本發(fā)明涉及顯微成像領(lǐng)域，進一步涉及一種多色超分辨成像裝置和多色受激輻射耗盡超分辨成像方法，還進一步涉及一種基于掃描成像的光學(xué)顯微鏡。

背景技術(shù)：

由于光學(xué)顯微鏡可以對生物樣品在生理條件下進行實時動態(tài)的成像觀察，已成為生物學(xué)家不可或缺的研究工具，而光學(xué)顯微鏡的發(fā)展也伴隨著生命科學(xué)的進步。然而由于光學(xué)衍射極限的存在，使得光學(xué)顯微鏡的空間分辨率被限制在半個波長左右，這樣的分辨率嚴(yán)重阻礙了生物學(xué)家們在亞細胞尺度上進行更精細的研究。自從1994年stefanw.hell理論上提出突破衍射極限，經(jīng)過二十來年的發(fā)展，受激輻射耗盡(stimulatedemissiondepletion-sted)顯微鏡、光活化定位顯微鏡(photo-activationlocalizationmicroscopy-palm)、隨機光學(xué)重構(gòu)顯微鏡(stochasticopticalreconstructionmicroscopy-storm)等多種超分辨技術(shù)得到廣泛應(yīng)用。并且，2014年諾貝爾化學(xué)獎授予ericbetzig、stefanw.hell和williame.moerner，以表彰他們在“發(fā)展超分辨熒光顯微鏡”方面的突出貢獻。其中sted顯微鏡因其在時間分辨方面的優(yōu)勢，而在對動態(tài)過程的超分辨成像應(yīng)用中具有較大的前景。

sted顯微鏡是一種基于共聚焦點掃描模式的超分辨成像技術(shù)，它需要在傳統(tǒng)共聚焦顯微鏡的基礎(chǔ)上額外添加一路sted損耗光，通過位相板調(diào)制sted光束波前從而在物鏡焦平面上形成一個環(huán)狀光斑，此環(huán)狀光斑與激發(fā)光斑空間上完全對準(zhǔn)，時間上稍有延后，從而將激發(fā)光衍射光斑周圍的熒光分子轉(zhuǎn)換為非輻射狀態(tài)，有效降低熒光激發(fā)半徑，實現(xiàn)超分辨效果。sted超分辨成像能夠更加清晰直觀地觀察到一些亞細胞尺度的細胞結(jié)構(gòu)和蛋白分布，但是在生物學(xué)研究中僅僅觀察到精細結(jié)構(gòu)和蛋白分布是不夠的，觀察不同蛋白或者蛋白與亞細胞結(jié)構(gòu)之間等多組分之間的相互作用才能更好地理解細胞生理過程，因此發(fā)展多色超分辨顯微鏡具有重要應(yīng)用價值。

從成像裝置及光路設(shè)計上來說，目前研究人員主要通過以下兩種方式來實現(xiàn)多色sted成像：(1)選擇激發(fā)光譜和發(fā)射光譜可以截然分離的多種熒光分子進行標(biāo)記，裝置上使用相應(yīng)的多束激發(fā)光和多束sted損耗光來實現(xiàn)多色sted超分辨成像；(2)選擇激發(fā)光譜不同，發(fā)射光譜相近的多種熒光分子進行標(biāo)記后成像。然而，無論使用哪種方式實現(xiàn)多色sted成像都會面臨多個通道間交叉干擾(串色)問題，并且第一種方法還會存在多成像通道間橫向偏離的問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種多色受激輻射耗盡成像裝置和方法，以解決以上所述的至少一項技術(shù)問題。

根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供一種多色受激輻射耗盡超分辨成像裝置，包括：多個激勵光源，分別輸出彼此激發(fā)光譜不同的激發(fā)光；損耗光源，輸出受激輻射耗盡光；光學(xué)系統(tǒng)，用于向觀察區(qū)域照射調(diào)整后的激發(fā)光和受激輻射損耗光；其中，所述光學(xué)系統(tǒng)包括多個快門，分別位于各激勵光源輸出的激發(fā)光光路上；光電探測器，與所述激勵光源同數(shù)量，各光電探測器對應(yīng)于激勵光源分別探測觀察區(qū)域受調(diào)整后的激發(fā)光譜不同的激發(fā)光和受激輻射損耗光激發(fā)共同作用產(chǎn)生的熒光信號；以及控制單元，控制所述多個快門輪流開啟，以使每個激勵光源輸出的激發(fā)光依次照射到成像區(qū)域。

進一步的，所述激勵光源為兩個，分別為第一激勵光源和第二激勵光源，對應(yīng)輸出的激發(fā)光為第一激發(fā)光和第二激發(fā)光，所述快門包括第一快門和第二快門，分別位于第一激發(fā)光和第二激發(fā)光的光路上，所述控制單元控制第一快門和第二快門依次開啟，使第一激發(fā)光和第二激發(fā)光依次照射到成像區(qū)域。

進一步的，所述光學(xué)系統(tǒng)的設(shè)置包括：使每一激發(fā)光經(jīng)過各自激發(fā)光對應(yīng)的快門、反射鏡和二向色性濾光片后匯聚至顯微物鏡。

進一步的，所述光學(xué)系統(tǒng)的設(shè)置包括：使受激輻射耗盡光經(jīng)過位相板、反射鏡和二向色性濾光片后匯聚至所述顯微物鏡。

進一步的，所述光學(xué)系統(tǒng)的設(shè)置還包括：各激發(fā)光和所述受激輻射耗盡光在匯聚至所述顯微鏡物鏡之前均經(jīng)一反射鏡。

進一步的，各所述熒光信號經(jīng)二向色性濾光片的分離后，再經(jīng)各自濾波片收集濾波片后進入各光電探測器。

進一步的，所述控制單元還用于控制各光電探測器，在各激勵光源對應(yīng)快門開啟時，使激勵光源對應(yīng)的光電探測器工作。

進一步的，所述激勵光源工作方式為對觀察區(qū)域進行線掃描，所述控制器控制為：當(dāng)一激發(fā)光線掃描過觀察區(qū)域后，切換快門，控制另一激發(fā)光對觀察區(qū)域繼續(xù)進行線掃描。

進一步的，所述裝置還包括位移控制器，所述觀察區(qū)域包括樣品臺，所述位移控制器與樣品臺電性耦接，用于控制樣品臺平移，以使激勵光源輸出的激發(fā)光在樣品上掃描出一條線。

根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種多色受激輻射耗盡超分辨成像方法，包括：

設(shè)置多個激勵光源，分別輸出彼此激發(fā)光譜不同的激發(fā)光；

設(shè)置損耗光源，輸出受激輻射耗盡光；

設(shè)置光學(xué)系統(tǒng)，調(diào)整激發(fā)光和受激輻射損耗光后向觀察區(qū)域照射；其中，包括設(shè)置多個快門，各快門分別位于各激勵光源輸出的激發(fā)光光路上，通過控制所述多個快門輪流開啟，以使個激勵光源輸出的激發(fā)光依次照射到成像區(qū)域；

設(shè)置與所述激勵光源同數(shù)量的光電探測器，各光電探測器對應(yīng)于激勵光源，分別探測觀察區(qū)域受調(diào)整后的激發(fā)光譜不同的激發(fā)光和受激輻射損耗光激發(fā)共同作用產(chǎn)生的熒光信號。

進一步的，還包括對各光電探測器探測的熒光信號進行圖像重構(gòu)和處理。

進一步的，各所述激發(fā)光采用線掃描模式，通過快門控制多路激發(fā)光依次線激發(fā)，同時控制對應(yīng)的光電探測器依次探測熒光信號。

根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供一種基于掃描成像的光學(xué)顯微鏡，包括：

多個激勵光源，分別輸出彼此激發(fā)光譜不同的激發(fā)光；

光學(xué)系統(tǒng)，用于向觀察區(qū)域照射調(diào)整后的激發(fā)光；其中，所述光學(xué)系統(tǒng)包括多個快門，分別位于各激勵光源輸出的激發(fā)光光路上；以及

控制單元，以控制所述多個激勵光源對觀察區(qū)域交替進行線掃描，所述交替通過控制多個快門輪流開啟來實現(xiàn)。

根據(jù)本發(fā)明的再一方面，提供一種多色受激輻射耗盡超分辨成像裝置，包括：

多個激勵光源，分別輸出彼此激發(fā)光譜不同的激發(fā)光；

損耗光源，輸出受激輻射耗盡光；

光學(xué)系統(tǒng)，用于向觀察區(qū)域照射調(diào)整后的激發(fā)光和受激輻射損耗光；

光電探測器，與所述激勵光源同數(shù)量，各光電探測器對應(yīng)于激勵光源分別探測觀察區(qū)域受調(diào)整后的激發(fā)光譜不同的激發(fā)光和受激輻射損耗光激發(fā)共同作用產(chǎn)生的熒光信號；以及

控制單元，控制所述多個激勵光源輪流工作，以使每個激勵光源輸出的激發(fā)光輪流照射到成像區(qū)域。

根據(jù)上述技術(shù)方案，本發(fā)明所提供的多色sted超分辨成像裝置和方法具有以下有益效果：

1.在本發(fā)明的裝置中，突破光學(xué)衍射極限，提高傳統(tǒng)共聚焦顯微鏡成像分辨率，實現(xiàn)多色光學(xué)超分辨成像；

2.成像系統(tǒng)采用多路激發(fā)光，一路sted損耗光的方式，既能實現(xiàn)同時多色成像，又能避免不同通道間的圖像橫向偏離，光路相對簡單；

3.成像系統(tǒng)采用線掃描模式，通過快門控制多路激發(fā)光依次交替線激發(fā)，同時用程序控制不同通道的光電探測器依次交替探測一條線的信號，成功解決通道間的交叉干擾問題；

4.線掃描模式能徹底消除其他通道激發(fā)光激發(fā)樣品所產(chǎn)生的熒光信號串到自身通道；

5.相較于通過圖像處理、光譜分離和基于點掃描和面掃描模式的時間門分離法等方法實現(xiàn)多色超分辨，本發(fā)明提出的線掃描模式不僅能夠徹底解決多通道間交叉干擾問題實現(xiàn)多色同時成像，而且成像光路系統(tǒng)較簡單，同時節(jié)約經(jīng)濟成本，更有利于sted顯微鏡的發(fā)展；

6.本發(fā)明裝置中所提出的線掃描模式可用于所有的基于掃描成像模式的光學(xué)顯微鏡，以解決多通道間的交叉干擾。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例提供的雙色sted超分辨成像裝置的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖2為圖1所示裝置兩個通道超分辨成像能力的驗證圖(標(biāo)尺：1μm)。

圖3為圖1所示裝置應(yīng)用線掃描模式對40nm混合熒光球(580/605nm&660/680nm)的雙色共聚焦和sted超分辨成像圖(標(biāo)尺：1μm)。

圖4為圖1所示裝置線掃描模式下細胞微管雙通道超分辨共定位成像圖(標(biāo)尺：1μm)。

圖5為圖1所示裝置線掃描模式下雙通道交叉干擾問題的檢驗圖(標(biāo)尺：1μm)。

附圖標(biāo)記說明：

1激光器a；2激光器b；3激光器c；4快門a；5反射鏡d；6二向色性濾光片a；7二向色性濾光片b；8二向色性濾光片c；9反射鏡b；10顯微鏡物鏡；11樣品臺；12快門b；13反射鏡c；14二向色性濾光片d；15位相板；16反射鏡a；17熒光濾波片a；18收集透鏡a；19光電探測器a；20熒光濾波片b；21收集透鏡b；22光電探測器b；23位移控制器；24光學(xué)信號采集器；25控制采集處理軟件。

具體實施方式

根據(jù)本發(fā)明的基本構(gòu)思，提供一種實現(xiàn)同時多色超分辨成像的裝置。在本成像裝置中，首先實現(xiàn)多色共聚焦顯微成像，對每一個顏色通道加入sted損耗光從而實現(xiàn)超分辨光學(xué)成像。在成像裝置中使用快門分別開關(guān)不同通道的激發(fā)和探測，實現(xiàn)線掃描模式成像，成功解決多通道之間的交叉干擾問題。

本發(fā)明實施例的提供一種實現(xiàn)同時多色超分辨成像的裝置，包括多個激勵光源，分別輸出彼此激發(fā)光譜不同的激發(fā)光；損耗光源，輸出受激輻射耗盡光；光學(xué)系統(tǒng)，用于向觀察區(qū)域照射調(diào)整后的激發(fā)光和受激輻射損耗光；其中，所述光學(xué)系統(tǒng)包括多個快門，分別位于各激勵光源輸出的激發(fā)光光路上；光電探測器，與所述激勵光源同數(shù)量，各光電探測器對應(yīng)于激勵光源分別探測觀察區(qū)域受調(diào)整后的激發(fā)光譜不同的激發(fā)光和受激輻射損耗光激發(fā)共同作用產(chǎn)生的熒光信號；以及控制單元，控制所述多個快門輪流開啟，以使個激勵光源輸出的激發(fā)光依次照射到成像區(qū)域。

該成像裝置中，通過多個激勵光源、損耗光源、光學(xué)系統(tǒng)、光電探測器和控制單元，實現(xiàn)多色共聚焦顯微成像，并對每一激勵光源所產(chǎn)生激發(fā)光所經(jīng)過顏色通道加入sted損耗光實現(xiàn)超分辨光學(xué)成像。在實現(xiàn)超分辨成像時，本發(fā)明裝置選擇激發(fā)光譜不同，發(fā)射光譜相近的多種熒光分子進行標(biāo)記，從而在裝置上可以實現(xiàn)多路激發(fā)光進行樣品激發(fā)而使用同一路sted損耗光進行熒光淬滅，這樣既可實現(xiàn)sted同時多色超分辨成像而又避免通道間發(fā)生圖像偏離。另外，本發(fā)明實施例在成像裝置中使用快門分別開關(guān)不同通道的激發(fā)和探測，實現(xiàn)線掃描模式成像，成功解決多通道之間的交叉干擾問題。

本發(fā)明實施例還提供一種基于掃描成像的光學(xué)顯微鏡，包括：

多個激勵光源，分別輸出彼此激發(fā)光譜不同的激發(fā)光；

光學(xué)系統(tǒng)，用于向觀察區(qū)域照射調(diào)整后的激發(fā)光；其中，所述光學(xué)系統(tǒng)包括多個快門，分別位于各激勵光源輸出的激發(fā)光光路上；以及

控制單元，以控制所述多個激勵光源對觀察區(qū)域交替進行線掃描，所述交替通過控制多個快門輪流開啟來實現(xiàn)。

上述光學(xué)顯微鏡可以是現(xiàn)有技術(shù)中的各種光學(xué)顯微鏡，包括但不限于受激輻射耗盡顯微鏡、光活化定位顯微鏡、隨機光學(xué)重構(gòu)顯微鏡。只要其顯微鏡系統(tǒng)中包含多各激勵光源，以能夠設(shè)置多個快門的均可應(yīng)用于此。

本發(fā)明實施例還提供一種多色受激輻射耗盡超分辨成像裝置，包括：

多個激勵光源，分別輸出彼此激發(fā)光譜不同的激發(fā)光；

損耗光源，輸出受激輻射耗盡光；

光學(xué)系統(tǒng)，用于向觀察區(qū)域照射調(diào)整后的激發(fā)光和受激輻射損耗光；

光電探測器，與所述激勵光源同數(shù)量，各光電探測器對應(yīng)于激勵光源分別探測觀察區(qū)域受調(diào)整后的激發(fā)光譜不同的激發(fā)光和受激輻射損耗光激發(fā)共同作用產(chǎn)生的熒光信號；以及

控制單元，控制所述多個激勵光源輪流工作，以使每個激勵光源輸出的激發(fā)光輪流照射到成像區(qū)域。

為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合具體實施例，并參照附圖，對本發(fā)明作進一步的詳細說明。

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步說明，但本發(fā)明并不局限于以下實施例。下面以雙色sted超分辨顯微鏡為例，介紹多色受激輻射耗盡超分辨成像裝置和裝置的工作流程，其中該裝置包括：

通道1(也即上述的顏色通道)：激光器a(或者稱為第一激勵光源)輸出的激發(fā)光(或稱為第一激發(fā)光)經(jīng)快門a(或稱為第一快門)和反射鏡d后，再依次經(jīng)過二向色性濾光片a、二向色性濾光片b、二向色性濾光片c和反射鏡b后匯聚至顯微鏡物鏡照射到樣品臺，得到的待測樣品的熒光信號經(jīng)同一物鏡匯聚后分別經(jīng)過反射鏡b、二向色性濾光片c、二向色性濾光片b、二向色性濾光片a，再經(jīng)過熒光濾波片a和收集透鏡a后進入光電探測器a；

通道2：激光器b(或稱為第二激勵光源)輸出的激發(fā)光(或稱為第二激發(fā)光)經(jīng)快門b(或稱為第二快門)和反射鏡c后，再依次經(jīng)過二向色性濾光片d、二向色性濾光片b、二向色性濾光片c和反射鏡b后匯聚至顯微鏡物鏡照射到樣品臺，得到的待測樣品的熒光信號經(jīng)同一物鏡匯聚后分別經(jīng)過反射鏡b、二向色性濾光片c、二向色性濾光片b、二向色性濾光片d，再經(jīng)過熒光濾波片b和收集透鏡b后進入光電探測器b；

sted損耗光經(jīng)激光器c(也稱為損耗單元)輸出后經(jīng)過位相板和反射鏡a后，再經(jīng)過二向色性濾光片c和反射鏡b后匯聚至顯微鏡物鏡。其中光電探測器a和光電探測器b將收集到的光電信號輸入至光學(xué)信號采集器。

控制采集處理軟件(也稱為控制單元)分別與光學(xué)信號采集器、位移控制器、快門a和快門b相連接，用于控制樣品臺移動、收集光學(xué)信號采集器的數(shù)據(jù)和控制快門的交替線激發(fā)，然后由控制采集處理軟件進行信號收集重構(gòu)和處理，進而獲得雙色超分辨熒光顯微圖像。

上述雙色超分辨成像裝置中，激光器a所輸出的激光要經(jīng)過反射鏡d和反射鏡b之后才匯聚至顯微鏡物鏡，激光器b所輸出的激光要經(jīng)過反射鏡c和反射鏡b之后才匯聚至顯微鏡物鏡，激光器c所輸出的激光要經(jīng)過反射鏡a和反射鏡b之后才匯聚至顯微鏡物鏡，三種激光都要經(jīng)過兩個反射鏡后才進入顯微鏡物鏡以便于光路的對準(zhǔn)。

上述雙色超分辨成像裝置中，所述待測樣品的熒光信號在入射至兩個通道的光電探測器之前都要經(jīng)過一反射鏡b，以便于光路對準(zhǔn)；所述待測樣品的熒光信號在入射至兩個通道的光電探測器之前都要經(jīng)過熒光濾波片，用于濾除激發(fā)光和損耗光；所述待測樣品的熒光信號在入射至兩個通道的光電探測器之前都要經(jīng)過收集透鏡，用于收集熒光。

上述雙色超分辨成像裝置中，激光器a和激光器b所輸出的激光都要經(jīng)過一個快門，此快門用于控制兩路激發(fā)光的交替線激發(fā)；激光器c所輸出的激光要經(jīng)過一個位相板，用于形成一個環(huán)狀的損耗光束。

上述實施例的多色sted超分辨成像裝置中，具體實施光路為：

通道1的樣品激發(fā)和熒光收集過程為：激光器a1輸出的激發(fā)光經(jīng)快門a4和反射鏡d5后，再依次經(jīng)過二向色性濾光片a6、二向色性濾光片b7、二向色性濾光片c8和反射鏡b9后匯聚至顯微鏡物鏡10照射到樣品臺11，用于激發(fā)通道1熒光標(biāo)記的待測樣品，得到的待測樣品的熒光信號經(jīng)同一物鏡10匯聚后分別經(jīng)過反射鏡b9、二向色性濾光片c8、二向色性濾光片b7、二向色性濾光片a6，再經(jīng)過熒光濾波片a17和收集透鏡a18后進入光電探測器a19，光電探測器a19輸出的光電信號輸入至光學(xué)信號采集器24；

通道2的樣品激發(fā)和熒光收集過程為：激光器b2輸出的激發(fā)光經(jīng)快門b12和反射鏡c13后，再依次經(jīng)過二向色性濾光片d14、二向色性濾光片b7、二向色性濾光片c8和反射鏡b9后匯聚至顯微鏡物鏡10照射到樣品臺11，用于激發(fā)通道2熒光標(biāo)記的待測樣品，得到的待測樣品的熒光信號經(jīng)同一物鏡10匯聚后分別經(jīng)過反射鏡b9、二向色性濾光片c8、二向色性濾光片b7、二向色性濾光片d14，再經(jīng)過熒光濾波片b20和收集透鏡b21后進入光電探測器b22，光電探測器b22輸出的光電信號輸入至光學(xué)信號采集器24；

sted損耗光經(jīng)激光器c3輸出后經(jīng)過位相板15產(chǎn)生內(nèi)部強度為零的環(huán)狀光束，經(jīng)反射鏡a16反射后，再經(jīng)過二向色性濾光片c8和反射鏡b9后匯聚至顯微鏡物鏡10，用于將激發(fā)光激發(fā)的熒光斑周圍的熒光分子退激發(fā)，最后只有中心處一小部分熒光分子發(fā)出熒光，從而獲得超分辨光學(xué)成像。

本發(fā)明實施例裝置在成像時采用線掃描模式：快門a4打開時，激光器a1輸出激光激發(fā)待測樣品，光電探測器a19進行信號采集，采集一條線的信號，該過程中位移控制器23控制樣品臺11平移，使樣品臺11相對于激光器a1輸出的激光平移，從而在樣品上掃描出一條線；此時快門b12關(guān)閉，光電探測器b22工作但是不采集信號；快門b12打開時，激光器b2輸出激光激發(fā)待測樣品，光電探測器b22進行信號采集，采集一條線的信號，該過程中位移控制器23控制樣品臺11平移，使樣品臺11相對于激光器b2輸出的激光在樣品上掃描同一條線；此時快門a4關(guān)閉，光電探測器a19工作但是不采集信號；

控制采集處理軟件25分別與光學(xué)信號采集器24、位移控制器23、快門a4和快門b12相連接，分別用于控制樣品臺11移動、收集光學(xué)信號采集器24的數(shù)據(jù)和控制快門a4和b12的交替線激發(fā)，然后由控制采集處理軟件25進行信號收集處理和重構(gòu)，進而獲得雙色超分辨熒光顯微圖像。

應(yīng)說明的是，上述雙色sted僅僅用于示例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)上述實現(xiàn)方式將其應(yīng)用至三色或更多色的成像裝置中。

圖2為圖1所示裝置兩個通道超分辨成像能力的驗證圖。使用上述裝置對直徑為40nm的熒光微球進行成像實驗以驗證其超分辨能力，如附圖2，其中通道1獲得了80nm的橫向分辨率，通道2獲得了40nm的橫向空間分辨，顯示兩個通道都獲得了較好的橫向空間分辨率，遠遠超過普通共聚焦顯微鏡的分辨率。

圖3為圖1所示裝置應(yīng)用線掃描模式對40nm混合熒光球(580/605nm和660/680nm)的雙色共聚焦和sted超分辨成像圖。為了檢驗本發(fā)明裝置提出的線掃描模式對解決通道間交叉干擾問題的能力，把兩種標(biāo)記的熒光微球混合后再進行同時雙色超分辨成像，如附圖3所示，本發(fā)明裝置在獲得雙通道超分辨成像的前提下，成功的將兩種混合熒光微球區(qū)分開。

圖4為圖1所示裝置線掃描模式下細胞微管雙通道超分辨共定位成像圖。如附圖4所示，細胞微管經(jīng)第一抗體孵育后，同時用連接通道1染料(atto594)的第二抗體和連接通道2染料(atto647n)的第二抗體進行標(biāo)記，然后進行雙色共定位成像。sted超分辨成像結(jié)果顯示兩個通道具有較好的共定位效果，不存在通道間的橫向漂移。

圖5為線掃描模式下雙通道交叉干擾問題的檢驗圖。如附圖5，通道1是對最大激發(fā)波長為580nm，最大發(fā)射波長為605nm的40nm熒光球進行共聚焦和sted超分辨成像，針對此樣品用通道2的激發(fā)光進行激發(fā)和通道2的探測器進行信號探測，沒有探測到熒光信號，以此證明線掃描模式下通道1的熒光信號不會串到通道2中；通道2是對最大激發(fā)波長為660nm，最大發(fā)射波長為680nm的40nm熒光球進行共聚焦和sted超分辨成像，針對此樣品用通道1的激發(fā)光進行激發(fā)和通道1的探測器進行信號探測，沒有探測到熒光信號，以此證明線掃描模式下通道2的熒光信號不會串到通道1中，所以使用交叉激發(fā)探測的方法驗證了兩個通道間的交叉干擾問題被成功解決。

本發(fā)明實施例通過多通道交替線掃描的方式實現(xiàn)門控多色sted成像，不僅解決了點掃描模式裝置復(fù)雜控制困難的問題，也解決了面掃描模式下不同通道間圖像橫向漂移的問題。并且本發(fā)明提出的線掃描模式可應(yīng)用于所有的基于掃描成像模式的光學(xué)顯微鏡，以解決多通道間的交叉干擾。

以上所述的具體實施例，對本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果進行了進一步詳細說明，應(yīng)理解的是，以上所述僅為本發(fā)明的具體實施例而己，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。