LDI 檢測(cè)區(qū)域。通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域的表面修飾和物理設(shè)置來(lái)形成一個(gè)分離區(qū)域。 存在兩個(gè)另外的分離區(qū)域，其可以通過(guò)例如抗體涂層和IMAC樹(shù)脂來(lái)功 能化。轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域被分成不同的流動(dòng)路徑。通過(guò)不同的流動(dòng)路徑內(nèi)隆起結(jié)構(gòu)的不同的形狀、尺寸、間隔和分布，在不同的流動(dòng)路徑內(nèi)可以實(shí)現(xiàn)不同的流動(dòng)速度。
附圖9顯示了一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方式。加載區(qū)域(110)連"^妾到轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域，轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域延伸貫穿設(shè)備的其余部分。轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域中存在一個(gè)分離區(qū)域(120)以及兩個(gè)LDI檢測(cè)區(qū)域(130, 140)。在這個(gè)實(shí)施方式中，遠(yuǎn)離的LDI區(qū)域(140)將給出與鄰近的LDI區(qū)域(130)相似的質(zhì)譜，但是沒(méi)有在分離區(qū)域(120)中所除去的成分。
具體實(shí)施例方式
如上文所闡述的那樣，對(duì)于一些設(shè)備存在著持續(xù)的需求，所述設(shè)備容許以易于實(shí)施的方式分離生物樣品，和使得能夠通過(guò)質(zhì)譜法對(duì)分離的樣品進(jìn)行多通道分析。
本發(fā)明提供了解決這種需求的設(shè)備和方法。在更詳細(xì)地描述本發(fā)明的這些方面之前，提供了一些一般定義，其在本發(fā)明的整個(gè)說(shuō)明書(shū)中應(yīng)用。
如在本說(shuō)明書(shū)和附隨的權(quán)利要求中使用的，單數(shù)形式"a"和"an"也包括了相應(yīng)的復(fù)數(shù)，除非上下文明顯地表示相反的意思。因而，術(shù)語(yǔ)"an^:分析物，，可以包^"多于一種^皮分析物，即，兩種、三種、四種、五種等等被分析物，以及一起具有確定性診斷性質(zhì)的被分析物譜。
在本發(fā)明的上下文中術(shù)語(yǔ)"約，，表示本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解為仍然確保了所討論的特征的技術(shù)效果的精確性區(qū)間(interval of accuracy)。該術(shù)語(yǔ)一般表示偏離所指出的數(shù)值+/-10%或優(yōu)選+/-5%。
術(shù)語(yǔ)"樣品"是指一定體積的液體，它是溶液、乳液或懸浮體，人們意圖將其用于其任何性質(zhì)的定性或定量測(cè)定，例如成分的存在或不存在、成分的濃度等等。
樣品可以是取自生物體例如人類或動(dòng)物的樣品，來(lái)自生物圏例如水或泥漿樣品，或來(lái)自工業(yè)加工流體，包括藥物、食物或飼料的制造過(guò)程的加工流體，來(lái)自飲用水的純化，或來(lái)自流出的廢液。所述樣品可以直接進(jìn)行定性或定量測(cè)定，或在適合的預(yù)處理例如，均質(zhì)化、超聲處理、裂解、過(guò)濾、沉降、離心、熱處理，等等之后進(jìn)行。
本發(fā)明的上下文中典型的樣品是體液，例如血液、血漿、血清、淋巴液、尿液、唾液、精液、胃液、痰、淚液，等等。
13其他的典型樣品是環(huán)境流體，例如地表水、地下水、淤泥(sludge),等等。
工業(yè)樣品包括加工流體，例如牛奶、乳清、湯、營(yíng)養(yǎng)溶液、細(xì)胞培 養(yǎng)基，等等。
雖然本發(fā)明的意圖是可用于所有種類前述樣品，但是體液樣品和全 血樣品構(gòu)成了優(yōu)選的樣品種類。
對(duì)于本發(fā)明來(lái)說(shuō)，術(shù)語(yǔ)"被分析物"與術(shù)語(yǔ)"標(biāo)志物"同義地使用，并 描述存在于樣品內(nèi)并且其存在和/或數(shù)量將要通過(guò)基于LDI的質(zhì)量分離 和才企測(cè)方法來(lái)確認(rèn)的任何物質(zhì)。
在一個(gè)實(shí)施方式中本發(fā)明提供用于分離液體樣品中至少一種被分 析物的設(shè)備，其包含具有以下的至少一個(gè)基底
-用于加載液體樣品的至少一個(gè)區(qū)域；
-用于轉(zhuǎn)運(yùn)所述液體樣品的至少一個(gè)區(qū)域；
-用于從所述液體樣品的其他成分中分離所述至少 一種被分析物的
至少一個(gè)區(qū);^或；和
-用于激光解吸電離(LDI)質(zhì)譜檢測(cè)的至少一個(gè)區(qū)域； 其中所述至少 一個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域包括隆起結(jié)構(gòu)的陣列，所述隆起結(jié)構(gòu)具 有一定形狀、尺寸和所述隆起結(jié)構(gòu)之間的間隔，從而實(shí)現(xiàn)了/人所述加載 區(qū)域通過(guò)所述分離區(qū)域到所述LDI檢測(cè)區(qū)域的所述樣品的毛細(xì)力驅(qū)動(dòng)的流動(dòng)。
因而所述設(shè)備的特征在于加載區(qū)域、轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域、激光解吸電離(LDI) 檢測(cè)區(qū)域和分離區(qū)域的存在。如下文將闡述的那樣，分離區(qū)域可以鄰近 于所述加載區(qū)域、轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域和/或LDI檢測(cè)區(qū)域和/或處于所述加載區(qū)域、 轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域和/或LDI檢測(cè)區(qū)域中。
術(shù)語(yǔ)"基底，，的意思是襯底、載體、表面、基質(zhì)或芯片，在其上布置 了加載區(qū)域、轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域、LDI檢測(cè)區(qū)域和/或分離區(qū)域。
因而，術(shù)語(yǔ)"基底"描述了在其上進(jìn)行實(shí)際的分離和定性和/或定量測(cè) 定的載體結(jié)構(gòu)。所述基底可以從與加載、轉(zhuǎn)運(yùn)、分離和/或LDI檢測(cè)區(qū)域 相同的材料制得，因而可以從任何下文提及的塑料材^F制得。然而，所 述基底也可以從與用于生產(chǎn)加載、轉(zhuǎn)運(yùn)、分離和/或LDI檢測(cè)區(qū)域的材料 不同的材料制得。因而，如果前述區(qū)域由例如硅制得，則在一個(gè)實(shí)施方 式中基底可以由玻璃覆蓋片(glass cover slide)、金屬、或與所述設(shè)備的預(yù)
14定用途(即，引入質(zhì)譜儀中)相容的任何其他材料制得。典型的基底材料
是硅、玻璃、石英、陶瓷、金屬或塑料材料，例如，PMMA或Teflon。一般地，各個(gè)區(qū)域(加載區(qū)域、轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域、分離區(qū)域和/或LDI檢測(cè)區(qū)域)將在塑料基底上構(gòu)建，其優(yōu)選是熱塑性的或是具有塑料上層的基底。各個(gè)區(qū)域不必是物理上分離的，如附圖3和6中所描述的那樣?；纂S后可以利用例如濺射、蒸發(fā)、溶膠-凝月交涂覆、薄層沉積(waferdeposition)等等的技術(shù)來(lái)涂覆或衍生化來(lái)得到例如硅、金屬或其他材料的涂層。本發(fā)明的基底也可以由硅基底制成。
如它們?cè)诒菊f(shuō)明書(shū)、實(shí)施例和權(quán)利要求的上下文中使用的那樣，術(shù)語(yǔ)"區(qū)域"、"地區(qū)"和"位點(diǎn)"定義了在前述基底上液體樣品的流動(dòng)路徑的部分。
術(shù)語(yǔ)"陣列，，描述了隆起結(jié)構(gòu)在表面上有序的規(guī)則的布置。現(xiàn)在將更詳細(xì)地解釋如上所述的不同類型的區(qū)域。
加載區(qū)域^皮設(shè)計(jì)用以接受液體樣品。因而它可以采用適合于容納液體樣品的任何形狀。這些形狀包括圓形、橢圓形、矩形，等等。加載區(qū)域可以提供凹處或凹坑，從而液體樣品不會(huì)溢出基底。在任何情況下，加載區(qū)域都將祐:設(shè)計(jì)以容許液體樣品從加載區(qū)域到轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域和其他區(qū)
》或的傳送(communication)。
轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域包含隆起結(jié)構(gòu)的陣列，隆起結(jié)構(gòu)具有一定形狀、大小和在所述隆起結(jié)構(gòu)之間的間隔，乂人而實(shí)現(xiàn)從所述加載區(qū)域沿著轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域的液體樣品成分的毛細(xì)力驅(qū)動(dòng)的流動(dòng)。
因而，本發(fā)明涉及這樣的設(shè)備，通過(guò)它們的轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域的設(shè)計(jì)，其容
許沿著所述轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域的^:動(dòng)流動(dòng)(即，不施加外力)。
隆起結(jié)構(gòu)可以采用，例如，基柱樣外觀并且基本上垂直從基底平面
凸出出來(lái)。因而它們也可以稱為基柱、柱或突出物。
隆起結(jié)構(gòu)可以采用適合于提供樣品成分的毛細(xì)力驅(qū)動(dòng)的流動(dòng)的任
何形狀。因而它們可以是圓形、橢圓形、矩形、三角形，等等。隆起結(jié)
構(gòu)的典型外觀在附圖1中描繪。
隆起結(jié)構(gòu)的高度一般將高于大約1 iiim, —般低于大約1000 ^m。在某些優(yōu)選的實(shí)施方式中，隆起結(jié)構(gòu)的高度將高于5^im,甚至更優(yōu)選高于20 |tim。
隆起結(jié)構(gòu)的寬度一般將是高度乘以因子0.5-1,例如對(duì)于10 |Lim高的結(jié)構(gòu)為5-10 ^m。
隆起結(jié)構(gòu)將例如具有亞微米(submicrometer)到數(shù)百微米的大小， 一般5-75 nm,具有類似的直徑和間隔，基柱的長(zhǎng)寬比一般S2.5。
隆起結(jié)構(gòu)之間的間隔一般將在大約0.1到大約1000 ixm的范圍內(nèi)。優(yōu)選的實(shí)施方式涉及其中隆起結(jié)構(gòu)之間的間隔在1到100 |Lim的區(qū)間內(nèi)，更優(yōu)選在1到50 |iim的區(qū)間內(nèi)的設(shè)備。
隆起結(jié)構(gòu)之間的間隔不必在所有方向上都相同，然而這樣的布置可以代表一種優(yōu)選的實(shí)施方式。
隆起結(jié)構(gòu)之間的間隔和/或距離可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員選擇，技術(shù)人員的選擇將基于樣品的類型。因而，本領(lǐng)域技術(shù)人員將清楚地知道，不同樣品的不同粘度將對(duì)隆起結(jié)構(gòu)的形狀、尺寸和隆起結(jié)構(gòu)之間的間隔提出不同要求，以確4呆液體樣品沿著轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域的毛細(xì)力驅(qū)動(dòng)的流動(dòng)。
例如，如果小于5.7pm的被分析物將要通過(guò)毛細(xì)力驅(qū)動(dòng)的流動(dòng)來(lái)轉(zhuǎn)運(yùn)，那么基柱之間的間隔可以從5.8到6.0pm中選擇，容許具有5.7(im直徑的球體裝配于它們之間，從而球之間的中心間隔是lO)iim。
隆起結(jié)構(gòu)可以纟皮設(shè)計(jì)以不僅確保毛細(xì)力驅(qū)動(dòng)的流動(dòng)，而且還展現(xiàn)優(yōu)選的流動(dòng)方向。這可以通過(guò)利用流動(dòng)路徑的不同部分中不同截面形狀的隆起結(jié)構(gòu)、流動(dòng)路徑的不同部分中隆起結(jié)構(gòu)之間的不同間隔、流動(dòng)路徑的不同部分中隆起結(jié)構(gòu)的不同的化學(xué)或生物化學(xué)表面處理，或流動(dòng)路徑的不同部分中不同的高度水平來(lái)實(shí)現(xiàn)。
因而，轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域的流動(dòng)路徑可以再分成不同的區(qū)域，其中隆起結(jié)構(gòu)可以具有不同的高度、長(zhǎng)度、寬度、性質(zhì)和/或隆起結(jié)構(gòu)之間的間隔。例如如果隆起結(jié)構(gòu)采用基柱的形式，可以在一個(gè)區(qū)域內(nèi)、在具有不同尺寸和間隔的鄰近的組中緊密鄰近地提供基柱(If for example the elevatedstructures take the form of pillars, the pillars can be provided in one zone in closeproximity in adjacent groups having different dimensions and spacing)。
取決于形狀、間隔等等，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將能夠通過(guò)設(shè)計(jì)基柱來(lái)提供越來(lái)越地強(qiáng)的毛細(xì)力來(lái)選擇優(yōu)選的流動(dòng)方向。如果隆起結(jié)構(gòu)之間的間隔被降低， 一般將實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)。因而，人們可以在轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域的起始處以大約100 的基柱間隔作為開(kāi)始，其將被逐漸縮窄到大約lOjxm。由于間隔的縮窄將導(dǎo)致提高的毛細(xì)力，所以液體樣品將被迫進(jìn)入具有降低的間隔的基柱樣結(jié)構(gòu)的方向。本發(fā)明的這樣的一個(gè)實(shí)施方式在附圖2中示意地示出。
當(dāng)然，本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道，持續(xù)地降低隆起結(jié)構(gòu)之間的間隔還將產(chǎn)生過(guò)濾效果，其可以用于分離液體樣品的某些成分，如以下將在分離區(qū)域的上下文中說(shuō)明的那樣。
例如，所述設(shè)備可以使用轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域中的第一"密集區(qū)域"，其中隆起結(jié)構(gòu)之間的間隔可比較地是小的。這樣的區(qū)域?qū)⒆鳛楹Y網(wǎng)或柵欄，阻止更大的顆粒例如細(xì)胞沿著轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域通過(guò)。接下來(lái)，可以存在具有隆起結(jié)構(gòu)的區(qū)域，所述隆起結(jié)構(gòu)具有隆起結(jié)構(gòu)之間相對(duì)大的間隔。這可以用于暫時(shí)地降低液-固相相互作用的時(shí)間，例如如果期望樣品被暴露于某些表面結(jié)合的部分指定的時(shí)間以使特定反應(yīng)進(jìn)行到合理的完成度。在這個(gè)低速區(qū)域之后，可以提供另外的、具有隆起結(jié)構(gòu)之間相當(dāng)狹窄的通道的更大隆起結(jié)構(gòu)的區(qū)域。隆起結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)和設(shè)置因而將對(duì)液體樣品的分離和流動(dòng)路徑具有影響。
樣品的流動(dòng)路徑也可以受到隆起結(jié)構(gòu)的表面的功能化部分的影響。因而可以考慮將顆粒附著或誘捕在隆起結(jié)構(gòu)之間。這些顆?？梢栽谏虡I(yè)
上可獲得的或定制的顆粒中選擇，例如，微米顆?；蚣{米顆粒(micro- ornano-particles),并且可以具有玻璃、金屬或聚合物或這些的組合的核，
質(zhì)、抗體、氨基酸、核酸、碳水化合物、羧基部分(carboxylic moiety)、胺部分，等等。
所述顆?？梢曰瘜W(xué)地或物理地結(jié)合到基底，或通過(guò)自組裝機(jī)械地捕獲在基柱樣結(jié)構(gòu)覆蓋的區(qū)域之內(nèi)。取決于液體樣品對(duì)隆起結(jié)構(gòu)的這些功能化的表面的親和力，液體樣品的流動(dòng)可以被導(dǎo)向到某些方向。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，隆起結(jié)構(gòu)的性質(zhì)如形狀、尺寸和/或間隔，與額外功能化隆起結(jié)構(gòu)的部分的表面結(jié)合，可以用于形成梯度，即，轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域的部分之上的連續(xù)變化，引起逐步的滯留、過(guò)濾和/或改變樣品的流動(dòng)速度。
然而，流動(dòng)方向，例如樣品的非期望的回流的防止，不僅受到如上所述的隆起結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)和設(shè)置的影響，還可以受到外界影響，選自加熱、冷卻、可見(jiàn)光和/或UV光照射、和/或電流的施加或它們的組合，作用于轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域的至少 一部分上。隆起結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)同樣可以用于支持和增強(qiáng)這些外力的效果。例如，隆起結(jié)構(gòu)的高度可以被降低，來(lái)提高.熱介導(dǎo)的蒸發(fā)。是的，完全正確。(但是作為最重要的情況，所述設(shè)備是意圖不使用外部資源而分離樣品)。
轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域也可以包含一個(gè)、兩個(gè)或更多個(gè)流動(dòng)路徑，其每一個(gè)可以
例如連接到特定的LDI檢測(cè)區(qū)域。這種設(shè)備將適合于用一個(gè)單獨(dú)的樣品從一個(gè)加載區(qū)域開(kāi)始進(jìn)行平行的多個(gè)分析(多通道化)。在這種情況下，每個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域可以例如包含具有不同形狀、尺寸和/或隆起結(jié)構(gòu)之間間隔的隆起結(jié)構(gòu)。類似地，每個(gè)流動(dòng)路徑可以被進(jìn)一步功能化，通過(guò)例如使用不同的化學(xué)涂層或生物分子。轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域的不同的流動(dòng)路徑可以被分隔，例如通過(guò)高于所述隆起結(jié)構(gòu)的壁，以避免溢出和由此在不同的流動(dòng)路徑之間的交叉污染。如果隆起結(jié)構(gòu)之間的距離足夠大以避免毛細(xì)力驅(qū)動(dòng)的流動(dòng)，則不同的流動(dòng)路徑也可以僅通過(guò)隆起結(jié)構(gòu)的缺少來(lái)分隔。
制造如上所述的在基底上的隆起結(jié)構(gòu)存在著不同的可能性。這些包括珪光刻(silicon lithography), 電鍍(electro-plating),壓花，鑄造(casting),例如PMMA、聚碳酸酯、聚烯烴(polyoleofines)如Zeonor或Topas以及導(dǎo)電的相應(yīng)的碳填充的材料的注射才莫塑。其他方法包括硅的切割或DRIE蝕刻(參見(jiàn)下文)。
一般地，制造過(guò)程包括硅母版(siliconmaster)的制造，從該硅母版的鎳模具的電鍍，以及就像對(duì)于例如音樂(lè)CD所做的那樣，從模具通過(guò)注射模塑對(duì)大量聚合物基底的復(fù)制。因而，所述硅母版以半導(dǎo)體工業(yè)的精確性來(lái)制造，隨后用音樂(lè)CD行業(yè)的生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)性來(lái)復(fù)制。
這種隆起結(jié)構(gòu)的制造因而可以以其最簡(jiǎn)單的形式進(jìn)行，通過(guò)基底上沉積的光敏感性均聚物或預(yù)聚物(mono-or pre-polymer)的直接固化，采用透過(guò)其來(lái)照射光以引發(fā)固化的掩模，并此后清洗押未固化的區(qū)域(厚膜光刻工藝(thick film photo-resist process))。
另 一種直接方法是通過(guò)正本(original)到聚合物中的復(fù)制。所述正本可以在珪中通過(guò)DRIE工藝(深反應(yīng)離子蝕刻，Deep Reactive Ion Etch)來(lái)制造，其中可以制造高長(zhǎng)寬比的結(jié)構(gòu)。生產(chǎn)這種正本的其他途徑可以例如是通過(guò)基底的或在基底上的激光加工、放電法、自由形狀制造(FreeForm Manufacturing, FFM)、電4匕學(xué)iU匕學(xué)獨(dú)刻、氣相獨(dú)刻、才幾才成力口工、厚膜光刻工藝或它們的組合，所述基底例如是硅、玻璃、石英、陶瓷、
18金屬或塑料例如PMMA、聚碳酸酯、polyoleofines或Teflon的基底。
復(fù)制的最直接的方法之一是在具有所需負(fù)像形狀(negative shape)的正本上澆鑄均聚物或預(yù)聚物。生產(chǎn)聚合物復(fù)制品的其他途徑可包括熱塑性或熱固性材料的注射模塑或壓花。
如果正本在某些方面經(jīng)受不住復(fù)制過(guò)程，則可以首先從正本制造在合適的材料中的中間復(fù)制品(模板(stamper))。這種模板方法的實(shí)例可以用于首先將導(dǎo)電層沉積在正本的上面，此后通過(guò)電鍍從正本形成負(fù)像。某些電鍍材料例如鎳非常適合于模板的拷貝的重復(fù)的和非破壞性的生產(chǎn)。這提供了從負(fù)像到正像改變極性、以及產(chǎn)生一系列的相同的模板用于復(fù)制品的大量生產(chǎn)的可能性。模板制造的其他實(shí)例可以是在精選的聚合物中，在澆鑄、壓花或注射模塑過(guò)程中給出正本的負(fù)像形狀。重復(fù)地和非破壞性地生產(chǎn)模板的拷貝的同樣的可能性對(duì)于聚合物模板也是成立的。
適合于隆起結(jié)構(gòu)的注射模塑的聚合物包括，例如，聚碳酸酯和環(huán)狀的polyoleofines, ，H口 Zeonor牙口 Topas。
根據(jù)本發(fā)明的隆起結(jié)構(gòu)可以以不同的方法產(chǎn)生。以上列出了一些常見(jiàn)的方法，但是還可能的是，從獨(dú)立的部件制得所述結(jié)構(gòu)，其在例如基柱形成之后在適合的基底上進(jìn)行組裝。
要理解的是，轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域可以不必物理上不同于加載區(qū)域和/或LDI檢測(cè)區(qū)域。因而，轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域的隆起結(jié)構(gòu)可以已經(jīng)存在于加載區(qū)域中，并且它們也可以延伸到LDI檢測(cè)區(qū)域中。
上文已經(jīng)闡述的是，轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域的隆起結(jié)構(gòu)的形狀、尺寸和隆起結(jié)構(gòu)之間的間隔的選擇不僅通過(guò)提供樣品的毛細(xì)力介導(dǎo)的流動(dòng)可對(duì)流動(dòng)方向有影響，而且可對(duì)施加到加載區(qū)域的液體樣品的分離有影響。
現(xiàn)在將更洋細(xì)地說(shuō)明通過(guò)分離區(qū)域可以^L用f分離液體樣品內(nèi)的被分析物的原理。
分離區(qū)域涉及沿著液體樣品的流動(dòng)路徑的所述設(shè)備的區(qū)域，其中實(shí)現(xiàn)至少一種被分析物從樣品的其他成分中的分離。
為此，分離區(qū)域可以鄰近于加載區(qū)域、轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域和/或LDH企測(cè)區(qū)域設(shè)置和/或處于加載區(qū)域、轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域和/或LDI檢測(cè)區(qū)域中。
從加載區(qū)域穿過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域到LDI沖全測(cè)區(qū)域的液體樣品的全部流動(dòng)路徑因而可以由如上所述的隆起結(jié)構(gòu)形成，并通過(guò)隆起結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)同時(shí)可以是整個(gè)分離區(qū)域。
然而，分離區(qū)域也可以僅位于(部分)加載區(qū)域中，它可以僅位于(部
分)LDI檢測(cè)區(qū)域中，或者它可以僅位于(部分)分離區(qū)域中。
在又一個(gè)實(shí)施方式中，可以存在沿著轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域的各種分離區(qū)域，分離區(qū)域的布置的進(jìn)一步的組合對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員將是顯而易見(jiàn)的，
特別是鑒于以下描述的優(yōu)選的實(shí)施方式。
分離區(qū)域可以通過(guò)物理、化學(xué)或生物學(xué)功能性來(lái)提供被分析物從所述液體樣品的其他成分中的分離。
通過(guò)物理功能性的分離已經(jīng)在前文在轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域設(shè)計(jì)的上下文中部分地描述。因而，提供從加載區(qū)域到LDI檢測(cè)區(qū)域的液體樣品的毛細(xì)力驅(qū)動(dòng)的流動(dòng)的隆起結(jié)構(gòu)也可以用于從樣品分離^皮分析物，通過(guò)例如過(guò)濾和駐留樣品的相對(duì)大的顆粒物質(zhì)。這可以通過(guò)隆起結(jié)構(gòu)的合適的形狀、尺寸和隆起結(jié)構(gòu)之間間隔的選擇來(lái)實(shí)現(xiàn)。
例如，液體樣品的顆粒物質(zhì)的屏障可以由結(jié)構(gòu)之間的間隔阻止顆粒物質(zhì)沿著設(shè)備的轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域轉(zhuǎn)運(yùn)的隆起結(jié)構(gòu)組成。因而，紅細(xì)胞從全血中的柔和的分離，即，分離紅細(xì)胞而沒(méi)有所述細(xì)胞的顯著破裂，可以用基柱樣結(jié)構(gòu)的梯度來(lái)實(shí)現(xiàn)，其中在分離區(qū)域的長(zhǎng)度上基柱間隔從約7 pm降低到約llLim。其他顆粒物質(zhì)包括但不限于細(xì)胞、血小板、巨噬細(xì)胞、細(xì)菌、病毒顆粒和勻^1的固體組織。
這還使得以下變得清楚分離區(qū)域例如可以已經(jīng)以之前描述的隆起結(jié)構(gòu)的形式緊挨著加載區(qū)域或位于加載區(qū)域中，從而液體樣品的顆粒物質(zhì)進(jìn)入流動(dòng)路徑或更遠(yuǎn)下游(further downstream)的其他分離區(qū)域的任何穿透都^皮阻止。
術(shù)語(yǔ)"物理功能性，，因而包括涉及除主賣(mài)是化學(xué)或生物學(xué)的那些之外的反應(yīng)和相互作用的功能性。實(shí)例是具有不同形狀、尺寸、間隔、表面構(gòu)形、表面密度，即每單位面積隆起結(jié)構(gòu)的數(shù)量、所述隆起結(jié)構(gòu)的表面的濕潤(rùn)行為或它們的組合的前述的隆起結(jié)構(gòu)，以及影響樣品成分的流動(dòng)、滯留、粘附或排斥的其他功能性。因而，分離區(qū)域可以由電極制得，以分離帶電的樣品成分。
上文已經(jīng)提及的是，根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備的轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域可以提供具有例如不同流動(dòng)速度的不同的流動(dòng)路徑。當(dāng)然，由于具有不同流動(dòng)速度的不同流動(dòng)路徑可以通過(guò)不同形狀、尺寸和隆起結(jié)構(gòu)之間間隔的隆起結(jié)構(gòu)實(shí) 現(xiàn)，所以這樣的不同流動(dòng)路徑對(duì)特定液體樣品也將具有不同的分離特 征。因而通過(guò)在單個(gè)設(shè)備中設(shè)計(jì)都源于同一加載區(qū)域的、隆起結(jié)構(gòu)具有 不同形狀、尺寸和/或間隔的流動(dòng)路徑，可以在單個(gè)設(shè)備上從單個(gè)樣品平 行地進(jìn)行許多分離方法(多通道化)。
還可以利用化學(xué)功能性實(shí)現(xiàn)從樣品的其他成分中分離被分析物。術(shù) 語(yǔ)"化學(xué)功能性"包括用于實(shí)施或促進(jìn)被分析物從液體樣品的分離所需 要的任何化學(xué)化合物或部分?？梢杂糜谠撃康牡囊唤M化學(xué)化合物是例如 涂層，其展現(xiàn)出與樣品中 一種或多種成分結(jié)合或相互作用的 一定的特異 性親和力或能力。這些成分可以例如是疏水性涂層，其可以從脂肪族烴，
特別是Crds脂肪族烴或包含例如官能團(tuán)如苯基的芳香族烴來(lái)制得。這
的相互作用有用的其他材料包括親硫的相互作用吸收，如可從Pierce, Rockford， Illinois獲得的T-GEL 。其他的化學(xué)功能性包括親水性的涂 層，例如金屬氧化物如二氧化鈦，氧化硅，親水聚合物如葡聚糖，線形 或支化脂肪族聚合物，聚乙二醇，瓊脂糖，纖維素，肝素，聚-L-賴氨酸 (poly-L-lysin)和它們的衍生物，環(huán)氧化物，洗滌劑，生物物質(zhì)如聚合物， 碳水化合物，大分子或它們的組合，等等。聚合物可以被衍生化來(lái)實(shí)現(xiàn) 高密度的例如羧基、銨或IMAC基團(tuán)。
分離區(qū)域還可以在功能化之前被給予親水性處理，例如，通過(guò)使基 底經(jīng)歷氧化處理，例如，氣體等離子處理(gas plasma treatment)。
化學(xué)功能性還包括例如用分子部分覆蓋轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域、加載區(qū)域和/或 LDI檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的隆起結(jié)構(gòu)，其中所述分子部分容許基于它們的電荷分 離液體樣品的某些成分。類似地，這種化學(xué)功能性可以沿著樣品的流動(dòng)
路徑沉積在不包含隆起結(jié)構(gòu)的基底區(qū)域上。在這種情況下，必需確保的 是，該部分不具有損害通向下一個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)/分離區(qū)域的毛細(xì)管驅(qū)動(dòng)的流動(dòng)的 尺寸。
因而，在一個(gè)實(shí)施方式中，人們可以用一般用于陽(yáng)離子或陰離子交 換層析的樹(shù)脂涂覆轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域的一部分的隆起結(jié)構(gòu)。類似地，人們可以用 通常用于疏水性相互作用層析的樹(shù)脂涂覆轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域、加載區(qū)域和/或LDI 檢測(cè)區(qū)域的隆起結(jié)構(gòu)的某些部分。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟悉這樣的樹(shù)脂，并將能夠根據(jù)需要選擇所需的化學(xué)分離原理。陰離子交換基質(zhì)包括仲胺、叔胺或季胺的基質(zhì)。人們還
可以使用常見(jiàn)的陰離子層析樹(shù)脂的分子實(shí)體(molecular entities),例如可從 Amersham獲得的Q-Sepharose、 DEAE-Sepharose。在這種情況下相關(guān)的 部分是季胺。在陽(yáng)離子交換層析的情況下，人們可以使用吸收材料，例 如硫酸根陰離子的基質(zhì)、羧酸根陰離子或磷酸根陰離子的基質(zhì)。
其他的化學(xué)功能性包括一般用于固定的金屬親和捕獲(immobilized metal affinity capture, IMAC )的配位共價(jià)相互作用吸收材4牛。在這方面， 人們可以考慮在分離區(qū)域中使用基于次氮基三乙酸的表面。其他的化學(xué) 修飾對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言將是清楚的。
下面，將針對(duì)從血液分離紅細(xì)胞來(lái)討論分離區(qū)域的化學(xué)功能性，這 構(gòu)成了本發(fā)明的優(yōu)選的應(yīng)用之一。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解這些 原理也適用于其他樣品。
在本發(fā)明中具有特別的相關(guān)性的 一組化學(xué)化合物是展現(xiàn)出對(duì)血液 樣品中的一種或多種成分的特異性親和力、或與血液樣品中的一種或多 種成分結(jié)合或相互作用的能力的化合物或成分。
紅細(xì)胞分離試劑構(gòu)成了 一個(gè)說(shuō)明性的實(shí)例。這樣的試劑可以是能夠 聚集或結(jié)合紅細(xì)胞的任何物質(zhì)，例如凝集素。優(yōu)選的試劑是帶正電的材 料，例如聚陽(yáng)離子，包括，例如，聚-L-賴氨酸氫溴酸鹽；聚(二曱基 二烯丙基銨)氯化物(MerquatTM-100、 Merquat TM 280、 Merquat TM 550 );聚-L-精氨酸鹽酸鹽；聚-L-組氨酸；聚(4-乙烯基吡啶)， 聚(4-乙烯基吡啶)鹽酸鹽；交聯(lián)的聚(4-乙烯基吡口定)甲基氯化物季 鹽；聚(4-乙烯基吡啶-共聚-苯乙烯)；聚(4-乙烯基吡啶鏡聚(氟化氫))； 聚(4-乙烯基吡啶像-P-曱苯磺酸鹽)；聚(4-乙烯基镥吡啶-三溴化物)； 聚(4-乙烯基吡咯烷酮-共聚曱基丙烯酸2-二甲氨基乙酯)；聚乙烯吡咯 烷酮，交聯(lián)的聚乙烯吡咯烷酮，聚(三聚氰胺-共聚-曱醛)；部分曱基 化的海美溴銨；聚(Glu, Lys) 1: 4氫溴酸鹽；聚(Lys, Ala) 3: l氫 溴酸鹽；聚(Lys， Ala) 2: 1氬溴酸鹽；琥珀?；木?L -賴氨酸；聚 (Lys, Ala) 1: 1氫溴酸鹽；和聚(Lys， Trp) 1: 4氬溴酸鹽。在這方 面最優(yōu)選的聚陽(yáng)離子材料之一是聚(二甲基二烯丙基銨)氯化物 (Merquat TM-100)。
所述紅細(xì)胞分離試劑可以在分離區(qū)域中以任何適合的數(shù)量使用。取 決于分離區(qū)域的設(shè)計(jì)，因而它可以涂覆在上述的隆起結(jié)構(gòu)上或平面基底上。
因而，通過(guò)選擇轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域的隆起結(jié)構(gòu)的特定形狀、尺寸和隆起結(jié)構(gòu) 之間間隔的組合并對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域的地區(qū)施加化學(xué)功能性，例如可以將樣品 流動(dòng)精細(xì)調(diào)整到某個(gè)方向，和同時(shí)實(shí)現(xiàn)某些被分析物的分離以及樣品的 某些成分的去除。舉例來(lái)說(shuō)，樣品流動(dòng)可以通過(guò)精細(xì)調(diào)節(jié)直徑、高度、 形狀、橫截面、間隔、表面構(gòu)形、表面花紋和每單位面積的隆起結(jié)構(gòu)的 數(shù)量來(lái)調(diào)整。此外，隆起結(jié)構(gòu)可以被表面涂覆來(lái)確保隆起結(jié)構(gòu)表面的一 定的濕潤(rùn)4亍為。
此外，轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域的另 一個(gè)部分或整個(gè)設(shè)備可以用親水性的涂層來(lái)涂 覆，通過(guò)例如使隆起結(jié)構(gòu)的這一部分經(jīng)受氧化處理，即氣體等離子處理 來(lái)進(jìn)行。它還可以用親水物質(zhì)例如氧化硅，或親水聚合物例如葡聚糖、 聚乙二醇、肝素和它們的衍生物、洗滌劑等等來(lái)涂覆。利用這樣的特定 組合，人們將能夠同時(shí)將流動(dòng)導(dǎo)入某個(gè)方向以及從樣品中分離某些成 分。
如果額外地通過(guò)例如在流動(dòng)路徑之間包括分隔壁或無(wú)基柱區(qū)域來(lái) 在設(shè)備的轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域內(nèi)提供不同的流動(dòng)路徑，以及如果用不同的化學(xué)功能 性涂覆所述流動(dòng)路徑，同 一樣品的不同性質(zhì)的多通道分析將是可能的。
作為對(duì)物理和/或化學(xué)官能性的替換選擇或除物理和/或化學(xué)官能性 外，分離區(qū)域可以以生物學(xué)功能性為特征。
術(shù)語(yǔ)"生物學(xué)功能性"包括樣品中的成分和分離區(qū)域之上和/或之中 的試劑之間的所有生物學(xué)相互作用，例如催化、結(jié)合、
internationalization、活化或其他生物特異性結(jié)合相互作用?？梢杂糜谏?物學(xué)功能性的適合的典型試劑包括但不限于抗體、抗體片段和其衍生 物、單鏈抗體、蛋白A、蛋白G、抗生蛋白鏈菌素、碳水化合物、凝集 素、DNA、 RNA、適體、修飾的核酸、受體、配體、小分子抑制物，等等。
舉例來(lái)說(shuō)，轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域、加載區(qū)域和/或LDI檢測(cè)區(qū)域的隆起結(jié)構(gòu)或基 底的平面區(qū)域可以被修飾以攜帶在多克隆抗體、單克隆抗體、氨基酸、 核酸、碳水化合物、羧基部分(carboxylic moieties)等等中選擇的分子。 凝集素的一個(gè)實(shí)例是伴刀豆球蛋白A，其可以用于結(jié)合樣品中的糖蛋白。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員當(dāng)然還知道，可以在轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域、加載區(qū)域和/或 LDI檢測(cè)區(qū)域的不同地區(qū)內(nèi)使用不同的分離技術(shù)。因而，轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域的隆起結(jié)構(gòu)可以例如在 一個(gè)區(qū)域中被布置為它們?nèi)缟纤鐾ㄟ^(guò)選擇隆起結(jié) 構(gòu)的合適的形狀、尺寸和隆起結(jié)構(gòu)之間的間隔來(lái)提供對(duì)例如紅細(xì)胞的過(guò) 濾功能。在第二區(qū)域中，轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域的隆起結(jié)構(gòu)可以被修飾以提供基于化
學(xué)功能性的分離區(qū)域，通過(guò)例如用IMAC樹(shù)脂涂覆隆起結(jié)構(gòu)。在第三區(qū) 域中，轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域的隆起結(jié)構(gòu)可以用特異于目標(biāo)蛋白質(zhì)的抗體涂覆。
如果血液樣品被置于加載區(qū)域中，紅細(xì)胞將通過(guò)毛細(xì)力產(chǎn)生的側(cè)向 轉(zhuǎn)運(yùn)首先被濾出。在第二步驟中，對(duì)特異性IMAC樹(shù)脂具有親和力的成 分被保留，如果例如已知它們對(duì)于進(jìn)一步的分析是有害的。在以后的步 驟中，然后可以通過(guò)抗體固定蛋白質(zhì)。如果如以下將顯示的那樣，LDI 檢測(cè)區(qū)域也將存在于該分離區(qū)域中，則人們可以檢測(cè)結(jié)合到所述抗體的 蛋白質(zhì)的存在和/或數(shù)量，而無(wú)需液體樣品處理期間的任何重要操作步 驟。
因而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將清楚地知道，不同的分離原理例如疏水 性涂層、親水性涂層、離子交換涂層、或例如IMAC的原理、生物學(xué)功 能性如核酸探針、抗體、受體等，可以在轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域、加載區(qū)域和/或LDI 檢測(cè)區(qū)域的不同地區(qū)內(nèi)被組合，來(lái)確保無(wú)任何外部影響液體樣品的顯著 的分離。
液體樣品通過(guò)不同的分離區(qū)域的運(yùn)動(dòng)將由毛細(xì)力提供，所述毛細(xì)力 通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域的隆起結(jié)構(gòu)的大小、尺寸和隆起結(jié)構(gòu)之間的間隔來(lái)產(chǎn)生。 如上所述，設(shè)想的是，單個(gè)設(shè)備可以包含轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域的不同的泳道(lanes), 其由例如壁來(lái)分隔。每個(gè)泳道可以含有具有不同分離原理的流動(dòng)路徑。 因而，所述不同的泳道將容許同一液體樣品的多通道分析，而不需要添 加洗滌緩沖液或自動(dòng)化吸移設(shè)備。如果每個(gè)泳道進(jìn)一步包含不同的分離 原理，則多通道分析的程度甚至可以進(jìn)一步提高。任選地，所述設(shè)備可 以謬皮設(shè)計(jì)用于并經(jīng)歷樣品添加之后的緩沖液添加或類似的洗滌步驟。
^^,^ ^庠檢*且鍵
如上所述，本發(fā)明的設(shè)備的一個(gè)特征是它們包含用于通過(guò)激光解吸 電離檢測(cè)的至少一個(gè)區(qū)域。為了確保通過(guò)基于激光解吸電離的機(jī)制如質(zhì) 譜法來(lái)檢測(cè)被分析物，需要樣點(diǎn)(spot)是本領(lǐng)域的技術(shù)人員公知的。
用于LDI檢測(cè)的區(qū)域包括至少一種金屬和/或能夠在基質(zhì)輔助的激 光解吸電離質(zhì)譜法(MALDI-MS)中用作基質(zhì)材料的至少一種能量吸收 分子(EAM)和/或至少一種校準(zhǔn)物。
24因而本領(lǐng)域的技術(shù)人員將清楚地知道，質(zhì)譜儀分析中的品質(zhì)可以通
過(guò)利用包含金屬成分如金和/或銀的LDI檢測(cè)樣點(diǎn)來(lái)提高。其他適合的金 屬或合金包括鉑、釔、鉻、鈦和銅，具有例如鉻和/或鈦的粘附層。
這些金屬可以通過(guò)在轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域的隆起結(jié)構(gòu)上或在基底的平面區(qū)域 上'踐射金屬例如金來(lái)沉積在LDI檢測(cè)區(qū)域中。因而，如同分離區(qū)域，LDI 才全測(cè)區(qū)域可以鄰近于轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域和/或位于轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域中，并且它可以與 一個(gè) 或多個(gè)分離區(qū)域重合，意味著LDI檢測(cè)區(qū)域也可以包含前述類型的隆起 結(jié)構(gòu)。
金屬將容許質(zhì)譜儀分析中解吸/電離期間的電荷轉(zhuǎn)移，因而將改善整 個(gè)分析的品質(zhì)。
對(duì)于在LDI檢測(cè)區(qū)域中使用金屬，另外地或作為選擇，LDI檢測(cè)區(qū) 域的特征在于適合于與基質(zhì)相關(guān)的激光解吸電離質(zhì)譜法(MALDI-MS ) 的能量吸收分子的存在。
因而，LDI ;險(xiǎn)測(cè)區(qū)域的至少部分可以;故制備為具有附著的 MALDI-MS基質(zhì)物質(zhì)。這樣的基質(zhì)物質(zhì)包括，例如，a-氰基-4-羥基肉桂 酸(CHCA) 、 3,5-二曱氧基-4-羥基肉桂酸(SPA)或2, 5-二羥基苯曱 酸(DHB)。其他基質(zhì)物質(zhì)可以是4-羥基吡啶曱酸、酒石酸或甘油。
這些基質(zhì)材料可以通過(guò)常見(jiàn)的技術(shù)沉積在LDI樣點(diǎn)中。本領(lǐng)域的技 術(shù)人員非常熟悉這樣的技術(shù)，并且也知道可以用于MALDI基質(zhì)目的的 其他聚合材料。在這方面參考US 2003/0207460 Al,其作為EAM基質(zhì) 材料提及了許多單體和聚合物，其特別適合于在要被檢測(cè)的被分析物在 基質(zhì)中共結(jié)晶之前沉積在LDI檢測(cè)區(qū)域中。例如，在特定樣點(diǎn)中在沉積 被分析物之前，01-氰基-4-甲基丙烯酰氧基-肉桂酸和曱基丙烯酸十八烷基 酯的共聚合本發(fā)明的情況中是一種合適的基質(zhì)材料。進(jìn)一 步的實(shí)例對(duì)于 本領(lǐng)域的技術(shù)人員將是顯而易見(jiàn)的。某些實(shí)例是苯曱酸、肉桂酸和相關(guān) 的芳香化合物的衍生物，例如，2,5-二羥基苯曱酸(2,5-DHB或龍膽酸)、 a—氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA) 、 3,5-二曱氧基-4-羥基肉桂酸(芥子酸， 芥子酸或SPA)、煙酸、吡啶曱酸、反式-3-曱氧基-4-羥基肉桂酸(阿魏 酸)、2- (4-羥基苯基偶氮)-苯曱酸(HABA) 、 6-氮雜-2-硫代胸腺嘧 啶(6-aza-2-thiothymine， ATT) 、 3-HPA、 丁二酸、甘油、2,4,6-三羥基苯 乙酮、3-羥基吡啶甲酸、3-氨基喹啉、1,8,9-三羥基-蒽(蒽三酚)、激光 染料香豆素120、取代的嘧啶、吡啶和苯胺，例如對(duì)硝基苯胺。所述基質(zhì)材料可以共價(jià)地或非共價(jià)地附著到基底和/或可在LDI檢
測(cè)區(qū)域內(nèi)存在的隆起結(jié)構(gòu)上。
在一個(gè)可選擇的實(shí)施方式中，所述LDI檢測(cè)區(qū)域由校準(zhǔn)物，即校準(zhǔn) 標(biāo)準(zhǔn)物的存在來(lái)限定。 一般地，人們可以使用適合作為MALDI-MS中 的參考和校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)物的任何類型的分子。以下給出了生物學(xué)校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)物 的具體實(shí)例。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，LDI檢測(cè)區(qū)域可以另外具有校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)物， 所述校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)物已經(jīng)與基質(zhì)材料一起(或沒(méi)有基質(zhì)材料)沉積在特定地 區(qū)中。因而，人們可以將校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)物沉積在LDI檢測(cè)區(qū)域中。這可以是 共價(jià)的或非共價(jià)的附著。如果被分析物到達(dá)LDI檢測(cè)區(qū)域和如果進(jìn)行 MALDI,校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)物將與被分析物一起^皮電離和解吸，從而被分析物譜 的分析將可以基于已知的校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)物的譜。做為選擇，可以存在獨(dú)立的 LDI區(qū)域，不鄰近轉(zhuǎn)運(yùn)或分離區(qū)域，具有附著的一種或多種校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)物。 然后從具有樣品組分的LDI區(qū)域以及從具有一種或多種校準(zhǔn)物的LDI 區(qū)域進(jìn)行LDI?？梢允褂玫牡湫偷男?zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)物在以下的表1中描述
表1: 4交準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)物
上文已經(jīng)提及，在具有隆起結(jié)構(gòu)的區(qū)域中對(duì)樣品流動(dòng)的精確控制可 以通過(guò)調(diào)整隆起結(jié)構(gòu)的形狀、尺寸和隆起結(jié)構(gòu)之間的間隔以及例如表面 修飾來(lái)實(shí)現(xiàn)。通過(guò)精細(xì)調(diào)整具有隆起結(jié)構(gòu)的這種區(qū)域中樣品的流動(dòng)速 度，也可以控制LDI檢測(cè)區(qū)域中的結(jié)晶速率。
從上文描述顯而易見(jiàn)的是，本領(lǐng)域的技術(shù)人員清楚地知道，LDI檢 測(cè)區(qū)域可以鄰近于轉(zhuǎn)運(yùn)和/或分離區(qū)域和/或位于轉(zhuǎn)運(yùn)和/或分離區(qū)域中。
如果例如抗體沉積在轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域的一部分的隆起結(jié)構(gòu)上并從而產(chǎn)生 分離區(qū)域，則這種抗體可以具有把要通過(guò)質(zhì)譜法分析的成分捕捉出來(lái)的 功能，即，該抗體分離區(qū)域也是LDI檢測(cè)區(qū)域。做為選擇，所述抗體可 以具有把分析之前要除去的成分捕捉出來(lái)的功能，在該后一種情況中， 分離區(qū)域可以不與LDI檢測(cè)區(qū)域重合，LDI檢測(cè)區(qū)域于是將位于抗體分 離區(qū)域的下游。
例如，在基于MS的診斷領(lǐng)域中某些臨床研究在MS分析之前作為 樣品制備的一部分除去白蛋白，因?yàn)樗宰銐蚋叩臐舛却嬖谟谘逯衼?lái) 主宰質(zhì)鐠，而其他的則捕獲白蛋白并進(jìn)行MS,因?yàn)榘椎鞍自谄渥陨砩?帶有與診斷相關(guān)的肽。對(duì)于在LDI檢測(cè)區(qū)域中金屬成分和/或MALDI基質(zhì)成分的前述用 途，存在可行的不同的組合和變體。因而，在一個(gè)示范性的過(guò)程中，人 們從將薄的金層濺射到轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域的隆起結(jié)構(gòu)以產(chǎn)生LDI檢測(cè)區(qū)域開(kāi)始。 隨后，具有官能團(tuán)的烷烴硫醇化合物被容許在表面上形成自組裝的單分 子層(monolayer)。所述官能團(tuán)然后用于與例如葡聚糖或聚乙二醇的進(jìn)一 步化學(xué)修飾。這種修飾產(chǎn)生了基于金屬的LDI檢測(cè)樣點(diǎn)以及用于某些樣 品成分的化學(xué)功能性。
除將薄金層濺射在隆起結(jié)構(gòu)上以產(chǎn)生LDI檢測(cè)區(qū)域之外或在將薄金 層濺射在隆起結(jié)構(gòu)上以產(chǎn)生LDI檢測(cè)區(qū)域之后，人們可以如上所述制備 MALDI基質(zhì)物質(zhì)的薄膜。做為選擇，LDI檢測(cè)區(qū)域通過(guò)僅沉積MALDI 基質(zhì)來(lái)產(chǎn)生。隨后，具有官能團(tuán)的烷烴硫醇化合物被容許在表面上形成 自組裝的單分子層。所述官能團(tuán)然后用于與例如葡聚糖或聚乙二醇的進(jìn) 一步化學(xué)修飾。
因而本發(fā)明的特征在于提供設(shè)備，其在基底上含有用于液體樣品的 至少一個(gè)加載區(qū)域、至少一個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域和至少一個(gè)LDI4全測(cè)區(qū)域。液體 樣品通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域從加載區(qū)域到LDI檢測(cè)區(qū)域的流動(dòng)由隆起結(jié)構(gòu)介導(dǎo) (mediated),所述隆起結(jié)構(gòu)具有一定形狀、尺寸和隆起結(jié)構(gòu)之間的間隔 以確〗呆液體樣品的毛細(xì)力驅(qū)動(dòng)的#皮動(dòng)流動(dòng)。流動(dòng)速度和流動(dòng)方向可以通 過(guò)修改隆起結(jié)構(gòu)的形狀、尺寸和/或隆起結(jié)構(gòu)之間的間隔來(lái)選擇。
此外，根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備包括分離區(qū)域，其可以依靠物理的、化學(xué) 的和生物學(xué)的功能性來(lái)實(shí)現(xiàn)液體樣品內(nèi)獨(dú)特的被分析物的分離或液體 樣品內(nèi)某些成分的去除。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將知道化學(xué)、生物學(xué)和物理 功能性之間的區(qū)別并不總是可能的，相互作用例如樣品中的成分和基底 上的試劑之間的相互作用可以同時(shí)涉及化學(xué)、物理和生物學(xué)元素。盡管 如此，物理功能性將主要地同樣由可在轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域、加載區(qū)域和/或LDI 檢測(cè)區(qū)域中發(fā)現(xiàn)的隆起結(jié)構(gòu)的形狀、尺寸和/或隆起結(jié)構(gòu)之間的間隔來(lái)介 導(dǎo)。因而隆起結(jié)構(gòu)的參數(shù)將形成物理約束，例如過(guò)濾屏障或柵欄，其可 以從液體樣品中除去例如顆粒物質(zhì)。化學(xué)和生物學(xué)功能性涉及在任何加 載區(qū)域、轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域和/或LDI檢測(cè)區(qū)域中隆起結(jié)構(gòu)的修飾、或不包含這種 隆起結(jié)構(gòu)的任何加載區(qū)域、轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域和/或LDI檢測(cè)區(qū)域的部分的修飾， 以容許期望的被分析物的分離或樣品的不希望的其他成分的去除。當(dāng)
然，人們可以使用物理、生物學(xué)和化學(xué)功能性的不同的組合，從而產(chǎn)生容許施加 一個(gè)單一樣品和隨后對(duì)其進(jìn)行多通道分析的設(shè)備。 在下文中，將更詳細(xì)地描述一些優(yōu)選的實(shí)施方式。
附圖3描繪了本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式。它由也可以稱作樣品施加區(qū) 域的加載區(qū)域組成。這個(gè)樣品施加區(qū)域與轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域緊密接觸，該轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū) 域由具有被設(shè)計(jì)以確保樣品的毛細(xì)管轉(zhuǎn)運(yùn)的基柱的基柱區(qū)域組成。所述 基柱在附圖3中被示意性地描繪。
測(cè)區(qū)域。這個(gè)LDI檢測(cè)區(qū)域可以包含與轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域相同的基柱樣結(jié)構(gòu)、具 有更短的基柱樣結(jié)構(gòu)，或可以是基本上平面的。LDI檢測(cè)區(qū)域可以是金 屬涂覆的，和/或它可以具有結(jié)合到其表面的MALDI基質(zhì)，具有或者沒(méi) 有校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)物。此外，該設(shè)備可以包括標(biāo)識(shí)碼(ID碼)用于樣品跟蹤目 的。
如果液體樣品;故施加到加載區(qū)域，液體樣品將通過(guò)毛細(xì)管作用祐j皮 動(dòng)地轉(zhuǎn)運(yùn)到LDI檢測(cè)區(qū)域。 一旦它到達(dá)LDI檢測(cè)區(qū)域，樣品可以-故容許 進(jìn)行蒸發(fā)，并因而與已經(jīng)例如沉積在LDI檢測(cè)區(qū)域中的基質(zhì)材料共結(jié)晶， 然后整個(gè)設(shè)備可浮皮插入MALDI質(zhì)譜儀中。
取決于基柱樣結(jié)構(gòu)的大小、形狀、尺寸和基柱樣結(jié)構(gòu)之間的間隔以 及樣品的性質(zhì)，轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域本身可以已經(jīng)通過(guò)滯留顆粒物質(zhì)或更大的結(jié)構(gòu) 來(lái)容許分離，例如在樣品是血液的情況下的紅細(xì)胞。
附圖4顯示了本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方式。與附圖3中描繪的 設(shè)備相比，轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域被分成五個(gè)不同的子區(qū)域，其可以由薄壁或無(wú)基柱 區(qū)域來(lái)分隔，阻止液體從一個(gè)泳道溢流到另 一個(gè)泳道。每個(gè)泳道可以包 含具有不同形狀、長(zhǎng)度、寬度和高度以及結(jié)構(gòu)間的不同間隔的隆起結(jié)構(gòu)。 因而，各泳道可以具有不同的流動(dòng)速度。當(dāng)然，由于不同的隆起結(jié)構(gòu)的 不同密度，這樣的泳道還將提供五個(gè)不同的分離區(qū)域，其可以用于從液 體樣品中濾出不同尺寸的顆粒。
除不同的形狀、尺寸和隆起結(jié)構(gòu)之間的間隔之外，所述泳道可以另 外通過(guò)如上所述的化學(xué)和/或生物學(xué)修飾來(lái)功能化。這樣，所述設(shè)備容許 才艮據(jù)不同的原理平行地分離液體樣品。當(dāng)液體樣品;故添加到相同的加載 區(qū)域，液體可以直接透入五個(gè)不同的泳道，不需要自動(dòng)化的吸移裝置。
而不需要使用例如洗滌緩沖液ii。 、5 、'、 '、''在附圖5中顯示了又一個(gè)實(shí)施方式。在此，分離區(qū)域位于轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域 中，非常接近于LDI檢測(cè)區(qū)域。雖然轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域的隆起結(jié)構(gòu)元件當(dāng)然也可 以有助于液體試樣的物理分離，但是分離區(qū)域可以提供在轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域的不 同地區(qū)中的分離。因而，標(biāo)明的分離區(qū)域可以包括與轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域的其余部 分相比具有更高密度的隆起結(jié)構(gòu)，從而產(chǎn)生進(jìn)一步的過(guò)濾屏障。另外或 作為選擇，分離區(qū)域可以用例如陰離子樹(shù)脂或抗體來(lái)涂覆。取決于分離 區(qū)域的功能性，某些類型的分子可以被保持在分離區(qū)域內(nèi)。如果例如分 離區(qū)域包含強(qiáng)陰離子交換樹(shù)脂，液體樣品的帶正電的多肽可以穿透進(jìn)一 步到達(dá)LDI檢測(cè)區(qū)域。在本發(fā)明的這個(gè)實(shí)施方式中，帶負(fù)電的蛋白質(zhì)的 不需要的物種因而將被保留在分離區(qū)域內(nèi)。另一方面，如果目的是檢測(cè) 液體樣品中帶負(fù)電的蛋白質(zhì)，則LDI檢測(cè)區(qū)域可以移到分離區(qū)域內(nèi)，或
反之亦然。
附圖6顯示了附圖4和附圖5的組合。因而，所述設(shè)備包括多個(gè)流 動(dòng)路徑，取決于它們的功能性的類型其可以提供不同的物理分離屏障并 另外提供用于化學(xué)或生物學(xué)相互作用的親和表面。
附圖7是本發(fā)明的的又一個(gè)實(shí)施方式，附圖8也一樣，兩者都描繪 了前述原理的進(jìn)一步的細(xì)節(jié)。因而，同樣，液體樣品通過(guò)隆起結(jié)構(gòu)提供 的毛細(xì)力沿著轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域被轉(zhuǎn)運(yùn)到LDI檢測(cè)區(qū)域。轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域可以包含不同 原理的分離區(qū)域，例如，聚合物涂層或抗體涂層。取決于要檢測(cè)的被分 析物是保持在分離區(qū)域中還是通過(guò)分離區(qū)域，LDI檢測(cè)區(qū)域可以與分離 區(qū)域重合，或它們可以位于分離區(qū)域的下游或上游。附圖8顯示了平行 分析如何通過(guò)引入不同的流動(dòng)路徑來(lái)進(jìn)一步增加。
要理解的是，前文描述的實(shí)例和附圖不被看作是限制性的。本領(lǐng)域 的技術(shù)人員明顯能夠想象對(duì)在此舉出的原理的進(jìn) 一 步的修改。
在另 一個(gè)方面中本發(fā)明還涉及用于測(cè)定樣品中至少 一種被分析物 的存在和/或數(shù)量的方法，包括步驟
a)提供用于分離液體樣品中至少一種被分析物的設(shè)備，其包含具有 以下的至少一個(gè)基底
-用于加載液體樣品的至少一個(gè)區(qū)域；
-用于轉(zhuǎn)運(yùn)所述液體樣品的至少一個(gè)區(qū)域；和
-用于從所述液體樣品的其他成分中分離所述至少一種被分析物的 至少一個(gè)區(qū)i^;
29其中所述至少 一個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域包括隆起結(jié)構(gòu)的陣列，所述隆起結(jié)構(gòu)具 有一定形狀、尺寸和所述隆起結(jié)構(gòu)之間的間隔，乂人而實(shí)現(xiàn)了/人所述加載
區(qū)域通過(guò)所述分離區(qū)域的所述樣品的毛細(xì)力驅(qū)動(dòng)的流動(dòng)；
b) 將樣品加載到步驟a)的所述設(shè)備的加載區(qū)域上；
c) 利用a)的所述設(shè)備從所述樣品的其他成分中分離所述至少一種 被分析物；
d) 通過(guò)基于LDI的方法例如MALDI-MS測(cè)定所述至少一種^皮分析 物的存在和/或數(shù)量。
要理解的是，關(guān)于加載區(qū)域、轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域和分離區(qū)域的設(shè)計(jì)的前述原 理同樣地應(yīng)用于測(cè)定樣品中被分析物的存在和/或數(shù)量的方法中所用的 設(shè)備。
還要理解的是，如果設(shè)備的一種實(shí)施方式是優(yōu)選的，則當(dāng)設(shè)備在測(cè) 定樣品中至少一種被分析物的存在和/或數(shù)量的方法中使用時(shí)，這還應(yīng)用 于所述設(shè)備。
因而，所述轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域同樣可以特征在于，使用具有一定形狀、尺寸 和隆起結(jié)構(gòu)之間的間隔的隆起結(jié)構(gòu)以確保從加載區(qū)域進(jìn)入特定方向的 樣品的毛細(xì)力驅(qū)動(dòng)的流動(dòng)^皮動(dòng)地發(fā)生。
然而，對(duì)于測(cè)定樣品中被分析物的存在和/或數(shù)量的目的，在LDI 檢測(cè)區(qū)域包含金屬成分和/或適合于MALDI-MS的EAM分子和/或4交準(zhǔn) 物的意義上，所述設(shè)備不必必須包含指定的預(yù)先建立的LDI檢測(cè)區(qū)域。 因而，所述設(shè)備可以:故原樣插入質(zhì)譜儀中以進(jìn)行分析。
因而人們可以使用如上所述的沒(méi)有指定的預(yù)先建立的LDI檢測(cè)區(qū)域 的設(shè)備，并將液體樣品施加到該設(shè)備。液體樣品然后將通過(guò)隆起結(jié)構(gòu)產(chǎn) 生的毛細(xì)力經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域被轉(zhuǎn)運(yùn)。
轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域本身將確保一定的流動(dòng)路徑并且同時(shí)鑒于隆起結(jié)構(gòu)的形 狀、尺寸和間隔可能已經(jīng)提供了物理分離。另外，如果所述隆起結(jié)構(gòu)或 基底的其他部分如上所述被化學(xué)地或生物學(xué)地功能化，則被分析物進(jìn)入 某些方向的運(yùn)動(dòng)以及樣品分離的特異性可以被提高。
所述設(shè)備當(dāng)然還可以包括如上所述的分離區(qū)域，所述分離區(qū)域可以 鄰近于加載區(qū)域和/或轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域和/或位于加載區(qū)域和/或轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域中。如 上所述，分離區(qū)域可以完全地與加載和/或轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域重合，或可以僅形成 它們的部分。因而，分離區(qū)域也可以由前述的隆起結(jié)構(gòu)組成，此外它可以通過(guò)化 學(xué)或生物學(xué)修飾來(lái)功能化以提供不同的分離原理。
當(dāng)然，所述設(shè)備還可以提供各種分離原理的不同的流動(dòng)路徑以及不 同的分離區(qū)域，以允許針對(duì)不同的被分析物對(duì)同 一樣品進(jìn)行平行研究。
一旦樣品通過(guò)了加載、轉(zhuǎn)運(yùn)和分離區(qū)域，人們?nèi)缓罂梢詢?yōu)選地在感
興趣的位置添加基質(zhì)材料，其適合于MALDI-MS,并隨后將設(shè)備放入質(zhì) 譜儀中，用于樣品中被分析物的存在的定性和/或定量測(cè)定。
類似地，例如，人們可以將某些金屬例如金和銀濺射到感興趣的區(qū) 域中。本領(lǐng)域的技術(shù)人員當(dāng)然還會(huì)考慮同時(shí)使用金屬和適合于 MALDI-MS的基質(zhì)材料。
還可以設(shè)想以液體形式將MALDI-MS基質(zhì)材料添加到液體樣品中， 使它隨同樣品轉(zhuǎn)運(yùn)。隨后，所述設(shè)備可以進(jìn)行蒸發(fā)，然后可以在這些區(qū) 域中進(jìn)行MALDI-MS。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將清楚地知道，校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)物可 以如上所述地共同施用或預(yù)先施加。
雖然測(cè)定樣品中特定成分的存在和/或數(shù)量的方法可以使用不包含 預(yù)先建立的LDI檢測(cè)區(qū)域的設(shè)備來(lái)進(jìn)行，但是包含了這種預(yù)先建立的 LDI檢測(cè)區(qū)域的如上所述的設(shè)備的使用可以是優(yōu)選的。在這種情況下， 如上所述，LDI檢測(cè)區(qū)域?qū)饘俪煞趾?或適合于MALDI-MS的基 質(zhì)成分和/或一交準(zhǔn)物。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，多種試劑、緩沖液等等可以順序地添加 到流動(dòng)^各徑中。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及包含至少 一個(gè)基底的設(shè)備用于分離液體樣品中 至少一種纟皮分析物以及隨后通過(guò)MALDI-MS確定所述至少一種^皮分析 物的存在和/或數(shù)量的用途，所述基底具有
-用于加載液體樣品的至少一個(gè)區(qū)域；
-用于轉(zhuǎn)運(yùn)所述液體樣品的至少一個(gè)區(qū)域；和
-用于從所述液體樣品的其他成分中分離所述至少 一種被分析物的 至少一個(gè)區(qū);l或；
其中所述至少 一個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域包括隆起結(jié)構(gòu)的陣列，所述隆起結(jié)構(gòu)具 有一定形狀、尺寸和所述隆起結(jié)構(gòu)之間的間隔，從而實(shí)現(xiàn)了/人所述加載 區(qū)域通過(guò)所述分離區(qū)域的所述樣品的毛細(xì)力驅(qū)動(dòng)的流動(dòng)。
技術(shù)人員理解的是，關(guān)于加載區(qū)域、轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域、分離區(qū)域和預(yù)先建
31立的LDI檢測(cè)區(qū)域的設(shè)計(jì)，在設(shè)備的情況下已經(jīng)描述的所有上述修飾同 樣地適用。
本發(fā)明的設(shè)備和方法可以有利地用于例如體外診斷目的。 一些優(yōu)選 的實(shí)施方式涉及體液的生物標(biāo)志物的體外診斷分一斤，所述體液例如尿 液、血液、血漿、精液等等。然而如上所述的設(shè)備和方法也可以用于對(duì) 樣品例如環(huán)境樣品、廢水等等的其他診斷或分析目的。
因而，本發(fā)明在一個(gè)實(shí)施方式中涉及上文描述的設(shè)備和方法在體外 診斷方法情境中的用途，用于分離液體樣品的至少 一 種被分析物以及隨 后通過(guò)MALDI-MS確定所述至少一種被分析物的存在和/或數(shù)量。
針對(duì)該目的的診斷測(cè)定的實(shí)例包括但不限于疾病的檢測(cè)和分期。診 斷鑒定物可以是標(biāo)志物，幾種標(biāo)志物的組合，或例如蛋白質(zhì)組模式。潛 在感興趣的疾病包括各種癌癥(例如，前列腺、肺、結(jié)腸、乳腺、卵巢 癌、非小細(xì)胞癌、頭和頸部癌、'淋巴瘤等等)、心臟和神經(jīng)疾病，例如 多發(fā)性硬化、阿爾茨海默病和感染性疾病(infection disease)(例如感染 (sepsis))。利用本發(fā)明的方法和設(shè)備， 一種血液樣品可以一次篩查 多種不同的疾病狀態(tài)。
在這些測(cè)試的情境中，人們可以使用本發(fā)明的設(shè)備和方法來(lái)檢測(cè)常 見(jiàn)的疾病標(biāo)志物，例如胂瘤疾病(PSA、前列腺癌的端粒酶、卵巢癌的 CA-125)、慢性的代謝失調(diào)，例如血糖、血酮、尿糖(糖尿病)、血液 膽固醇(動(dòng)脈粥樣硬化、肥胖癥，等等)的標(biāo)志物；其他特定疾病的標(biāo) 志物，例如，急性病，如冠狀動(dòng)脈梗塞標(biāo)志物(例如，肌釣蛋白-T)、 甲狀腺功能的標(biāo)志物(例如，促曱狀腺激素(TSH)的測(cè)定)、細(xì)菌或 病毒感染的標(biāo)志物(感染vs. SIRS，特異性病毒抗體的^r測(cè))；等等。
診斷測(cè)定的另 一個(gè)重要的領(lǐng)域涉及妊娠和生育力，例如妊娠測(cè)試 (缺少人絨膜促性腺激素(hCG)的測(cè)定)、排卵測(cè)試(缺少促黃體生 成激素(LH)的測(cè)定)、生育力測(cè)試(缺少促卵泡激素(FSH)的測(cè)定) 等等。
與單一標(biāo)志物(如上文所列的那些)的檢測(cè)同樣重要的是特定疾病 或疾病階^歐區(qū)分性肽或蛋白質(zhì)才莫式的^r測(cè)和分析，如例如Adam等.
(Cancer Research( 2002 ), 62, 3609—3614 ) 、 Petricoin等.(Urol. Oncol.
(2004) , 22, 322-328)和Liotta等.(Nature (2003 ) , 425 )所描述 的那樣。這樣的模式可以用于各種疾病領(lǐng)域，例如上文列出的那些中的每文感的和選擇的診斷。
跟蹤治療(follow-uptherapy)是一個(gè)相關(guān)的應(yīng)用領(lǐng)域，包括，例如， 化學(xué)治療的劑量監(jiān)視、患者放射反應(yīng)、轉(zhuǎn)移行為(metastatic behavior)、 對(duì)感染的宿主反應(yīng)、心力衰竭和梗塞程度。
研究和開(kāi)發(fā)活動(dòng)，如蛋白質(zhì)組、蛋白質(zhì)組模式發(fā)現(xiàn)和分析、用于例 如成像或治療的生物標(biāo)志物或靶發(fā)現(xiàn)、以及藥物發(fā)現(xiàn)和開(kāi)發(fā)，形成了本 發(fā)明的其他感興趣的應(yīng)用領(lǐng)域。
另一個(gè)重要的領(lǐng)域是藥物測(cè)試的領(lǐng)域，用于容易和快速的檢測(cè)表明 藥物濫用的藥物和藥物代謝物；例如尿液樣品等等中的特定藥物和藥物 代謝物(例如，THC)的檢測(cè)。
特別優(yōu)選的是在體外診斷測(cè)試的情境中利用這樣的設(shè)備和方法，用 于測(cè)定前述的標(biāo)志物之一的存在和/或數(shù)量。
然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員也將清楚地知道，所述設(shè)備和方法也可以
用于大量其他應(yīng)用，例如檢測(cè)廢水或工業(yè)加工流體中的毒素。
例如如果要控制食物的質(zhì)量，樣品可以是來(lái)自牛奶的加工鏈的原材 料。樣品還可以是屠宰場(chǎng)的攪勻的肉，或磨粉廠的花。然后在根據(jù)本發(fā) 明的設(shè)備上和/或用根據(jù)本發(fā)明的方法利用MALDI-MS測(cè)量樣品的特 征。
在工業(yè)過(guò)程的情境中，需要考慮的是許多這樣的過(guò)程涉及要在數(shù)天 或數(shù)周的時(shí)期內(nèi)進(jìn)行監(jiān)測(cè)的復(fù)雜液體。這些過(guò)程包括啤酒釀造、通過(guò)發(fā) 酵和/或使用細(xì)胞培養(yǎng)物的重組精細(xì)藥物(recombinant fine pharmaceuticals) 的生產(chǎn)以及用于洗衣粉的酶的生產(chǎn)。同樣，這些過(guò)程的液體可以通過(guò)根 據(jù)本發(fā)明的設(shè)備和方法來(lái)控制。
以下將針對(duì)優(yōu)選的體外診斷測(cè)試應(yīng)用來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的 一些優(yōu)點(diǎn)。但 是本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解，這些優(yōu)點(diǎn)也適用于如上文所述的其他應(yīng) 用。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)之 一 是包含轉(zhuǎn)運(yùn)和分離區(qū)域并且容許 SELDI/MALDI-MS多通道化的設(shè)備的使用，其中所述轉(zhuǎn)運(yùn)和分離區(qū)域包 含前述的隆起結(jié)構(gòu)?，F(xiàn)有技術(shù)公開(kāi)了 SELDI在用于特定選擇條件的一個(gè) 層析表面上進(jìn)行。然而，本發(fā)明容許提高效率，不僅因?yàn)闃悠吠ㄟ^(guò)毛細(xì) 力在提供特異性的表面之上被牽引通過(guò)，還因?yàn)閱蝹€(gè)樣品制備物可以同 時(shí)地進(jìn)行許多層析方案，而基本上不需要單獨(dú)的樣品預(yù)處理或自動(dòng)化。這降低了樣品制備的變化性(variability),因?yàn)樾枰俚臉悠分苽?步驟。進(jìn)而，這種降低的樣品制備變化性提高了 SELDI/MALDI-MS測(cè) 量的特異性和精確性，就診斷應(yīng)用而言其是決定性因素之一。
然而，本發(fā)明還容許通過(guò)不同的分離原理提高 一個(gè)設(shè)備內(nèi)的多通道 分析的水平。因而，不僅通過(guò)在設(shè)備的轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域中包含超過(guò)一個(gè)流動(dòng)路 徑，而且通過(guò)在一個(gè)相同的流動(dòng)路徑中包含超過(guò)一個(gè)LDI區(qū)域，可以實(shí) 現(xiàn)多通道化。
舉例來(lái)說(shuō)，全血樣品可以用結(jié)合/停止紅細(xì)胞的分離區(qū)域來(lái)分離，并 且在更遠(yuǎn)下游用結(jié)合白蛋白的 一個(gè)分離區(qū)域分離。沿著這樣的流動(dòng)i 各徑 可以包含四個(gè)LDI檢測(cè)區(qū)域。 一個(gè)可以位于紅細(xì)胞結(jié)合/停止區(qū)域(用于 紅細(xì)胞的MALDI-MS分析)， 一個(gè)處在兩個(gè)分離區(qū)域之間， 一個(gè)處在 白蛋白分離區(qū)域中(用于與白蛋白相關(guān)的肽的MALDI-MS分析)，和 一個(gè)在白蛋白分離區(qū)域的下游，用于白蛋白耗盡的血漿的分析。
本發(fā)明的設(shè)備和方法的優(yōu)點(diǎn)還包括高精度、給出明確限定的流動(dòng)和 結(jié)合特性、低成本和簡(jiǎn)單性。舉例來(lái)說(shuō)，不需要蓋、外部的泵或電觸點(diǎn) 來(lái)驅(qū)動(dòng)流動(dòng)，雖然這樣的措施可以在本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施方式中存 在。洗滌步驟也不是必需的。
進(jìn)一步的，本發(fā)明的設(shè)備容易制造，因?yàn)樽⑸淠Ｋ艿奈⒔Y(jié)構(gòu)極好地 適合于樣品制備和MALDI-MS。
除了這些方面之外，常見(jiàn)的SELDI和MALDI技術(shù)的某些缺點(diǎn)也被
克服。如已經(jīng)闡述的那樣，經(jīng)典SELDI和MALDI-MS技術(shù)的大多數(shù)問(wèn)
題與樣品處理和制備、自動(dòng)化問(wèn)題和層析平臺(tái)相關(guān)。由于現(xiàn)有技術(shù)的方
法或者需要單獨(dú)提供不同的層析表面或者需要在后添加基質(zhì)材料和校
準(zhǔn)物，所以本發(fā)明提供了某些優(yōu)點(diǎn)。來(lái)源于向每個(gè)樣品樣點(diǎn)添加基質(zhì)的
變化性可以通過(guò)在根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備的預(yù)先建立的LDI檢測(cè)區(qū)域上加入
基質(zhì)材料來(lái)減輕，產(chǎn)生更為標(biāo)準(zhǔn)化與基質(zhì)的樣品結(jié)晶。
其它優(yōu)點(diǎn)包括所述設(shè)備的每日處理量。本文建議的設(shè)備容許樣品的 簡(jiǎn)單郵寄和貯存。
在現(xiàn)有技術(shù)的SELDI平臺(tái)中需要幾個(gè)不同的層析表面的情況下，必 須制備樣品的獨(dú)立的等分試樣并置于各表面類型上。所有的樣品制備通 ?？拷鼨z測(cè)單元進(jìn)行并且需要濕化學(xué)實(shí)驗(yàn)室。利用本發(fā)明的設(shè)備和方 法，對(duì)于設(shè)備準(zhǔn)備不需要通常需要濕化學(xué)環(huán)境的生物處理器單元。通過(guò)簡(jiǎn)化樣品制備和除去許多準(zhǔn)備步驟例如緩沖液交換，可以獲得 更為受控的和更少噪聲的樣品制備。
進(jìn)一步的，提出的設(shè)備是低成本的一次性部件。 現(xiàn)在將通過(guò)設(shè)想的實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。 設(shè)務(wù)^^遂-磁辨
-利用適合的技術(shù)制造正本，例如，厚膜刻蝕加工，利用SU-8, —
種正性環(huán)氧基樹(shù)脂，或利用DRIE Bosch過(guò)程的硅酮蝕刻。
-通過(guò)利用經(jīng)碳或玻璃填充的環(huán)氧樹(shù)脂鑄造、或通過(guò)例如銅或鎳的 電鍍，將該正本轉(zhuǎn)移到在剛性材料例如金屬中的模具。
-將所述模具安裝在注射才莫塑儀器中， 一側(cè)位于模腔中。 -在高溫用熔融的熱塑性聚合物填充模腔，對(duì)于聚碳酸酯例如為 300°C,使用大約7(TC的模具溫度，在200Bar的壓力下。
_在冷卻合適的時(shí)間以使片材料低于玻璃化轉(zhuǎn)化溫度(例如，PC 100 C)之后，從^t具上除下所述部件。
-用導(dǎo)電金屬例如金和化學(xué)/生物化學(xué)功能性涂層修飾表面。 附圖9公開(kāi)了根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備。所述設(shè)備具有樣品加載區(qū)域 (110)、由轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域(120)所創(chuàng)建的一個(gè)流動(dòng)路徑，該轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域由隆 起的基柱樣結(jié)構(gòu)組成。這個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域與分離區(qū)域重合，因?yàn)槠浒谒?述隆起結(jié)構(gòu)上的抗體涂層。所述抗體特異性地結(jié)合血清白蛋白，防止它 沿著設(shè)備進(jìn)一步傳送。
該設(shè)備進(jìn)一步包括兩個(gè)LDI檢測(cè)區(qū)域(130)和(140)。值得注意 的是，整個(gè)設(shè)備包括提及的隆起結(jié)構(gòu)，從而將被轉(zhuǎn)運(yùn)通過(guò)分離區(qū)域(120) 的液體樣品將被進(jìn)一步轉(zhuǎn)運(yùn)到第二 LDI檢測(cè)區(qū)域(140)。位于分離區(qū) 域(120 )內(nèi)的LDI檢測(cè)區(qū)域(130 )也用抗體覆蓋。根據(jù)該設(shè)備的設(shè)計(jì)， 到達(dá)第二 LDI檢測(cè)區(qū)域(140)的液體樣品將具有降低的血清白蛋白數(shù) 量。相比之下，LDI檢測(cè)區(qū)域(130)將主要含有血清白蛋白，其通過(guò)隆 起結(jié)構(gòu)上和之間存在的抗體^皮捕獲。
為了分析血液樣品，人們將在第一步驟中在設(shè)備的樣品加載區(qū)域上 施加20 pl的血清。然后該設(shè)備將在室溫下水平地培育五分鐘。LDI檢 測(cè)區(qū)域?qū)⒒蛘呔哂幸呀?jīng)放置的SPA MALDI基質(zhì)，或者人們將向LDI區(qū) 域添加1 pl飽和的SPA基質(zhì)溶液。隨后，所述設(shè)備將被插入質(zhì)譜儀中， 通過(guò)MALDI-MS將獲得每個(gè)LDI區(qū)域的語(yǔ)。上文已經(jīng)針對(duì)本發(fā)明的某些優(yōu)選的實(shí)施方式描述了本發(fā)明。然而， 這不應(yīng)按照任何限制性的方式來(lái)理解。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將明顯地能夠 設(shè)想構(gòu)成上述本發(fā)明基礎(chǔ)的所述原理的進(jìn) 一 步的修改。
權(quán)利要求
1.用于分離液體樣品中至少一種被分析物的設(shè)備，其包含具有以下的至少一個(gè)基底-用于加載液體樣品的至少一個(gè)區(qū)域；-用于轉(zhuǎn)運(yùn)所述液體樣品的至少一個(gè)區(qū)域；-用于從所述液體樣品的其他成分中分離所述至少一種被分析物的至少一個(gè)區(qū)域；和-用于激光解吸電離(LDI)質(zhì)譜檢測(cè)的至少一個(gè)區(qū)域；其中所述至少一個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域包括隆起結(jié)構(gòu)的陣列，所述隆起結(jié)構(gòu)具有一定形狀、尺寸和/或所述隆起結(jié)構(gòu)之間的間隔，從而實(shí)現(xiàn)了從所述加載區(qū)域通過(guò)所述分離區(qū)域到所述LDI檢測(cè)區(qū)域的所述樣品的毛細(xì)力驅(qū)動(dòng)的流動(dòng)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的設(shè)備，其中所述隆起結(jié)構(gòu)具有基柱樣形狀，所述基柱結(jié)構(gòu)之間的間隔在約 0.1到1000 jim的范圍內(nèi)、優(yōu)選在約0.1到100 iiim的范圍內(nèi)，所述基柱 結(jié)構(gòu)的高度高于約lpm ,優(yōu)選高于10)im。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1的設(shè)備，其中所述至少一個(gè)分離區(qū)域鄰近于所述加載區(qū)域、所述轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域和 /或所述LDI檢測(cè)區(qū)域設(shè)置或設(shè)置在所述加載區(qū)域、所述轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域和/或 所述LDH企測(cè)區(qū)域中。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3的設(shè)備，其中所述分離區(qū)域進(jìn)一步包含物理、化學(xué)和/或生物學(xué)功能性，以容 許從所述樣品的其他成分中分離所述至少 一種被分析物。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4的設(shè)備，其中所述物理功能性由具有一定形狀、尺寸和間隔的所述隆起結(jié)構(gòu) 提供，來(lái)容許從所述樣品的其他成分中分離所述至少 一種被分析物。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4的設(shè)備，其中所述化學(xué)功能性由疏水性的、親水性的、IMAC和/或離子性質(zhì) 的涂層來(lái)提供，來(lái)容許從所述樣品的其他成分中分離所述至少 一種被分 析物。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4的設(shè)備，其中所述生物學(xué)功能性容許通過(guò)基于親和力的相互作用從所述樣品的其他成分中分離所述至少 一種被分析物。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1的設(shè)備，其中所述用于LDI檢測(cè)的區(qū)域包括至少一種金屬和/或能夠在基質(zhì) 輔助激光解吸電離質(zhì)譜法(MALDI-MS)中用作基質(zhì)材料的至少一種能 量吸收分子(EAM)和/或至少一種校準(zhǔn)物。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8的設(shè)備，其中所述用于LDI檢測(cè)的區(qū)域包含選自包括金、銀、柏、釔、鉻、 鈦和銅的組的至少一種金屬或合金。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8的設(shè)備，其中所述用于LDI檢測(cè)的區(qū)域包含選自下組的至少一種基質(zhì)，該組 包含苯曱酸、肉桂酸的衍生物和相關(guān)的芳香化合物，例如，2,5-二羥基 苯曱酸(2,5-DHB或龍膽酸)、a-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA) 、 3,5-二甲氧基-4-羥基肉桂酸(芥子酸，芥子酸或SPA)、煙酸、吡啶甲酸、 反式-3-曱氧基-4-羥基肉桂酸(阿魏酸)、2- (4-羥基苯基偶氮)-苯曱酸 (HABA) 、 6-氮雜-2-硫代胸腺嘧啶(ATT) 、 3-HPA、 丁二酸、甘油、 4-羥基吡啶曱酸、酒石酸、甘油、2,4,6-三羥基苯乙酮、3-羥基吡啶曱酸、 3-氨基喹啉、1,8,9-三羥基-蒽(蒽三酚)、激光染料香豆素120、取代的 嘧啶、吡咬和苯胺，例如對(duì)硝基苯胺。
11. 測(cè)定樣品中至少一種被分析物的存在和/或數(shù)量的方法，包括步驟a) 提供用于分離液體樣品中至少一種被分析物的設(shè)備，其包含具有 以下的至少一個(gè)基底-用于加載液體樣品的至少一個(gè)區(qū)域； -用于轉(zhuǎn)運(yùn)所述液體樣品的至少一個(gè)區(qū)域；和 -用于從所述液體樣品的其他成分中分離所述至少一種被分析物的 至少一個(gè)區(qū)域；其中所述至少 一個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域包括隆起結(jié)構(gòu)的陣列，所述隆起結(jié)構(gòu)具 有一定形狀、尺寸和/或所述隆起結(jié)構(gòu)之間的間隔，從而實(shí)現(xiàn)了從所述加 載區(qū)域通過(guò)所述分離區(qū)域的所述樣品的毛細(xì)力驅(qū)動(dòng)的流動(dòng)；b) 將樣品加載到步驟a)的所述設(shè)備的加載區(qū)域上；c) 利用a)的所述設(shè)備從所述樣品的其他成分中分離所述至少一種 :陂分析物；d)通過(guò)MALDI-MS測(cè)定所述至少一種被分析物的存在和/或數(shù)量。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述隆起結(jié)構(gòu)具有基柱樣形狀，所述基柱結(jié)構(gòu)之間的間隔在約 0.1到1000 ]Lim的范圍內(nèi)、優(yōu)選在約0.1到100 pm的范圍內(nèi)，所述基柱 結(jié)構(gòu)的高度高于約lpm ,優(yōu)選高于10pm。
13. 根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述設(shè)備進(jìn)一步包括用于LDI檢測(cè)的至少 一個(gè)區(qū)域，所述區(qū)域 包括至少 一種金屬和/或能夠在基質(zhì)輔助激光解吸/電離質(zhì)譜法 (MALDI-MS)中用作基質(zhì)材料的至少一種能量吸收分子(EAM)和/ 或至少一種4交準(zhǔn)物。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述用于LDI檢測(cè)的區(qū)域包含選自包括金、銀、鎮(zhèn)、釔、鉻、 鈦和銅的組的金屬或合金。
15. 根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述用于LDI檢測(cè)的區(qū)域包含選自下組的基質(zhì)，所述組包含苯 甲酸、肉桂酸的衍生物和相關(guān)的芳香化合物，例如，2,5-二羥基苯曱酸 (2,5-DHB或龍膽酸)、a-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA) 、 3,5-二曱氧基 一4-羥基肉桂酸(芥子酸，芥子酸或SPA)、煙酸、吡啶甲酸、反式-3-甲氧基-4-羥基肉桂酸(阿魏酸)、2-( 4-羥基苯基偶氮)-苯甲酸(HABA)、 6-氮雜-2-硫代胸腺嘧啶(ATT) 、 3-HPA、 丁二酸、甘油、4-羥基吡啶 甲酸、酒石酸、甘油、2,4,6-三羥基苯乙酮、3-羥基吡啶曱酸、3-氨基會(huì) 啉、1,8，9-三羥基-蒽(蒽三酚)、激光染料香豆素120、取代的嘧啶、 吡，定和苯胺，例如對(duì)硝基苯胺。
16. 根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述至少一個(gè)分離區(qū)域鄰近于所述加載區(qū)域、所述轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域和 /或所述LDI檢測(cè)區(qū)域設(shè)置或設(shè)置在所述加載區(qū)域、所述轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域和/或 所述LDH企測(cè)區(qū)域中。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中所述分離區(qū)域進(jìn)一步包含物理、化學(xué)和/或生物學(xué)功能性，以容 許從所述樣品的其他成分中分離所述至少 一種被分析物。
18. 包含至少 一 個(gè)基底的設(shè)備用于分離液體樣品中的至少 一 種被分 析物以及隨后通過(guò)LDI檢測(cè)、優(yōu)選通過(guò)MALDI檢測(cè)確定所述至少一種被分析物的存在和/或數(shù)量的用途，其中所述基底具有-用于加載液體樣品的至少一個(gè)區(qū)域；-用于轉(zhuǎn)運(yùn)所述液體樣品的至少一個(gè)區(qū)域；和-用于從所述液體樣品的其他成分中分離所述至少 一種被分析物的 至少一個(gè)區(qū)域；其中所述至少一個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域包括隆起結(jié)構(gòu)的陣列，所述隆起結(jié)構(gòu)具 有一定形狀、尺寸和/或所述隆起結(jié)構(gòu)之間的間隔，從而實(shí)現(xiàn)了從所述加 載區(qū)域通過(guò)所述分離區(qū)域的所述樣品的毛細(xì)力驅(qū)動(dòng)的流動(dòng)。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的用途，其中所述設(shè)備進(jìn)一步包括用于LDI檢測(cè)的至少 一個(gè)區(qū)域，所述區(qū)域 包含至少 一 種金屬和/或能夠在基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜法 (MALDI-MS)中用作基質(zhì)材料的至少一種能量吸收分子(EAM)。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于分離液體樣品中的至少一種被分析物并進(jìn)一步通過(guò)激光解吸/電離(LDI)質(zhì)譜法分析所述被分析物的設(shè)備。本發(fā)明進(jìn)一步涉及所述設(shè)備用于分離液體樣品中至少一種被分析物以及隨后通過(guò)LDI質(zhì)譜法確定所述至少一種被分析物的存在和/或數(shù)量的用途。本發(fā)明還涉及用于分離液體樣品中至少一種被分析物和隨后通過(guò)LDI質(zhì)譜法確定所述至少一種被分析物的存在和/或數(shù)量的方法。
文檔編號(hào)H01J49/16GK101542678SQ200780043605
公開(kāi)日2009年9月23日 申請(qǐng)日期2007年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月23日
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