表面等離子體增強(qiáng)全內(nèi)反射熒光顯微成像方法及裝置制造方法
【專利摘要】本發(fā)明提出了一種基于高級(jí)次軸對(duì)稱偏振光束的表面等離子體增強(qiáng)全內(nèi)反射熒光顯微成像方法，包括步驟：激光器發(fā)出的激光束經(jīng)過(guò)針孔濾波器進(jìn)行空間濾波，被準(zhǔn)直透鏡準(zhǔn)直為平行光束；該平行光束入射到偏振轉(zhuǎn)換系統(tǒng)中進(jìn)行偏振態(tài)轉(zhuǎn)換；獲得的高級(jí)次軸對(duì)稱偏振光束進(jìn)一步通過(guò)光瞳濾波器和環(huán)形光闌進(jìn)行振幅及相位調(diào)制；調(diào)制后的高級(jí)次軸對(duì)稱偏振光束經(jīng)過(guò)二向色分束鏡反射到高數(shù)值孔徑的聚焦物鏡中進(jìn)行聚焦，并射入“玻璃基底-金屬薄膜-樣品”的三層結(jié)構(gòu)上；激發(fā)的熒光信號(hào)通過(guò)該三層結(jié)構(gòu)反射回聚焦物鏡中，并被其擴(kuò)束，通過(guò)二向色分束鏡透射，經(jīng)過(guò)濾波片濾波后，最終被一聚光鏡聚焦到針孔陣列板上，通過(guò)探測(cè)器將光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，并進(jìn)一步處理。
【專利說(shuō)明】表面等離子體增強(qiáng)全內(nèi)反射熒光顯微成像方法及裝置
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及表面等離子體增強(qiáng)全內(nèi)反射熒光顯微成像技術(shù)，具體涉及一種基于高級(jí)次軸對(duì)稱偏振光束的表面等離子體增強(qiáng)全內(nèi)反射熒光顯微成像方法及裝置。
【背景技術(shù)】
[0002]全內(nèi)反射突光顯微成像(TotalInternal Reflection FluorescenceMicroscopy, TIRFM)通過(guò)使入射光束超過(guò)臨界角入射以在玻璃-樣品界面產(chǎn)生倏逝場(chǎng)，從而有選擇地激發(fā)界面附近的熒光分子，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞微細(xì)結(jié)構(gòu)的顯微成像。全內(nèi)反射熒光顯微成像技術(shù)不僅可以幫助進(jìn)一步理解細(xì)胞功能，同時(shí)改進(jìn)了探測(cè)信號(hào)的信噪比。但是，當(dāng)對(duì)生物微結(jié)構(gòu)進(jìn)行動(dòng)態(tài)快速成像時(shí)，幀采集速率較大，通常大于100幀/秒，需要進(jìn)一步增加熒光信號(hào)強(qiáng)度。為此，提出了基于表面等離子體增強(qiáng)全內(nèi)反射熒光顯微成像技術(shù)(SurfacePlasmon Enhanced TIRFM, SPE-TIRFM)，該技術(shù)利用表面等離子體增強(qiáng)效應(yīng)提高了熒光激發(fā)效率，同時(shí)進(jìn)一步抑制了背景噪聲。最近幾年，關(guān)于SPE-TIRFM的研究取得了很大的進(jìn)展，受到了業(yè)界的廣泛關(guān)注，包括Nikon在內(nèi)的多家公司也開發(fā)了相應(yīng)產(chǎn)品。總體來(lái)說(shuō)，基于表面等離子體增強(qiáng)全內(nèi)反射熒光顯微成像技術(shù)作為全內(nèi)反射熒光顯微成像技術(shù)的一個(gè)典型方案，具有很重要的研究?jī)r(jià)值，對(duì)于進(jìn)一步提高單分子熒光成像的空間分辨率和成像速度也具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明將一種獨(dú)特的空間偏振變化的矢量光束一高級(jí)次軸對(duì)稱偏振光束，引入到基于表面等離子體增強(qiáng)全內(nèi)反射熒光顯微成像技術(shù)系統(tǒng)中，通過(guò)合理的系統(tǒng)設(shè)計(jì)，以進(jìn)一步提聞系統(tǒng)的成像性能。
[0004]根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種基于高級(jí)次軸對(duì)稱偏振光束的表面等離子體增強(qiáng)全內(nèi)反射熒光顯微成像方法，包括如下步驟:激光器發(fā)出的激光束經(jīng)過(guò)針孔濾波器進(jìn)行空間濾波，然后被準(zhǔn)直透鏡準(zhǔn)直為平行光束；該平行光束入射到偏振轉(zhuǎn)換系統(tǒng)中進(jìn)行偏振態(tài)轉(zhuǎn)換，獲得高級(jí)次軸對(duì)稱偏振光束；獲得的高級(jí)次軸對(duì)稱偏振光束進(jìn)一步通過(guò)光瞳濾波器和環(huán)形光闌進(jìn)行振幅及相位調(diào)制，其中環(huán)形光闌的作用是阻擋光束中間區(qū)域部分入射到聚焦物鏡中，從而消除由于中間區(qū)域光束透射進(jìn)行熒光激發(fā)導(dǎo)致的背景噪聲；經(jīng)過(guò)調(diào)制后的高級(jí)次軸對(duì)稱偏振光束經(jīng)過(guò)二向色分束鏡反射到高數(shù)值孔徑的聚焦物鏡中進(jìn)行聚焦，并射入“玻璃基底-金屬薄膜-樣品”的三層結(jié)構(gòu)上；根據(jù)表面等離子體波激發(fā)需要滿足的相位匹配條件，只有滿足某一諧振角度范圍的光束才能透射過(guò)三層結(jié)構(gòu)，在金屬表面激發(fā)較強(qiáng)的表面等離子體波光場(chǎng)；在金屬表面激發(fā)的表面等離子體波沿著表面以行波的形式傳播，彼此干涉形成一干涉場(chǎng)，但是該波的強(qiáng)度沿著垂直金屬表面的軸向以指數(shù)形式衰減，因此，該表面等離子體波場(chǎng)只能激發(fā)金屬界面附近的熒光分子；激發(fā)的熒光信號(hào)通過(guò)“樣品-金屬薄膜-玻璃基底”三層結(jié)構(gòu)反射回聚焦物鏡中，并被其擴(kuò)束，通過(guò)二向色分束鏡透射，經(jīng)過(guò)濾波片濾波后，最終被一聚光鏡聚焦到針孔陣列板上，在針孔后面放置探測(cè)器，將光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，并進(jìn)一步送入計(jì)算機(jī)進(jìn)行后續(xù)的分析處理。
[0005]優(yōu)選地，所述方法還包括采用光束偏轉(zhuǎn)系統(tǒng)，以調(diào)控聚焦光束的聚焦位置，從而控制在金屬-樣品表面激發(fā)的表面等離子體波場(chǎng)的區(qū)域，進(jìn)而控制熒光分子的激發(fā)區(qū)域。
[0006]優(yōu)選地，所述光束偏振系統(tǒng)采用基于棱鏡的光束偏轉(zhuǎn)功能，將入射的平行光束轉(zhuǎn)換為不同偏轉(zhuǎn)角度的平行光束，然后采用一對(duì)透鏡組成的望遠(yuǎn)鏡結(jié)構(gòu)，將入射的平行光束轉(zhuǎn)換為偏轉(zhuǎn)方向和光斑大小可控的平行光束，使?jié)M足偏轉(zhuǎn)方向和光斑大小的光束入射進(jìn)聚焦物鏡，其中光束偏轉(zhuǎn)角度以及光斑大小與兩透鏡的焦距比值有關(guān)。
[0007]優(yōu)選地，光束偏轉(zhuǎn)系統(tǒng)使用一電控偏轉(zhuǎn)器進(jìn)行光束偏轉(zhuǎn)。
[0008]優(yōu)選地，所述高級(jí)次軸對(duì)稱偏振光束的偏振級(jí)次小于5。
[0009]根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種基于高級(jí)次軸對(duì)稱偏振光束的表面等離子體增強(qiáng)全內(nèi)反射熒光顯微成像裝置:激光器，所述激光器發(fā)出激光束；針孔濾波器和準(zhǔn)直透鏡，激光束經(jīng)過(guò)針孔濾波器進(jìn)行空間濾波，然后被準(zhǔn)直透鏡準(zhǔn)直為平行光束；偏振轉(zhuǎn)換系統(tǒng)，該平行光束入射到偏振轉(zhuǎn)換系統(tǒng)中進(jìn)行偏振態(tài)轉(zhuǎn)換，獲得高級(jí)次軸對(duì)稱偏振光束；光瞳濾波器和環(huán)形光闌，獲得的高級(jí)次軸對(duì)稱偏振光束進(jìn)一步通過(guò)光瞳濾波器和環(huán)形光闌進(jìn)行振幅及相位調(diào)制，其中環(huán)形光闌的作用是阻擋光束中間區(qū)域部分入射到聚焦物鏡中，從而消除由于中間區(qū)域光束透射進(jìn)行熒光激發(fā)導(dǎo)致的背景噪聲；聚焦物鏡，經(jīng)過(guò)調(diào)制后的軸對(duì)稱偏振光束經(jīng)過(guò)二向色分束鏡反射到高數(shù)值孔徑的聚焦物鏡中進(jìn)行聚焦，并射入“玻璃基底-金屬薄膜-樣品”的三層結(jié)構(gòu)上，根據(jù)表面等離子體波激發(fā)需要滿足的相位匹配條件，只有滿足某一諧振角度范圍的光束才能透射過(guò)三層結(jié)構(gòu)，在金屬表面激發(fā)較強(qiáng)的表面等離子體波光場(chǎng)，在金屬表面激發(fā)的表面等離子體波沿著表面以行波的形式傳播，彼此干涉形成一干涉場(chǎng)，但是該波的強(qiáng)度沿著垂直金屬表面的軸向以指數(shù)形式衰減，因此，該表面等離子體波場(chǎng)只能激發(fā)金屬界面附近的熒光分子，激發(fā)的熒光信號(hào)通過(guò)“樣品-金屬薄膜-玻璃基底”三層結(jié)構(gòu)反射回聚焦物鏡中，并被其擴(kuò)束，針孔陣列板和探測(cè)器，經(jīng)過(guò)擴(kuò)束的光通過(guò)二向色分束鏡透射，經(jīng)過(guò)濾波片濾波后，最終被一聚光鏡聚焦到針孔陣列板上，在針孔后面放置探測(cè)器，將光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)；分析處理系統(tǒng)，電信號(hào)被送入計(jì)算機(jī)進(jìn)行后續(xù)的分析處理。
[0010]優(yōu)選地，還包括光束偏轉(zhuǎn)系統(tǒng)，用于調(diào)控聚焦光束的聚焦位置，從而控制在金屬-樣品表面激發(fā)的表面等離子體波場(chǎng)的區(qū)域，進(jìn)而控制熒光分子的激發(fā)區(qū)域。
[0011]優(yōu)選地，所述光束偏振系統(tǒng)采用基于棱鏡的光束偏轉(zhuǎn)功能，將入射的平行光束轉(zhuǎn)換為不同偏轉(zhuǎn)角度的平行光束，然后采用一對(duì)透鏡組成的望遠(yuǎn)鏡結(jié)構(gòu)，將入射的平行光束轉(zhuǎn)換為偏轉(zhuǎn)方向和光斑大小可控的平行光束，使?jié)M足偏轉(zhuǎn)方向和光斑大小的光束入射進(jìn)油浸物鏡，其中光束偏轉(zhuǎn)角度以及光斑大小與兩透鏡的焦距比值有關(guān)。
[0012]優(yōu)選地,光束偏轉(zhuǎn)系統(tǒng)使用一電控偏轉(zhuǎn)器進(jìn)行光束偏轉(zhuǎn)。
[0013]優(yōu)選地，所述高級(jí)次軸對(duì)稱偏振光束的偏振級(jí)次小于5。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0014]圖1 (a)是初始偏振方位角為-45°的柱矢量光束(P=I)，圖1 (b)是徑向偏振光，圖1 (C)是切向偏振光，圖1 (d)是偏振級(jí)次P=2的柱矢量光束，圖1 (e)是P=3的柱矢量光束，圖1(f)是P=4的柱矢量光束，其中箭頭表示對(duì)應(yīng)位置線偏振的方位。[0015]圖2(a)是基于軸對(duì)稱偏振光束的基于表面等離子體增強(qiáng)全內(nèi)反射熒光顯微成像技術(shù)結(jié)構(gòu)示意圖，圖2(b)是差動(dòng)共焦檢測(cè)系統(tǒng)圖，圖2(c)是基于旋轉(zhuǎn)棱鏡的光束偏轉(zhuǎn)系統(tǒng)，以及圖2(d)是基于電控偏轉(zhuǎn)器的光束偏轉(zhuǎn)系統(tǒng)。
[0016]圖3(a)和圖3(b)是生成高級(jí)次軸對(duì)稱偏振光束的兩種典型方法。
[0017]圖4是理論計(jì)算的P偏振光在玻璃/金屬薄膜/介質(zhì)系統(tǒng)中的反射率隨入射角度的變化曲線。
[0018]圖5(a)-圖5(b)是徑向偏振光在玻璃-樣品界面附近獲得的表面等離子體波場(chǎng)強(qiáng)度分布，圖5 (c)-圖5 (d)是偏振級(jí)次為4的軸對(duì)稱偏振光束在玻璃-樣品界面附近獲得的SPP場(chǎng)強(qiáng)度分布。
[0019]圖6 (a)-圖6 (b)分別是偏振級(jí)次為8和20的聚焦的軸對(duì)稱偏振光束激發(fā)的SPP橫截面光場(chǎng)強(qiáng)度分布，其中圖6 (a)對(duì)應(yīng)偏振級(jí)次8，圖6 (b)對(duì)應(yīng)偏振級(jí)次20。
[0020]圖7是針孔陣列板的結(jié)構(gòu)示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0021]本發(fā)明將一種獨(dú)特的矢量光束一高級(jí)次軸對(duì)稱偏振光束引入到全內(nèi)反射熒光顯微成像系統(tǒng)中，以期進(jìn)一步提升系統(tǒng)的成像性能。
[0022]軸對(duì)稱偏振光束是一類具有軸對(duì)稱偏振光束特性的矢量光束，對(duì)稱軸為光束的傳播軸。在光束橫截面上任意一點(diǎn)(中心點(diǎn)除外)都為線偏振，沿圓周方向的偏振方位變化滿足如下關(guān)系，
[0023]Φ (r, Φ) =P X Φ + Φ ο (P ≠ O) (I)
[0024]其中，P稱為偏振級(jí)次，表示光束沿圓周方向變化360°時(shí)偏振方位變化的周期數(shù)；Φο是當(dāng)φ=0時(shí)對(duì)應(yīng)的初始偏振方位角，其值與X軸的選取有關(guān)。當(dāng)偏振級(jí)次P=I時(shí)，該類型光束稱為柱矢量光束，光束在橫截面上的線偏振方位呈柱對(duì)稱分布；特別地，當(dāng)Φ0=0°時(shí)，為徑向偏振光，當(dāng)Φο=90°時(shí)，為切向偏振光，如圖l(a)-(c)所示。當(dāng)偏振級(jí)次P大于I時(shí)，稱之為高級(jí)次軸對(duì)稱偏振光束，如圖l(d)_(f)所示。很顯然，不同的偏振級(jí)次和初始偏振方位角對(duì)應(yīng)不同形式的軸對(duì)稱偏振光束，其光束橫截面上的偏振分布形式也不同。
[0025]高級(jí)次軸對(duì)稱偏振光束因?yàn)楠?dú)特的偏振分布，具有一些獨(dú)特的聚焦特性，例如在高數(shù)值孔徑聚焦的情況下，可以獲得多個(gè)超小聚焦光斑，具體可參考文獻(xiàn)“高偏振級(jí)次軸對(duì)稱偏振光束的聚焦(Focusing of high polarization order axially-symmetricpolarized beams).Chin Opt Lett, 2009, 7 (10):938-940.”。當(dāng)米用高級(jí)次軸對(duì)稱偏振光束激發(fā)表面等離子體波(Surface Plasmon Polaritons, SPPs)時(shí),在金屬表面的等離子體波相互干涉產(chǎn)生多個(gè)聚焦光斑，具體參考周哲海等人的文獻(xiàn)“通過(guò)高度聚焦高偏振級(jí)次軸對(duì)稱偏振光束形成的表面等離子體干涉(Surface plasmon interference formed by highlyfocused higher polarization order axially-symmetric polarizd beams).Chin OptLett, 2010, 8(12): 1178-1181”。
[0026]本發(fā)明基于高級(jí)次軸對(duì)稱偏振光束所具有的這種獨(dú)特的表面等離子體波激發(fā)特性，建立了如圖2所示的基于表面等離子體增強(qiáng)全內(nèi)反射熒光顯微成像技術(shù)(SPE-TIRFM)系統(tǒng)。該系統(tǒng)基于克雷奇曼結(jié)構(gòu)，利用聚焦的高級(jí)次軸對(duì)稱偏振光束激發(fā)表面等離子體波，從而激發(fā)金屬表面附近的熒光分子，因?yàn)楸砻娴入x子波形成的焦斑處于亞波長(zhǎng)量級(jí)，因?yàn)榭梢詫?shí)現(xiàn)生物樣品微納米結(jié)構(gòu)的顯微成像。
[0027]如圖2所示，系統(tǒng)的工作原理為:(I)激光器I發(fā)出的激光束首先經(jīng)過(guò)一針孔濾波器2進(jìn)行空間濾波，然后被準(zhǔn)直透鏡3準(zhǔn)直為平行光束；該平行光束入射進(jìn)一偏振轉(zhuǎn)換系統(tǒng)4中進(jìn)行偏振態(tài)轉(zhuǎn)換，獲得軸對(duì)稱偏振光束；獲得的軸對(duì)稱偏振光束進(jìn)一步通過(guò)光瞳濾波器5和環(huán)形光闌6進(jìn)行振幅及相位調(diào)控，其中環(huán)形光闌6的作用是阻擋光束中間區(qū)域部分入射到油浸物鏡8中，從而消除由于中間區(qū)域光束透射進(jìn)行熒光激發(fā)導(dǎo)致的背景噪聲。經(jīng)過(guò)調(diào)制后的軸對(duì)稱偏振光束經(jīng)過(guò)二向色分束鏡11反射進(jìn)一高數(shù)值孔徑的油浸物鏡8中進(jìn)行聚焦，照射到“玻璃基底9'-金屬薄膜9-樣品10”的三層結(jié)構(gòu)上。
[0028](2)系統(tǒng)采用了一種克雷奇曼的表面等離子體波激發(fā)機(jī)制，即通過(guò)高數(shù)值孔徑的油浸物鏡8得到一聚焦激光束，然后該聚焦光束入射到一“玻璃基底9'-金屬薄膜9-樣品10”的三層結(jié)構(gòu)上，根據(jù)表面等離子體波激發(fā)需要滿足的相位匹配條件，只有滿足某一諧振角度范圍的光束才能透射過(guò)三層結(jié)構(gòu)，在金屬表面激發(fā)較強(qiáng)的表面等離子體波光場(chǎng)。因?yàn)榫劢构馐邪芏嗖煌嵌鹊墓馐绻劢雇哥R的數(shù)值孔徑足夠大，則就有滿足諧振條件的光束入射到三層結(jié)構(gòu)上，從而實(shí)現(xiàn)金屬表面等離子體波的激發(fā)。
[0029](3)在金屬表面激發(fā)的表面等離子體波沿著表面以行波的形式傳播，彼此干涉形成一干涉場(chǎng)，但是該波的強(qiáng)度沿著垂直金屬表面的軸向以指數(shù)形式衰減，深度通常只有幾百納米。因此，該表面等離子體波場(chǎng)只能激發(fā)金屬界面附近的熒光分子，如果能進(jìn)一步控制表面等離子體波場(chǎng)的橫向尺寸，則可以實(shí)現(xiàn)更小區(qū)域熒光分子的激發(fā)，從而實(shí)現(xiàn)更高空間分辨率的顯微探測(cè)。激發(fā)的熒光信號(hào)通過(guò)“樣品10-金屬薄膜9-玻璃基底9' ”三層結(jié)構(gòu)反射回油浸物鏡8中，并被其擴(kuò)束，通過(guò)二向色分束鏡11透射，經(jīng)過(guò)濾波片12濾波后，最終被一聚光鏡13聚焦到針孔陣列板14上，在針孔后面放置探測(cè)器15，將光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，并進(jìn)一步送入計(jì)算機(jī)進(jìn)行后續(xù)的分析處理，
[0030]該倏逝場(chǎng)沿著玻璃界面?zhèn)鞑グl(fā)生干涉，沿著垂直方向強(qiáng)度以指數(shù)形式衰減，穿透深度在百納米量級(jí)，因此倏逝場(chǎng)只對(duì)界面附近的樣品進(jìn)行熒光激發(fā)，探測(cè)的厚度很薄，背景噪聲被極大抑制。倏逝場(chǎng)激發(fā)的突光信號(hào)經(jīng)過(guò)二向色分束鏡11和濾波片12后被一聚光鏡13聚焦到一針孔陣列板14上，針孔陣列板后放置一光電探測(cè)器15，探測(cè)的信號(hào)進(jìn)一步輸送到計(jì)算機(jī)中進(jìn)行后續(xù)分析處理。基于該探測(cè)針孔可實(shí)現(xiàn)一種共焦成像關(guān)系，即激發(fā)樣品的聚焦光束的聚焦點(diǎn)與聚光鏡聚焦熒光信號(hào)的聚焦點(diǎn)形成共軛成像關(guān)系，可進(jìn)一步提高TIRFM成像的軸向分辨率和靈敏度。
[0031]在圖2(a)中，可利用多種方法將準(zhǔn)直光束轉(zhuǎn)換為高級(jí)次軸對(duì)稱偏振光束，這里列舉2種典型的方法:(a)基于4f系統(tǒng)和空間光調(diào)制器的自相干分解與合成生成方法，具體可參考文獻(xiàn)“用空間光調(diào)制器和共光路干涉測(cè)量布置生成任意矢量光束(Generationof arbitrary vector beams with a spatial light modulator and a common pathinterferometric arrangement).0pt.Lett.，32:3549，2007，，。(2)基于空間偏振轉(zhuǎn)換器的生成方法。設(shè)計(jì)一種由多個(gè)半波片組成的分塊光學(xué)器件，使每個(gè)半波片沿著圓周方向的快軸呈一定規(guī)律變化，可將入射的線偏振光轉(zhuǎn)換為振動(dòng)方向空間變化的線偏振光，具體可參考周哲海等人的中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)CN201210562648.9——“偏振轉(zhuǎn)換器、矢量光束生成系統(tǒng)及方法”。[0032]圖3(a)和圖3(b)是生成高級(jí)次軸對(duì)稱偏振光束的兩種典型方法，其中SLM為空間光調(diào)制器，Pl為偏振片1，L1為傅里葉變換透鏡1，L2為傅里葉變換透鏡2，F(xiàn)為空間濾波器，G為Ronchi光柵。
[0033]采用如圖2(b)所示的差動(dòng)共焦檢測(cè)系統(tǒng)，則可以進(jìn)一步提高系統(tǒng)軸向分辨率和靈敏度。關(guān)于差動(dòng)共焦檢測(cè)技術(shù)，可參考J B Tan等人的文獻(xiàn)“基于差動(dòng)共焦顯微技術(shù)的光學(xué)聚焦檢測(cè)的理論分析和性質(zhì)研究(Theoretical analysis and property study ofoptical focus detection based on differential confocal microscopy).MeasurementScience and Technology, 13(88):1289-1293，2002”。
[0034]同時(shí)，為了實(shí)現(xiàn)樣品的三維掃描，系統(tǒng)引入了如圖2(c)和圖2(d)所示的光束偏轉(zhuǎn)系統(tǒng)，以調(diào)控聚焦光束的聚焦位置，從而控制在金屬-樣品表面激發(fā)的SPP場(chǎng)的區(qū)域，進(jìn)而控制熒光分子的激發(fā)區(qū)域。其中，圖2(c)基于棱鏡33的光束偏轉(zhuǎn)功能，將入射的平行光束轉(zhuǎn)換為不同偏轉(zhuǎn)角度的平行光束，然后采用一雙透鏡31和32組成的望遠(yuǎn)鏡結(jié)構(gòu)，將入射的平行光束轉(zhuǎn)換為偏轉(zhuǎn)方向和光斑大小可控的平行光束，其中光束偏轉(zhuǎn)角度以及光斑大小與兩透鏡的焦距比值有關(guān)。最終，使?jié)M足偏轉(zhuǎn)方向和光斑大小的光束入射進(jìn)油浸物鏡。與圖2(c)不同，圖2(d)所不的光束偏轉(zhuǎn)系統(tǒng)使用一電控偏轉(zhuǎn)器36進(jìn)行光束偏轉(zhuǎn),如基于聲光效應(yīng)或磁光效應(yīng)的光束偏轉(zhuǎn)器。
[0035]通常情況下，高級(jí)次軸對(duì)稱偏振光束具有如下的光場(chǎng)復(fù)振幅分布，
[0036]Επι(ι.,φ,ζ) = ΑΡ(τ){οο$[(Ρ-?)φ + φ?]βr+5?η[(Ρ-?)φ + φ?]βφ]
[0037]其中，A是一常數(shù)，代表光場(chǎng)的平均振幅大小；P(r)為光束的光瞳函數(shù)，表征了光束的相對(duì)振幅及相位分布；P為光束的偏振級(jí)次；^、 分別為沿著徑向和切向的單位矢量。
[0038]基于矢量衍射理論，可推導(dǎo)出高級(jí)次軸對(duì)稱偏振光束在金屬-樣品界面產(chǎn)生的SPP場(chǎng)分布，
【權(quán)利要求】
1.一種基于高級(jí)次軸對(duì)稱偏振光束的表面等離子體增強(qiáng)全內(nèi)反射熒光顯微成像方法，包括如下步驟: 激光器發(fā)出的激光束經(jīng)過(guò)針孔濾波器進(jìn)行空間濾波，然后被準(zhǔn)直透鏡準(zhǔn)直為平行光束； 該平行光束入射到偏振轉(zhuǎn)換系統(tǒng)中進(jìn)行偏振態(tài)轉(zhuǎn)換，獲得高級(jí)次軸對(duì)稱偏振光束；獲得的高級(jí)次軸對(duì)稱偏振光束進(jìn)一步通過(guò)光瞳濾波器和環(huán)形光闌進(jìn)行振幅及相位調(diào)制，其中環(huán)形光闌的作用是阻擋光束中間區(qū)域部分入射到聚焦物鏡中，從而消除由于中間區(qū)域光束透射進(jìn)行熒光激發(fā)導(dǎo)致的背景噪聲； 經(jīng)過(guò)調(diào)制后的高級(jí)次軸對(duì)稱偏振光束經(jīng)過(guò)二向色分束鏡反射到高數(shù)值孔徑的聚焦物鏡中進(jìn)行聚焦，并射入“玻璃基底-金屬薄膜-樣品”的三層結(jié)構(gòu)上； 根據(jù)表面等離子體波激發(fā)需要滿足的相位匹配條件，只有滿足某一諧振角度范圍的光束才能透射過(guò)三層結(jié)構(gòu)，在金屬表面激發(fā)較強(qiáng)的表面等離子體波光場(chǎng)； 在金屬表面激發(fā)的表面等離子體波沿著表面以行波的形式傳播，彼此干涉形成一干涉場(chǎng)，但是該波的強(qiáng)度沿著垂直金屬表面的軸向以指數(shù)形式衰減，因此，該表面等離子體波場(chǎng)只能激發(fā)金屬界面附近的熒光分子； 激發(fā)的熒光信號(hào)通過(guò)“樣品-金屬薄膜-玻璃基底”三層結(jié)構(gòu)反射回聚焦物鏡中，并被其擴(kuò)束，通過(guò)二向色分束鏡透射，經(jīng)過(guò)濾波片濾波后，最終被一聚光鏡聚焦到針孔陣列板上，在針孔后面放置探測(cè)器，將光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，并進(jìn)一步送入計(jì)算機(jī)進(jìn)行后續(xù)的分析處理。
2.如權(quán)利要求1所述的表面等離子體增強(qiáng)全內(nèi)反射熒光顯微成像方法，其中，還包括采用光束偏轉(zhuǎn)系統(tǒng)，以調(diào)控聚焦光束的聚焦位置，從而控制在金屬-樣品表面激發(fā)的表面等離子體波場(chǎng)的區(qū)域，進(jìn)而控制熒光分子的激發(fā)區(qū)域。
3.如權(quán)利要求2所述的表面等離子體增強(qiáng)全內(nèi)反射熒光顯微成像方法，其中，所述光束偏振系統(tǒng)采用基于棱鏡的光束偏轉(zhuǎn)功能，將入射的平行光束轉(zhuǎn)換為不同偏轉(zhuǎn)角度的平行光束，然后采用一對(duì)透鏡組成的望遠(yuǎn)鏡結(jié)構(gòu)，將入射的平行光束轉(zhuǎn)換為偏轉(zhuǎn)方向和光斑大小可控的平行光束，使?jié)M足偏轉(zhuǎn)方向和光斑大小的光束入射進(jìn)聚焦物鏡，其中光束偏轉(zhuǎn)角度以及光斑大小與兩透鏡的焦距比值有關(guān)。
4.如權(quán)利要求2所述的表面等離子體增強(qiáng)全內(nèi)反射熒光顯微成像方法，其中，光束偏轉(zhuǎn)系統(tǒng)使用一電控偏轉(zhuǎn)器進(jìn)行光束偏轉(zhuǎn)。
5.如權(quán)利要求1所述的表面等離子體增強(qiáng)全內(nèi)反射熒光顯微成像方法，所述高級(jí)次軸對(duì)稱偏振光束的偏振級(jí)次小于5。
6.—種基于高級(jí)次軸對(duì)稱偏振光束的表面等離子體增強(qiáng)全內(nèi)反射熒光顯微成像裝置: 激光器，所述激光器發(fā)出激光束； 針孔濾波器和準(zhǔn)直透鏡，激光束經(jīng)過(guò)針孔濾波器進(jìn)行空間濾波，然后被準(zhǔn)直透鏡準(zhǔn)直為平行光束； 偏振轉(zhuǎn)換系統(tǒng)，該平行光束入射到偏振轉(zhuǎn)換系統(tǒng)中進(jìn)行偏振態(tài)轉(zhuǎn)換，獲得高級(jí)次軸對(duì)稱偏振光束； 光瞳濾波器和環(huán)形光闌，獲得的高級(jí)次軸對(duì)稱偏振光束進(jìn)一步通過(guò)光瞳濾波器和環(huán)形光闌進(jìn)行振幅及相位調(diào)制，其中環(huán)形光闌的作用是阻擋光束中間區(qū)域部分入射到聚焦物鏡中，從而消除由于中間區(qū)域光束透射進(jìn)行熒光激發(fā)導(dǎo)致的背景噪聲； 聚焦物鏡，經(jīng)過(guò)調(diào)制后的軸對(duì)稱偏振光束經(jīng)過(guò)二向色分束鏡反射到高數(shù)值孔徑的聚焦物鏡中進(jìn)行聚焦，并射入“玻璃基底-金屬薄膜-樣品”的三層結(jié)構(gòu)上，根據(jù)表面等離子體波激發(fā)需要滿足的相位匹配條件，只有滿足某一諧振角度范圍的光束才能透射過(guò)三層結(jié)構(gòu)，在金屬表面激發(fā)較強(qiáng)的表面等離子體波光場(chǎng)，在金屬表面激發(fā)的表面等離子體波沿著表面以行波的形式傳播，彼此干涉形成一干涉場(chǎng)，但是該波的強(qiáng)度沿著垂直金屬表面的軸向以指數(shù)形式衰減，因此，該表面等離子體波場(chǎng)只能激發(fā)金屬界面附近的熒光分子，激發(fā)的熒光信號(hào)通過(guò)“樣品-金屬薄膜-玻璃基底”三層結(jié)構(gòu)反射回聚焦物鏡中，并被其擴(kuò)束， 針孔陣列板和探測(cè)器，經(jīng)過(guò)擴(kuò)束的光通過(guò)二向色分束鏡透射，經(jīng)過(guò)濾波片濾波后，最終被一聚光鏡聚焦到針孔陣列板上，在針孔后面放置探測(cè)器，將光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)； 分析處理系統(tǒng)，電信號(hào)被送入計(jì)算機(jī)進(jìn)行后續(xù)的分析處理。
7.如權(quán)利要求6所述的表面等離子體增強(qiáng)全內(nèi)反射熒光顯微成像裝置，其中，還包括光束偏轉(zhuǎn)系統(tǒng)，用于調(diào)控聚焦光束的聚焦位置，從而控制在金屬-樣品表面激發(fā)的表面等離子體波場(chǎng)的區(qū)域，進(jìn)而控制熒光分子的激發(fā)區(qū)域。
8.如權(quán)利要求7所述的表面等離子體增強(qiáng)全內(nèi)反射熒光顯微成像裝置，其中，所述光束偏振系統(tǒng)采用基于棱鏡的光束偏轉(zhuǎn)功能，將入射的平行光束轉(zhuǎn)換為不同偏轉(zhuǎn)角度的平行光束，然后采用一對(duì)透鏡組成的望遠(yuǎn)鏡結(jié)構(gòu)，將入射的平行光束轉(zhuǎn)換為偏轉(zhuǎn)方向和光斑大小可控的平行光束，使?jié)M足偏轉(zhuǎn)方向和光斑大小的光束入射進(jìn)油浸物鏡，其中光束偏轉(zhuǎn)角度以及光斑大小與兩透鏡的焦距比值有關(guān)。
9.如權(quán)利要求7所述的表面等離子體增強(qiáng)全內(nèi)反射熒光顯微成像裝置，其中，光束偏轉(zhuǎn)系統(tǒng)使用一電控偏轉(zhuǎn)器進(jìn)行光束偏轉(zhuǎn)。
10.如權(quán)利要求6所述的表面等離子體增強(qiáng)全內(nèi)反射熒光顯微成像裝置，所述高級(jí)次軸對(duì)稱偏振光束的偏振級(jí)次小于5。
【文檔編號(hào)】G02B21/00GK103472576SQ201310415225
【公開日】2013年12月25日 申請(qǐng)日期:2013年9月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月12日
【發(fā)明者】祝連慶, 周哲海, 郭陽(yáng)寬, 婁小平, 張蔭民, 孟曉辰 申請(qǐng)人:北京信息科技大學(xué)